WO2023054391A1 - 核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法及び二本鎖ｄｎａの製造装置 - Google Patents

核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法及び二本鎖ｄｎａの製造装置 Download PDF

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WO2023054391A1
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cleaved
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dna
double
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洋 阿部
雅仁 稲垣
文貴 橋谷
陽花 平岡
奈保子 阿部
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国立研究開発法人科学技術振興機構
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a method for cleaving a nucleic acid chain, a device for cleaving a nucleic acid chain, a method for producing double-stranded DNA, and an apparatus for producing double-stranded DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Amplification products of template DNA amplified by PCR are blunt-ended as they are, and need to be ligated to host DNA such as plasmid DNA.
  • the 3'-end and 5'-end of the amplification product are used as sticky ends (also called sticky ends, protruding ends, etc.), and the host side also forms sticky ends in the same way, and the two are ligated to construct a vector.
  • one strand of the double-stranded DNA must be cut at the desired position to create an overhang in the DNA strand.
  • 3′-S - Oligonucleotides containing phosphorothiolate linkages were prepared in an automatic DNA synthesizer, the strand containing the 3'-S-phosphorothiolate linkage was chemically cleaved specifically at this site using Ag + (Abstract).
  • Non-Patent Document 1 uses silver ions (Ag + ) as a cleaving agent for cleaving single-stranded DNA. Since silver ions have a positive charge, they electrostatically interact with negatively charged functional groups such as DNA phosphate groups and nucleobase moieties, resulting in aggregate formation due to non-specific interactions. However, the yield of the target DNA was low.
  • the inventors have conducted extensive research to solve the above problems. As a result, the inventors found that the use of metal nanoparticles instead of metal ions as a cleaving agent improves the efficiency of cleaving the nucleic acid to be cleaved and increases the recovery rate of the target nucleic acid, thus completing the present invention.
  • NucA is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved
  • NucB is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the portion on the 3′-terminal side with reference to X.
  • the nucleic acid preparation step is characterized by synthesizing part or all of the nucleic acid to be cleaved by a phosphoramidite method using an amidite reagent represented by the following formulas (3) and (4) [ 1].
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium
  • DMTr represents a dimethoxytrityl group.
  • nucleic acid preparation step a part of the nucleic acid to be cleaved is synthesized by a phosphoramidite method as a primer, and a template DNA having a sequence complementary to the nucleic acid to be cleaved is used as a template to perform multiple polymerase chain reactions.
  • nucleic acid preparation means for preparing a nucleic acid to be cleaved having a structure represented by the following formula (1); a cleaving means for reacting the nucleic acid to be cleaved with a cleaving agent to cleave the nucleic acid to be cleaved at X in the formula (1) to generate a nucleic acid having a structure represented by the following formula (2); with A nucleic acid chain cleaving device, wherein the cleaving agent is a metal nanoparticle containing an atom selected from the group consisting of silver, mercury and cadmium. (Here, B represents a base, and X represents sulfur or selenium.
  • NucA is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and is on the 5′ end side with respect to X.
  • NucB is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the portion on the 3′ end side based on the X.
  • the nucleic acid preparation means is characterized by synthesizing part or all of the nucleic acid to be cleaved by a phosphoramidite method using an amidite reagent represented by the following formulas (3) and (4) [ 8].
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium
  • DMTr represents a dimethoxytrityl group.
  • a method for producing double-stranded DNA for producing double-stranded DNA having cohesive ends comprising: A double-stranded DNA to be cleaved, comprising a sense strand and an antisense strand having a sequence complementary to the sense strand, wherein at least one of the sense strand and the antisense strand is represented by the following formula (1) a double-stranded DNA preparation step of preparing a double-stranded DNA to be cleaved having a structure shown; The double-stranded DNA to be cleaved is reacted with a cleaving agent to cleave the sense strand and/or the antisense strand at X in the formula (1) to have a structure represented by the following formula (2).
  • a method for producing double-stranded DNA wherein the cleaving agent is a metal nanoparticle containing an atom selected from the group consisting of silver, mercury and cadmium.
  • the cleaving agent is a metal nanoparticle containing an atom selected from the group consisting of silver, mercury and cadmium.
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium.
  • NucA is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and is on the 5′ end side with respect to X.
  • NucB is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the portion on the 3′ end side based on the X.
  • a double-stranded DNA to be cleaved comprising a sense strand and an antisense strand having a sequence complementary to the sense strand, wherein at least one of the sense strand and the antisense strand is represented by the following formula (1)
  • double-stranded DNA preparation means for preparing a double-stranded DNA to be cleaved having a structure shown;
  • the double-stranded DNA to be cleaved is reacted with a cleaving agent to cleave the sense strand and/or the antisense strand at X in the formula (1) to have a structure represented by the following formula (2).
  • cleaving agent is a metal nanoparticle containing an atom selected from the group consisting of silver, mercury and cadmium.
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium.
  • NucA is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and is on the 5′ end side with respect to X.
  • NucB is composed of at least one nucleotide, is part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the portion on the 3′ end side based on the X.
  • double-stranded DNA to be cleaved has a plurality of structures represented by the formula (1), and the number of nucleotides between each structure is 10 or less; double-stranded DNA manufacturing apparatus.
  • nucleic acid chain scission method and a nucleic acid chain scission device with good cleavage efficiency and high recovery rate of the target nucleic acid. Further, according to the present invention, it is possible to provide a method for producing a double-stranded DNA and an apparatus for producing a double-stranded DNA, in which the formation efficiency of the cohesive ends is high and the yield of the double-stranded DNA having the desired cohesive ends is high. It becomes possible.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing an overview of a nucleic acid chain cleavage reaction using metal nanoparticles and a reaction of preparing and ligating double-stranded DNA having cohesive ends.
  • FIG. 1 shows synthesis of oligonucleotides with 3′-thiophosphate linkages using a thiolated amidite reagent and analysis results by reversed-phase HPLC and MALDI-TOF-MS. It is a figure which shows the result of examination of the DNA strand cleavage reaction by silver nanoparticle treatment, and silver nanoparticle size, reaction time, and reaction temperature dependence. It is a figure which shows the result of the DNA strand scission
  • FIG. 1 shows synthesis of oligonucleotides with 3′-thiophosphate linkages using a thiolated amidite reagent and analysis results by reversed-phase HPLC and MALDI-TOF-MS. It is
  • FIG. 10 shows the results of preparation of 3′ overhang cohesive ends by treating double-stranded short-stranded DNA with silver nanoparticles.
  • FIG. 10 shows the results of PCR studies when thiolated oligonucleic acid was introduced into a DNA template. Schematic representation of DNA amplification by PCR and preparation of adherent fragments by BsaI or silver nanoparticle treatment. It is a diagram showing the results of a ligation experiment of adhesive fragments using T4 DNA ligase.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of thiolated oligonucleic acid chain cleavage by silver nitrate treatment, which is an existing technique.
  • FIG. 10 shows the results of preparation of 3′ overhang cohesive ends by treating double-stranded short-stranded DNA with silver nanoparticles.
  • FIG. 2 is a diagram showing molecular weight analysis results by MALDI-TOF-MS of cleavage products in thiolated oligonucleic acid chain cleavage by silver nitrate treatment, which is an existing technique.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of examining thiolated oligonucleic acid chain cleavage by silver nitrate treatment and removal of silver ions by addition of thiols, which are existing techniques.
  • Fig. 2 shows removal of silver nanoparticles by centrifugation (nanoparticle size dependence). Comparison of silver nitrate treatment and silver nanoparticle treatment in thiolated oligonucleic acid strand cleavage.
  • Lane 1 is a diagram showing the result of electrophoresis of DNA (15mer) 5'-CACATTAATTGCGTT-FAM-3' having the same base length as DNA generated after cleavage.
  • FIG. 4 shows that surface PEG modification of silver nanoparticles improves dispersibility.
  • FIG. 4 shows that surface PEG modification improved the dispersibility of silver nanoparticles.
  • FIG. 3 shows the sequence design of DNA ligation reaction using silver nanoparticles to generate cohesive ends by DNA strand scission.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of examining optimization of coupling conditions in dimer model synthesis aiming at improving reaction conditions for 3′-thiolated amidites. Fig.
  • FIG. 3 is an experimental result showing the effect of reaction time when using 0.25 M BTTH (13 equivalents) in dimer model synthesis.
  • FIG. 2 is a diagram showing a presumed mechanism of side reactions in coupling reactions clarified in dimer model synthesis. The results of applying the optimized reaction conditions for dimer synthesis to oligo DNA synthesis and improving the conditions are shown.
  • FIG. 10 shows the results of synthesizing an oligo DNA (sequence: 5'-TAA TsCATTAATTGCGTT-FAM-3') examined for synthesis under optimized coupling conditions.
  • FIG. 2 shows the result of synthesizing a 51-base-long oligo DNA (5'-ATGAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3') into which three 3' thiophosphate bonds were introduced.
  • FIG. 4 shows sequences of primer DNAs for PCR into which 4 and 2 3′-thiophosphate bonds have been introduced and the synthesis results thereof.
  • FIG. 10 shows the results of synthesis of 3'-thiophosphorylated oligo DNA (5'-TAACAs CACATTAATTGCGTT-FAM-3') synthesized using 3'-thiolated amidite adenosine derivatives.
