BG61484B1 - 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им - Google Patents

3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им Download PDF

Info

Publication number
BG61484B1
BG61484B1 BG95575A BG9557591A BG61484B1 BG 61484 B1 BG61484 B1 BG 61484B1 BG 95575 A BG95575 A BG 95575A BG 9557591 A BG9557591 A BG 9557591A BG 61484 B1 BG61484 B1 BG 61484B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
group
amino
synthesis
formula
oligonucleotides
Prior art date
Application number
BG95575A
Other languages
English (en)
Other versions
BG95575A (bg
Inventor
Joachim Engels
Mathias Herrlein
Renate Konrad
Matthias Mag
Original Assignee
Hoechst Aktiengesellschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Aktiengesellschaft filed Critical Hoechst Aktiengesellschaft
Publication of BG95575A publication Critical patent/BG95575A/bg
Publication of BG61484B1 publication Critical patent/BG61484B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/20—Purine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. 3'-(2')-амино- и тиолмодифицирани нуклеозиди, нуклеотиди и олигонуклеотиди с формула в която R1 означава пуринова или пиримидинова база, поне единот остатъците R2 и R3 е флуоресциращо багрило вили позиция, свързано чрез аминогрупа или тиолова група, а другият остатък в даден случай означава водород, хидроксилна група, защитна хидроксилна илиметоксигрупа в позиция или , n има стойност 0, R4 e 5'-защитна група или фосфат, пирофосфат илитрифосфат, R5 - кислород, флуорметилен, дифлуорметилен или метилен, R6 - хидроксилна или метоксигрупа или водород в позиция или , като R1, R5 и R6 могат съответно да имат еднакви или различни значения и Y и X могат да бъдат еднакви или различни и означават кислород, сяра, NH или метилен.

Description

Белязаните олигонуклеотиди намират извънредно много различни приложения в генната технология, тъй като боравенето с тях е по-лесно, отколкото традиционно използваните като проби за хибридизация сонди DNA, които се произвеждат чрез частична преработка от нативен генетичен материал.
Белязаните олигонуклеотиди, които се използват под формата на т.нар. “антисенсни” олигонуклеотиди DNA, могат да имат регулиращо действие в развитието на клетката и с това придобиват все по-голямо значение например за изследването in vivo на синтеза на протеини. Както е известно, механизмът минава през взаимодействието на DNA-DNA, DNA - RNA и RNA - RNA, но все още не е изяснен в подробности.
Белязаните олигонуклеотиди служат in vitro например при идентифицирането на гении фрагменти, съдържащи се в една генна банка, като с помощта на белязания олигонуклеотид се сондират и се идентифицират посредством блот генни проби на генната банка.
За да могат такива изследвания да се извършват in vivo или in vitro, както вече беше посочено, олигонуклеотидите трябва да бъдат подходящо белязани. Успоредно с радиоактивното белязане чрез подходящи изотопи за нерадиоактивно белязане се използват производни на флуоресциращи багрила, които дават възможност за по-лесна и безопасна работа.
От лит.източник /1/ са известни примери на заместени на 2' или 5' позиция с флуоресциращо багрило маркирани олигонуклеотиди, които са получени от съответните аминозаместени на 2' респективно 5' позиция олигонуклеотиди.
Такава техника е използвана успешно досега за нерадиоактивни участъци от DNA. Тук основно е посочена базираща се на метода на Зангер (2) подготовка за изследването.
Флуоресциращото бележещо вещество се вкарва (3) или на 5' позиция на олигонуклеотида (4), или на нуклеиновата база (5).
Основният недостатък на последния метод се състои в това, че флуоресциращото бележещо вещество се подава по време на синтеза, т.е. по време на полимеризацията, по-специално 5 по време на ензимната полимеризация. Този етап от процеса води до това, че за синтеза могат да се подадат само още няколко полимерази и че поемащата способност на трифосфатите спада по време на полимеризацията, 10 което изисква субстратен излишък.
Въвеждането на флуоресциращо бележещо вещество не се ограничава до поредицата на Зангер. Известна е и химичната поредица на Максам-Жилберт с флуоресциращи беле15 жещи вещества (6).
Аналогично на това е описано и систематизирането на ограничителни участъци с флуоресциращи детектори (7).
Установено е, че флуоресциращо багрило може чрез аминогрупа или тиолова група да се свърже в 3'-(2')-позиция (в а или β положение) на нуклеозид, нуклеотид или олигонуклеотид и това съединение може много добре да се прилага in vivo и in vitro за синтез на срещуположни вериги в присъствието на шаблонна верига или на олигонуклеотиди, а също за откриване на генетичен материал.
Изобретението се отнася до съединение с формула
в която R1 е пуринова база или пиримидинова база, най-малко един от остатъците R2 и R3 означават свързано чрез аминогрупа или тиолова група флуоресциращо багрило в а или β положение, а другият остатък е водород, хидроксилна група, защитна хидроксилна група или метоксигрупа в положение а или/i, η има стойност > 0, R4 е 5' -защитна група или фосфат, пирофосфат, трифосфатЖ5 е кислород, флуорметилен, дифлуорметилен или метилен, R6 означава хидроксилна група или метоксигрупа или водород в положение а или β, като R1, R5 и R6 могат съответно да бъдат еднакви или различни.
Υ и X е кислород, сяра, ΝΗ или метилен, като X и Υ могат съответно да бъдат еднакви или различни.
Съединенията с формула (I) се прилагат за:
а) синтез на срещуположни вериги в присъствието на шаблонна верига,
б) синтез на определени олигонуклеотиди,
в) тяхното определяне in vivo и in vitro и
г) определяне на нуклеинови киселини in vivo и in vitro.
По-нататък изобретението се описва подробно, най-вече в предпочитаните му изпълнения.
В основни линии съединенията на общата формула I се синтезират по познати в литературата методи (8).
За свързването на багрилото в 3'- и/ или 2' позиция се изхожда от съединение с формула II, най-добре нуклеозид:
За взаимодействието се използва съединението от формула II, в която R1 - R6,X,Y и η имат посочените значения, като заместителите могат да бъдат еднакви или различни и R7 или R8 означават водород, хидроксилна група или защитна хидроксилна група или метоксигрупа. Свързването на багрилото става, като вместо хидроксилната група на 3' и 2' позиция се въвежда амино или тиолови групи.
За въвеждането на азида на 3-(2') позиция се въвежда отделяща се група. Като отделяща се група предимно се считат трифлат, или мезилат, или тосилат. Чрез нуклеофилно въздействие с азид, особено с литиев азид, се извършва въвеждането на азида. Нуклеофилното въздействие на тиолати или на S-защитни тиолати дава тиол или защитния тиол.
