JPH04290896A - ３′−（２′）−アミノ−またはチオール−修飾された螢光色素結合ヌクレオシド、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド、並びにその製造法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】標識されたオリゴヌクレオチドは、ハイブ
リダイゼーションプローブとして一般的に用いられてお
り且つ制限消化により天然の遺伝子物質から調製される
ＤＮＡプローブよりも扱いやすいので、遺伝子工学にお
いて極めて多数の用途が見出だされている。

【０００２】いわゆるアンチセンスＤＮＡオリゴヌクレ
オチドの形態で用いられる標識されたオリゴヌクレオチ
ドは調節するやり方で細胞の出来事に介入することがで
きるので、例えばタンパク質発現のインビボでの検討に
ついて重要性が増大してきている。現在の知識によれば
、この機構はＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲ
ＮＡ−ＲＮＡ相互作用によって起こるが、詳細は未だ解
明されていない。

【０００３】標識されたオリゴヌクレオチドは、インビ
トロでは例えばこの標識されたオリゴヌクレオチドを用
いることによって遺伝子バンク内の遺伝子フラグメント
の同定に用いて、遺伝子バンクのブロットした遺伝子プ
ローブの検査および同定を行う。

【０００４】インビトロまたはインビボでこのような実
験を行うことができるようにするためには、オリゴヌク
レオチドは前記のように標識しなければならない。好適
な同位体による放射能標識の外に、既に用いられている
非放射性標識の一つの形態は、誘導体形成した螢光色素
であって、これはいっそう容易で危険性の少ない取扱い
を提供する。

【０００５】今日まで、この種の技法は、既にＤＮＡの
非放射性配列決定に首尾よく用いられてきている。これ
に対する方法は本質的にはサンガーの方法に基づいてい
る（エフ・サンガー（Ｆ．　Ｓａｎｇｅｒ）　、エス・
ニックレン（Ｓ．　Ｎｉｃｋｌｅｎ）およびエス・クー
ルソン（Ｓ．　Ｃｏｕｌｓｏｎ）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ
ｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　７４，　５４
６３　（１９７７）　）。

【０００６】螢光標識は、オリゴヌクレオチドの５′末
端（エル・イー・フード（Ｌ．Ｅ．　Ｈｏｏｄ）　、エ
ル・エム・スミス（Ｌ．Ｍ．　Ｓｍｉｔｈ）およびシー
・ハイナー（Ｃ．　Ｈｅｉｎｅｒ）　、Ｎａｔｕｒｅ，
　３２１，　６７４　（１９８６）　）またはヌクレオ
ベース（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）（ジェイ・エム・プロ
ーバー（Ｊ．Ｍ．　Ｐｒｏｂｅｒ）　、ジー・エル・ト
レイナー（Ｇ．Ｌ．Ｔｒａｉｎｏｒ）およびアール・ジ
ェイ・ダム（Ｒ．Ｊ．　Ｄａｍ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２
３８，　３３６　（１９８７）　）に付けられる（Ｇ．
Ｌ．　Ｔｒａｉｎｏｒ，　Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．　６２
，４１８（１９９０））。一番最後に述べた方法の決定
的な不都合は、螢光標識が合成中、すなわち重合中およ
びこの場合には特に酵素的重合中に導入されるという事
実に由来する。前記の方法でのこの段階では、結果とし
て若干のポリメラーゼしか合成に用いることができず、
このポリメラーゼによるトリホスフェートの受容は少な
くなり、更に、大過剰の基質を必要とする。

【０００７】しかしながら、螢光標識の導入はサンガー
の配列決定に限定されない。螢光標識によるマクサム−
ギルバートの化学的配列決定も知られている（エイチ・
ボス（Ｈ．　Ｖｏｓｓ）　、シー・シュヴァーガー（Ｃ
．　Ｓｃｈｗａｇｅｒ）　、ユー・ヴィルクナー（Ｕ．
　Ｗｉｒｋｎｅｒ）、ビー・シュプロート（Ｂ．　Ｓｐ
ｒｏａｔ）　、ジェイ・ツィンマーマン（Ｊ．　Ｚｉｍ
ｍｅｒｍａｎｎ）　、エイ・ローゼンタール（Ａ．　Ｒ
ｏｓｅｎｔｈａｌ）、エイチ・エルフル（Ｈ．　Ｅｒｆ
ｌｅ）、ジェイ・ステージマン（Ｊ．　Ｓｔｅｇｅｍａ
ｎｎ）およびダブリュ・アンソルグ（Ｗ．　Ａｎｓｏｒ
ｇｅ）、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１７，
　２５１７（１９８９）　）。

【０００８】これと同様に、螢光検出器による制限フラ
グメントのマッピングも記載されている（エイ・ヴィ・
カラノ（Ａ．Ｖ．　Ｃａｒｒａｎｏ）、ジェイ・ラマデ
ィン（Ｊ．　Ｌａｍｅｒｄｉｎ）、エル・ケイ・アシュ
ワース（Ｌ．Ｋ．　Ａｓｈｗｏｒｔｈ）　、ビー・ワト
キンス（Ｂ．　Ｗａｔｋｉｎｓ）、イー・ブランスコム
（Ｅ．　Ｂｒａｎｓｃｏｍｂ）、ティー・スレザック（
Ｔ．　Ｓｌｅｚａｋ）　、エム・ラフ（Ｍ．　Ｒａｆｆ
）　ピー・ジェイ・ドゥ・ジョング（Ｐ．Ｊ．　ｄｅ　
Ｊｏｎｇ）、ディー・カイト（Ｄ．　Ｋｅｉｔｈ）、エ
ル・マックブライド（Ｌ．　ＭｃＢｒｉｄｅ）、エス・
マイスター（Ｓ．　Ｍｅｉｓｔｅｒ）、エム・クローニ
ック（Ｍ．　Ｋｒｏｎｉｃｋ）、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　
４，　１２９　（１９８９））、およびエス・ブレンナ
ー（Ｓ．　Ｂｒｅｎｎｅｒ）およびケイ・ジェイ・リヴ
ァック（Ｋ．Ｊ．　Ｌｉｖａｋ）Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ
．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８６，　８９０
２　（１９８９）　）。

【０００９】螢光色素をヌクレオシド、ヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチドの３′−（２′）位（αまたは
β位）にアミノまたはチオール基を介して結合させるこ
とができ、この化合物は鋳型鎖またはオリゴヌクレオチ
ドの存在下にて相補鎖を合成することおよびインビボお
よびインビトロで遺伝子物質を検出するために好都合に
用いることができる。