  • FIG. 10 shows the results of examining the adjustment of 3'-overhang cohesive ends by cleaving 3'-thiophosphate-bound DNA containing an adenosine analogue with silver nanoparticles.
  • FIG. 2 shows experimental designs and sequences for cohesive-end adjustment and ligation when using primers into which multiple modifications have been introduced.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing adhesive end adjustment and ligation reaction using multiple modified introduction primers, and a diagram showing the results of agarose electrophoresis of PCR products. It is the result of comparing the ligation efficiency with the ligation of 34-base-long sticky-end DNAs obtained by cleaving a PCR amplification product at multiple sites.
  • the method for cleaving a nucleic acid strand of the present invention comprises a nucleic acid preparation step of preparing a nucleic acid to be cleaved having a structure represented by the following formula (1), and reacting the nucleic acid to be cleaved with a cleaving agent to obtain X of formula (1).
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium.
  • NucA is composed of at least one nucleotide, is a part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the part on the 5′ end side with respect to X.
  • NucB is composed of at least one nucleotide, is a part of the nucleic acid to be cleaved, and represents the part on the 3′ end side with reference to X.
  • base B specifically includes adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil, N-methyladenine, N-benzoyladenine, 2-methylthioadenine, 2-aminoadenine, 7-methylguanine, N-iso butyrylguanine, 5-fluorocytosine, 5-bromocytosine, 5-methylcytosine, 4-N-methylcytosine, 4-N,N-dimethylcytosine, 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, or 5,6-dihydrouracil and the like can be mentioned.
  • the cleaving agent is a metal nanoparticle containing atoms selected from the group consisting of silver, mercury and cadmium. Silver is particularly preferred as the cleaving agent from the viewpoints of low toxicity and low cost.
  • X in formula (1) of the nucleic acid to be cleaved is preferably sulfur.
  • the average particle size of the metal nanoparticles is preferably 100 nm or less, more preferably 50 nm or less, and particularly preferably 20 nm or less, from the viewpoint of high efficiency of cleaving the target nucleic acid.
  • the lower limit of the average particle size of the metal nanoparticles is not particularly limited, but is, for example, 0.1 nm or more, preferably 0.5 nm or more, and more preferably 1 nm or more.
  • the metal nanoparticles are preferably surface-treated with polyethylene glycol to bind polyethylene glycol to the surface.
  • polyethylene glycol By bonding polyethylene glycol to the surface of the metal nanoparticles, the oxidation of the surfaces of the metal nanoparticles is prevented and the dispersibility of the metal nanoparticles in the aqueous solution is improved. Therefore, compared with metal nanoparticles not surface-treated with polyethylene glycol, the metal nanoparticles surface-treated with polyethylene glycol have improved cleaving activity for nucleic acids to be cleaved.
  • Polyethylene glycol can be conjugated to metal nanoparticles using terminal thiol modifications.
  • the average molecular weight of polyethylene glycol is preferably in the range of 1,000 to 10,000.
  • FIG. 1 Nucleic acid chain cleavage reaction by metal nanoparticles [Step_1]”) schematically shows the nucleic acid chain cleavage method of the present invention.
  • X in formula (1) is sulfur
  • the cleaving agent is silver nanoparticles
  • the nucleic acid to be cleaved thiolated oligonucleic acid
  • the invention is not so limited.
  • the target nucleic acid can be cleaved by the same mechanism.
  • the nucleic acid preparation step is a step of preparing a nucleic acid to be cleaved having a structure represented by formula (1).
  • amidite reagents represented by the following formulas (3) and (4) can be used to synthesize part or all of the nucleic acid to be cleaved by the phosphoramidite method.
  • B represents a base
  • X represents sulfur or selenium
  • DMTr represents a dimethoxytrityl group.
  • the amidite reagent represented by formula (3) (thioated amidite reagent or selenized amidite reagent) can be synthesized by the following method. First, a nucleoside derivative is prepared in which the amino group of a base is protected with an amide bond and the 5' carbon is protected with a dimethoxytrityl group (DMTr group) or a tert-butyldimethylsilyl group (TBDMS group).
  • DMTr group dimethoxytrityl group
  • TDMS group tert-butyldimethylsilyl group
  • this nucleoside derivative is reacted with triphenylphosphine (PPh 3 ), diisopropyl azodicarboxylate (DIAD) or the like to stereoinvert the 3′ hydroxyl group, and the 3′ hydroxyl group is reacted with thiobenzoic acid or selenobenzoic acid.
  • Ph 3 triphenylphosphine
  • DIAD diisopropyl azodicarboxylate
  • benzoic acid is hydrolyzed with an alkali to obtain nucleosides in which the oxygen of the 3' hydroxyl group of the nucleoside derivative is substituted with sulfur or selenium.
  • an amidite such as 2-cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorophosphoramidite is reacted to obtain the desired amidite reagent.
  • the nucleic acid to be cleaved is prepared using a thiolated or selenized amidite reagent represented by formula (3) and a normal (that is, not thiolated or selenized) amidite reagent represented by formula (4). , can be synthesized using a known automatic nucleic acid synthesizer. By synthesizing a nucleic acid of a desired sequence with an amidite reagent represented by formula (4), and using an amidite reagent represented by formula (3) at a target position, a thiolated or selenized nucleotide is obtained at the desired position. A nucleic acid to be cleaved at a position can be synthesized.
  • Activating agents include 1H-tetrazole (1H-tet), 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl ]-1H-tetrazole (BTTH) and the like.
  • BTTH is the most preferable because it reduces the amount of by-products (dithiolates) produced and provides a good yield of the target nucleic acid to be cleaved.
  • the coupling time is preferably in the range of 60 to 120 seconds, and the coupling reaction can be performed multiple times (for example, 2 to 7 times) during this coupling time, thereby increasing the yield. is preferable from the viewpoint of improvement of
  • the full-length nucleic acid to be cleaved can be synthesized using the above-mentioned automatic nucleic acid synthesizer.
  • the full-length nucleic acid to be cleaved can be synthesized. That is, by PCR, the nucleic acid to be cleaved is generated by extending the primer along the template DNA.
  • the number of nucleotides constituting the primer can be appropriately set according to the purpose, and can be, for example, 5mer or more and 50mer or less.
  • a vector or the like can be constructed by forming a sticky end in the nucleic acid to be cleaved of the present invention and ligating it with another DNA strand having a sticky end.
  • the length of the single-stranded DNA on the protruding side of the cohesive end is long, for example, 20 bases or more, it is possible to introduce the structure represented by the above formula (1) at multiple sites on the complementary strand side. preferable.
  • the number of nucleotides nt (number of bases: b) between the structures of formula (1) is preferably 15 or less, and 10 or less. is more preferable. When the number of nucleotides is 15 or less, dissociation of the DNA fragment after strand cleavage by the metal nanoparticles is accelerated, and ligation efficiency tends to be high.
  • the cleavage step the nucleic acid to be cleaved is reacted with a cleaving agent to cleave the nucleic acid to be cleaved at X in formula (1) to generate a nucleic acid having a structure represented by formula (2) below.
  • the target nucleic acid thiolated oligonucleic acid
  • FIG. 1 the target nucleic acid (thiolated oligonucleic acid) is cleaved using silver nanoparticles. becomes.
  • the cutting agent is preferably used in the form of a dispersion in which metal nanoparticles are dispersed.
  • the cleavage reaction is preferably carried out at 70° C. or higher, more preferably 90° C. or higher, particularly preferably 95° C. or higher, from the viewpoint of high cleavage activity.
  • the upper limit of the cleavage reaction temperature is not particularly limited, and is preferably 100° C. or lower.
  • the reaction time of the cleavage reaction can be appropriately set according to the reaction temperature, and the higher the reaction temperature, the shorter the reaction time can be set.
  • the reaction time is preferably in the range of 5 minutes or more and 120 minutes or less.
  • the nucleic acid chain cleaving apparatus of the present invention is a device for carrying out the above-described method for cleaving a nucleic acid chain.
  • the nucleic acid chain cleaving device comprises a nucleic acid preparation means for preparing a nucleic acid to be cleaved having a structure represented by the formula (1), and a nucleic acid to be cleaved and a cleaving agent to react with the nucleic acid to be cleaved at the portion X in the formula (1).
  • Nucleic acid adjusting means include amidite reagents represented by the following formulas (3) and (4), automatic nucleic acid synthesizers, and various reagents used for nucleic acid synthesis.
  • amidite reagents represented by the following formulas (3) and (4)
  • automatic nucleic acid synthesizers and various reagents used for nucleic acid synthesis.
  • template DNAs template DNAs
  • PCR devices reagents used for PCR, etc. are also included in nucleic acid adjusting means.
  • the cleaving means includes the nucleic acid to be cleaved synthesized by the nucleic acid adjusting means, the above-mentioned cleaving agent, various devices (such as an incubator) for carrying out the cleavage reaction of the nucleic acid to be cleaved by the cleaving agent, various reagents used in the reaction, and the like. .
  • a method for producing double-stranded DNA having cohesive ends will be described.
  • cohesive ends are formed at one or both ends of the double-stranded DNA.
  • a double-stranded DNA preparation step is performed.
  • a double-stranded DNA to be cleaved consisting of a sense strand and an antisense strand is prepared.
