CN117567536A - 荧光标记核苷酸在dna合成测序以及单分子测序中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光标记核苷酸在DNA合成测序及单分子测序中的应用，所述荧光标记核苷酸典型结构其中Base为U,C,A,G四个不同的碱基；R为苯环、炔基或乙烯基；Cleavable Linker为三氮烯连接单元；R1是将三氮烯连接单元与荧光素连接在一起的化学分子基团，Dye是荧光染料。该类荧光标记核苷酸参与DNA延伸、断裂后，残留在碱基上的基团只有苯(胺)基、炔基、乙烯基等含π‑电子基团。本发明在DNA合成测序及单分子测序中，荧光标记核苷酸在参与延伸并断裂反应后，在DNA链上的残基只有苯(胺)基、炔基、乙烯基，有助于DNA测序读长更长且错误率更低。

Description

荧光标记核苷酸在DNA合成测序以及单分子测序中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地，涉及一种荧光标记核苷酸在DNA合成测序以及单分子测序中的应用。
背景技术
人类基因组计划完成后，DNA测序技术得到了迅速发展。DNA测序(DNAsequencing)是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的排列顺序。发展精确、高通量、低成本的DNA测序方法对于生物、医学等具有重要意义。
基于荧光标记核苷酸的DNA合成测序以及单分子合成测序技术已经得到广泛应用，但是现有的核心荧光标记核苷酸在参与DNA链延伸并断裂后，均不可避免地在碱基上有一段残基保留，该类残基随着多次测序循环的进行而不断累计，导致DNA双链的构型、构象均发生变化，这是DNA测序读长受限、错误率偏高的根本原因。如CN 104003902A公开了一种三氮烯连接单元的合成及其在DNA测序中的用途；由其三氮烯连接单元与核苷酸及荧光素连接而成的可逆终端结构式如下：
其在三氮烯与碱基之间的结构相对基团较大，断裂后残基带来的空间位阻更大，影响DNA合成测序效果；且，合成步骤繁琐，合成成本偏高。
一般情况下，天然核苷酸比碱基修饰核苷酸在参与DNA延伸时，是更好的延伸反应物，因此大多DNA合成测序技术的研究方向是尽可能降低残基的影响，甚至消除残基，达到无痕测序，从而提高测序读长，降低错误率。
申请人在先研究课题，CN 112390839 A提出了三氮烯无痕测序；从理论上讲，该类可逆终止核苷酸几乎是完美的，但是事实上却存在一系列缺点，首先DNA延伸产物断裂时，有副反应发生，反应不够干净彻底，导致在实际测序过程中，DNA链受损严重，读长与错误率都严重受限，并且在实验过程中我们发现这些副反应带来的影响实际上大于连接单元断裂后生成的残基的影响；其次在碱基上直接修饰三氮烯连接单元的合成条件极其苛刻，合成难度很大，且产物很难纯化，需要反复多次HPLC纯化才勉强得到可用的化合物；最后，该类可逆终止核苷酸在酸以及还原剂的共同作用下将连接单元断裂时，因为三氮烯直接与碱基相连，碱基上存在羟基、氨基等活泼基团，在合成三氮烯结构中容易发生副反应，且三氮烯与碱基之间形成复杂的异构体，导致可逆终止核苷酸损失很大，DNA双链损伤严重，很难应用于商业化测序，且试剂合成等测序成本很高。
发明内容
针对现有测序技术中的缺点，本发明的目的是提供一种新型荧光标记核苷酸在DNA合成测序以及单分子测序中的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种新型四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂，总的结构式如下所示：总结构式；在该结构式中，Base为U,C,A,G四个不同的碱基；R为苯环、炔基或者乙烯基；Cleavable Linker为三氮烯连接单元；R1是将三氮烯连接单元与荧光素连接在一起的化学分子基团，Dye是荧光染料。Dye具体包括Cy3，Cy5,Cy2,Cy3.5,TAMRA,FITC,sulfo-Cy3,sulfo-Cy2,sulfo-Cy5,sulfo-Cy3.5等。
本发明提供了一种新型荧光标记可逆终止核苷酸，按照连接单元的种类可分为如下结构：
本发明提供的新型可逆终止核苷酸DNA测序试剂(结构式1),Base为U,C,A,G四个不同的碱基；R为苯环、炔基或者乙烯基；R2为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基；R3为2-6个碳原子的脂肪碳链或含有N杂环结构的10个碳原子长度内的脂肪碳链。
优选地，结构式1具体结构如下所示：
本发明还提供了一种三氮烯可逆终止核苷酸的合成方法；所述方法包括如下步骤：
S1、4-氨基苯硼酸频哪醇酯和化合物/>(n＝1-3)反应得到/>
S2、和/>反应得到
S3、和Sulf-Cy3-NHS、Cy3-NHS、Cy5-NHS、FITC-NHS或Cy3.5-NHS反应，即得所述荧光标记可逆终止核苷酸，
作为本发明的一个实施方案，所述化合物(n＝1-3)是通过包括如下步骤的方法制备而得：化合物/>与三氟乙酸乙酯反应得化合物在三氟乙酸存在的条件下进一步脱除Boc保护基，得到所述化合物
作为本发明的一个实施方案，所述化合物是通过包括如下步骤的方法制备而得：化合物/>与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三正丁胺焦磷酸盐反应，反应物醇沉取固体，加入浓氨水反应，旋干溶剂后加水溶解，分离纯化，即得。
作为本发明的一个实施方案，步骤S1是在盐酸和亚硝酸钠存在的条件下进行反应。
作为本发明的一个实施方案，步骤S2是在碳酸铯、醋酸钯和TPPTS存在的条件下进行反应。
本发明提供的三氮烯荧光标记核苷酸，在参与DNA链延伸、断裂后，残留于碱基上的基团仅为苯基、炔基、乙烯基。