【００１０】したがって、本発明は、 １．　　式Ｉ

【化３】 （式中、Ｒ１はプリンまたはピリミジン塩基であり、基
Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方はアミノまたはチオー
ル基を介して結合したαまたはβ位における螢光色素で
あり、他の基は所望によりαまたはβ位における水素、
ヒドロキシル、保護されたヒドロキシルまたはメトキシ
基であり、ｎは０またはそれより大きい数であり、Ｒ４
は５′保護基またはホスフェート、ピロホスフェートま
たはトリホスフェートであり、Ｒ５は酸素、フルオロメ
チレン、ジフルオロメチレンまたはメチレンであり、Ｒ
６はαまたはβ位におけるヒドロキシルまたはメトキシ
基または水素であり、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそ
れぞれの場合に同じまたは異なる意味を有することがで
き、ＹおよびＸは酸素、硫黄、ＮＨまたはメチレンであ
り、但し、ＸおよびＹはそれぞれの場合に同じまたは異
なることができる）を有する物質、 ２．　　ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌク
レオチドの３′および／または２′位に位置するＯＨ基
をアミノまたはチオール基に誘導形成した後、螢光色素
に結合させることを特徴とする、１に記載の化合物の製
造法、 ３．　　ａ）　　鋳型鎖の存在下における相補鎖の合成
、ｂ）　　定義されたオリゴヌクレオチドの合成、ｃ）
　　インビボおよびインビトロにおけるその検出、およ
び ｄ）　　インビボおよびインビトロにおける核酸の検出
、における１に記載の化合物の使用、に関する。

【００１１】本発明を、以下において具体的に好ましい
態様について記載する。本発明は特許請求の範囲の内容
によって更に定義される。

【００１２】式Ｉの化合物は、本質的には文献既知の方
法によって合成される（エム・ガイト（Ｍ．　Ｇａｉｔ
）　、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　アイアールエル−
プレス（ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ）　、オックスフォード、
１９８４年）。

【００１３】色素の３′および／または２′位への結合
は、式ＩＩの化合物、好ましくはヌクレオシドから開始
する。

【化４】

【００１４】式ＩＩ（式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙおよび
ｎは前記の意味を有し、これらの置換基については同じ
であることまたは異なるものであることが可能であり、
Ｒ７またはＲ８は水素、ヒドロキシルまたは保護された
ヒドロキシルまたはメチレン基である）の化合物を結合
に用いる。色素の結合は、アミンまたはチオールを導入
することによって３′および／または２′位におけるヒ
ドロキシル基を介して起こる。

【００１５】アジドを導入するために脱離基は３′−（
２′）位に導入される。脱離基として好適なものは、好
ましくはトリフレートまたはメシレートまたはトシレー
トである。アジドは、アジド好ましくはアジ化リチウム
による求核攻撃によって導入される。チオレートまたは
Ｓ−保護チオレートの求核攻撃では、チオールまたは保
護されたチオールを生成する。ヌクレオシドの糖部分に
おいて要求される立体化学は、ＳＮ２置換によって最も
良好に達成することができる。

【００１６】アミノ基はアジドとその後のアミンへの還
元によって直接に得ることができる（文献：ダブリュ・
エス・マンガル（Ｗ．Ｓ．　Ｍｕｎｇａｌｌ）およびア
ール・エル・レットジンガー（Ｒ．Ｌ．　Ｌｅｔｓｉｎ
ｇｅｒ）、Ｊ．　Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，　４０巻，　１
１号，　１６５９　（１９７５）　）。トリフェニルホ
スフィンと水とを用いるスタウジンガー反応がこの段階
では好ましい（文献：エム・メイ（Ｍ．　Ｍａｙ）およ
びジェイ・ダブリュ・エンジェルス（Ｊ．Ｗ．　Ｅｎｇ
ｅｌｓ），　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１
７，　１５，　５９７３　（１９８９））。

【００１７】総ての化合物の構造および立体配置は、Ｎ
ＭＲ、元素分析、ＵＶ、ＩＲ等によって決定した。

【００１８】重縮合が完了した後、ＤＮＡの３′末端の
糖部分の遊離の３′−（２′）−アミノまたはチオール
基を反応性の螢光色素と文献既知の方法によって反応さ
せることが可能である（フンカピラー（Ｈｕｎｋａｐｉ
ｌｌｅｒ）　、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　
１３，　２３９９，　１９８５；ホッジス・アール・ア
ール（Ｈｏｄｇｅｓ　Ｒ．Ｒ．）　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ，　２８巻，２６１　（１９８９））。

【００１９】また、アミノ基はミツノブ反応（Ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ，　１巻，　１９８１，　１　頁）およびヤ
マモトらによって記載された反応（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　
Ｓｏｃ．　Ｐｅｒｋ．　Ｔｒａｎｓ．　１，　１，　３
０６，１９８０）によっても得られる。螢光色素のチオ
ール基を介する結合は同様の方法で行われる。しかしな
がら、アジドの代わりにチオールは保護されたまたは未
保護の形態で導入される。

【００２０】螢光色素のヌクレオシド、ヌクレオチドま
たはオリゴヌクレオチドの遊離のアミノ基またはチオー
ル官能基（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）　への結合は
、代わりにそれらを使用した後にのみ起こるようにする
こともできる。例えば、全混合物を螢光色素で標識する
ことによるＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定反応の終了段階
の後に螢光色素反応を行うことが可能である。

【００２１】原則的には、螢光色素としてアミノまたは
チオール基と反応する総ての市販の色素、好ましくはフ
ルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、ＮＢＤ（
シグマ（Ｓｉｇｍａ）　社製の４−フルオロ−７−ニト
ロベンゾフラザン）、クマリン、フルオレサミン、スク
シニルフルオレセインおよびダンシルを用いることが可
能である。

【００２２】誘導体形成した反応混合物をゲル電気泳動
によって分別し、光度測定法またはレーザー分光分析法
によって検出することができる（エイチ・スワードロウ
（Ｈ．　Ｓｗｅｒｄｌｏｗ）　およびアール・ゲスター
ランド（Ｒ．　Ｇｅｓｔｅｒｌａｎｄ），　Ｎｕｃｌ．
　ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，　１８，　１４１５　頁（１９
９０））。キャピラリー電気泳動（エイ・エス・コーエ
ン（Ａ．Ｓ．　Ｃｏｈｅｎ）ら，　Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．　
ＵＳ．，　８５，　９６６０　（１９８８）　）、例え
ばアクリルアミドゲルを充填したものも十分利用出るこ
とが判った。この場合には、キャピラリーからの出口で
検出を行うのが好ましい（エイチ・スワードロウ（Ｈ．
　Ｓｗｅｒｄｌｏｗ），エス・ヴー（Ｓ．　Ｗｕ），エ
イチ・ハルケ（Ｈ．　Ｈａｒｋｅ），　エヌ・ドヴィチ
（Ｎ．　Ｄｏｖｉｃｈｉ），Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐ
ｈｙ　５１６，６１　（１９９０））。