  • the antisense strand has a sequence complementary to the sense strand described above.
  • At least one of the sense strand and the antisense strand has a structure represented by formula (1).
  • the lower part of FIG. 1 shows the case where both the sense strand and the antisense strand each have the structure of formula (1). In this way, by introducing the structure of formula (1) into both strands, a DNA having cohesive ends at both ends can be generated in the cohesive end-generating step described later.
  • the cohesive end generating step is performed ("[Step_1] Strand scission" in Fig. 1).
  • the double-stranded DNA to be cleaved is reacted with a cleaving agent to cleave the sense strand and/or the antisense strand at the X portion of formula (1).
  • a double-stranded DNA having a structure represented by formula (2) and having cohesive ends is produced.
  • Cutting conditions and the like are as described in the above "(2) Cutting step".
  • the apparatus of the present invention is an apparatus for carrying out the above-described method for producing double-stranded DNA having cohesive ends.
  • the double-stranded DNA preparation means for preparing the double-stranded DNA to be cleaved and the double-stranded DNA to be cleaved and the cleaving agent are reacted to have a structure represented by the formula (2) and adhere cohesive end generating means for generating double-stranded DNA having ends.
  • the cohesive end-generating means includes nucleic acids to be cleaved synthesized by the nucleic acid adjusting means, cleaving agents, various devices such as incubators, and various reagents, as described in the above "cleaving means”.
  • cleaving agent metal nanoparticles are used instead of conventionally used metal ions, so that DNA, which is a cleavage product, can be recovered while maintaining a high cleaving activity equivalent to that of metal ions.
  • the rate is higher, and cohesive ends can be formed efficiently.
  • DNAs having such cohesive ends can be ligated freely.
  • a cohesive end common to both the target DNA and the vector is formed with a cleaving agent, and these are ligated to prepare a recombinant DNA, which is used for cloning, library construction, construction of a large-scale expression system, and the like. be able to.
  • a genome build-up reaction can be performed in a test tube (see “Step_2" at the bottom of FIG. 1).
  • genome build-up reaction can also be performed in cells by introducing double-stranded DNA in a blunt-ended state into cells and performing deprotection treatment in cells.
  • obtained as 2.3 g (3.0 mmol) of the obtained compound 4A was weighed and deoxygenated by argon bubbling for 30 minutes. .0 mmol), and stirred at -10°C for 30 minutes under argon bubbling.
  • the reaction was terminated by slowly dropping a 1 M potassium dihydrogen phosphate aqueous solution (38 mL, 19 mmol) to the reaction solution.
  • 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite (1.1 mL, 3.5 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was diluted with dichloromethane (50 mL) and then washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution (50 mL). After drying the organic phase with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off using a rotary evaporator.
  • the obtained 2'-keto compound was dissolved in tetrahydrofuran (260 mL) and stirred at -78°C for 30 minutes. Subsequently, a 1M L-selectride/tetrahydrofuran solution (40 mL, 40 mmol) was added dropwise, and the mixture was stirred at -78°C for 16 hours. A saturated ammonium chloride aqueous solution (50 mL) was added to the reaction solution to terminate the reaction, and the mixture was extracted with ethyl acetate three times. After drying the organic phase with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off using a rotary evaporator.
  • triethylamine hydrogen trifluoride (16 ml, 100 mmol) was added and the mixture was stirred at room temperature for 16 hours.
  • reaction solution was diluted with ethyl acetate (300 mL) and washed with saturated aqueous sodium hydrogencarbonate solution (300 mL) and saturated brine (300 ml).
  • organic phase was dried with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off using a rotary evaporator to obtain 1.7 g of compound 6G as a white solid.
  • 5-(Ethylthio)-1H-tetrazole (0.34 g, 2.6 mmol) was added to the obtained compound 6G (1.7 g, 2.6 mmol) and dissolved in dichloromethane (40 mL).
  • 2-cyanoethyl N,N,N',N'-tetraisopropylphosphorodiamidite (1.3 mL, 4.0 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour.
  • the reaction solution was diluted with dichloromethane (300 mL) and washed twice with saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution (300 mL). After drying the organic phase with anhydrous sodium sulfate, the solvent was distilled off using a rotary evaporator.
  • 0.3 M BTT was used as activator and 0.05 M iodine (pyridine/water; v/v: 9/1) solution was used as oxidant.
  • 6-FAM-glycerol support 500 ⁇ (manufactured by ChemGenes) was used as a solid-phase carrier to introduce FAM at the 3' end. Synthesis was set to Final DMTr-ON and removed leaving the DMTr group on the 5'-terminal hydroxyl group. After completion of the synthesis, concentrated aqueous ammonia (500 ⁇ L) and 40% methylamine aqueous solution (500 ⁇ L) were added to the solid phase carrier, and the solid phase carrier was treated at 65° C.
  • oligonucleotide was redissolved in super deionized water, and the concentration was calculated by measuring the absorption at 260 nm.
  • MALDI-TOF molecular weight measurement of oligonucleotides was performed using 3-hydroxypicolinic acid as a matrix and using UltrafleXtreme (manufactured by Bruker) in linear positive mode.
  • FIG. 2 shows the synthesis of oligonucleotides having a 3'-thiophosphate bond using a thiolated amidite reagent (compound 5T) and the analysis results by reversed-phase HPLC and MALDI-TOF-MS.
  • (a) of the figure is a 20-base-long oligodeoxyribonucleotide 5'-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3' having a 3'-thiophosphoric acid bond between the 4th and 5th bases from the 5' side using compound 5T. was synthesized and analyzed by reversed-phase HPLC.
  • HPLC analysis conditions are as follows.
  • the main peak seen near the retention time of 18.8 minutes is the 20-mer target DNA, and the DMTr group remains as the 5'-hydroxyl-protecting group.
  • some products whose synthesis was stopped at the stage of introduction of compound 5T were also observed around the retention time of 12.7 to 13.5 minutes. It was possible to separate into By fractionating the peak near the retention time of 18.8 minutes, the 5'-DMTr protected form of the target DNA was obtained.
  • (c) of the figure shows the results of MALDI-TOF-MS molecular weight analysis of the DNA obtained above. As a result, a peak at m/z 6650.7 derived from the target product was observed.
  • DNA strand cleavage reaction by metal nanoparticles of thiolated oligonucleic acid (1) Silver nanoparticle size of DNA strand cleavage reaction by silver nanoparticle treatment (a) Silver nanoparticle treatment 3 ⁇ M PS-modified DNA (5′-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM- 3′) was measured to 10 ⁇ L, 50 ⁇ L of silver nanoparticle dispersion (10 nm, 0.02 mg/mL) was added, and incubated at 37° C. for 31 hours. 20 ⁇ L of the reaction solution was measured and 20 ⁇ L of 2x loading buffer was added. After heat treatment at 95° C.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of examination of DNA strand scission reaction by silver nanoparticle treatment and the dependence of silver nanoparticle size and reaction time/reaction temperature.
  • (a) of the figure shows the results of silver nanoparticle size dependence of DNA strand scission by silver nanoparticles.
  • Strand cleavage of 20mer DNA 5′-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3′ to form 15mer DNA 5′-pCACATTAATTGCGTT-FAM-3′ was analyzed by denaturing gel electrophoresis using 10 nm, 20 nm and 100 nm silver nanoparticles. Ts indicates a 3'-thiolated thymidine base.
  • FAM is introduced as a fluorescent dye at the 3' end. It is designed so that phosphate (p) remains at the 5' end of the 15-mer DNA after cleavage.
  • the cleavage reaction was carried out at 37°C for 31 hours. From the gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection, the cleavage efficiency when using silver nanoparticles of 10 nm, 20 nm, and 100 nm was 35.9%, 21.9%, and 13.1%, respectively, and the nanoparticle size was large. It was found that the cutting efficiency decreased as the
  • (b) of the figure shows the reaction time and reaction temperature dependence of DNA strand scission by silver nanoparticles.
  • a 20-mer DNA strand scission reaction was performed at 70°C or 95°C using 10 nm silver nanoparticles. The reaction was carried out for 15, 30, 60, and 120 minutes, and each reaction solution was analyzed by denaturing gel electrophoresis. From the gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection, the cleavage efficiency at each temperature and time was calculated. The reaction time was plotted against the cleavage efficiency on the vertical axis.
  • FIG. 4 shows the results of improving the DNA strand scission activity by modifying the surface of the silver nanoparticles with a polymer.
  • (a) of the figure is a schematic diagram showing the surface of the polymer-modified silver nanoparticles. It was modified with a terminal thiol-modified polyethylene glycol having an average molecular weight of 5,000.
  • Surface-modified nanoparticles can be easily prepared by mixing any amount of polymer with commercially available silver nanoparticle dispersions. It is also possible to control the amount of modification by adjusting the amount of polymer added.
  • (b) of the figure shows the results of comparing the DNA strand scission activity of 1 nm silver nanoparticles with and without surface modification.
  • PEG-SH in the figure indicates polyethylene glycol with a terminal thiol.
  • the reaction was carried out at 37° C. for 31 hours, the reaction solution was analyzed by denaturing gel electrophoresis, the band intensity analysis of the gel was performed by FAM-derived fluorescence detection, and the cleavage efficiency was calculated.