Желаната стереохимия в захарната част на нуклеозида може да се постигне най-добре чрез заместители Sn 2.
Аминогрупата може просто да се получи от азида и следваща реакция до амин (9). На този етап се предпочита реакцията на Щаудингер с трифенилфосфин и вода (10).
Строежът и конфигурацията на всички съединения са определени чрез NMR, елемен тарен анализ, UV, IR и така нататък.
След завършване на поликондензацията свободната 3'-(2') аминогрупа или тиолова група от захарната част на 3'-края на DNA може да реагира с реактивно флуоресциращо багрило по известен в литературата метод (11).
Аминогрупата се получава алтернативно и чрез реакцията на Митсуноби (12) и съответно чрез описаната от Ямамото (13) реакция.
Взаимодействието на флуоресциращото багрило чрез тиолова група се извършва по аналогичен начин, но вместо азидна група се въвежда тиолова група в защитна и незащитна форма.
Свързването на флуоресциращото багрило със свободната аминогрупа или тиолфункцията на нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида може алтернативно да се извърши едва след използването им. Така например е възможно реакцията на флуоресциращото багрило да се извърши след терминация на поредната реакция на DNA или RNA, като цялата изходна смес се маркира с флуоресциращото багрило.
Като флуоресциращи багрила по принцип могат да се използват всички багрила, които се продават, и които реагират с аминогрупа или тиолова група, предимно Fluoresceine, Rhodamine, Texasrot, NBD (4- флуоро-7-нитробензофуразен от “Сигма”), Coumarine, Fluorescamine, Succinylfluoreszine и Dansyle.
Реакционната смес от различните производни може да се раздели чрез гелелектрофореза и да се идентифицира чрез фотометрия или лазерна спектрометрия (14). Добре приложима се оказва и капилярната електрофореза (15). Определянето тогава се извършва предимно на изхода на капилярите (16).
Изхождайки от едно съединение на формула I, което в позиция 5' има трифосфат, може чрез произволно изходно вещество и шаблонна верига с помощта на полимераза, т.н. ензим, който в присъствието на подходящи субстрати точно синтезира допълнително копие на поредицата, в присъствието на четирите нуклеозидтрифосфата да се извърши синтез на двойна верига DNA, предимно с помощта на полимеразата Т7 или Taq -полимеразата на полимеразата I DNA и на реверсивната транскриптаза. като защитна група 5' са валидни тритил, метокситритил или диметоксит ритил (17).
Терминацията на синтеза може специфично да се определи чрез използването на 3'(2') аминомодифициран нуклеотид A, С, G, Т от формула I. Това е от особено значение за синтеза на срещуположни вериги DNA в присъствието на шаблонна верига, а от тук и за поредицата от вериги DNA, тъй като използването на модифициран нуклеотид гарантира базисноспецифично прекъсване на реакцията.
Синтезът на нуклеозиди RNA, нуклеотиди и олигонуклеотиди се извършва по аналогичен начин.
Освен това е възможен синтез на производни на олигонуклеозидите с помощта на изходен нуклеотид, ксйто е амино- или тиовариран в края 3'(2') и е фиксиран към полимерен носител.
За олигонуклеотиди се считат всички обичайно произведени нуклеотиди DNA и RNA, но предимно с дължина 2 до 100, особено предпочитани са нуклеотидите 12-50 (химичен синтез), респ. с дължина до около 3.000 (ензимен синтез), в зависимост от ефективността на използваната полимераза.
Олигонуклеотидният синтез се извършва, като се изхожда от комплекса начален нуклеотид - носител, по обичайния начин, т.е. в посока 3' и 5', което прави възможен синтеза на олигонуклеотид от дефинирана поредица.
Фиксирането на началния нуклеозид към обичайни носители става чрез съединителна връзка, която след синтеза се разпада, например чрез известното ь литературата свързване на янтарната киселина или чрез свързване с уретан (18).
След извършения синтез олигонуклеотида трябва чрез подходящи реакции да се отдели от носителя. Образуването на производни с произволно флуоресциращо багрило се извършва директно след това.
Така синтезираните и модифицирани в двата края - 3'(2') на олигонуклеотиди могат да бъдат използвани за определяне на допълнителни олигонуклеотиди.
Предимствата на изобретението са следните.
При производството на белязана срещуположна верига едновременно се извършва и прекъсването на веригата чрез намиращия се в крайно положение 3'(2') амино- или тиолмодифициран нуклеотид. Освен това чрез беля зането па същия с флуоресциращо багрило в позиция 3'(2') е възможно безопасно определяне.
При производството на точно дефинирани олигонуклеотиди чрез белязане на прикачен към носител и също така 3’(2’) аминоили тиолмодифициран начален нуклеотид е възможен точен синтез на олигонуклеотид, свързан с възможността за флуоресциращо белязане и следователно за определяне.
Посочените по-долу примери допълнително поясняват изобретението.
1. Аномерни 3’- или 2'-амино- или азидо-нуклеозид-5'-трифосфати
Пример 1. Синтез на 5'-трифосфат-3'амино-3'-дезоксирибозидтимидин;
Схема
Н°-0Т -ро.-^т Ν» Ъ ни/
5'-монофосфат-3'-азидо-3'-дезоксирибозид-тимидин
3'-ацидотимидин (Sigma) (160 mg, 0,6 mmol) се разтваря при разбъркване в 10 ml триетилфосфат. С накапваща фуния при 4°С към разтвора се добавят 0,2 ml РОС13 в 6 ml триетилфосфат. След 24 h се неутрализира с 50 ml наситен разтвор от NaHCO3 и се залива на два пъти с 60 ml толуол и 100 ml етер. Течната фаза се разрежда с дестилирана вода до 500 ml и се пуска на анионообменна колона (Sephadex)А-25; 50 х 2,5 cm), в която чрез въвеждане на 200 ml 0,2 М буфер ТВК (разтвор от триетиламин и бикарбонат, pH 7,5 се саморегулира) и която е заредена с НСО3 като насрещен йон. След това се промива с 300 ml дестилирана вода и елюира първо с 200 ml 0,1 М буфер ТВК, а след това, при линеен градиент от 0,1 - 0,2 М, с буфер ТВК (общ обем на градиента 1350 ml). В хроматограмата се явява пик за продукта. Продуктът елюира при буферна концентрация от 0,12 до 0,15 М (буфер ТВК). DC-позитивните 20 ml фракции се смесват и намаляват обема си лиофилизация. Буферът се отстранява чрез многократно добавяне на етанол. Продуктът се получава във вид на бяла, кристаловидна риетиламониева сол.