【００２３】５′位にトリホスフェートを有する式Ｉの
化合物から出発すると、任意の好適なプライマーと鋳型
鎖を用いてポリメラーゼ、すなわち好適な基質の存在下
で配列の真の相補コピーを４種類のヌクレオシドトリホ
スフェートの存在下で合成する酵素の助けによって、好
ましくはＴ７またはＴａｑポリメラーゼ、ＤＮＡポリメ
ラーゼＩおよび逆転写酵素の助けによってＤＮＡ二本鎖
の合成を行うことが可能である。好適な５′保護基は、
トリチル、メトキシ−またはジメトキシトリチルである
（ガイト（Ｇａｉｔ）、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌ
ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　
アイアールエル−プレス（ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ）　、オ
ックスフォード、１９８４年）。

【００２４】合成の終結は、具体的にはそれぞれの場合
に式Ｉの３′−（２′）−アミノ−修飾Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ
ヌクレオチドを用いることによって決定することができ
る。これは、修飾ヌクレオチドの使用によって非常に塩
基特異的な反応の終結を確実に行うことができるので、
鋳型鎖の存在下でのＤＮＡ相補鎖の合成およびＤＮＡ鎖
の配列決定にも特に重要である。

【００２５】ＲＮＡヌクレオシド、ヌクレオチドおよび
オリゴヌクレオチドの合成は、同様に行われる。

【００２６】３′−（２′）末端でアミノ−またはチオ
−修飾し、重合支持体上で固定化されたスターターヌク
レオチドの助けによって誘導体形成可能なオリゴヌクレ
オチドの合成を更に行うことが可能である。

【００２７】好適なオリゴヌクレオチドは総て通常の方
法で調製したＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドであるが
、好ましくは長さが２〜１００、特に好ましくは１２〜
５０ヌクレオチド（化学合成）であるかまたは長さが用
いたポリメラーゼの効率によって３，０００ヌクレオチ
ド（酵素合成）までのものである。

【００２８】オリゴヌクレオチド合成は、通常の方法で
、すなわち３′および５′方向でスターターヌクレオチ
ド−支持体複合体から出発して行い、定義された配列の
オリゴヌクレオチドを合成することを可能にする。

【００２９】スターターヌクレオシドは、市販の支持体
上で合成の後に開裂することができる連結アーム（スペ
ーサー）を介して、例えば文献既知のコハク酸結合を介
してまたはウレタンによる結合（エフィモフ（Ｅｆｉｍ
ｏｖ）ら、Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１
，８３６９，　１９８３）　）を介して固定化される。

【００３０】合成を行った後に、オリゴヌクレオチドは
好適な試薬を用いて支持体から開裂しなければならない
。その後直ちに任意の好適な螢光色素による誘導体形成
を行う。

【００３１】３′−（２′）末端で修飾され且つこの方
法で合成されたオリゴヌクレオチドを次に例えば相補オ
リゴヌクレオチドの検出に用いることができる。

【００３２】本発明による使用は２つの利点を兼ね備え
ている。 １）　　標識した相補鎖の調製において、末端３′−（
２′）−アミノ−またはチオール−修飾ヌクレオチドに
よって同時に鎖が終結する。３′−（２′）位における
その螢光色素の標識により更に危険のない検出が可能に
なる。 ２）　　厳密に定義されたオリゴヌクレオチドの調製で
は、支持体に結合し且つ同様に３′−（２′）−アミノ
−またはチオール−修飾されたスターターヌクレオチド
の標識により螢光標識および検出の可能性と連合した正
確なオリゴヌクレオチドの合成が可能になる。

【００３３】

【実施例】以下の例は本発明を更に詳しく説明するもの
である。 例 １．　　アノマー３′または２′−アミノ−またはアジ
ド−ヌクレオシド＝５′トリホスフェート例１ ５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′−デオキ
シリボシド−チミジンの合成

【化５】 ５′−モノホスフェート−３′−アジド−３′−デオキ
シリボシド−チミジン ３′−アジドチミジン（シグマ）（１６０ｍｇ，０．６
ミリモル）をトリエチルホスフェート１０ｍｌに撹拌溶
解する。ＰＯＣｌ３の０．２ｍｌをトリエチルホスフェ
ート６ｍｌに溶解したものを、滴下漏斗から溶液に４℃
で加える。２４時間後に、混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶
液５０ｍｌで中和し、トルエン６０ｍｌとエーテル１０
０ｍｌとでそれぞれ２回抽出する。水性相を蒸溜水５０
０ｍｌで希釈し、０．２モルＴＢＣ緩衝液（重炭酸トリ
エチルアンモニウム緩衝液；それ自身でｐＨ７．５に設
定した）２００ｍｌを通過させることによって逆イオン
（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｉｏｎ）　としてＨＣＯ３−を入れ
た陰イオン交換カラム（ＲセファデックスＡ−２５；５
０×２．５ｃｍ）に詰める。次いで、蒸溜水３００ｍｌ
を通過させることによって精製を行い、最初に０．１モ
ルＴＢＣ緩衝液２００ｍｌで溶出し、次に直線状の０．
１〜０．２モルＴＢＣ緩衝液グラディエント（グラディ
エントの全容積１３５０ｍｌ）で溶出を行う。一つのピ
ークである生成物ピークがクロマトグラムに現れる。生
成物は０．１２〜０．１５モルＴＢＣ緩衝液の緩衝液濃
度で溶出した。ＴＬＣ陽性の２０ｍｌ画分を一緒にまと
め、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸トリエチルアン
モニウムをエタノールを数回加えることによって除去す
る。生成物は白色結晶トリエチルアンモニウム塩の形態
である。 収率：２２０ｍｇ（５６．２％）；分子量６５１．８１
；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０
：２０）：０．４０；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ
２Ｏ）：１．３６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９０（ｓ
，３Ｈ，ＣＨ３）；２．５０（ｍ，４Ｈ，２′，２″−
Ｈ）；３．１８〜３．３０（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２）；４
．１０（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．３（ｍ，１Ｈ，３
′−Ｈ）；６．３１（ｔ，１Ｈ，１′−Ｈ）；７．７（
ｓ，１Ｈ，６−Ｈ）；１１．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），
３００ＭＨｚ−３１Ｐ−ＮＭＲ（８５％Ｈ３ＰＯ４外部
，Ｄ２Ｏ）：１．２３（ｓ，１Ｐ）。