  • the cleavage efficiency was 35.9%
  • the cleavage activity was 91.8%, showing surface PEG modification. significantly improved the cleavage activity. This effect of improving the cleavage activity is explained by the PEG modification, which prevents the surface oxidation of silver nanoparticles and improves the dispersibility in an aqueous solution.
  • (c) of the figure shows the results of reaction time dependence of DNA strand scission using 1 nm surface PEG-modified silver nanoparticles.
  • the reaction was carried out at 50° C. for 15, 30, and 60 minutes, and each reaction solution was analyzed by denaturing gel electrophoresis, and the cleavage efficiency at each reaction time was calculated from the gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection.
  • an improvement in the chain scission efficiency depending on the reaction time was observed, and 90% or more cleavage was observed 60 minutes after the start of the reaction. From this result, by modifying the surface of commercially available silver nanoparticles with PEG, highly efficient DNA strand scission became possible under relatively mild temperature conditions.
  • a terminal thiol PEG aqueous solution (23.9 g/L) was added to 50 ⁇ L of a commercially available silver nanoparticle dispersion (manufactured by Sigma-aldrich, 10 nm, 0.02 mg/mL). was prepared by adding 30 ⁇ L of the reaction solution was measured and 30 ⁇ L of 2x loading buffer was added. After heat treatment at 95° C. for 5 minutes, analysis was performed by 15% denaturing acrylamide electrophoresis (10 ⁇ 12 cm, 30 mA, 20 minutes, 6 ⁇ L applied, containing 7.5 M urea). A gel electrophoresis image was acquired using a gel image analyzer (manufactured by BioRad) by FAM-derived fluorescence detection.
  • FIG. 5 shows the results of preparation of 3′ overhang cohesive ends by treating short double-stranded DNA with silver nanoparticles.
  • Cleavage of 20-mer duplex DNA with 3′-SP linkages was performed using 1 nm surface PEG-modified silver nanoparticles.
  • the SP bond was positioned between the 5th and 6th bases from the 5' end, and was designed so that a cohesive end protruding by 5 bases could be prepared upon cleavage.
  • the reaction was carried out at 50° C. for 15, 30, and 60 minutes, and each reaction solution was analyzed by denaturing gel electrophoresis, and the cleavage efficiency at each reaction time was calculated from the gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection.
  • DNA was amplified by performing 30 cycles of denaturation (95°C, 15 seconds)-annealing (55°C, 15 seconds)-strand elongation (68°C, 30 seconds).
  • the PCR product was purified using a wizard column (manufactured by Promega) according to the manufacturer's recommended protocol to obtain thiolated DNA.
  • the SP bond was cleaved by treating at 50° C. for 2 to 4 hours to remove the sticky terminal. was prepared.
  • FIG. 6 shows the results of PCR studies when the thiolated oligonucleic acid was introduced into the DNA template.
  • the 3′ ends were annealed, and polymerase extension reactions were performed using various polymerases (KOD-Pkus-Neo, PrimeSTAR HS, Phusion High Fidelity, Q5 High Fidelity, Deep Vent, Taq DNA polymerase).
  • extension terminates at the 3'-SP modification site, a 4- or 5-base extension product from the 22-mer primer is generated.
  • the 3'-SP modified site is successfully extended, a full-length 41-mer DNA is produced.
  • the reaction solution was analyzed by 20% denaturing gel electrophoresis (containing 7.5 M urea, 20 x 22 cm, 20 W, 2 hours), and a gel image analyzer (manufactured by BioRad) using fluorescence detection derived from 5'-FAM. Bands were visualized.
  • any polymerase was used, a full-length 41-mer DNA-derived band was observed, and no extension termination product at the 3'-SP modification site was observed. From this, it was clarified that DNA introduced with 3'-SP modification can function as a primer.
  • Fig. 7 shows a schematic diagram of DNA amplification by PCR and preparation of adhesive fragments by BsaI or silver nanoparticle treatment.
  • (a) of the figure shows the result of preparation of 4-base overhang cohesive ends using the restriction enzyme BsaI.
  • (b) of the figure shows the result of preparation of 8-base overhang cohesive ends using 3'-SP bond cleavage by silver nanoparticle treatment.
  • Silver nanoparticles of 10 nm size with surface PEG modification were used.
  • FIG. 8 shows the results of ligation experiments of adhesive fragments using T4 DNA ligase.
  • two adhesive fragment DNAs prepared by silver nanoparticle treatment or restriction enzyme BsaI treatment as a control experiment were ligated with T4 DNA ligase and subjected to 1% agarol gel electrophoresis (electrophoresis buffer: 1x TBE, 100V , 30 min). The reaction was carried out at 25° C. for 3 hours, and the PCR product DNA was treated with silver nanoparticles for 60, 120, 180, and 240 minutes. did. The gel results confirmed the formation of a ligation product of 838 bp under all ligation conditions.
  • (b) of the figure shows a graph showing the ligation efficiency of the product at each silver nanoparticle treatment time and the product by BsaI treatment.
  • the amount of ligation product increased with increasing silver nanoparticle treatment time.
  • the ligation of DNA fragments prepared by silver nanoparticle treatment for 240 minutes showed higher ligation efficiency than the ligation of DNA fragments prepared by BsaI treatment.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of thiolated oligonucleic acid chain cleavage by silver nitrate treatment, which is an existing technique.
  • Silver nitrate treatment of the 20mer PS-DNA 5'-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3' to generate the 15mer DNA 5'-pCACATTAATTGCGTT-FAM-3' strand cleavage product was analyzed by denaturing gel electrophoresis. It is designed to leave a phosphate (p) at the 5' end of the 15mer DNA after cleavage.
  • Gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection showed that 90% or more of the DNA was cleaved 5 minutes after the start of the reaction.
  • MALDI-TOF-MS molecular weight analysis was carried out using 3-hydroxypicolinic acid as a matrix and measured in linear negative mode with UltraFleXtreme (manufactured by Bruker). The results are shown in FIG.
  • FIG. 10 shows molecular weight analysis results by MALDI-TOF-MS of cleavage products in thiolated oligonucleic acid chain cleavage by silver nitrate treatment, which is an existing technique.
  • (a) of the figure shows the sequences of the cleavage target DNA (41mer) 5'-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3' and its cleavage product DNA fragment.
  • the 5'-fragment (15mer) side becomes 3'-SH (5'-AGGGGTGCCTAATGTs-3'), and the 3'-fragment (26mer) is 5'- It is designed to be a phosphate (5'-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3', p indicates a phosphate group).
  • (b) of the figure is a diagram showing MALDI-TOF-MS molecular weight analysis of the cleavage reaction solution by silver nitrate treatment.
  • the target DNA fragment was produced because peaks corresponding to the molecular weights of 466.2 and 8040.2 of the 5'-fragment (15mer) and 3'-fragment (26mer) produced by cleavage were observed.
  • (c) of the figure is an enlarged view of the MALDI-TOF-MS spectral peak region derived from the 5'-fragment (15mer) of the cleavage product by silver nitrate treatment.
  • (d) of the figure is an enlarged view of the MALDI-TOF-MS spectrum peak region derived from the 3'-fragment (26mer) of the cleavage product by silver nitrate treatment.
  • Figures (c) and (d) indicate that the cleavage product exists in the form of multiple silver ions added to the phosphate binding site.
  • peaks having cluster-like molecular weight distributions with different silver ion addition numbers were detected.
  • the mixture was diluted with super-deionized water (160 ⁇ L) and incubated at room temperature for 20 minutes. Subsequently, a precipitate derived from silver ions was removed by centrifugation (15,000 rpm, 15 minutes). The supernatant was recovered and concentrated using an ultrafiltration centrifugal filter (Amicon Ultra 3K, manufactured by Merck) according to the manufacturer's recommended protocol.
  • the amount of recovered product was calculated by quantifying the cleaved product of the concentrated sample solution by measuring the absorbance at 260 nm derived from the nucleic acid using NanoDrop.
  • ⁇ 260 250,000 L ⁇ mol ⁇ 1 ⁇ cm ⁇ 1 , was used to quantify DNA by Lambert-Beer law.
  • Fig. 11 shows the results of examining the existing technology of scission of thiolated oligonucleic acid chains by silver nitrate treatment and removal of silver ions by addition of thiols.
  • As the cleavage target DNA 41mer 5'-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3' was used, and as shown in the figure, it was cleaved at the 3'-SP binding site and 5'-fragment (15mer) 5'-AGGGGTGCCTAATGTs-3') and 3'-fragment (26mer) 5'-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3' are generated designs.
  • SYBR Green II was used for DNA staining by gel analysis, and the bands on the gel were visualized by fluorescence detection derived from SYBR Green II bound to DNA.
  • a band derived from dimerization of the thiol site of the 5'-fragment by disulfide bond was observed along with the cleavage products 5'-fragment and 3'-fragment.
  • the band derived from dimerization had almost the same mobility as the 41-mer 5'-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3' of the raw material cleavage target DNA, and was difficult to distinguish, but the gel band was cut out and DNA was extracted from the gel piece. After that, as a result of MALDI-TOF-MS molecular weight analysis of the extract, it was found to be a 5'-fragment dimer.
  • Silver nanoparticles are known to exhibit absorption over a range of 350 to 700 nm depending on the particle size due to the surface plasmon resonance effect. Therefore, by acquiring the absorption spectrum of the dispersion, the amount of nanoparticles present in the dispersion can be estimated from the absorbance.