本发明还提供了该类荧光标记核苷酸在DNA合成测序以及单分子测序中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明提出的三氮烯四色荧光标记可逆终止核苷酸，在参与DNA链延伸、断裂后，在碱基上仅留下苯基、炔基或乙烯基，在DNA合成测序及单分子测序中更有利于实现读长更长及错误率更低。
2、本发明提供的三氮烯可逆终止核苷酸在DNA合成测序及单分子测序的实践中发现，不论是延伸反应还是断裂实验，反应干净彻底，没有观察到副产物生成。
3、相比核苷三磷酸的碱基直接与三氮烯荧光标记核苷酸连接而生成的可逆终止核苷酸(发明专利202011286386.9)，本发明所述可逆终止核苷酸，其中核苷三磷酸的碱基通过苯基、炔基或者乙烯基连接的三氮烯荧光标记核苷酸，合成所需原料已经商业化，非常容易获得，且反应过程、反应方法简单、高效，合成效率高，产物纯度高，最终产物只需要一次制备HPLC纯化，即可得到高纯度(>99.9％纯度)可逆终止核苷酸，并且可大量合成，所以该类可逆终止核苷酸可用于更多的实验验证，从而可得到更多的实验数据，具有更大的实用价值和推广应用开发价值。相比之下，发明人发展的基于三氮烯的无痕连接单元的可逆终止核苷酸(发明专利202011286386.9)用于DNA测序，从理论上讲，该类可逆终止核苷酸几乎是完美的，但是事实上却存在一系列缺点，首先DNA延伸产物断裂时，有副反应发生，反应不够干净彻底，导致在实际测序过程中，DNA链受损严重，读长与错误率都严重受限，并且在实验过程中我们发现这些副反应带来的影响实际上大于连接单元断裂后生成的残基的影响；其次专利202011286386.9所述化合物的合成难度很大，且产物很难纯化，需要反复多次HPLC纯化才勉强得到可用的化合物。最后一点是以上专利所述化合物在酸以及还原剂的共同作用下将连接单元断裂时，因为三氮烯直接与碱基相连，碱基上存在羟基、氨基等活泼基团，在合成三氮烯结构中容易发生副反应，且三氮烯与碱基之间形成复杂的异构体，导致可逆终止核苷酸损失很大，相当一部分核苷酸在此过程中被破坏。在这种情况下，我们发展了该类新型荧光标记核苷酸，先在苯环、炔基或乙烯基上合成出三氮烯，再通过苯环、炔基或乙烯基将三氮烯与碱基连接，避免了三氮烯合成反应过程中碱基上活泼基团参与反应的问题，避免了大量副反应、异构体的生成；反应干净彻底，几乎没有观察到副反应发生，且该类化合物合成简单方便，可以大量合成。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明所述荧光标记核苷酸的总结构式；
图2为本发明所述三氮烯可逆终止核苷酸结构式；
图3为本发明实施例1所述的三氮烯dUTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图4为本发明实施例2所述的三氮烯dUTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图5为本发明实施例3所述的三氮烯dUTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图6为本发明实施例4所述的三氮烯dUTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图7为本发明实施例5所述的三氮烯dATP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图8为本发明实施例6所述的三氮烯dCTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图9为本发明实施例7所述的三氮烯dGTP荧光标记核苷酸及其合成方法；
图10为本发明实施例4所述的四色荧光标记核苷酸在次磷酸作用下快速完全断裂的路线图；
图11为本发明实施例4所述的四色荧光标记核苷酸在次磷酸作用下快速完全断裂实验结果；其中，Line 1:24bp，Line 2:25bp，Line 3:C4+Bst+(-A-)第一次延伸，Line 4:C4+Bst+(-A-)第一次延伸后断裂，Line 5:Ph+Bst+(-A-)；
图12为本发明实施例4所述的荧光标记核苷酸用变性胶表征参与延伸、断裂的实验结果；其中，Line 1:Primer(24bp)，Line 2:Primer(25bp)，Line 3:C4+Bst+Template1，Line 4:C4+Bst+Template2第一次延伸，Line 5:C4+Bst+Template2第一次延伸后断裂，Line 6:C4+Bst+Template2第二次延伸，Line 7:C4+Bst+Template2第二次延伸后断裂；
图13为本发明实施例4所述的荧光标记核苷酸参与DNA延伸的荧光图像；
图14为本实施例4所述的荧光标记核苷酸核磁氢谱；
图15为本实施例4所述的荧光标记核苷酸核磁磷谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明涉及的荧光标记核苷酸的总结构式如图1所示，以下实施例均为三氮烯可逆终止核苷酸，其结构式如图2所示。
实施例1：荧光标记核苷酸(结构式II)的合成路线
合成路线如图3所示，具体包括：
化合物43的合成
向500ml单口瓶中加入180ml四氢呋喃，冰水浴搅拌下，逐份加入四氢铝锂(4.6g,120mmol)，称取化合物42N-Boc-6-氨基己酸(11.56g，50mmol)溶于50ml四氢呋喃后，缓慢滴加入反应液中，滴加完毕后，先在室温下搅拌0.5h，再65℃回流2h。冷却至室温后，冰水浴下依次缓慢滴加蒸馏水(4.6ml*4)、15％氢氧化钠溶液(4.6ml)淬灭反应。待体系中固体全部变为白色后，减压抽滤，滤液浓缩后，残余物使用5:1DCM/MeOH为淋洗剂进行柱层析，得化合物43 6.1g，产率93％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.60(t,J＝6Hz,2H),2.56(t,J＝7Hz,2H),2.40(s,3H),2.05(s,2H),1.52-1.36(m,8H).