【００３４】５′−トリホスフェート−３′−アジド−
３′−デオキシリボシド−チミジン トリエチルアンモニウム塩としての５′−モノホスフェ
ート−３′−アジド−３′，２′デオキシリボシド−チ
ミジン（１３０ｍｇ，０．２ミリモル）を無水ＤＭＦ（
ジメチルホルムアミド）６ｍｌに溶解させ、この溶液に
２５℃でＮ，Ｎ′−カルボニルジイミダゾール（１６２
．１５ｍｇ，１ミリモル）を無水ＤＭＦ３ｍｌに溶解し
たものを撹拌しながら加える。２時間の反応時間の後に
、無水メタノール１ｍｌを加え、混合物を更に１５分間
撹拌し、メタノールを留去する。残渣をトリ−ｎ−ブチ
ルアンモニウムピロホスフェートをＤＭＦに溶解した０
．２モル溶液５ｍｌと混合し、室温で一晩撹拌する。 イミダゾールピロホスフェートから成る沈澱を濾別し、
ＤＭＦ２０ｍｌで洗浄し、濾液をロータリーエバポレー
ターで濃縮する。残渣を０．１モルＴＢＣ緩衝液２５０
ｍｌに溶解させ、溶液をＨＣＯ３−を加えたセファデッ
クスＡ−２５陰イオン交換カラムに詰める。生成物を蒸
溜水２００ｍｌを通過させることによって精製し、０〜
０．５モルＴＢＣ緩衝液の直線状グラディエント（グラ
ディエントの全容積２，０００ｍｌ）で溶出させる。２
個のピークがクロマトグラムに現れ、最初のものはモノ
ホスフェートによって生じ、２番目のものは生成物によ
って生じる。生成物は、０．３０〜０．３５モルＴＢＣ
緩衝液の緩衝液濃度で溶出する。陽性の２０ｍｌ画分を
一緒にまとめ、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸トリ
エチルアンモニウムをエタノールを数回加えて除去する
。生成物は白色結晶状のトリエチルアンモニウム塩の形
態である。 収率：９２ｍｇ（５０．４％）；分子量９１１．９５；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．１４；３００ＭＨｚ−３１Ｐ−ＮＭＲ（８
５％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１０．７４（ｄ，　
２ＪＰＰ＝２２．１Ｈｚ，１Ｐ，α−Ｐ原子）；−１１
．４５（ｄ，　２ＪＰＰ＝２１．９Ｈｚ，１Ｐ，γ−Ｐ
原子）；−２２．９９（ｔ，　２ＪＰＰ＝２０．３Ｈｚ
，１Ｐ，β−Ｐ原子）。

【００３５】５′−トリホスフェート−３′−アミノ−
３′−デオキシリボシド−チミジン ５′−トリホスフェート−３′−アジド−３′，２′−
デオキシリボシド−チミジン（６８ｍｇ，０．０７５ミ
リモル）をジオキサン／蒸溜水（２：１）５ｍｌに溶解
し、撹拌しながら室温でトリフェニルホスフィン（２０
０ｍｇ，０．７５ミリモル）を加える。反応混合物を２
５℃で３０時間撹拌した後、溶媒を除去する。残渣を蒸
溜水３０ｍｌに溶解させ、それぞれエーテル３０ｍｌで
３回抽出する。水性相を１５０ｍｌに希釈し、溶液をＨ
ＣＯ３−を加えたセファデックスＡ−２５陰イオン交換
カラムに詰める。生成物を蒸溜水２００ｍｌを通過させ
ることによって精製し、０〜０．５モルＴＢＣ緩衝液の
直線状グラディエント（グラディエントの全容積２，０
００ｍｌ）で溶出させる。クロマトグラムには３個のピ
ークが現れ、最初はモノホスフェート化合物６を表わし
、第二のものは生成物ピークを第三のものは前駆体ピー
ク７を表わす。生成物は０．４０〜０．４２モルＴＢＣ
緩衝液の緩衝液濃度で溶出した。陽性の２５ｍｌ画分を
一緒に纏めて、凍結乾燥によって濃縮する。重炭酸トリ
エチルアンモニウムを、エタノールを加えて除去する。 生成物は無定形の白色トリエチルアンモニウム塩の形態
である。 収率：５７ｍｇ（８５．７％）；分子量８８５．９０；
Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０：７０：
２０）：０．０８；３００ＭＨｚ−１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２
Ｏ）：１．３０（ｔ，３Ｈ，ＣＨ３）；１．９２（ｓ，
３Ｈ，ＣＨ３）；２．６４（ｍ，４Ｈ，２′，２″−Ｈ
）；３．１９〜３．２１（ｄｄ，２Ｈ，ＣＨ２）；４．
２６（ｍ，１Ｈ，４′−Ｈ）；４．４１（ｍ，１Ｈ，３
′−Ｈ）；６．３４（ｔ，　３ＪＨＨ＝６．７４Ｈｚ，
１Ｈ，１′−Ｈ）；７．６９（ｓ，１Ｈ，６−Ｈ）；１
１．５０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。３００ＭＨｚ−３１Ｐ−
ＮＭＲ（８５％Ｈ３ＰＯ４外部，Ｄ２Ｏ）：−１０．７
５（ｄ，　２ＪＰＰ＝２２Ｈｚ，１Ｐ；α−Ｐ原子）；
−１１．４５（ｄ，　２ＪＰＰ＝２１．９Ｈｚ，１Ｐ，
γ−Ｐ原子）；−２２．０５（ｔ，　３ＪＰＰ＝２０．
４Ｈｚ，１Ｐ，β−Ｐ原子）。

【００３６】例２ １−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミンの合成

【化６】 １−（３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペントフラノ
シル）チミン 四臭化炭素（１１．９１ミリモル、４．１０ｇ）を５′
−ジメトキシトリチルチミジン（調製については、エム
・ガイト（Ｍ．　Ｇａｉｔ）　、オリゴヌクレオチド合
成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ）　アイアールエル−プレス（ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ
）　、（１９８４），２７頁を参照されたい）（５．９
８ｇ，１１ミリモル）、トリフェニルホスフィン（３．
０７６ｇ，１１．７３ミリモル）およびアジ化リチウム
（３．１ｇ，５５ミリモル）を乾燥ＤＭＦ３７ｍｌに溶
解した撹拌溶液に加える。混合物を室温（ＲＴ）で５６
時間撹拌した後、メタノール１５ｍｌを加える。生成物
を次に氷冷蒸溜水８００ｍｌ中で沈澱させる。沈澱をク
ロロホルムに溶解させ、フラッシュクロマトグラフィ（
酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝３：１）によって精製する
。クロロホルム：メタノール９：１中のＲｆ＝０．５２
。ＩＲ（ｃｍ−１）：２１００アジド、収率８０％、４
．９５ｇ。