  • the silver nanoparticle dispersion diluted with super deionized water 700 ⁇ L was transferred to an Eppendorf tube and centrifuged at 15,000 rpm for 1 hour to precipitate the nanoparticles. After transferring to a cell (optical path length: 1 cm, optical path width: 1 cm), the absorption spectrum was measured. The results are shown in FIG.
  • FIG. 12 is a diagram showing removal of silver nanoparticles by centrifugation (nanoparticle size dependence).
  • (a) of the figure shows the results when using silver nanoparticles with a particle size of 10 nm.
  • (b) of the figure shows the results when silver nanoparticles with a particle size of 20 nm were used.
  • (c) of the figure shows the results when silver nanoparticles with a particle size of 100 nm were used.
  • the blue spectrum in the figure is derived from the 0.01 mg/mL silver nanoparticle dispersion.
  • the orange spectrum in the figure is the result of centrifuging the nanoparticle dispersion liquid at 15,000 rpm for 1 hour to precipitate the nanoparticles, and collecting and measuring the resulting supernatant.
  • the silver nanoparticle dispersion with a particle size of 10 nm was 29.9%
  • the silver nanoparticle dispersion with a particle size of 20 nm was 82.4%
  • the silver nanoparticle dispersion with a particle size of 100 nm was almost 100%.
  • a decrease in absorbance near ⁇ 500 nm was observed.
  • silver nanoparticles with a particle size of 10 to 100 nm can be removed from the reaction solution as a precipitate by centrifugation.
  • the larger the size of silver nanoparticles the easier it is to remove them from the reaction system by centrifugation, and that nanoparticles with a particle size of 20 nm or more can be removed by centrifugation.
  • This mixture (80 ⁇ L) was diluted with super-deionized water (20 ⁇ L), mixed well, and centrifuged at 15,000 rpm for 1 hour to remove precipitates. The supernatant was collected and concentrated using an ultrafiltration centrifugal filter (Amicon Ultra 3K, Merck) according to the manufacturer's recommended protocol. The amount of recovered product was calculated by quantifying the cleaved product of the concentrated sample solution by measuring the absorbance at 260 nm derived from the nucleic acid using NanoDrop. The concentrated sample solution was diluted with super-deionized water to prepare a 0.50 ⁇ M aqueous solution. 5 ⁇ L of 0.50 ⁇ M cleavage product solution was measured and mixed with 2 ⁇ loading buffer (5 ⁇ L).
  • the amount of recovered product was calculated by quantifying the cleaved product of the concentrated sample solution by measuring the absorbance at 260 nm derived from the nucleic acid using NanoDrop.
  • the concentrated sample solution was diluted with super-deionized water to prepare a 0.50 ⁇ M aqueous solution.
  • 5 ⁇ L of 0.50 ⁇ M cleavage product solution was measured and mixed with 2 ⁇ loading buffer (5 ⁇ L).
  • analysis was performed by 15% denaturing acrylamide gel electrophoresis (10 ⁇ 12 cm, 30 mA, 20 minutes, 5 ⁇ L applied, containing 7.5 M urea).
  • a gel migration image was obtained using a gel image analyzer (manufactured by BioRad) by FAM-derived fluorescence detection. The results are shown in FIG.
  • Fig. 13 shows a comparison between silver nitrate treatment and silver nanoparticle treatment in thiolated oligonucleic acid chain cleavage.
  • Lane 1 is the result of electrophoresis of DNA (15mer) 5'-CACATTAATTGCGTT-FAM-3' having the same base length as the DNA generated after cleavage.
  • Lane 2 is the result of migration of cleaved target DNA (20mer) 5'-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3'. Ts in the sequence indicates a 3'-thiolated thymidine base.
  • FAM is introduced as a fluorescent dye at the 3' end.
  • Lane 3 is the result of electrophoresis of the reaction product when thiolated oligonucleic acid chain cleavage was performed using silver nanoparticles with a particle size of 100 nm.
  • the reaction was performed by incubating at 90° C. for 25 hours after adding silver nanoparticles.
  • the silver nanoparticles in the reaction solution were removed as precipitates by centrifugation at 15,000 rpm for 1 hour, and then subjected to electrophoresis.
  • the results showed that almost all of the cleavage target DNA (20mer) disappeared and was converted to the cleavage product DNA (15mer) (89.6%).
  • Lane 4 is the result of electrophoresis of the reaction product when thiolated oligonucleic acid chain cleavage was performed using silver nitrate.
  • the reaction was performed by incubating at room temperature for 1.5 hours after adding silver nitrate. After removing silver ions in the reaction solution as a precipitate by adding DTT, electrophoresis was performed. The results showed that the cleavage target DNA (20mer) was cleaved and converted to cleavage product DNA (15mer) (98.7%).
  • the above is a table showing a comparison of the recovery amount of cleavage product DNA between silver nitrate treatment and silver nanoparticle treatment.
  • silver nitrate treatment the amount of DNA contained in the supernatant after removal of silver ion precipitation by the addition of DTT was quantified by measuring the absorbance of DNA origin at 260 nm.
  • silver nanoparticle treatment the silver nanoparticles were removed as a precipitate by centrifugation, and then the amount of DNA contained in the supernatant was quantified by measuring the absorbance at 260 nm derived from DNA.
  • the absorption spectrum of the silver nanoparticle dispersion without surface modification was obtained by measuring 350 ⁇ L of a dispersion of silver nanoparticles having a particle size of 20 nm (manufactured by Sigma-Aldrich, 0.02 mg/mL sodium citrate aqueous solution), and adding super deionized water ( 1050 ⁇ L), and then measured using a quartz cell (optical path length: 1 cm, optical path width: 1 cm).
  • the absorption spectrum of the silver nanoparticle dispersion without surface modification in the presence of buffers and salts was obtained by measuring 350 ⁇ L of a silver nanoparticle dispersion with a particle diameter of 20 nm (manufactured by Sigma-Aldrich, 0.02 mg/mL sodium citrate aqueous solution). After diluting with super deionized water (630 ⁇ L), a sample was prepared by adding 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.3) (140 ⁇ L), 500 mM potassium chloride aqueous solution (140 ⁇ L), and 15 mM magnesium chloride aqueous solution (140 ⁇ L), It was measured using a quartz cell (optical path length: 1 cm, optical path width: 1 cm).
  • the absorption spectrum of the surface PEG-modified silver nanoparticle dispersion was obtained by measuring 350 ⁇ L of a dispersion of silver nanoparticles having a particle diameter of 20 nm (manufactured by Sigma-Aldrich, 0.02 mg/mL sodium citrate aqueous solution) and measuring 23.9 g/ L-terminal thiolated PEG (O-[2-(3-mercaptopropionylamino)ethyl]-O'-methylpolyethylene glycol, average molecular weight 5,000, manufactured by Sigma-Aldrich) aqueous solution (140 ⁇ L) was added, followed by super desorption.
  • the apparatus used for the measurement is an ultraviolet-visible spectrophotometer V-650 manufactured by JASCO Corporation.
  • the measurement conditions were data interval: 0.5 nm, bandwidth: 1.0 nm, response: medium, scanning speed: 100 nm/min. The results are shown in FIG.
  • FIG. 14 is a diagram showing that surface PEG modification of silver nanoparticles improved dispersibility.
  • the blue spectrum in the figure is an absorption spectrum derived from a commercially available silver nanoparticle dispersion, and a maximum absorption was observed at 396 nm.
  • Tris-hydrochloride buffer pH 8.3
  • Tris-hydrochloride buffer pH 8.3
  • ligation by DNA ligase and potassium chloride and magnesium chloride aqueous solutions as salts were added to this nanoparticle dispersion, and as shown in the red spectrum, Absorption around 396 nm disappeared.
  • a sample was prepared by adding an aqueous PEG4000 solution (140 ⁇ L) and measured using a quartz cell (optical path length: 1 cm, optical path width: 1 cm).
  • the absorption spectrum in the presence of buffers and salts was measured by measuring 350 ⁇ L of a dispersion of silver nanoparticles with a particle size of 20 nm (manufactured by Sigma-Aldrich, 0.02 mg/mL sodium citrate aqueous solution) and adding super deionized water (490 ⁇ L).
  • FIG. 15 is a diagram to prove that the thiol group of the surface-modifying PEG is important for the interaction with the silver nanoparticles, and that surface PEG modification improved the dispersibility of the silver nanoparticles.
  • silver nanoparticles particle size 20 nm
  • thiol-unmodified PEG4000 average molecular weight 2700 to 3300, manufactured by Fujifilm-Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the behavior in the dispersion liquid was analyzed by absorption spectrum measurement.
  • the blue spectrum in the figure shows the absorption behavior of a dispersion obtained by adding 1.58 g/L of PEG4000 to a silver nanoparticle dispersion.
  • FIG. 16 is a diagram showing the sequence design of a DNA ligation reaction that utilizes the generation of cohesive ends by DNA strand scission by silver nanoparticles.
  • the total length of the ligation product DNA is 848 base pairs
  • two types of DNA primers Rev for F1: 5'-AGCGCCATsTCGCCATTCAGG-3' and Fw for F1: 5'-ATGGCGCTsTTGCCTGGTTTC-3 having 3'-SP bonds indicated by Ts 'By using ', DNA fragments of 298 base pairs and 558 base pairs, respectively, are amplified by PCR, and the resulting PCR amplification products are treated with silver nanoparticles to prepare cohesive ends with 8 bases protruding on the 5'-side. It has become.