化合物44的合成
称取化合物43(6.1g，46.5mmol)于250mL单口瓶，加入60ml乙醇溶解。称取Boc2O(15.2g，69.7mmol)溶于50ml乙醇后滴加于反应液中，在25℃下搅拌2h。旋出溶剂后，残余物使用10:1DCM/MeOH为淋洗剂进行柱层析，得化合物44 7.8g，产率73％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.64(t,J＝6.4Hz,2H),3.21(m,2H),2.83(s,3H),1.63–1.50(m,6H),1.46(s,9H),1.42–1.36(m,2H)。
化合物45的合成
将化合物44(6.5g，28mmol)置于250mL单口瓶中，加入四溴化碳(11.1g，33.5mmol)，抽真空氮气保护后，注入60mL无水DCM溶解，冰浴搅拌，然后滴加三苯基膦溶液(8.8g，33.5mmol，溶于50ml无水DCM.控温0℃，滴加完毕后25℃搅拌过夜。反应液依次使用水与饱和食盐水洗涤，有机相使用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，以10:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析分离，得到化合物45 8.2g，产率99％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.40(t,J＝6.4Hz,2H),3.20(m,2H),2.83(s,3H),1.86(m,2H),1.52(m,2H),1.45(s,9H),1.29(m,2H)。
化合物47的合成
称取化合物45(5g，17mmol)和邻苯二甲酰亚胺钾(4.7g，25mmol)于250mL单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入100ml无水DMF溶解。100℃加热搅拌24h。旋出溶剂后，加入二氯甲烷100mL搅拌，过滤，滤液旋除溶剂后，加入8mL水合肼、50mL乙醇，90℃加热回流2h，旋除溶剂，以5:1DCM/MeOH为淋洗剂进行柱层析分离，得到化合物47 2.5g，产率64％。
化合物46 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(m,2H),7.71(m,2H),3.67(t,J＝7.6Hz,2H),3.17(t,J＝7.6Hz,2H),2.81(s,3H),1.74–1.62(m,2H),1.54–1.45(m,2H),1.44(s,9H),1.39–1.26(m,4H)。
化合物47 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.18(t,J＝4.8Hz,2H),2.82(s,3H),2.69(t,J＝6.8Hz,2H),1.55–1.41(m,4H),1.45(s,9H),1.39–1.23(m,4H)。
化合物48的合成
称取化合物47(2.5g，11mmol)和三乙胺(2.2g,22mmol)于150mL单口瓶中，加入50ml甲醇搅拌溶解。滴加三氟乙酸乙酯(3.3g,16mmol)于反应液中，在25℃下搅拌4h。旋出溶剂后，加入二氯甲烷50mL，依次用水与饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，残余物使用5:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析，得化合物48 2.3g，产率65％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.17(t,J＝4.8Hz,2H),2.92(t,J＝7.6Hz,2H),2.82(s,3H),1.86–1.75(m,2H),1.56–1.34(m,4H),1.45(s,9H),1.34–1.21(m,2H)。
化合物49的合成
称取化合物48(2.3g，7mmol)于100mL单口瓶中，加入15ml二氯甲烷、15ml三氟乙酸，在25℃下搅拌2h。旋出溶剂后，不进行纯化，直接用于下一步反应。1H NMR(400MHz,DMSO)δ3.18(q,J＝6.4Hz,6.8Hz,2H),2.86(m,2H),2.55(t,J＝5.2Hz,3H),1.60–1.42(m,4H),1.35–1.21(m,4H)。
化合物50的合成
取化合物6 4-氨基苯硼酸频哪醇酯(1.4g，6.4mmol)置于150mL双口瓶中，加入15mL丙酮，15ml HCl水溶液(7.5ml浓HCl稀释一倍)搅拌，在冰浴搅拌控温0-5℃下加入亚硝酸钠(442mg，6.4mmol)。0℃搅拌1h，控温0-5℃下加入化合物49(1.6g，7mmol)，再加入Et3N调节pH至8-9，0℃搅拌0.5h，室温搅拌1h，反应结束旋除丙酮后，EA(30ml*5)萃取。有机相使用无水硫酸钠干燥后浓缩。以5:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析分离，得到化合物50 2.1g，产率71％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝8.4Hz,2H),7.39(d,J＝8.4Hz,2H),3.76(t,J＝6.8Hz,2H),3.34(m,2H),3.22(s,3H),1.62-1.53(m,4H),1.41–1.35(m,4H),1.34(s,12H)。