Добив: 220 mg (56,2%); MG: 651,81; R, (амоняк: изопропанол: вода=10: 70 : 20): 0,40; 300 NH-'H-NMRiDjO): 1,36 (t,3H, СН3); 1,90 (s, ЗН,СН3); 2,50 (m, 4H, 2’, 2-H); 3,18-3,30 (dd, 2Н, СН2); 4,10 (m, 4'-Н); 4,3 (т,1Н,3'Н); 6,31 (t, 1Н, Г-Н); 7,7 (s,lH,6-H); 11,50 (s, 1H, NH), 300 MH/1 P-NMR (85%-ов H3PO4 D2O): 1,23 (s, IP). 1
5'-триофосфат-3’-азидо-3'-дезоксирибозид-тимидин
5'-монофосфат-3'-азидо-3',2'-дезоксирибозид-тимин като тиретиламониева сол (130 mg, 0,2 mmol) се разтваря в 6 ml abs. DMF (диметилформамид) и при 25°С към разтвора при разбъркване се прибавя Ν,Ν’-карбонилдиимидазол (162,15 mg, 1 mmol) в 3 ml abs. DMF. След 2 h се прибавя 1 ml abs. метанол, разбърква се още 15 min и метанолът се дестилира. Остатъкът се смесва с 5 ml 0,2 М разтвор на три-бутиламониев пирофосфат в DMF и се разбърква в продължение на една нощ при стайна температура. Филтрира се утайката от имидазол-пирофосфат, измива се с 20 ml DMF и филтратът намалява обема си на ротационен изпарител. Остатъкът се разтваря в 250 ml 0,1 М буфер- ТВК и разтворът се пуска на заредена с НСО3 Sephadex А-25 анионообменна колона. Продуктът се пречиства чрез прекарване на 200 ml дестилирана вода и се елюира при линеен градиент от 0 до 0,5 М буфер- ТВК (общ обем на градиента 2.000 ml). На хроматограмата се появяват два пика, от които първият отговаря на монофосфата, а вторият- на получения продукт. Продуктът се елюира при концентрация на буферния разтвор от 0,30 до 0,35 М буфер ТВК. Позитивните 20 ml фракции се смесват и намаляват обема си посредством лиофилизация. Буферът се отстранява чрез многократно добавяне на етанол. Продуктът се получава като бяла кристаловидна триетиламониева сол.
Добив: 92 mg (50,4%); MG: 911,95; Rf (амоняк: изопропанол: вода 10: 70: 20): 0,14; 300 MHt-31P-NMR (85%-ов Н3РО4, D20): -10,74 (d, 2Jw - 22,1 Hz, IP, а -Р-атом): -11,45 (d, 2JW = 21,9 Hz, γ -Р-атом); -22,99 (t, = 20,3
Hz, IP, β -Р-атом).
5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-тимидин
5'-трифосфат-3'-азидо-3’,2'-дезоксирибозид-тимин (68 mg, 0,075 mmol) се разтваря в 5 ml диоксан-дистилирана вода (2:1) и при разбъркване се смесва при стайна температура с трифенилфосфин (200 mg,0,75 mmol). Реакционната смес се разбърква 30 h при 25°С и след това разтворителят се отстранява. Остатакът се разтваря в 30 ml дестилирана вода и се екстрахира три пъти с по 30 ml етер. Течната фаза се разрежда до 150 ml и разтворът се пуска на заредена с НСО3 Sephadex А25 анионообменна колона. Продуктът се пречиства чрез прекарване на 200 ml дестилирана вода и се елюира с линеен градиент от 0 до 0,5 М буфер ТВК (обем на градиента 2.000 ml). Хроматограмата показва три пика, от които първият отговаря на монофосфатното съединение 6, вторият - на продукта и третият на извлечения чрез анализа продукт 7. Продуктът се елюира при концентрация на буферния разтвор от 0,40 до 0,42 М буфер ТВК. Позитивните 25 ml фракции се смесват и намаляват обема си чрез лиофилизация. Буферът се отстранява чрез добавяне на етанол. Продуктът се получава като бяла аморфна триетиламониева сол.
Добив: 57 mg (85,7%); MG: 885,90; Rf(амоняк: изопроп.: вода 10:70:20): 0,08; 300 MHz-‘H-NMR (D20): 1,30 (t,3H,CH3); 1,92 (s, ЗН, CH3); 2,64 (m,4H,2',2-H): 3,19-3,21 (dd, 2H,CH2); 4,26 (m, 1H, 4'-H); 4,41 (m, 1H, 3'H); 6,34 (t, 3JHH = 6,74 Hz, 1H, Г-Н); 7,69 (s, 1H.6-H); 11,50 (s, ΙΗ,ΝΗ).
300 MHz-3,P-NMR (85%-ов H3PO4 външен, D20); -10,75 (d,2Jpp = 22 Hz, 1Ρ;α -Pатом); -11,45 (d,2Jpp = 21,9 Hz, IP, γ -Р-атом); -22,05 (t, = 20Л Hz, IP, ^-Р-атом).
Пример 2. Синтез на 1-(3'-амино-2',3'дидезокси-5'-трифосфат-/? -D-треопентофуранозил) -тимин;
Схема
DMTO-^T ___ОМТЮ-^Т ___ ____ __*F’0“~^yT
ОН
- (3'-азидо-2’,3'-дидезокси-5'-0-диметокситритил- β - D-треопентофуранозил) -тимин
Към разтвор от 5'-диметокситритилтимидин (5,98 g, 11 mmol), трифенилфосфин (3,076 g, 11,73 mmol) и литиев азид (3,1 g, 55 mmol) в 37 ml сух DMF при разбъркване се добавя въглероден четирибромид (11,91 mmol, 4,10 g). Сместа се разбърква 56 h при стайна температура и след това се добавят 15 ml метанол. Следва утаяване на продукта в 800 ml ледено студена дестилирана вода. Утайката се пропива с хлороформ и се пречиства чрез повърхностна хроматография (естер на оцетната киселина: п-хексан = 3:1). Стойност R, хлороформ: метанол 9:1 = 0,52. IR (cnr1): 2100 азид, добив 80%, 4,95 g.
- (3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-0-диметокситритил-/? - О-треопентофураноксил)-тимин
Към разбъркван разтвор от 1-(3'-азидо2',3'-дидезокси-5'-0-диметокситритил- -D-треопентофуранозил)-тимин (0,5 g, 0,8 mmol) се прибавя 0,15 g трифентилфосфин (1,3 g, 4,94 mmol) и се оставя да взаимодейства в продължение на 4 h. За хидролизиране на фосфинимина се прибавя 3 ml дестилирана вода и се разбърква още 3 h. След спиране на разбъркването на разтвора останалото масло се пречиства чрез повърхностна-хроматография (хлороформ: метанол 99: 1+1 % триоетиламин). Стойността на Rf в същия разтворител е 0,27. Чрез третиране с нинхидрин в тънкослойната хроматография аминът може да се обгари във виолетово. Добив 87,5%, 0,42 g. Продуктът показва съответния спектър H-NMR.