  • the red underlined portion (ATGGCGCT) in the ligation product sequence corresponds to the sequence of the 8-base overhang.
  • DNAs of 298 base pairs and 558 base pairs after PCR amplification are treated with silver nanoparticles and then ligated with T4 DNA ligase to synthesize a ligated product DNA of full length 848 base pairs.
  • Two kinds of DNA primers Rev for F1: 5'-AGCGCCATsTCGCCATTCAGG-3' and Fw for F1: 5'-ATGGCGCTsTTGCCTGGTTTC-3' were synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer.
  • FIG. 17 shows the results of analyzing the production yield of the target dimer by studying various activating agents, the concentrations of the activating agents, and the coupling time in dimer model synthesis.
  • activating agents 1H-tetrazole (1H-tet), 5-benzylthio-1H-tetrazole (BTT), 4,5-dicyanoimidazole (DCI), 5-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl] -1H-tetrazole (BTTH) was used.
  • the yield of the target product is obtained by comparing the integral ratio of the signal derived from the 3'-thiolated amidite of the starting material (around 160 ppm), the signal derived from the target product (190 ppm), and the signal derived from the by-product (dithiolate form: around 140 ppm) by phosphorus NMR analysis. It was calculated by As a result, when 1H-tet was used, the yield of the target product was 1.4% (entry 1), but by using the more acidic BTT, the yield improved to 19%. (Entry 2). There was no change in BTT and yield when DCI, a more nucleophilic activator, was used (entry 3).
  • the yield improved to 66% using BTTH with high acidity (entry 4).
  • BTTH is the optimum activating agent
  • the concentration of BTTH was increased from 0.02 M to 0.25 M, and the reaction proceeded almost quantitatively in a reaction time of 2 minutes (entry 5).
  • the yield of the desired product decreased and the formation of the dithiolate by-product was confirmed (entry 6). From this result, it is important to use a high concentration of BTTH and complete the reaction in a short time in order to maximize the yield of the target product. It was shown that it was converted to a product and the yield decreased.
  • FIG. 18 shows experimental results showing the effect of reaction time when using 0.25 M BTTH (13 equivalents) in dimer model synthesis.
  • FIG. 18(A) is the result of plotting the relative abundance of the compound and the reaction time. The desired reaction was completed in 2 minutes from the start of the reaction. found to be converted.
  • FIG. 18(B) is a phosphorus NMR spectrum of the reaction product (2 hours after starting the reaction). A signal of the target product was observed around 190 ppm, and a signal derived from the by-product dithiolate was observed around 140 ppm.
  • Fig. 19 shows the mechanism of the presumed side reactions. After the target dimer is formed, it is further activated by an activating agent to form a dithiolate after chain scission.
  • Various amidite reagents were used as 50 mM acetonitrile solutions, and only compound 5T was used as a 150 mM acetonitrile solution.
  • BTTH was used as activator and 0.05 M iodine (pyridine/water; v/v: 9/1) solution as oxidant.
  • 0.25 M or 1.0 M BTTH was used, and 2 to 5 couplings were studied for 20 to 450 seconds.
  • 6-FAM-glycerol support 500 ⁇ manufactured by ChemGenes
  • Synthesis was set to Final DMTr-ON and removed leaving the DMTr group on the 5'-terminal hydroxyl group.
  • concentrated aqueous ammonia 500 ⁇ L
  • 40% methylamine aqueous solution 500 ⁇ L
  • the solid phase carrier was treated at 65° C. for 1 hour for cleavage from the solid phase carrier and deprotection.
  • the supernatant was filtered using a Millex LH filter (0.45 ⁇ m, manufactured by Merck), the filtrate was dried under reduced pressure using a centrifugal evaporator.
  • the obtained oligonucleotide was redissolved in super-deionized water, and the concentration was calculated by measuring the absorption at 260 nm.
  • Analysis of the product by reversed-phase HPLC revealed a peak derived from the target product in which a DMTr group remained as a 5′-hydroxyl-protecting group (retention time 17.2 minutes) and at the introduction stage of 3′ thiolated amidite 5T.
  • the peak area ratio between the peaks (retention time around 8.0 to 12.0 minutes) derived from the product whose synthesis stopped and the cleaved product was calculated.
  • the HPLC analysis conditions are as follows.
  • FIG. 20 shows the results of improving the conditions by applying the optimized reaction conditions for dimer synthesis to oligo DNA synthesis.
  • BTTH which has been found to be the best in dimer synthesis
  • 5′-TAA TsCATTAATTGCGTT-FAM-3′ was calculated on the reversed-phase HPLC peak.
  • the table in FIG. 20 shows the peak ratio of the target product and the chain-cleavage product+unreacted product (13-base length: sequence: 5'-CATTAATTGCGTT-FAM-3').
  • the oxidizing agent the most common iodine-pyridine solution was used. When coupled twice in 450 seconds using 0.25 M BTT as a conditioning control, the target ratio was 5% (entry 1).
  • Eluent A 50 mM triethylammonium acetate (pH 7.0) containing 5% acetonitrile, elution Liquid B: acetonitrile, gradient conditions: flow rate: 3 mL/min, column temperature: 50°C, detection wavelength: 260 nm.
  • FIG. 21 shows the results of synthesizing oligo DNA (sequence: 5'-TAA TsCATTAATTGCGTT-FAM-3') examined for synthesis using the coupling conditions optimized in the experiment of FIG. 20 (entry 6). From the reversed-phase HPLC analysis results of FIG. 21, the 17 base-length target product containing the 3′-thiophosphate bond was obtained at a ratio of 87% from the peak area ratio compared with the peak derived from the by-product (strand scission product). (retention time 16.9 minutes).
  • Ts indicates a 3'-thiolated thymidine base.
  • Various amidite reagents were used as 50 mM acetonitrile solutions, and only compound 5T was used as a 150 mM acetonitrile solution.
  • 0.25 M BTTH (5 couplings in 90 seconds) was used as activator and 0.05 M iodine (pyridine/water; v/v: 9/1) solution as oxidant. Synthesis was set to Final DMTr-ON and removed leaving the DMTr group on the 5'-terminal hydroxyl group.
  • Eluent A 50 mM triethylammonium acetate (pH 7.0) containing 5% acetonitrile, elution Liquid B: acetonitrile, gradient conditions: flow rate: 3 mL/min, column temperature: 50°C, detection wavelength: 260 nm.
  • FIG. 22 shows the results of synthesizing a 51-base-long oligo DNA (5'-ATGAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3') into which three 3' thiophosphate bonds were introduced and analyzing it by reverse-phase HPLC.
  • Ts indicates a 3'-thiolated thymidine base.
  • the main peak seen at a retention time of around 17.2 minutes is the 51-mer target DNA, and the DMTr group remains as a 5'-hydroxyl-protecting group.
  • oligonucleotide was redissolved in super-deionized water, and the concentration was calculated by measuring the absorption at 260 nm.
  • a 10% aqueous acetic acid solution was added and treated at room temperature for 1 hour to deprotect the DMTr groups to obtain the target oligo DNA.
  • the HPLC analysis conditions are as follows.
  • FIG. 23 shows the sequences of four types of PCR primer DNAs into which 3' thiophosphate bonds were introduced at multiple sites, and their synthesis results.
  • the synthesized primers were cleaved at 4 locations by silver nanoparticle cleavage after PCR amplification, yielding sticky ends of 34 bases, Rev_primer for F1_8 and Rev_primer for F2_8, versus 2 by silver nanoparticle cleavage after PCR amplification.
  • Rev_primer for F1 — 16 and Rev_primer for F2 — 16 which are cleaved in place and produce sticky ends of 34 bases.
  • the synthesized four oligo-DNAs were analyzed by reverse-phase HPLC.
  • FIG. 24 shows the results of synthesizing 3'-thiophosphorylated oligo DNA (sequence: 5'-TAACAsCACATTAATTGCGTT-FAM-3') containing an adenosine derivative using a 3'-thiolated amidite adenosine derivative (compound 6A).
  • Oligo DNAs synthesized using BTTH as an activator were analyzed by reverse-phase HPLC. As a result, from the reversed-phase HPLC peak area ratio, the ratio of the 5'-DMTr protected target oligo DNA near the retention time of 16.8 minutes was 40%, and the uncoupled form and the strand cleavage form (retention time of 11.5 minutes) could be clearly separated.
  • a 10% aqueous acetic acid solution was added and the product was treated at room temperature for 1 hour to deprotect the DMTr groups to obtain the target DNA.
  • a terminal thiol PEG aqueous solution (23.9 g/L) was added to 50 ⁇ L of a commercially available silver nanoparticle dispersion (manufactured by Sigma-aldrich, 10 nm, 0.02 mg/mL). was prepared by adding 30 ⁇ L of the reaction solution was measured and 30 ⁇ L of 2x loading buffer was added. After heat treatment at 95° C. for 5 minutes, analysis was performed by 15% denaturing acrylamide electrophoresis (10 ⁇ 12 cm, 30 mA, 20 minutes, 6 ⁇ L applied, containing 7.5 M urea). A gel electrophoresis image was acquired using a gel image analyzer (manufactured by BioRad) by FAM-derived fluorescence detection.