【００３７】１−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオ
キシ−５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオ
ペントフラノシル）チミン トリフェニルホスフィン（１．３ｇ，４．９４ミリモル
）を１−（３′−アジド−２′，３′−ジデオキシ−５
′−Ｏ−ジメトキシトリチル−β−Ｄ−スレオペントフ
ラノシル）チミン（０．５ｇ，０．８ミリモル）の撹拌
溶液に加え、４時間反応させる。ホスフィンイミンを、
蒸溜水３ｍｌを加えて加水分解し、更に３時間撹拌する
。ロータリーエバポレーター中で溶媒を除去した後、残
留オイルをフラッシュクロマトグラフィ（クロロホルム
：メタノール９９：１＋１％トリエチルアミン）によっ
て精製する。同じ溶媒中でのＲｆ＝０．２７。このアミ
ンは、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）でニンヒドリン
で処理することによって紫色に染色することができる。 収率８７．５％，０．４２ｇ。生成物は特有の　１Ｈ−
ＮＭＲスペクトルを有する。

【００３８】１−（３′−アミノ−２′，３′−ジデオ
キシ−５′−トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）チミンへの転換 続いて５′−トリホスフェートへ転換するために、ジメ
トキシトリチル基をエム・ガイト（Ｍ．　Ｇａｉｔ）　
、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ
ｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）アイアールエル−プレス
（ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ）　、４９頁、（１９８４）の記
載と同様の方法で除去し、例１に記載したのと同様にし
てトリホスフェートを５′位へ結合させる。

【００３９】例３ ２′−アミノ−２′−デオキシ−５′−トリホスフェー
ト−ウリジンの調製

【化７】 （２，２′−アンヒドロ−１−β−アラビノフラノシル
）−ウラシル 重炭酸ナトリウム０．５ｇ（５．９３ミリモル）を、ウ
リジン１９ｇ（７７．８ミリモル）およびジフェニルカ
ーボネート２２．２ｇ（１０３．６ミリモル）を無水ジ
メチルホルムアミド７５ｍｌに溶解したものに加えた。 溶解が完了した後、透明な無色液体を１５０℃の温度に
３０分間加熱する。冷却した後、冷溶液を無水エーテル
に注入する。エーテルを傾瀉によって生成する沈澱から
除去し、粗生成物をメタノール１６５０ｍｌから再結晶
させる。乾燥すると白色結晶性粉末を生じる。 融点：２３９℃；ＭＳ：２２７；Ｒｆ：０．３１　　塩
化メチレン／メタノール８：２；収率９．２２ｇ（５２
．３％）。　１Ｈ−ＮＭＲ　　６０ＭＨｚは文献値に対
応する。

【００４０】２′−アジド−２′−デオキシウリジン（
２，２′−アンヒドロ−１−β−アラビノフラノシル）
−ウラシル１．１６ｇ（１０ミリモル）およびアジ化リ
チウム３．５ｇ（７１．７ミリモル）を撹拌しながら無
水ＤＭＰＵ（１，３−ジメチル−３，４，５，６−テト
ラヒドロ−２−１−Ｈ）−ピリミジノール）２５ｍｌに
導入する。懸濁液を１２０℃まで加熱すると、反応溶液
は黒くなる。３日後に、黒色溶液を水８０ｍｌで希釈し
、塩化メチレン１００ｍｌで２回抽出する。次いで、一
緒にまとめた有機相を水で更に４回洗浄し、ロータリー
エバポレーターで濃縮する。固形のタール状残渣をシリ
カゲル上でカラムクロマトグラフィ（塩化メチレン／メ
タノール８：２）で精製する。黒色油状残渣をロータリ
ーエバポレーターで濃縮した後、これをシリカゲルベー
スで更に２回精製する（アセトン：メタノール８：３お
よびアセトン：酢酸エチル１：１）。ＴＬＣで純粋な無
色ガラス状物質（Ｒｆ塩化メチレン／メタノール８：１
＝０．６１）が得られる。収率２．０３５ｇ（３０％）
。ＩＲ（クロロホルムフィルム）：２１２０ｃｍ−１。 ＭＳ（ＦＡＢ）：２７０。生成物は予想した　１Ｈ−Ｎ
ＭＲスペクトルを有する。２′−アミノ−２′−デオキ
シ−５′−トリホスフェート−ウリジンを、ヒドロキシ
ル官能基の選択的３′−アシル化によって調製する。次
に、５′−トリホスフェート基の導入を例１と同様の方
法で行う。３′位で脱アシル化を行った後、アジドをト
リフェニルホスフィンと反応させて（例２と同様にして
）アミンへ還元する。

【００４１】例４ ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−アデノシンの合成

【化８】 Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ベンゾイル−２−デ
オキシ−β−Ｄ−スレオ−ペントフラノシル）アデニン
（ニシノ（Ｎｉｓｈｉｎｏ）　ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ
ｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，　１９８６，　５
，１５９によって記載された方法により調製した）Ｎ６
，５′−Ｏ−ジベンゾイル−２′−デオキシアデノシン
９２０ｍｇ（２ミリモル）を（ピリジン２ｍｌを含有す
る）無水ジクロロメタン３０ｍｌに懸濁したものを−３
０℃に冷却し、無水トリフルオロメタンスルホン酸をジ
クロロメタンに溶解したもの（１０容積％）５ｍｌをゆ
っくりと滴下して加える。冷却槽を取り外した後、溶液
を放置して暖め、水１ｍｌを加える。３時間後に、水を
更に５ｍｌを加え、有機相を洗浄する。溶媒を除去した
後、残留する残渣をメタノール５０ｍｌに溶解し、重炭
酸ナトリウム１００ｍｇを加える。混合物を室温で更に
２時間撹拌し、１０％強度の酢酸で中和し、溶媒を除去
し、シリカゲル上でフラッシュクロマトグラフィ（クロ
ロホルム：メタノール９７：３）で精製する。収率７１
０ｍｇ（１．４８ミリモル）７５％。Ｒｆクロロホルム
：メタノール９７：３＝０．４９。ＭＳ＝４５９。