Превръщане в 1-(3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-триофосфат- β D-треопентофуранозил) тиамин.
За по-нататъшното превръщане в 5-трифосфат се отстранява диметокситретичната група, аналогично на описаното в (19) и се извършва присъединяване на трифосфата в 5'позиция, както е посочено в пример 1.
Пример 3. Синтез на 3'-амино-2’3'-диде фосфат-аденозин;
Схема
OH ΝΗ,
1Ч4-бензоил-9- (5-0-бензоил-2-дезокси-β -D-трео-пентофуранозил) -аденин
Суспензия от 920 mg (2 mmol) N6,5'-0дибензоил-2'-деоксиаденозин се охлажда до ЗО°С в 30 ml abs. дихлорметан (съдържа 2 ml пиридин) и бавно се накапват 5 ml от разтвор на анхидрид на трифлуорметансулфоновата киселина в дихлорметан (10 об.%). След отстраняване на студената баня разтворът се загрява и се добавя 1 ml вода. След 3 h се прибавя още 5 ml вода и се отмива органичната фаза. След отстраняване на разтворителя остатъкът се разтваря с 50 ml метанол и се прибавя 100 mg натриев бикарбонат. Разбърква се още 2 h при стайна температура, неутрализира се с 10%ова оцетна киселина, разтворителят се дестилира и се пречиства чрез повърхностна хроматография на силикагел (хлороформ: метанол 97:3). Добив 710 mg (1,48 mmol) 75%. Rfстойност хлороформ: метанол 97:34),49. MS “ 459.
3'-азидо-2’,3'-дидезоксиаденозин.
Разтвор от 920 mg (2 mmol) ЬР-бензоил-9-(5-0-бензоил-2-деокси-/1 -D-треопентофуранозил)-аденин се охлажда до 30°С в 20 ml аЬя.дихлорметан ( и 2 ml пиридин). След това се накапват 5 ml (3 mmol) разтвор на анхидрид на трифлуорметансулфоновата киселина в аЬ8.дихлорметан. Студената баня се отстранява, разбърква се още 20 min и към разтвора се прибавя 980 mg (20 mmol) литиев азид в 20 ml DMF. След още 2 h разбъркване при стайна температура се прибавят 50 ml вода и 150 ml хлороформ, органичната фаза се разклаща и се измива с дестилирана вода. Разтворителят се отстранява на ротационен изпарител и в продължение на една нощ се третира с амонячно-метанолов разтвор за отстраняване на основната защитна група. След ново отстраняване на разтворителя се пречиства чрез повърхностна хрпоматография (хлороформ: метанол 95:5) на силикагел. Добив: 430 mg (1,6 mmol, 79%) бял кристаловиден прах. IR:2.100 спт1 азидна група.
3'-амино-2',3'-дидезокси-5'-трифосфатаденозин
Получаването на 5-трифосфата се извършва аналогично на пример 1. След това, както в пример 2, азидът се редуцира до амин.
Пример 4.
Синтез на 3-амино-2',3'-дидезокси-5'триофосфат-гуанозин;
Схема
Получаването на 3'-амино-2,3'-дидезокси-5'-трифосфат-гуанозин се извършва, като се излиза от №-изобутирил-5'-0-бензоил-2'дезоксигуанозин, който може да се получи по метода на Нишино и колектив(20). Превръщането на нуклеозида в 3'-азид се извършва аналогично на посоченото в пример 3. Трябва да се обърне внимание на това, че отпада трети рането с амонячен метанолов разтвор, тъй като отстраняването на изобутирилната защитна група става едва след въвеждането на триофосфатната група и преди редуцирането на азида в амин. Превръщането в триофосфат става и при гуанозин по посочения в пример 1 метод. Редуцирането в амин е описано в пример 2.
2. Синтез на 3'-амино-олигомери и последващо 3'-флуоресциращо белязане
Пример 5.
Синтез на олигомер от 20 нуклеотида 3'-H2N- 1Ш11Ш1Ш111Ш1 -5' се извършва, като се излиза от 5'-диметокситритил защитен 3'-амино-3’-дезокситимидин. Получаването на това съединение протича съгласно описанието в пример 1. При това се излиза от 5'-диметокситритил защитен AZT (азидо-3'-дезоксирибозид-тимидин), който може да се получи от AZT и диметокситритилхлорид по метода на М.Гаит (21).
След това съединението, както е описано в пример 1, се редуцира с трифенилфосфин. Следващият етап е получаването на носещия материал. За целта 200 mg 5'-0-(4,4'-диметокситритил)-3'-амино-3'-дезокси-тимидин се добавят към 700 μ\ abs. пиридин. Към този разтвор се прибавят 45 mg DMAP (диметиламинопиридин) и след това 40 mg анхидрид на янтарната киселина. След престои в продължение на една нощ се хидролизира останалият анхидрид на янтарната киселина чрез прибавяне на 10 μ\ вода. Изпарява се три пъти с толуол и остатъкът се поглъща от 12 ml метиленхлорид, промива се с 4 ml лимонена киселина (10%) и два пъти с по 4 ml вода. Органичната фаза се изсушава чрез натриев сулфат,намалява се обемът на разтворителя и субстанцията се разтваря в 1 ml метиленхлорид. Бавно при разбъркване тази течност се накапва в 30 ml n-хексан. Изсмуква се течността от отделилата се утайка и се изсушава при 40°С във вакуум с маслена помпа. По-нататъшното получаване на носещия материал на база CPG се осъществява съгласно стандартни протоколи и за производството на олигомера от 12 нуклеотида продължава да се работи със стандартния цикъл (22) на ABI 380 А синтезатор DNA по фосфорамидитния метод. След премахване на защитата и отцепване на 3'-аминоолигонуклеотида от носителя той се пречиства сатнадртно и се охарактеризира. По-доб ри резултати могат да се постигнат чрез базисно неустойчиви методи на взаимодействие за прикрепването към носителя. Благоприятна е субституцията на разцепващия се чрез функция на уретана киселинен амид така, както е описано при Ефимов (23).
Пример 6. Синтезът на олигомера от 23 нуклеотида с 3'-аминокрая 3'-H2NACACCCAATTCTGAAAATGGAT-5' се извършва съгласно пример 1. Пречистването и охарактеризирането се извършват по стандартни методи.