  • Fig. 25 shows the results of preparation of 3' overhang cohesive ends by treating double-stranded short-stranded DNA with silver nanoparticles.
  • cleavage of the 3'-thioadenosine analog synthesized in the experiment shown in Figure 24 was performed using 1 nm surface PEG-modified silver nanoparticles.
  • the SP bond was positioned between the 5th and 6th bases from the 5' end, and was designed to prepare a cohesive end protruding by 5 bases upon cleavage.
  • the reaction was carried out at 50° C. for 15, 30, 60 and 120 minutes, and each reaction solution was analyzed by denaturing gel electrophoresis, and the cleavage efficiency at each reaction time was calculated from gel band intensity analysis by FAM-derived fluorescence detection.
  • FIG. 26 shows the adjustment of 34 base length adhesive ends by silver nanoparticle cleavage of PCR amplification products using the four primer DNAs synthesized in Fig. 23 and their is a schematic diagram of an experimental system showing the sequences of the ligation products of the cleavage products of .
  • DNA was amplified by performing 30 cycles of denaturation (95°C, 15 seconds)-annealing (55°C, 15 seconds)-strand elongation (68°C, 30 seconds).
  • the PCR product was purified using a wizard column (manufactured by Promega) according to the manufacturer's recommended protocol to obtain thiolated DNA.
  • the SP bond was cleaved by treating at 50 ° C. for 4 hours, and the sticky end was removed. prepared.
  • FIG. 27 shows the flow of 34-base-long sticky-end adjustment by silver nanoparticle-treated cleavage of PCR amplification products using the four primer DNAs synthesized in FIG. The results of electrophoresis are shown. It was confirmed that four PCR products of desired lengths of 529-bp, 307-bp, 529-bp and 307-bp were obtained.
  • FIG. 28 shows the ligation of 34-base-long cohesive-end DNA obtained by cleaving the product amplified by PCR using Rev_primer for F1_8 and Rev_primer for F2_8 with silver nanoparticles, and PCR using Rev_primer for F1_16 and Rev_primer for F2_16. It is the result of comparing the ligation efficiency with the ligation of 34-base-long cohesive-end DNAs obtained by cleaving amplified products with silver nanoparticles.
  • a DNA fragment of 8 bases after cleavage of silver nanoparticles dissociates quickly after cleavage and exhibits a relatively high ligation efficiency, but a DNA fragment of 16 bases after cleavage of silver nanoparticles is dissociated after cleavage. It is expected to be relatively slow and exhibit low ligation efficiency.
  • the ligation efficiency was 29% in the two-site cleavage system (Ts modification x2), and the ligation efficiency was 44% in the four-site cleavage system (Ts modification x4). It was shown that the dissociation of the DNA fragment after cleavage is promoted and high ligation efficiency is exhibited.
  • the scavenger strand in the figure has the function of peeling off the product that is not ligated, even though the cohesive ends form complementary strands. used for

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Abstract

下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製工程と、この切断対象核酸と切断剤とを反応させて式（１）のＸの部分で切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断工程と、を備え、切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする核酸鎖切断方法。　【化１】 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５'末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３'末端側の部分を示す。）

Description

核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法及び二本鎖ＤＮＡの製造装置
　本発明は、核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法及び二本鎖ＤＮＡの製造装置に関する。
　分子生物学などの分野では、遺伝子組み換えや形質転換などを行うために、標的ＤＮＡをホストに組み込んだベクターが用いられている。一般に、標的ＤＮＡは、量が少ない場合はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して使用される。ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、これに相補的に結合するプライマーを用いて熱変性とアニーリングを複数サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅している。
　ＰＣＲで増幅されたテンプレートＤＮＡの増幅産物は、そのままでは平滑末端であり、これをプラスミドＤＮＡなどのホストＤＮＡと結合（ライゲーション）させるための処理をする必要がある。このような場合において、増幅産物の３’末端及び５’末端を接着末端（粘着末端、突出末端などともいう）とし、ホスト側も同様に接着末端を形成して両者をライゲーションしてベクターを構築する技術がある。
　ＤＮＡに接着末端を形成するには、二本鎖ＤＮＡのうち一方の鎖の所望の位置を切断してＤＮＡ鎖にオーバーハングを生じさせる必要がある。この点に関して、例えば、非特許文献１には、５’－Ｏ－モノメトキシトリチルチミジン３’－Ｓ－（２－シアノエチル）－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルホスホロチオアミダイトを用いて、３’－Ｓ－ホスホロチオレート結合を含むオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成機で調製したこと、３’－Ｓ－ホスホロチオレート結合を含む鎖は、Ａｇ＋を用いてこの部位で特異的に化学的に切断されたこと、などが記載されている（Ａｂｓｔｒａｃｔ）。
　非特許文献１では、一本鎖ＤＮＡを切断する切断剤として銀イオン（Ａｇ＋）を使用している。銀イオンはプラスの電荷を有しているため、ＤＮＡのリン酸基などマイナスの電荷を有する官能基や核酸塩基部と静電相互作用することから、非特異的相互作用に起因する凝集体形成により、目的のＤＮＡの回収率が低かった。
　本発明の目的は、切断効率が良く目的の核酸の回収率が高い核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置を提供することにある。また、本発明の他の目的は、接着末端の形成効率が良く目的の接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの回収率が高い、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び二本鎖ＤＮＡの製造装置を提供することにある。
　本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、金属イオンではなく金属ナノ粒子を切断剤として使用することで、切断対象の核酸の切断効率が良く、目的の核酸の回収率が高くなることを見出し、本発明を完成させた。
〔１〕下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製工程と、
　前記切断対象核酸と切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断工程と、を備え、
　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする核酸鎖切断方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
〔２〕前記切断剤が銀ナノ粒子であり、前記Ｘが硫黄であることを特徴とする〔１〕に記載の核酸鎖切断方法。
〔３〕前記金属ナノ粒子の平均粒径が１～２０ｎｍの範囲内であることを特徴とする〔１〕に記載の核酸鎖切断方法。
〔４〕前記金属ナノ粒子の表面にポリエチレングリコールが結合していることを特徴とする〔１〕に記載の核酸鎖切断方法。
〔５〕前記核酸調製工程は、下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬を用いて前記切断対象核酸の一部又は全部をホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする〔１〕に記載の核酸鎖切断方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を示す。）
〔６〕前記核酸調製工程は、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾールを活性化剤としてホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする〔５〕に記載の核酸鎖切断方法。
〔７〕前記核酸調製工程は、前記切断対象核酸の一部をホスホロアミダイト法で合成してプライマーとし、前記切断対象核酸と相補的な配列を有するテンプレートＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応を複数サイクル行い、前記テンプレートＤＮＡに沿って前記プライマーを伸長させることで前記切断対象核酸を生成することを特徴とする〔５〕に記載の核酸鎖切断方法。
〔８〕下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製手段と、
　前記切断対象核酸と切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断手段と、
を備え、
　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする核酸鎖切断装置。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
〔９〕前記核酸調製手段は、下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬を用いて前記切断対象核酸の一部又は全部をホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする〔８〕に記載の核酸鎖切断装置。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を示す。）
〔１０〕前記核酸調製工程は、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾールを活性化剤としてホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする〔９〕に記載の核酸鎖切断装置。
〔１１〕接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
　センス鎖と、前記センス鎖と相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、から構成される切断対象二本鎖ＤＮＡであって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に下記式（１）で示される構造を有する切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する二本鎖ＤＮＡ調製工程と、