化合物39的合成
称取5-碘-2-脱氧尿苷(306mg，67mmol),2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(162mg，80mmol),三正丁胺焦磷酸盐(440mg，80mmol)加入三个25ml单口瓶中，依次编号1，2，3。氮气保护下分别向三个单口瓶中加入1ml无水DMF。室温搅拌，向1号瓶中加入1.5ml无水三正丁胺。室温搅拌0.5h后，将反应瓶1中溶液转入2号瓶。继续室温搅拌0.5h后，将反应瓶2中溶液转入3号瓶。继续室温搅拌2h后，加入5ml3％碘溶液(Py/H2O＝9:1)，体系保持15分钟不褪色。加入8ml蒸馏水，室温搅拌2h，加入6ml饱和氯化钠溶液。将反应液加入120ml乙醇中，摇匀混合沉降。-20℃中静置2h，3200r/min离心20min。倾去上层清液，固体转移至25ml单口瓶中，加入6ml浓氨水，室温搅拌过夜。旋干溶剂后，加入少量蒸馏水溶解，针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：Agilent Prep-C 18柱(10μm，21.2×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-8％甲醇(2min)，8％-11％甲醇(23min)，流动相整体流速8mL/min，UV检测波长为254nm，保留时间大约为20min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得白色固体120mg。分析型HPLC测得纯度为93％。分析型HPLC检测纯度条件：依利特SupersilODS2(5μm，4.6×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级乙醇，洗脱梯度为0％-20％乙醇(35min)，流动相整体流速1mL/min，UV检测波长为254nm，保留时间大约为17min。1H NMR(400MHz,D2O)δ8.16(s,1H),6.17(t,J＝6.9Hz,1H),4.53(s,1H),4.09(d,J＝5.1Hz,3H),2.28(dd,J＝6.9,4.7Hz,2H).31P NMR(162MHz,D2O)δ-10.96(d,J＝19.6Hz),-11.76(d,J＝20.3Hz),-23.37(t,J＝20.0Hz).
化合物51的合成
称取化合物39(50mg，84umol)，化合物50(38mg，84umol)，碳酸铯(137mg，0.4mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂(氮气鼓吹除氧)，室温搅拌。称取醋酸钯(1.9mg，8umol)，TPPTS(24mg，42mmol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入2ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为32min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得橙色固体7mg。分析型HPLC检测纯度条件：依利特SupersilODS2(5μm，4.6×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级乙醇，洗脱梯度为0％-40％乙醇(70min)，流动相整体流速1mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间32min。
化合物52的合成
称取化合物51(7mg，10umol)，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取化合物41Sulf-Cy3-NHS(5mg，6.8umol)溶于0.1ml无水三乙胺、1ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为42min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体1.8mg。1H NMR(700MHz,D2O)δ8.19(t,J＝13.3Hz,1H),7.74-7.57(m,5H),7.27-7.15(m,3H),7.12-7.01(m,3H),6.11(t,J＝13.3Hz,1H),6.09-5.99(m,2H),4.02(m,3H),3.89(m,3H),3.79(m,2H),3.48(m,2H),2.96-2.85(m,5H),2.19(s,2H),2.09(m,2H),1.54(s,2H),1.47(s,6H),1.45(s,6H),1.21-1.17(m,2H),1.09-1.05(m,2H),1.04-0.98(m,2H)。31P NMR(283MHz,D2O)δ-5.47,-10.67,-19.21.