Пример 7. Следващото по-долу получаване на производни на олигомерите в 3-аминокрая се извършва с флуоресцеинизотиоцианат. 50 nmol от З-аминоолигонуклеотида се разтварят в съд на Епендорф в 25μ\ на 500 тМ разтвор от кисел натриев карбонат. Добавят се 20 μΐ от 300 mM FITC разтвор (Sigma) в DMSO. Реакцията протича в продължение на 6 h при стайна температура, след което реакционната смес се пречиства чрез промиване с 20 тМ разтвор от амониев ацетат посредством Sephadex G-25 колона. 3-FITCолигомерът се анализира чрез аналитичен ход HPLC, а също чрез флуоресциращ анализ и чрез UV анализ. Резултатите от HPLC се идентифицират и чрез анализи на капилярна гелелектрофореза (фирма Дионекс).
Структурната формула на флуоресцеинизотиоцианат е следната
Пример 8. Двата 3'-аминоолигомера от примерите 1 и 2 се преобразуват по описания в пример 3 метод с родаминов и тетраметилродаминов изотиоцианат. Флуоресциращо белязаните 3'-олигомери се анализират чрез аналитичен ход HPLC и чрез флуоресциращ анализ, а също и чрез UV анализ. Резултатите HPLC също се идентифицират чрез анализи чрез капилярна гелелектрофореза (фирма Дионекс).
Структурните формули на багрилата родаминов и тетраметилродаминов изотиоцианат са следните.
Пример 9. Двата 3'-аминоолигомера от примери 1 и 2 се трансформират с изобразеното производно на кумарина по описания в пример 3 метод. Флуоресциращо белязания 3’-оли- 10 гомер се анализира чрез аналитичен ход HPLC, а също и чрез флуоресциращ анализ и чрез UV анализ. Резултатите HPLC се идентифицират посредством анализи чрез капилярна гелелектрофореза (Фирма Дионекс). 15
Структурната формула на молекулата на багрилото кумарин е следната.
3. Вмъкване на модифицирани нуклеотиди чрез полимерази DNA и анализ на експериментални секвенти.
За проверка на акцептирането на аминотрифосфатите чрез подходящите секвентни ензими са произведени съответни ограничителни разтвори и са тестувани полимеразите (24). При това са анализирани вмъкнатите части и ограничителните свойства на трифосфатите, както по класическия начин, така и чрез белязане с флуоресциращо багрило.
Пример 10. Полученият, както в пример
1,5'-трифосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-ти мидин е заменен с 2',3’-дидезокси-5’-триофосфат-тимидин. Това е извършено при ограни чителните разтвори на всички посочени по-горе полимерази.Изпробвани са съответно еквимоларни, десетократно по-големи и десетократно по-малки dNTP/съотношения на ограничение. Секвенциите са извършени съг ласно стандартни протоколи. При тези изследвания е извършено авторадиографично определяне чрез вмъкване на a -^S-dATP. Става ясно, че а) 3'-амино-нуклеотида действа ограничаващо на използваните ензими, б) вмъква щите части при Т7, Taq и секвенция са иден тични на обичайните дидезокситерминатори и в) в крайна сметка с амино-нуклеотида може да се извърши безпроблемно секвентиране.
Пример 11. Съединението 5’-трифосфат3'-амино-3'-дезоксирибозидтимидин е трансформирано в 5'-триофосфат-3'-амино-3'-дезоксирибозид-3’-Ь1-флуоресцеинизотиоцианат-тимидин чрез флуоресцеинизотиоцианат.
5'-трифосфат-3'-амино-3',2'-дезоксирибозид-тимин (2,5 mg, 2,8 /zmol) се разтваря в съд на Епендорф и 200 μ ml дестилирана вода и се прибавят 200μ11 М прах Na2CO3/NaHCO3 (pH 9).
Изходната смес на реакцията се предпазва от дневна светлина чрез обвивка от алуминиево фолио и със 100 μ\ пипета се прибавя 80 μΐ разтвор от флуоресцеинизотиоционат (10 mg в 1 ml DMF). След 10 min продължителност на реакцията при стайна температура отделеното вещество се превръща количествено в ПС.Пречистването се извършва чрез гелфилтрация.
Колоната Sephadex G-10 се предпазва от светлина чрез обвиване с алуминиево фолио, след това изходната смес на реакцията се нанася върху колоната и се елюира с поток от 1 ml/min с вода. Хроматограмата показва два пика. Първият пик отговаря на продукта, а вторият - на нереагиралото багрило. Количеството на фракциите възлиза на 5 ml, като общо се получават 24 фракции. Въз основа на хроматограмата фракция 4 се оказва положителна. Това се потвърждава от DC. Разтворителят намалява обема си посредством лиофилизиране и субстанцията се поставя при -80°С. Добив 3,32 mg (93%); MG: 1.274,32; R( (амоняк: изопропанол: вода 10 : 70:60:): 0,62; спектър на флуоресциращото излъчване: Дължината на вълните иа подаваната светлина е около 420 nm. Максималното излъчване на съединението е около 514,8 nm. Изследван е разтвор на 2,5 mM в дестилирана вода. Максимумът на излъчване на разтвор от 2,5 mM на багрило без наличие на производни в дестилирана вода има дължина на вълната от 519,4 nm.
Произведеният 5'-трифосфат-3'-амино3'-дезоксирбиозид-3-флуоресцеинизотиоцианат-тимидин е заменен с 2’3'-дидеозокси-5трифосфат-тимидин. Това е извършено при ограничителните разтвори на всички посочени по-горе полимерази. Изпробвани са съот50 ветно еквимоларни, десетократно по-големи и десетократно по-малки съотношения dNTP/ ограничител. Секвенцията е извършена съгласно стандартни протоколи. При тези изследвания е извършена авторадиографично определяне чрез вмъкване на алфа-55 dATP. Става ясно, че а) 3'-флуоресциращо белязаният нуклеотид действа ограничително на използваните ензими, б) вмъкващите части при Т7, Taq и секвенция въз основа на изискващите стеричност остатъци от багрило са идентични на обичайните дидезоксиограничители при десетократно по-високи концентрации и в) с 3'флуоресциращо белязания ограничител може да се извърши безпроблемна секвенция.
Пример 12. Полученият 5'-трифосфат3'-амино-3'-дезоксирибозид-3'-М-флуоресцинизотиоцианат-тимидин е заменен с 2',3'-дидезокси-5'-трифосфат-тимидин. Това е извършено при ограничителните разтвори на полимеразите Т7 и Taq. Заложени са десетократно по-големи съотношения dNTP/ограничител. Секвенциранията са извършени съгласно стандартни протоколи. При тези изследвания не е използвано вмъкване на алфа-35Б^АТР и анализът на секвенцията е извършен успешно с 3'-флуоресциращо белязания ограничител чрез DNA-секвентор.