【００４２】３′−アジド−２′，３′−ジデオキシア
デノシン Ｎ６−ベンゾイル−９−（５−Ｏ−ベンゾイル−２−デ
オキシ−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）−アデニン
９２０ｍｇ（２ミリモル）を無水ジクロロメタン２０ｍ
ｌ（およびピリジン２ｍｌ）に溶解したものを−３０℃
に冷却する。次いで、無水トリフルオロメタンスルホン
酸を無水ジクロロメタンに溶解したもの５ｍｌ（３ミリ
モル）を滴下して加える。冷却槽を取り外し、混合物を
更に２０分間撹拌し、アジ化リチウム９８０ｍｇ（２０
ミリモル）をＤＭＦ２０ｍｌに溶解したものを溶液に加
える。ＲＴで更に２時間撹拌した後、水５０ｍｌおよび
クロロホルム１５０ｍｌを加え、有機相を吸収させ、蒸
溜水で洗浄する。溶媒を、Ｒロータヴェイパー（Ｒｏｔ
ａｖａｐｏｒ）　で除去し、生成物をアンモニア性メタ
ノール溶液で一晩処理して塩基保護基を除去する。溶媒
を再度除去してからシリカゲル上でフラッシュクロマト
グラフィ（クロロホルム：メタノール９５：５）で精製
を行う。収率：４３０ｍｇ（１．６ミリモル，７９％）
白色結晶性粉末。ＩＲ：２，１００ｃｍ−１アジド基。

【００４３】３′−アミノ−２，′，３′−ジデオキシ
−５′−トリホスフェート−アデノシン５′−トリホス
フェートは、例１と同様にして調製する。次いで、アジ
ドを例２と同様の方法でアミンまで還元する。

【００４４】例５ ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−グアノシンの合成

【化９】 ３′−アミノ−２′，３′−ジデオキシ−５′−トリホ
スフェート−グアノシンは、ニシノ（Ｎｉｓｈｉｎｏ）
　ら（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　＆　Ｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅｓ，　５，　１５９，　１９８６　）の方法によっ
て調製することができるＮ２−イソブチリル−５′−Ｏ
−ベンゾイル−２′−デオキシグアノシンから出発して
調製される。ヌクレオシドを例４における調製と同様に
して３′−アジドに転換する。この場合にイソブチリル
保護基はトリホスフェート基の導入の後でかつアジドの
アミンへの還元の前にのみ除去されるので、アンモニア
性メタノール溶液での処理は行われないことに留意すべ
きである。グアノシンの場合にもトリホスフェートへ転
換するために例１に記載の方法を用いる。アミンへの還
元は例２に記載されている。

【００４５】２．　　３′−アミノオリゴマーの合成お
よびその後の３′−螢光標識 例６ ２０個のヌクレオチドのオリゴマー ３′−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ
ＴＴ−５′の合成は、５′−ジメトキシトリチルで保護
された３′−アミノ−３′−デオキシチミジンから出発
する。この化合物は例１に記載した方法で調製される。 この場合に、出発物質は、エム・ガイト（Ｍ．　Ｇａｉ
ｔ）　（オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　アイアールエル
−プレス（ＩＲＬ−Ｐｒｅｓｓ）　、１９８４年、２７
頁）の方法によってＡＺＴとジメトキシトリチルクロリ
ドとから調製することができる５′−ジメトキシトリチ
ル保護ＡＺＴ（アジド−３′−デオキシリボシド−チミ
ジン）である。

【００４６】この化合物を次に、例１に記載の方法でト
リフェニルホスフィンで還元する。次の段階は支持体物
質の調製である。このために、５′−Ｏ−（４，４′−
ジメトキシトリチル）−３′−アミノ−３′−デオキシ
チミジン２００ｍｇを無水ピリジン７００μｌに導入す
る。この溶液に、ＤＭＡＰ（ジメチルアミノピリジン）
４５ｍｇ、引き続いて無水コハク酸４０ｍｇを加える。 混合物を一晩放置した後、残っている無水コハク酸を水
１０μｌを加えることによって加水分解する。トルエン
との共蒸発を３回行い、残渣を塩化メチレン１２ｍｌに
吸収させ、冷クエン酸（１０％強度）４ｍｌで洗浄し、
水４ｍｌで２回洗浄する。有機相を硫酸ナトリウム上で
乾燥させ、溶媒量を濃縮させ、物質を塩化メチレン１ｍ
ｌに溶解させる。この溶液をｎ−ヘキサン３０ｍｌに撹
拌しながら徐々に滴下して加える。分離した沈澱を吸引
濾別して、４０℃でオイルポンプ真空下で乾燥させる。 更に、標準的方法によってＣＰＧをベースとした支持体
物質を調製し、次に、ホスホルアミダイト法によるＡＢ
Ｉ３８０Ａ　　ＤＮＡシンセサイザー上での標準的サイ
クル（ＡＢＩ　３８０Ａ　Ｕｓｅｒ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ
，発刊番号３６，７　月，１９８６）を用いて１２個の
ヌクレオチドのオリゴマーを調製する。 支持体の３′−アミノオリゴヌクレオチドの脱保護およ
び開裂の後、精製および特性決定を標準的方法によって
行う。この場合に、一層塩基に不安定な結合法を用いて
支持体に結合させることによって一層良好な結果を得る
ことができる。エフィモフ（Ｅｆｉｍｏｖ）（Ｎｕｃｌ
．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１１，８３６９，１９８
３）によって記載されたのと同様にしてウレタン官能基
によって開裂される酸アミドを置換するのが有利である
。

【００４７】例７ ３′−アミノ末端を有する２３ヌクレオチドのオリゴマ
ー ３′−Ｈ２Ｎ−ＡＣＡＣＣＣＡＡＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴ
ＧＧＡＴ−５′の合成は、例１に記載したのと同様に行
う。精製および特性決定は標準的方法による。

【００４８】例８ 引き続く３′−アミノ末端でのオリゴマーの誘導体形成
は、フルオレセインイソチオシアネートで行う。３′−
アミノオリゴヌクレオチド５０ナノモルをエッペンドル
フチューブ中の５００ミリモル重炭酸ナトリウム溶液２
５μｌに溶解させる。３００ミリモルＦＩＴＣ（シグマ
）のＤＭＳＯ溶液２０μｌを加える。室温で６時間反応
させた後、反応混合物を２０ミリモル酢酸アンモニウム
溶液中でセファデックスＧ−２５カラムを通過させるこ
とによって精製する。３′−ＦＩＴＣオリゴマーを螢光
検出およびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行う
ことによって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリ
ーゲル電気泳動（ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）から
入手）上で分析することによっても確かめられた。フル
オレセインイソチオシアネートの式：