其它三个碱基(C,A,G)的荧光标记核苷酸(结构如式II,III,IV所示)用类似方法合成。最终产物均需要制备HPLC纯化并冷冻干燥。
实施例2：荧光标记核苷酸(结构式I)的合成路线
合成路线如图4所示，具体包括：
称取化合物(10.6mg，13.5umol)，化合物Sulf-Cy3-NHS(5mg，6.8umol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入1ml无水DMF，0.1ml无水三乙胺，避光、室温搅拌过夜。加入4ml水稀释后冷冻干燥除去DMF，之后加入2ml水溶解固体，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：Agilent Eclipse Plus C18柱(10μm，21.2×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-30％甲醇(0-5min)，30％-50％甲醇(5-35min)，50％-80％甲醇(35-55min)，流动相整体流速8mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为36min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体2.3mg。1H NMR(700MHz,D2O)δ8.34(t,J＝13.3Hz,1H),8.28-8.22(m,2H),7.80-7.64(m,7H),7.23(t,J＝7.7Hz,1H),7.20-7.10(m,2H),6.29-6.19(m,3H),4.46(s,1H),4.39(s,1H),4.13(t,J＝6.2Hz,1H),4.08(t,J＝6.2Hz,1H),4.01-3.95(m,2H),3.94-3.81(m,5H),3.00-2.94(m,1H),2.80-2.73(m,2H),2.36(t,J＝7.7Hz,1H),2.23(t,J＝6.3Hz,1H),2.19(t,J＝7.0Hz,1H),2.06-1.94(m,2H),1.74-1.67(m,1H),1.57(s,6H),1.48(s,6H),1.45-1.34(m,4H),1.14-1.07(m,5H),0.91-0.87(m,2H),0.80(t,J＝7.0Hz,2H).
31P NMR(283MHz,D2O)δ-5.44,-10.68,-19.24.
其它三个碱基(C,A,G)的荧光标记核苷酸(结构如式II,III,IV所示)用类似方法合成。最终产物均需要制备HPLC纯化并冷冻干燥。
实施例3：荧光标记核苷酸(结构式III)的合成路线
合成路线如图5所示，具体包括：
化合物54的合成
称取化合物53N-Boc-N-甲基乙二胺(3.5g，20mmol)和三乙胺(4ml)于150mL单口瓶中，加入50ml甲醇溶解。冰浴搅拌下滴加三氟乙酸乙酯(4.3g,30mmol)于反应液中，在25℃下搅拌4h。旋出溶剂后，加入二氯甲烷50mL，依次用水与饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，残余物使用5:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析，得化合物54 4.6g，产率85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.48(s,,4H),2.90(s,3H),1.46(s,9H)。
化合物55的合成
称取化合物54(4.6g，17mmol)于100mL单口瓶中，加入25ml二氯甲烷、25ml三氟乙酸，在25℃下搅拌2h。旋出溶剂后，不进行纯化，直接用于下一步反应。
化合物56的合成
取化合物4-氨基苯硼酸频哪醇酯(3.4g，15.5mmol)置于250mL双口瓶中，加入20mL丙酮，20ml HCl水溶液(10ml浓HCl稀释一倍)搅拌，在冰浴搅拌控温0-5℃下加入亚硝酸钠(1.1g，15.5mmol)。0℃搅拌1h，控温0-5℃下加入化合物55(2.9g，17mmol)，再加入Et3N调节pH至8-9，0℃搅拌0.5h，室温搅拌1h，反应结束旋除丙酮后，EA(50ml*5)萃取。有机相使用无水硫酸钠干燥后浓缩。以4:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析分离，得到化合物56 4.2g，产率67％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.80(d,J＝4.8Hz,2H),7.39(d,J＝4.8Hz,2H),3.96(t,J＝2.8Hz,2H),3.67(s,2H),3.39(s,3H),1.34(s,12H)。
化合物57的合成
称取化合物39(50mg，84umol)，化合物56(33.7mg，84umol)，碳酸铯(137mg，0.4mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂(氮气鼓吹除氧)，室温搅拌。称取醋酸钯(1.9mg，8umol)，TPPTS(24mg，42mmol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入2ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，10％-20％甲醇(2-7min)，20％-40％甲醇(7-37min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为15min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得橙色固体5mg。
化合物59的合成
称取化合物57(5mg，7.8umol)，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取Cy3-NHS(2mg，3.5umol)溶于0.1ml无水三乙胺、1ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，40％-60％甲醇(2-12min)，60％-78％甲醇(12-30min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为17min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体1.2mg。1HNMR(700MHz,D2O)δ8.46(t,J＝13.3Hz,1H),7.86(s,1H),7.63-7.45(m,8H),7.43-7.36(m,2H),7.21(d,J＝8.4Hz,1H),6.32(d,J＝14.0Hz,1H),6.22(t,J＝7.0Hz,1H),6.12(d,J＝13.3Hz,1H),烷基区未分析。