Пример 13. Синтез на 5'-трифосфат-3'тио-З-дезоксирибозид-тимидин
Схема
SSl SBi SH
5'-0-диметокситритил-3'-8-бензоил-тиотимидин
Вмъкването на сярата в 3'-позиция става чрез субституцията на една изходяща група (мезилат) с натриев тиобензоат.
Синтезът на натриев тиобензоат се извършва чрез прибавяне на 10 М NaOH в ледено изстуден разтвор от тиобензоена киселина (10 g) във вид 15 ml, докато разтворът е алкален. След това стойността pH се коригира до pH 7 с воден разтвор на тиобензоена киселина, охлажда се до -5°С и разтворът се филтрира, за да се отстранят твърдите остатъци. След отстраняване на водата чрез ротационен изпарител с етанол жълтата сол се изсушава под вакуум чрез фосфорпентоксид.
Разтвор от 5'-0-диметокситритил-3'-0метансулфонил-2'-деоксиксило-тимидин (8,45 mmol) (25) и натриев тиобензоат (33 mmol) в DMF (30 ml) се разбърква 4 h при 100°C. Изходната течност се извлича с дихлорметан и органичната фаза се измива с наситен разтвор на NaHCO3 и наситен разтвор от NaCl. След изсушаване на органичната фаза чрез натриев сулфат два пъти се изпарява с толуол и масленият суров продукт се пречиства чрез повърхностна хроматография (силикагел 60 Н, хлороформ /метаноло-10%).
Добив: 60%, продуктът има очаквания спектър Ή-NMR.
Защитната група 5'-диметокситритил се отцепва за фосфитилирането в 5'-позиция по известни в литературата методи (26). След това 5-трифосфат се получава по метода на Екщайн и Лудвиг (27) със салицилфосфорхлоридит (Алдрих) и при третиране с пирофосфат. Толуолът се отделя чрез реакция с 10 М NaOH в наситен с аргон етанол (28).
3'-тио-5'-трифосфат-тимидин е свързан по метода от пример 8 с йодацетамидфлуоресцеин и при това се получава флуоресциращо белязаният тионуклеотид с 80%-ов добив.
Пример 14. Синтез от 1-(3'-тио-2’-,3'дидеокси-5'-трифосфат —треопентофуранозил)-тимин
Схема:
DMTiO
OMs
т
Излизайки от 5'-ОМТг-0-,3'-0-месил-тимидин се замества с натриев тиобензоат, както е описано в пример 14. След това се отцепва 5' защитна група, вмъква се 5'-трифосфатът, освобождава се толуолът и се свързва йодацетамидфлуоресцеинът, аналогично на посоченото в пример 14.
Пример 15. Синтез на олигомер от 10 нуклеотида У-β -Η2Ν- ГП ПГ Ш Т-5.
Синтезът на олигомер У-β -Η2Ν- ПГ ΠΙ ПГ Т-5 се извършва, като се излиза от 1-(3'амино-2'-,3'-дидеокси-5'-ОМТг- β D-треопентофуранозил) -тамин, който по описания в пример 6 метод се превръща в материал-носител за фосфорамидитния метод. Следващото флуоресциращо белязане на 3'- Д-амино-олигонуклеотид с флуоресцеинизотиоцианат се извършва, съгласно пример 8.

Claims (6)

1. 3'-(2')-амино и тиолмодифицирани нуклеозиди, нуклеотиди и олигонуклеотиди с формула в която R1 е пуринова или пиримидинова база, най-малко един от остатъците R2 и R3 е флуоресциращо багрило в а или β позиция, свързано чрез аминогрупа или тиолова група, а другият остатък, в даден случай означава водород, хидроксилна група, защитна хидроксилна или метоксигрупа в положение а или β , ,а η има стойност 2: 0, R4 - 5'-защитна група или фосфат, пирофосфат или трифосфат, R5 кислород, флуорметилен, дифлуорметилен или метилен, R6 - хидроксилна или метоксигрупа или водород в позиция а или β, като R’,R5 и R* могат съответно да имат еднакви или различни значения, Y и X могат да бъдат еднакви или различни и означават кислород, сяра,Ь1Н или метилен.
2. Метод за получаване на съединението с формула I съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че намиращата се в 3' и/или 2' позиция ОН група на нуклеозида, нуклеотида или олигонуклеотида се заменя с аминогрупа или тиолова група, с последващо свързване с флуоресцентно багрило.
3. Метод за получаване на съединението с формула I съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че в съединението с формула в която R1 до R6, X, Υ,η п имат посочените по-горе значения, като R‘,R5 и R6 могат да имат еднакви или различни значения, a R7 или R’ означават водород, хидроксилна или защитна хидроксилна или метоксигрупа,
а) в 3- и/или 2-позиция чрез нуклеофилно въздействие се въвежда азид или тиол в защитена или незащитена форма и азидът се редуцира в амин и
б) флуоресциращото багрило се свързва чрез аминогрупа, респ. чрез тиолгрупа.
4. Метод съгласно претенция 3, характеризиращ се с това, че като флуоресциращи багрила се използват флуоресцини, родамини, тексаско червено, NBD, кумарин, флуоресцамини, сукцинилфлуоресцини и дансил.
5. Приложение на съединението с формула I, съгласно претенция 1
а) за синтез на RNA и DNA нуклеозиди, нуклеотиди и олигонуклеотиди и
б) за флуоресциращо микроскопичното и макроскопичното определяне in vivo и in vitro.
6. Приложение на съединението с формула I съгласно претенция 1.
а) за синтез на срещуположни вериги в присъствието на шаблонна верига и
б) за синтез на олигонуклеотиди.