【化１０】

【００４９】例９ 例１および２からの３′−アミノオリゴマーを、例３に
記載の方法によって、ローダミンイソチオシアネートお
よびテトラメチルローダミンイソチオシアネートと反応
させる。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出お
よびＵＶ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことに
よって分析した。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル
電気泳動（ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）から入手）
上で分析することによっても確かめられた。色素ローダ
ミンイソチオシアネートおよびテトラメチルローダミン
イソチオシアネートの式：

【化１１】

【００５０】例１０ 例１および２からの３′−アミノオリゴマーを、例３に
記載の方法によって下記のクマリン誘導体と反応させる
。３′−螢光標識したオリゴマーを、螢光検出およびＵ
Ｖ検出の両者により分析的ＨＰＬＣを行うことによって
分析する。ＨＰＬＣの結果は、キャピラリーゲル電気泳
動（ディオネックス（Ｄｉｏｎｅｘ）から入手）上で分
析することによっても確かめられる。 クマリン色素分子の式：

【化１２】

【００５１】３．　　ＤＮＡポリメラーゼによる修飾ヌ
クレオチドの結合および配列決定実験の分析通常の配列
決定酵素によるアミノトリホスフェートの受容をチェッ
クするために、適当な終結溶液を調製し、ポリメラーゼ
（クレノウ，ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）；
Ｔａｑ，アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）；Ｔ７，フ
ァルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　；シークエナーゼ
（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）　，ＵＳＢ）を試験した。これ
により、トリホスフェートの結合速度および終結特性の
古典的および螢光色素を用いる標識による分析を行った
。

【００５２】例１１ 例１と同様な方法で調製した５′−トリホスフェート−
３′−アミノ−３′−デオキシリボシド−チミジンを２
′，３′−ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チミ
ジンに代えた。これは、前記の総てのポリメラーゼの終
結溶液で行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍お
よび１０分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を試
験した。配列決定は、標準的方法で行った。これらの検
討におけるオートラジオグラフィ検出は、α−３５Ｓ−
ｄＡＴＰの結合によるものであった。ａ）　　３′−ア
ミノ−ヌクレオチドは用いた酵素に対して終結作用を有
し、ｂ）　　Ｔ７、Ｔａｑおよびシクエナーゼの場合の
結合速度は通常のジデオキシターミネーターと同じであ
り、ｃ）最終的には、アミノ−ヌクレオチドを用いて問
題なく配列決定が可能であるということが明らかになっ
た。

【００５３】例１２ 化合物５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′−
デオキシリボシド−チミジンをフルオレセインイソチオ
シアネートと反応させて５′−トリホスフェート−３′
−アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオ
レセインイソチオシアネート−チミジンを得た。５′−
トリホスフェート−３′−アミノ−３′，２′−デオキ
シリボシド−チミン（２．５ｍｇ，２．８マイクロモル
）をエッペンドルフキャップ中の蒸溜水２００μｌに溶
解し、１モルＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ
９）２００μｌを加える。反応混合物をアルミニウム箔
に包んで日光から保護し、フルオレセインイソチオシア
ネート溶液（ＤＭＦ１ｍｌ中１０ｍｇ）８０μｌを１０
０μｌピペットで加える。室温で１０分間反応させた後
、ＴＬＣでは前駆体が定量的に転換する。精製はゲル濾
過によって行う。セファデックスＧ−１０カラムをアル
ミニウム箔に包んで光から保護した後、完全な反応混合
物をカラム物質に詰め、１ｍｌ／分の流速で水で溶出す
る。クロマトグラムは２個のピークを示す。第一のピー
クは生成物により、第二のピークは未反応の色素によっ
て生じる。画分の大きさは５ｍｌであり、全部で２４画
分を得る。クロマトグラムに基づき、画分４が陽性であ
ることが判る。これはＴＬＣによって確かめられる。 溶媒を凍結乾燥により除去し、物質を−８０℃に保存す
る。収率３．３２ｍｇ（９３％）；分子量：１，２７４
．３２；Ｒｆ（アンモニア：イソプロパノール：水１０
：７０：６０）＝０．６２；螢光発光スペクトル：入射
光線の波長は４２０ｎｍである。化合物の発光最大値は
５１４．８ｎｍにおいてである。蒸留水中の２．５ミリ
モル溶液を測定した。誘導体形成しない色素の２．５ミ
リモル蒸留水溶液の発光最大値は、５１９．４ｎｍの波
長においてである。

【００５４】調製した５′−トリホスフェート−３′−
アミノ−３′−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレ
セイン−イソチオシアネート−チミジンを２′，３′−
ジデオキシ−５′−トリホスフェート−チミジンに代え
た。これは、前記した総てのポリメラーゼの終結溶液で
行った。それぞれの場合に、等モル、１０倍および１０
分の１のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を試験した。 配列決定は標準的方法で行った。これらの検討における
オートラジオグラフィ検出はα−３５Ｓ−ｄＡＴＰの結
合によった。ａ）　　３′−螢光標識したヌクレオチド
は用いた酵素について終結作用を有し、ｂ）　　Ｔ７、
Ｔａｑおよびシクエナーゼの場合における結合速度は、
立体的に要求する色素残基のために従来のジデオキシタ
ーミネーターの１０倍の濃度に等しく、ｃ）　　配列決
定は３′−螢光標識したターミネーターを用いて困難無
く行うことができるということがわかる。

【００５５】例１３ 調製した５′−トリホスフェート−３′−アミノ−３′
−デオキシリボシド−３′−Ｎ−フルオレセイン−イソ
チオシアネート−チミジンを２′，３′−ジデオキシ−
５′−トリホスフェート−チミジンに代えた。これは、
Ｔ７およびＴａｑポリメラーゼの終結溶液で行った。基
本として１０倍のｄＮＴＰ／ターミネーターの比率を用
いた。配列決定は標準的方法で行った。α−３５Ｓ−ｄ
ＡＴＰの結合は、これらの検討では行わなず、配列分析
は市販のＤＮＡシークエンサーで３′−螢光標識ターミ
ネーターで首尾よく行った。