其它三个碱基(C,A,G)的荧光标记核苷酸(结构如式II,III,IV所示)用类似方法合成。最终产物均需要制备HPLC纯化并冷冻干燥。
实施例4：荧光标记核苷酸(结构式IV)的合成路线
合成路线如图6所示，具体包括：
化合物61的合成
称取化合物60叔丁基(4-氨基丁基)(甲基)氨基甲酸叔丁酯(2g，10mmol)和三乙胺(2ml)于150mL单口瓶中，加入30ml甲醇溶解。冰浴搅拌下滴加三氟乙酸乙酯(2.1g,15mmol)于反应液中，在25℃下搅拌4h。旋出溶剂后，加入二氯甲烷30mL，依次用水与饱和食盐水洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，旋除溶剂，残余物使用5:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析，得化合物61 2.9g，产率97％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ3.27(t,J＝4.8Hz,2H),3.02-2.94(m,4H),2.87(s,3H),1.58–1.46(m,4H),1.42(s,9H)。
化合物62的合成
称取化合物61(2.9g，9.7mmol)于100mL单口瓶中，加入15ml二氯甲烷、15ml三氟乙酸，在25℃下搅拌2h。旋出溶剂后，不进行纯化，直接用于下一步反应。
化合物63的合成
取4-氨基苯硼酸频哪醇酯(2g，9mmol)置于250mL双口瓶中，加入10mL丙酮，10mlHCl水溶液(5ml浓HCl稀释一倍)搅拌，在冰浴搅拌控温0-5℃下加入亚硝酸钠(630mg，9mmol)。0℃搅拌1h，控温0-5℃下加入化合物62(2g，10mmol)，再加入Et3N调节pH至8-9，0℃搅拌0.5h，室温搅拌1h，反应结束旋除丙酮后，EA(30ml*5)萃取。有机相使用无水硫酸钠干燥后浓缩。以3:1PE/EA为淋洗剂进行柱层析分离，得到3g化合物63，产率77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.78(d,J＝8.4Hz,2H),7.37(d,J＝8.4Hz,2H),3.76(t,J＝4.8Hz,2H),3.51-3.43(m,4H),3.36(s,3H),2.07–1.95(m,4H),1.34(s,12H)。
化合物64的合成
称取化合物39(93mg，156umol)，化合物63(67mg，156umol)，碳酸铯(255mg，0.8mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，室温搅拌。称取醋酸钯(3.5mg，16umol)，TPPTS(45mg，78umol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入3ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为30min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得橙色固体5mg。
化合物65的合成
称取化合物64(11mg，16umol)，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取Cy3-NHS(2mg，3.5umol)溶于0.2ml无水三乙胺、2ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，40％-60％甲醇(2-12min)，60％-78％甲醇(12-30min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为19min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体1.2mg。核磁氢谱见图14，核磁磷谱见图15。
实施例5：荧光标记核苷酸(结构式V)的合成路线
合成路线如图7所示，具体包括：
称取7-脱氮-7-碘-2'-脱氧腺苷67mmol,2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮80mmol,三正丁胺焦磷酸盐80mmol加入三个25ml单口瓶中，依次编号1，2，3。氮气保护下分别向三个单口瓶中加入1ml无水DMF。室温搅拌，向1号瓶中加入1.5ml无水三正丁胺。室温搅拌0.5h后，将反应瓶1中溶液转入2号瓶。继续室温搅拌0.5h后，将反应瓶2中溶液转入3号瓶。继续室温搅拌2h后，加入5ml 3％碘溶液(Py/H2O＝9:1)，体系保持15分钟不褪色。加入8ml蒸馏水，室温搅拌2h，加入6ml饱和氯化钠溶液。将反应液加入120ml乙醇中，摇匀混合沉降。-20℃中静置2h，3200r/min离心20min。倾去上层清液，固体转移至25ml单口瓶中，加入6ml浓氨水，室温搅拌过夜。旋干溶剂后，加入少量蒸馏水溶解，针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：Agilent Prep-C 18柱(10μm，21.2×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-8％甲醇(2min)，8％-11％甲醇(23min)，流动相整体流速8mL/min，UV检测波长为254nm，保留时间大约为20min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得白色固体120mg。分析型HPLC测得纯度为93％。分析型HPLC检测纯度条件：依利特Supersil ODS2(5μm，4.6×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级乙醇，洗脱梯度为0％-20％乙醇(35min)，流动相整体流速1mL/min，UV检测波长为254nm，保留时间大约为20min。冻干得化合物dA-I。
称取化合物dA-I 159umol，化合物63(67mg，156umol)，碳酸铯(255mg，0.8mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，室温搅拌。称取醋酸钯(3.5mg，16umol)，TPPTS(45mg，78umol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入3ml水/乙腈(2:1)混合溶剂(氮气鼓吹除氧)，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为38min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得固体7mg。