BG95575A 1990-12-11 1991-12-04 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им BG61484B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4039488 1990-12-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG95575A BG95575A (bg) 1993-12-24
BG61484B1 true BG61484B1 (bg) 1997-09-30

Family

ID=6420050

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG95575A BG61484B1 (bg) 1990-12-11 1991-12-04 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им

Country Status (27)

Country Link
US (3) US5679785A (bg)
EP (1) EP0490281B1 (bg)
JP (1) JP3140127B2 (bg)
KR (1) KR920012107A (bg)
AT (1) ATE142222T1 (bg)
AU (1) AU643856B2 (bg)
BG (1) BG61484B1 (bg)
BR (1) BR9105335A (bg)
CA (1) CA2057475A1 (bg)
CS (1) CS374391A3 (bg)
DE (1) DE59108143D1 (bg)
DK (1) DK0490281T3 (bg)
ES (1) ES2093671T3 (bg)
FI (1) FI915779A (bg)
GR (1) GR3021041T3 (bg)
HU (1) HUT60505A (bg)
IE (1) IE75726B1 (bg)
IL (1) IL100298A (bg)
MX (1) MX9102468A (bg)
NO (1) NO914859L (bg)
NZ (1) NZ240900A (bg)
PL (1) PL168874B1 (bg)
PT (1) PT99747A (bg)
RO (1) RO111575B1 (bg)
RU (1) RU2073682C1 (bg)
TR (1) TR27715A (bg)
YU (1) YU187991A (bg)

Families Citing this family (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5476925A (en) * 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5726297A (en) * 1994-03-18 1998-03-10 Lynx Therapeutics, Inc. Oligodeoxyribonucleotide N3' P5' phosphoramidates
US5965720A (en) * 1994-03-18 1999-10-12 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'→P5' phosphoramidates
US5599922A (en) * 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
DE4418691A1 (de) * 1994-05-28 1996-02-22 Boehringer Mannheim Gmbh 3'-(4'-) nicht-radioaktiv markierte Nukleoside und Nukleotide mit Aminocarbonsäure-, Peptid- oder Carbonsäure-Spacer
US5962271A (en) * 1996-01-03 1999-10-05 Cloutech Laboratories, Inc. Methods and compositions for generating full-length cDNA having arbitrary nucleotide sequence at the 3'-end
US5859233A (en) * 1996-02-21 1999-01-12 Lynx Therapeutics, Inc. Synthons for synthesis of oligonucleotide N3-P5 phosphoramidates
US5684143A (en) * 1996-02-21 1997-11-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligo-2'-fluoronucleotide N3'->P5' phosphoramidates
US6017702A (en) * 1996-12-05 2000-01-25 The Perkin-Elmer Corporation Chain-termination type nucleic acid sequencing method including 2'-deoxyuridine-5'-triphosphate
DE19741084A1 (de) * 1997-09-18 1999-03-25 Knoell Hans Forschung Ev Hochaffine Nukleinsäuremoleküle mit funktionellen Gruppen zur spezifischen Erkennung von Zielmolekülen, ihre Herstellung und Verwendung
US6289229B1 (en) 1998-01-20 2001-09-11 Scimed Life Systems, Inc. Readable probe array for in vivo use
US6184347B1 (en) 1998-11-19 2001-02-06 Agilent Technologies Inc. Minimization of blooming in high-density arrays by using reactive wash reagents
US6761877B2 (en) * 2000-02-18 2004-07-13 Biocrystal, Ltd. Functionalized encapsulated fluorescent nanocrystals
AU2001294859A1 (en) 2000-09-29 2002-04-08 Molecular Probes, Inc. Modified carbocyanine dyes and their conjugates
US7563618B2 (en) 2001-03-23 2009-07-21 Geron Corporation Oligonucleotide conjugates
KR100762261B1 (ko) 2001-04-27 2007-10-04 (주)바이오니아 전장 상보 디옥시리보핵산 제조 방법과 이에 사용되는앵커와 프라이머
US7214428B2 (en) * 2001-09-17 2007-05-08 Invitrogen Corporation Highly luminescent functionalized semiconductor nanocrystals for biological and physical applications
US7205048B2 (en) * 2001-09-17 2007-04-17 Invitrogen Corporation Functionalized fluorescent nanocrystal compositions and methods of making
AU2002365124A1 (en) 2001-09-17 2003-07-09 Biocrystal, Ltd. Nanocrystals
WO2004055160A2 (en) * 2002-12-13 2004-07-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
JP4177123B2 (ja) * 2003-01-10 2008-11-05 富士通株式会社 配線図形検証方法、プログラム及び装置
JP4782668B2 (ja) 2003-03-31 2011-09-28 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 日本脳炎ウィルス血清グループのメンバーを包含する一定のフラビウィルスを検出するための組成物及び方法
US7160537B2 (en) * 2003-12-15 2007-01-09 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Method for preparing radiolabeled thymidine having low chromophoric byproducts
US20050131224A1 (en) * 2003-12-15 2005-06-16 Cti Pet Systems, Inc. Method for preparing radiolabeled thymidine
US7939251B2 (en) 2004-05-06 2011-05-10 Roche Molecular Systems, Inc. SENP1 as a marker for cancer
US20060172133A1 (en) * 2004-08-17 2006-08-03 Imad Naasani Synthesis of highly luminescent colloidal particles
WO2007001438A2 (en) * 2004-10-29 2007-01-04 Molecular Probes, Inc. Functionalized fluorescent nanocrystals, and methods for their preparation and use
US20090118132A1 (en) * 2004-11-04 2009-05-07 Roche Molecular Systems, Inc. Classification of Acute Myeloid Leukemia
US7541144B2 (en) * 2005-01-31 2009-06-02 Agilent Technologies, Inc. RNA labeling method
CA2596496A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Agencourt Bioscience Corp. Reagents, methods, and libraries for bead-based sequencing
US7544471B2 (en) * 2005-07-30 2009-06-09 Agilent Technologies, Inc. Preparing RNA from a wax-embedded tissue specimen
US7700289B2 (en) * 2006-04-03 2010-04-20 Agilent Technologies, Inc. Method for labeling RNA
EP2007907A2 (en) * 2006-04-19 2008-12-31 Applera Corporation Reagents, methods, and libraries for gel-free bead-based sequencing
US7572585B2 (en) * 2006-07-31 2009-08-11 Agilent Technologies, Inc. Enzymatic labeling of RNA
CN102443030B (zh) * 2006-12-05 2015-12-16 激光基因公司 光可断裂的标记核苷酸和核苷与标记的核苷酸和核苷以及其在dna测序中的使用方法
EP2185726B1 (en) 2007-08-06 2014-01-08 Orion Genomics, LLC Novel single nucleotide polymorphisms and combinations of novel and known polymorphisms for determining the allele-specific expression of the igf2 gene
CA2639416C (en) 2007-09-11 2019-12-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Diagnostic test for susceptibility to b-raf kinase inhibitors
US20090191553A1 (en) * 2007-10-01 2009-07-30 Applied Biosystems Inc. Chase Ligation Sequencing
US20100086914A1 (en) * 2008-10-03 2010-04-08 Roche Molecular Systems, Inc. High resolution, high throughput hla genotyping by clonal sequencing
JP5748672B2 (ja) 2009-02-11 2015-07-15 オリオン ゲノミクス エルエルシー Ｉｇｆ２の対立遺伝子特異的な発現を判定するための多型の組み合わせ
US8431416B2 (en) 2009-04-01 2013-04-30 Becton, Dickinson And Company Reactive heterocycle-substituted 7-hydroxycoumarins and their conjugates
JP5730311B2 (ja) * 2009-08-31 2015-06-10 プロメガ コーポレイションＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ 反応性シアニン化合物
WO2011128096A1 (en) 2010-04-16 2011-10-20 Roche Diagnostics Gmbh Polymorphism markers for predicting response to interleukin-6 receptor-inhibiting monoclonal antibody drug treatment
ES2647612T3 (es) 2010-06-04 2017-12-22 Chronix Biomedical Biomarcadores de ácidos nucleicos en circulación asociados al cáncer de próstata
US8623324B2 (en) 2010-07-21 2014-01-07 Aat Bioquest Inc. Luminescent dyes with a water-soluble intramolecular bridge and their biological conjugates
PL2768985T3 (pl) 2011-10-21 2019-10-31 Chronix Biomedical Biomarkery będące krążącymi kwasami nukleinowymi związane z rakiem jelita grubego
ES2413566B1 (es) 2011-12-14 2014-05-20 Fundación Pública Andaluza Progreso Y Salud Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y pronóstico de la hipoacusia neurosensorial.