【００５６】例１４ ５′−トリホスフェート−３′−チオ−３′−デオキシ
リボシド−チミジンの合成

【化１３】 ５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｓ−ベンゾイル
−チオチミジン ３′位における硫黄の導入は脱離基（メシレート）をナ
トリウムチオベンゾエートで置き換えることによって行
う。ナトリウムチオベンゾエートはチオ安息香酸（１０
ｇ）の水１５ｍｌの氷冷溶液に１０モルＮａＯＨ溶液を
加えて溶液をアルカリ性にすることによって合成する。 次いで、ｐＨを水性チオ安息香酸で７に調整し、溶液を
−５℃に冷却し、濾過して、固形の残渣を除去する。水
をロータリーエバポレーターでエタノールと共に除去し
た後、黄色塩を五酸化リン上で真空で乾燥する。５′−
Ｏ−ジメトキシトリチル−３′−Ｏ−メタンスルホニル
−２′−デオキシキシロ−チミジン（８．４５ミリモル
）（メシレートの合成：ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），フォ
ックス（Ｆｏｘ）（１９６４），　Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃ
ｈｅｍ．，　２９，　１７７２　）およびチオ安息香酸
ナトリウム（３３ミリモル）のＤＭＦ（３０ｍｌ）溶液
を１００℃で４時間撹拌する。混合物をジクロロメタン
で抽出し、有機相を飽和ＮａＨＣＯ３溶液および飽和Ｎ
ａＣｌ溶液で洗浄する。硫酸ナトリウム上で有機相を乾
燥した後、トルエンと共に共蒸発させ、油性粗生成物を
フラッシュクロマトグラフィ（シリカゲル６０Ｈ、クロ
ロホルム／メタノール０〜１０％）によって精製する。 収率：６０％、生成物は予想された　１Ｈ−ＮＭＲスペ
クトルを有する。

【００５７】５′−ジメトキシトリチル保護基を、文献
既知の方法（エム・ガイト（Ｍ．　Ｇａｉｔ）　、オリ
ゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）　アイアールエル−プレス（Ｉ
ＲＬ−Ｐｒｅｓｓ）　、オックスフォード、１９８４年
）によって開裂して５′位をホスフィチル化する。次に
、５′−トリホスフェートを、エクシュタイン（Ｅｃｋ
ｓｔｅｉｎ）とルードヴィッヒ（Ｌｕｄｗｉｇ）の方法
（Ｊ．Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．，　１９８９，　５４　巻
，３　号，６３１　）によってサリチルホスホクロリダ
イト（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）　）を用い、ピ
ロホスフェートで処理することによって調製する。チオ
ールは、アルゴンを飽和したエタノール中１０モルＮａ
ＯＨと反応させることによって遊離する（アール・コス
チック（Ｒ．　Ｃｏｓｓｔｉｃｋ）　、Ｎｕｃｌｅｉｃ
　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１８，　４，８２
９）。３′−チオ−５′−トリホスフェート−チミジン
を例８における方法によってヨードアセタミドフルオレ
セイン（モレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｐｒｏｂｅｓ））と結合させ、８０％の収率の螢光
標識したチオヌクレオチドがこの工程で得られる。

【００５８】例１５ １−（３′−チオ−２′−，３′−ジデオキシ−５′−
トリホスフェート−β−Ｄ−スレオペントフラノシル）
チミジンの合成

【化１４】 ナトリウムチオベンゾエートでの置換は５′−ＤＭＴｒ
−Ｏ−，３′−Ｏ−メシル−チミジンから出発して例１
４に記載の方法で行う。この後に、５′保護基を開裂さ
せ、５′−トリホスフェートを導入し、チオールを遊離
させ、ヨードアセタミドフルオレセインを例１４の方法
と同様にして結合させる。

【００５９】例１６ １０個のヌクレオチド３′−β−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴ　　Ｔ
ＴＴ　　ＴＴＴ　　Ｔ−５′のオリゴマーの合成オリゴ
マー３′−β−Ｈ２Ｎ−ＴＴＴ　　ＴＴＴ　　ＴＴＴ　
　Ｔ−５′の合成は１−（３′−アミノ−２′−，３′
−ジデオキシ−５′−ＤＭＴｒ−β−Ｄ−スレオペント
フラノシル）−チミジンから出発し、これを例６に記載
の方法で反応させてホスホルアミダイト法の支持体物質
を得る。次の、フルオレセインイソチオシアネートによ
る３′−β−アミノ−オリゴヌクレオチドの螢光標識は
例８と同様に行う。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式Ｉ 【化１】 （式中、Ｒ１はプリンまたはピリミジン塩基であり、基
   Ｒ２およびＲ３の少なくとも一方はアミノまたはチオー
   ル基を介して結合したα−またはβ位における螢光色素
   であり、他の基は所望によりαまたはβ位における水素
   、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシルまたはメトキ
   シ基であり、ｎは０またはそれより大きい数であり、Ｒ
   ４は５′保護基またはホスフェート、ピロホスフェート
   またはトリホスフェートであり、Ｒ５は酸素、フルオロ
   メチレン、ジフルオロメチレンまたはメチレンであり、
   Ｒ６はαまたはβ位におけるヒドロキシルまたはメトキ
   シ基または水素であり、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６は
   それぞれの場合に同じまたは異なる意味を有することが
   でき、ＹおよびＸは酸素、硫黄、ＮＨまたはメチレンで
   あり、但し、ＸおよびＹはそれぞれの場合に同じまたは
   異なることができる）を有する３′−および／または２
   ′−アミノ−およびチオール修飾ヌクレオシド、ヌクレ
   オチドまたはオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴ
   ヌクレオチドの３′および／または２′位に位置するＯ
   Ｈ基をアミノまたはチオール基に誘導形成した後、螢光
   色素に結合させることを特徴とする、請求項１に記載の
   式Ｉの化合物の製造法。
3. 【請求項３】式ＩＩ 【化２】 （式中、Ｒ１〜Ｒ６、Ｘ、Ｙおよびｎは前記の意味を有
   し、但し、Ｒ１、Ｒ５およびＲ６はそれぞれの場合に同
   一または異なる意味を有することができ、Ｒ７またはＲ
   ８は水素、ヒドロキシルまたは保護されたヒドロキシル
   またはメトキシ基である）の化合物において、ａ）　　
   求核攻撃によって３′および／または２′位に保護され
   たまたは保護されていない形でアジドまたはチオールを
   導入し、但し、適切であればアジドをアミンに還元し、 ｂ）　　アミノ基を介してまたはチオール基を介して螢
   光色素を結合させること、を特徴とする、式Ｉの化合物
   の製造法。
4. 【請求項４】フルオレセイン、ローダミン、テキサスレ
   ッド、ＮＢＤ、クマリン、フルオレサミン、スクシニル
   フルオレセインおよびダンシルを螢光色素として用いる
   、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】ａ）　　ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオシド
   、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの合成のため
   の、 ｂ）　　インビボおよびインビトロでの顕微鏡的および
   肉眼的螢光検出のための、請求項１に記載の式Ｉの化合
   物の使用。
6. 【請求項６】ａ）　　鋳型鎖の存在下での相補鎖の合成
   のための、 ｂ）　　オリゴヌクレオチドの合成のための、請求項５
   に記載の式Ｉの化合物の使用。