称取化合物66 16umol，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取Cy5-NHS(2mg，3.5umol)溶于0.2ml无水三乙胺、2ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，40％-60％甲醇(2-12min)，60％-78％甲醇(12-30min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为28min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体1.8mg。最终产物经EESI-MS表征，结构正确，实测分子量为1160.24，理论分子量为1160.13。
实施例6：荧光标记核苷酸(结构式VI)的合成路线
合成路线如图8所示，具体包括：
以5-碘-2'-脱氧胞嘧啶核苷为原料，参考化合物39和dA-I合成路线及方法合成dC-I。称取化合物dC-I 160umol，化合物63(67mg，156umol)，碳酸铯(255mg，0.8mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，室温搅拌。称取醋酸钯(3.5mg，16umol)，TPPTS(45mg，78umol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入3ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为43min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得固体9mg。
称取化合物68 16umol，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取FITC-NHS(2mg，3.5umol)溶于0.2ml无水三乙胺、2ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，40％-60％甲醇(2-12min)，60％-78％甲醇(12-30min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为19min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体1.6mg。最终产物经ESI-MS表征，结构正确，实测分子量为1159.37，理论分子量为1159.23。
实施例7：荧光标记核苷酸(结构式VII)的合成路线
合成路线如图9所示，具体包括：
以7-脱氮-7-碘-2'-脱氧鸟苷为原料，参考化合物39和dA-I合成路线及方法合成
0.8mmol)于25ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入4ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，室温搅拌。称取醋酸钯(3.5mg，16umol)，TPPTS(45mg，78umol)于10ml单口瓶中，抽真空氮气保护后，加入3ml水/乙腈(2:1)混合溶剂，待固体溶解后，转移至25ml单口瓶中，90℃回流0.5h，冷却后旋出乙腈和大部分水，残余物使用针式滤器过滤后加入样品瓶用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％-50％甲醇(50min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为293nm，保留时间大约为49min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得固体8mg。
称取化合物70 16umol，于10ml单口瓶中加入2ml 0.5M Na2CO3-NaHCO3缓冲溶液，称取Cy3.5-NHS(2mg，3.5umol)溶于0.2ml无水三乙胺、2ml乙腈后加入反应瓶中，避光、室温搅拌过夜。旋除乙腈后，溶液经针式滤器过滤后加入样品瓶，用制备型HPLC分离纯化，分离条件：依利特Supersil ODS2(5μm，10×250mm)，流动相为20mM三乙胺-乙酸(TEAA)缓冲体系和色谱级甲醇，洗脱梯度为0％甲醇(0-2min)，40％-60％甲醇(2-12min)，60％-78％甲醇(12-30min)，流动相整体流速4mL/min，UV检测波长为546nm，保留时间大约为31min，制备型HPLC分得的产品旋蒸除去甲醇和大部分水后，冻干机冷冻干燥，得红色固体2.0mg。最终产物经ESI-MS表征，结构正确，实测分子量为1150.26，理论分子量为1150.45。
实施例8：四色荧光标记核苷酸在次磷酸作用下快速完全断裂
断裂试验路线如图10所示。将实施例4-实施例7制备的四色荧光标记核苷酸(式I-式IV结构)溶于pH＝5的次磷酸钠溶液中，室温下反应5min,反应后的产物(1H-NMR和HRMS表征)表明，断裂效率100％，说明该类化合物在参与DNA链延伸后的断裂干净彻底，没有副产物生成。而且变性胶PAGE证实(图11)，该实施例断裂后的产物line4分离纯化之后，与原位断裂产物用denaturing PAGE表征正确。
实施例9：可逆终止剂的DNA链延伸反应
实施例4-实施例7合成的可逆终止核苷酸IV,V,VI,VII用测序胶证实可顺利参与DNA链延伸、断裂，具有用于DNA测序的潜力，能够满足DNA合成测序的要求。
(1)DNA链退火和延伸
取摩尔比为1:1的模板(template)和引物(primer(24))(如表1所示),混匀，在95℃保持min,然后以0.1℃,/min的速度缓慢降至室温，得到DNA双链(dsDNA)；按照表2所列的成分配制20μL延伸反应液体系，将配制好的反应液混匀，在PCR仪(Bio-rad T100,US)上进行链延伸反应，反应条件：65℃5min→16℃保持。
(2)断裂
在经过延伸的DNA溶液中加入180μL dd H2O稀释，然后加入加入28μL 0.24M HCl，调节pH至2.95，室温下震荡处理1min后，再加入16μL 0.1M NaH2PO2室温下震荡处理1min。再用28μL 1M Tris调节pH至8.0。
(3)凝胶电泳检测
将延伸及断裂后的样品，进行凝胶电泳分析，凝胶为含有7M尿素的12％变性聚丙烯酰胺。电泳前，制备的凝胶在2000V电压和40W恒定功率下运行30min。同时，将测序反应样品与少量0.1M氢氧化钠混合，加热至95℃3min后迅速冷却至室温，使其变性成单链。取1μL样品(约15ng/μL DNA)与2μL含有标记染料的上样缓冲液混合，然后加样电泳，在2000V电压和40W恒定功率下运行3h。然后在785nm激光激发下，使用Odyssey红外成像系统(LI-CORBiosciences,US)观察得到凝胶，图12、图13实验结果表明，在测序循环中，可逆终止核苷酸可实现100％延伸，延伸后的产物可100％断裂，第一次延伸产物断裂后，第二次仍然可以实现100％延伸以及100％断裂，并且当模板存在连续多个相同碱基时，我们合成的可逆终止核苷酸一次测序循环只延伸一个碱基。