CN104619894B (zh) 2012-06-18 2017-06-06 纽亘技术公司 用于非期望核酸序列的阴性选择的组合物和方法
WO2014093825A1 (en) 2012-12-14 2014-06-19 Chronix Biomedical Personalized biomarkers for cancer
WO2014194113A2 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Chronix Biomedical Detection and quantification of donor cell-free dna in the circulation of organ transplant recipients
US10570443B2 (en) 2014-10-01 2020-02-25 Chronix Biomedical Methods of quantifying cell-free DNA
WO2017172608A1 (en) 2016-03-28 2017-10-05 Aat Bioquest, Inc. Polyfluoreno[4,5-cde]oxepine conjugates and their use in methods of analyte detection
US11220628B2 (en) 2019-02-20 2022-01-11 Aat Bioquest, Inc. Condensed polycyclic conjugated polymers and their use for biological detection
US20230131000A1 (en) 2020-01-30 2023-04-27 Aat Bioquest, Inc. UV Excitable Polyfluorene Based Conjugates and Their Use in Methods of Analyte Detection
WO2023147355A2 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 Oregon Health & Science University Methods and systems for increasing capture potential of a spatial array

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5015733A (en) * 1983-12-20 1991-05-14 California Institute Of Technology Nucleosides possessing blocked aliphatic amino groups
US4849513A (en) * 1983-12-20 1989-07-18 California Institute Of Technology Deoxyribonucleoside phosphoramidites in which an aliphatic amino group is attached to the sugar ring and their use for the preparation of oligonucleotides containing aliphatic amino groups
EP0267996A1 (en) * 1986-11-20 1988-05-25 Tamir Biotechnology Ltd. New nucleotide derivatives
GB2236852B (en) * 1989-09-25 1994-04-06 Scotgen Ltd DNA probe based assays and intermediates useful in the synthesis of cleavable nucleic acids for use in such assays
US5227487A (en) * 1990-04-16 1993-07-13 Molecular Probes, Inc. Certain tricyclic and pentacyclic-hetero nitrogen rhodol dyes
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US5659025A (en) 1997-08-19
MX9102468A (es) 1992-06-01
PT99747A (pt) 1992-11-30
IE75726B1 (en) 1997-09-24
JP3140127B2 (ja) 2001-03-05
FI915779A0 (fi) 1991-12-09
CA2057475A1 (en) 1992-06-12
CS374391A3 (en) 1992-06-17
EP0490281A1 (de) 1992-06-17
GR3021041T3 (en) 1996-12-31
IL100298A0 (en) 1992-09-06
AU643856B2 (en) 1993-11-25
FI915779A (fi) 1992-06-12
TR27715A (tr) 1995-06-22
EP0490281B1 (de) 1996-09-04
ATE142222T1 (de) 1996-09-15
NZ240900A (en) 1994-07-26
IE914301A1 (en) 1992-06-17
US5679785A (en) 1997-10-21
PL292701A1 (en) 1992-09-21
ES2093671T3 (es) 1997-01-01
YU187991A (sh) 1994-09-09
DE59108143D1 (de) 1996-10-10
HUT60505A (en) 1992-09-28
RU2073682C1 (ru) 1997-02-20
US5668269A (en) 1997-09-16
IL100298A (en) 1997-03-18
HU913885D0 (en) 1992-02-28
KR920012107A (ko) 1992-07-25
NO914859D0 (no) 1991-12-10
NO914859L (no) 1992-06-12
BG95575A (bg) 1993-12-24
DK0490281T3 (bg) 1997-02-10
BR9105335A (pt) 1992-08-25
PL168874B1 (pl) 1996-04-30
AU8892791A (en) 1992-06-18
JPH04290896A (ja) 1992-10-15
RO111575B1 (ro) 1996-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG61484B1 (bg) 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им
EP0135587B2 (en) Defined sequence single strand oligonucleotides incorporating reporter groups, process for the chemical synthesis thereof, and nucleosides useful in such synthesis
US7741472B2 (en) Polynucleotide containing a phosphate mimetic
WO2008037568A2 (en) Reversible terminators for efficient sequencing by synthesis
JPH0812698A (ja) インビトロにおけるオリゴヌクレオチド合成法
EP2125856A2 (en) Photocleavable labeled nucleotides and nucleosides and labeled nucleotides and nucleosides and methods for their use in dna sequencing
JPH0359914B2 (bg)
JP2562862B2 (ja) 鋳型依存性酵素的核酸合成用プライマーとしてのオリゴヌクレオチド同時合成および直接標識化のための機能性担体
EP3004131B1 (en) Phosphoramidite building blocks for sugar-conjugated oligonucleotides
JPH03505209A (ja) 標的付与されたオリゴヌクレオチド類の合成に使用できるヌクレオシド誘導体類、これ等誘導体類から得たオリゴヌクレオチド類及びそれ等の合成
US5864031A (en) Process for preparing 5-dithio-modified oligonucleotides
WO2007059912A1 (en) Polynucleotide labelling reagent
CN115181147A (zh) C4′-三氟甲硫基修饰核苷和c4′-三氟甲硫基修饰核酸的制备方法
Stolze et al. Synthesis of 3′‐Sugar‐and Base‐Modified Nucleotides and Their Application as Potent Chain Terminators in DNA Sequencing
WO2023054391A1 (ja) 核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法及び二本鎖ｄｎａの製造装置
WO2021020561A1 (ja) プライマー及びこれを用いた二本鎖ｄｎａの製造装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法
Schoetzau et al. Synthesis of a fluorescent derivative of 6-N-[N-(6-aminohexyl) carbamoyl)-2′, 3′-dideoxyadenosine 5′-triphosphate for detection of nucleic acids
JPS6299392A (ja) 新規リボヌクレオシド誘導体およびその用途