表1DNA合成测序模板与引物
表2DNA合成测序的缓冲液体系
实施例10：四色荧光标记可逆终止核苷酸DNA单分子测序系统
本实施例提供了一种DNA单分子测序系统和测序方法，在本实施例中选择实施例4-实施例7制备的可逆终止核苷酸IV,V,VI,VII作为四色荧光可逆终止核苷酸测序试剂。
四条不同的待测模板序列如下：5’-CTACGTTCGAACTACTAACTTGATGTAGCTTCGTAGTAATTTTTTTTTTTTTTTTTT TT-3’(序列1)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAATGGCCAACTTTAGGTACAGGCTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列2)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAAGCAATCCGGCAGATCGTCACTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列3)，
5’-CTACGTTCGAACTACTAAAACTGGTACAGCCAACGTCTGTTTTTTTTTTTTTTTTT TTT-3’(序列4)
先将上述四条不同序列的模板与固定在流通池反应器表面的引物在65℃下温育5min进行杂交，然后在DNA聚合酶的作用下用四种不同荧光标记的可逆终止核苷酸延伸引物，延伸反应时间为15min，温度为60℃。第一次延伸反应结束后通过检测延伸产物的荧光信号即可得到待测碱基的信息，然后在次磷酸(pH＝5)作用下，去除标记在碱基上的荧光素。以第一次延伸后的荧光成像作为定位荧光，采用相同的步骤进行第二次延伸循环，以此类推，进行多次测序循环。该实施例中，使用前一次延伸产物的荧光信息作为下一次延伸产物的定位信息，不需要在待测模板的3′-端标记特定的定位荧光信息。并且在我们初步的实验过程中，我们发现四色荧光单分子测序系统在不需要特意在待测模板上标记定位信息的前提下，也就不存在由于定位信息的荧光淬灭。
所以本发明所述单分子测序系统能够获得长读长、低错误率的高通量的单分子测序系统。这些实验结果都是在我们自己设计的测序芯片及装置中完成的。
总之，本发明所述三氮烯四色荧光标记核苷酸，用于DNA合成测序与单分子测序均具有测序读长更长，错误率更低的特点，并且测序效率高，一次测序循环就可测定一个碱基的读长。而现有单色单分子测序系统四次测序循环才能测得一个碱基的读长，测序效率提高了四倍。此外，Michal Hocek等研究探讨了天然核苷酸酸与苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团修饰的核苷酸的延伸效果，最后得出结论和天然核苷酸相比，苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团修饰的核苷酸因为与Bst等DNA聚合酶有更好位点结合效应，因此延伸效果更好(Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7552-7555；ACS Chem.Biol.2016,11,3165-3171)。然而，其只是比较了天然核苷酸与苯环、炔基或乙烯基等含π-电子基团结构修饰核苷酸，在参与DNA链第一次延伸的结果，而DNA测序要求多达几百次延伸才有实际意义，而多次延伸导致的DNA链构型、构象的变化，是否仍然与聚合酶有更好的结合位点，是否仍然是更好的DNA链延伸反应物，是未知数的、不可预料的；并且，其并不涉及三氮烯结构，自然也不涉及三氮烯相关结构的断裂研究。
需要说明的是，本发明提供的四色荧光单分子测序系统，并不限于目前提出的几类可逆终止剂，也同样适用于其他类型的可逆终止剂。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种荧光标记可逆终止核苷酸，结构式如下所示：
其中，Base为U,C,A,G四个不同的碱基；R为苯环、炔基或者乙烯基；Cleavable Linker为三氮烯连接单元；R1是将三氮烯连接单元与荧光素连接在一起的化学分子基团，Dye是荧光染料。
2.根据权利要求1所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，所述Dye选自Cy3、Cy5、Cy2,、Cy3.5、TAMRA、FITC、sulfo-Cy3、sulfo-Cy2、sulfo-Cy5或sulfo-Cy3.5。
3.根据权利要求1所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，其结构式为：
其中，R2为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基；R3为2-6个碳原子的脂肪碳链或含有N杂环结构的10个碳原子长度内的脂肪碳链。
4.根据权利要求3所述的荧光标记可逆终止核苷酸，其特征在于，其结构式为：
5.一种根据权利要求1-4中任一项所述的荧光标记可逆终止核苷酸在DNA合成测序和/或单分子测序中的用途。
6.一种根据权利要求2-4中任一项所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、4-氨基苯硼酸频哪醇酯和化合物/>(n＝1-3)反应得到
S2、反应得到
S3、和Sulf-Cy3-NHS、Cy3-NHS、Cy5-NHS、FITC-NHS或Cy3.5-NHS反应，即得所述荧光标记可逆终止核苷酸。
7.根据权利要求6所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，所述化合物(n＝1-3)是通过包括如下步骤的方法制备而得：化合物/>与三氟乙酸乙酯反应得化合物/>在三氟乙酸存在的条件下进一步脱除Boc保护基，得到所述化合物/>
8.根据权利要求6所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，所述化合物是通过包括如下步骤的方法制备而得：化合物/>与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三正丁胺焦磷酸盐反应，反应物醇沉取固体，加入浓氨水反应，旋干溶剂后加水溶解，分离纯化，即得。
9.根据权利要求6所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤S1是在盐酸和亚硝酸钠存在的条件下进行反应。
10.根据权利要求6所述的荧光标记可逆终止核苷酸的合成方法，其特征在于，步骤S2是在碳酸铯、醋酸钯和TPPTS存在的条件下进行反应。
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