　前記切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖を切断し、下記式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを生成させる接着末端生成工程と、を備え、
　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
〔１２〕前記切断対象二本鎖ＤＮＡは、前記式（１）で示される構造を複数有しており、各構造の間のヌクレオチド数が１０以下であることを特徴とする〔１１〕に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
〔１３〕接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、
　センス鎖と、前記センス鎖と相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、から構成される切断対象二本鎖ＤＮＡであって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に下記式（１）で示される構造を有する切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する二本鎖ＤＮＡ調製手段と、
　前記切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖を切断し、下記式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを生成させる接着末端生成手段と、を備え、
　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
〔１４〕前記切断対象二本鎖ＤＮＡは、前記式（１）で示される構造を複数有しており、各構造の間のヌクレオチド数が１０以下であることを特徴とする〔１３〕に記載の二本鎖ＤＮＡの製造装置。
　本発明によれば、切断効率が良く目的の核酸の回収率が高い核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置を提供することが可能となる。また、本発明によれば、接着末端の形成効率が良く目的の接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの回収率が高い二本鎖ＤＮＡの製造方法及び二本鎖ＤＮＡの製造装置を提供することが可能となる。
金属ナノ粒子を使用した核酸鎖切断反応と、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを調製してライゲーションする反応の概略を示す模式図である。 チオ化アミダイト試薬を用いた３’－チオリン酸結合を有するオリゴヌクレオチドの合成と、逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析結果を示す図である。 銀ナノ粒子処理によるＤＮＡ鎖切断反応の検討と、銀ナノ粒子サイズ及び反応時間・反応温度依存性の結果を示す図である。 銀ナノ粒子表面のポリマー修飾によるＤＮＡ鎖切断活性向上の結果を示す図である。 二重鎖短鎖ＤＮＡの銀ナノ粒子処理による３’オーバーハング接着末端の調製を行った結果を示す図である。 チオ化オリゴ核酸をＤＮＡテンプレートへ導入した際のＰＣＲの検討結果を示す図である。 ＰＣＲによるＤＮＡ増幅とＢｓａＩ又は銀ナノ粒子処理による接着断片の調製の模式図である。 Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いた接着断片の連結実験結果を示す図である。 既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断結果を示す図である。 既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断における切断生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量解析結果を示す図である。 既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断とチオール類添加による銀イオン除去を検討した結果を示す図である。 銀ナノ粒子の遠心分離による除去（ナノ粒子サイズ依存性）を示す図である。 チオ化オリゴ核酸鎖切断における硝酸銀処理と銀ナノ粒子処理の比較。ゲル画像中、Ｌａｎｅ１は切断後に生じるＤＮＡと同じ塩基長のＤＮＡ（１５ｍｅｒ）５’－ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を泳動した結果を示す図である。 銀ナノ粒子の表面ＰＥＧ修飾により分散性が向上したことを示す図である。 表面ＰＥＧ修飾により銀ナノ粒子の分散性が向上したことを示す図である。 銀ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断による接着末端生成を利用したＤＮＡ連結反応の配列デザインを示す図である。 ３’－チオ化アミダイトの反応条件改良を目指した二量体モデル合成におけるカップリング条件最適化を検討した結果を示す図である。 二量体モデル合成において、０．２５ＭのＢＴＦＴＨ（１３当量）を用いた際の反応時間の影響を示す実験結果である。 二量体モデル合成において明らかになったカップリング反応における副反応の推定機構を示す図である。 二量体合成において最適化した反応条件を参考にし、オリゴＤＮＡ合成へと応用し条件改良した結果を示す。 最適化したカップリング条件を採用し合成検討したオリゴＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の合成結果を示す図である。 ３箇所３’チオリン酸結合を導入した５１塩基長のオリゴＤＮＡ（５’－ＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴｓＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴｓＡＡＴＴＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴｓＧ－３’）の合成結果を示す図である。 ４箇所及び２箇所の３’チオリン酸結合を導入したＰＣＲ用プライマーＤＮＡの配列とその合成結果を示す図である。 ３’－チオ化アミダイトアデノシン誘導体を用いて合成した３’チオリン酸化オリゴＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＡｓ　ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－　３’）の合成結果を示す図である。 アデノシンアナログを含む３’－チオリン酸結合ＤＮＡの銀ナノ粒子による切断による３’－オーバーハング接着末端の調整を検討した結果を示す図である。 複数修飾を導入したプライマーを用いた際の接着末端調整と連結の実験デザイン及び配列を示す図である。 複数修飾導入プライマーを用いた接着末端調整と連結反応を示す模式図ならびにＰＣＲ産物のアガロース電気泳動結果を示す図である。 ＰＣＲ増幅産物の複数箇所での切断により得られた３４塩基長の接着末端ＤＮＡ同士の連結との連結効率を比較した結果である。
１．核酸鎖切断方法
　以下、本発明の核酸鎖切断方法について説明する。本発明の核酸鎖切断方法は、下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製工程と、この切断対象核酸と切断剤とを反応させて式（１）のＸの部分で切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断工程と、を備える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、切断対象核酸の一部であり、Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、切断対象核酸の一部であり、Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
　ここで、塩基Ｂは、具体的には、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、Ｎ－メチルアデニン、Ｎ－ベンゾイルアデニン、２－メチルチオアデニン、２－アミノアデニン、７－メチルグアニン、Ｎ－イソブチリルグアニン、５－フルオロシトシン、５－ブロモシトシン、５－メチルシトシン、４－Ｎ－メチルシトシン、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルシトシン、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、又は５，６－ジヒドロウラシルなどを挙げることができる。
　切断剤は、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子である。切断剤としては、毒性の少なさや安価であるなどの観点から、銀が特に好ましい。切断剤が銀ナノ粒子である場合、切断対象核酸の式（１）におけるＸが硫黄であることが好ましい。
　金属ナノ粒子の平均粒径は、切断対象核酸に対する切断効率の高さなどの観点から、１００ｎｍ以下であることが好ましく、５０ｎｍ以下であることがより好ましく、２０ｎｍ以下であることが特に好ましい。また、金属ナノ粒子の平均粒径の下限は、特に限定されないが、例えば、０．１ｎｍ以上であり、０．５ｎｍ以上であることが好ましく、１ｎｍ以上であることがより好ましい。
　金属ナノ粒子は、切断対象核酸に対する切断活性の向上の観点から、ポリエチレングリコールで表面処理して表面にポリエチレングリコールを結合させることが好ましい。金属ナノ粒子の表面にポリエチレングリコールを結合させることで、金属ナノ粒子の表面の酸化が防止され、かつ金属ナノ粒子の水溶液中での分散性が向上する。このため、ポリエチレングリコール表面処理していない金属ナノ粒子と比較して、ポリエチレングリコールで表面処理した金属ナノ粒子は、切断対象核酸に対する切断活性が向上する。ポリエチレングリコールは、末端にチオール修飾を施したものを使用して金属ナノ粒子に結合させることができる。ポリエチレングリコールの平均分子量としては、１,０００～１０,０００の範囲内が好ましい。
（１）核酸調製工程
　次に、図１を参照して、本発明の各工程について説明する。図１の上段（「金属ナノ粒子による核酸鎖切断反応［Ｓｔｅｐ＿１］」）は、本発明の核酸鎖切断方法を模式的に示している。なお、図１では、式（１）のＸが硫黄であり、切断剤が銀ナノ粒子であり、切断対象核酸（チオ化オリゴ核酸）をＰＣＲプライマーとして使用するケースについて説明しているが、本発明はこれに限定されない。例えばＸがセレンの場合や、切断剤が水銀、カドミウムの場合も同様のメカニズムで切断対象核酸を切断することができる。
　まず、核酸調製工程について説明する。核酸調製工程は、式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する工程である。本工程では、下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬を用いて切断対象核酸の一部又は全部をホスホロアミダイト法で合成することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を示す。）
　式（３）で示されるアミダイト試薬（チオ化アミダイト試薬又はセレノ化アミダイト試薬）は、以下の方法で合成することができる。まず、塩基のアミノ基をアミド結合により保護し、５’炭素をジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ基）又はｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ基）で保護したヌクレオシド誘導体を用意する。次に、このヌクレオシド誘導体に、トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３）、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ）などを反応させて３’水酸基を立体反転させ、この３’水酸基にチオ安息香酸やセレノ安息香酸を反応させる。続いて、安息香酸をアルカリ加水分解することで、ヌクレオシド誘導体の３’水酸基の酸素が硫黄又はセレンに置換されたヌクレオシド類を得る。最後に、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトなどのアミダイト類を反応させて、目的とするアミダイト試薬を得ることができる。
　切断対象核酸は、式（３）で示されるチオ化又はセレノ化されたアミダイト試薬と、式（４）で示される通常の（すなわち、チオ化又はセレノ化されていない）アミダイト試薬とを用いて、公知の核酸自動合成装置を使用して合成することができる。式（４）で示されるアミダイト試薬で所望の配列の核酸を合成し、目的とする位置に式（３）で示されるアミダイト試薬を使用することで、チオ化又はセレノ化されたヌクレオチドが所望の位置に配置された切断対象核酸を合成することができる。
　切断対象核酸の合成の際には、活性化剤（アクチベーター）を添加することが好ましい。活性化剤としては、１Ｈ－テトラゾール（１Ｈ－ｔｅｔ）、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＦＴＨ）などを挙げることができる。これらのうち、副生成物（ジチオレート体）の生成量を減らして目的の切断対象核酸の収率が良い点から、ＢＴＦＴＨが最も好ましい。さらに、活性化剤としてＢＴＦＴＨを使用する場合、カップリング時間は６０～１２０秒の範囲内が好ましく、このカップリング時間で複数回（例えば２～７回）カップリング反応を行うことが、収率の向上の観点から好ましい。
　切断対象核酸は、上記の核酸自動合成装置を用いて全長を合成することができるが、切断対象核酸の一部のみを核酸自動合成装置で合成し、これをプライマーとして切断対象核酸と相補的な配列を有するテンプレートＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行うことで、切断対象核酸の全長を合成することができる。すなわち、ＰＣＲにより、テンプレートＤＮＡに沿ってプライマーを伸長させることで切断対象核酸を生成する。プライマーを構成するヌクレオチドの数は、目的に応じて適宜設定することができるが、例えば５ｍｅｒ以上、５０ｍｅｒ以下とすることができる。
　後述するように、本発明の切断対象核酸に接着末端を形成させ、他の接着末端を有するＤＮＡ鎖とライゲーションさせることで、ベクターなどを構築することができる。接着末端のうち突出した側の一本鎖ＤＮＡの長さが例えば２０塩基以上のように長い場合、これの相補鎖側の複数の個所に上記式（１）で示される構造を導入することが好ましい。この場合、後述する実施例で示すように、ライゲーション効率の観点から、式（１）の構造の間のヌクレオチド数ｎｔ（塩基数：ｂ）は、１５以下であることが好ましく、１０以下であることがより好ましい。このヌクレオチド数が１５以下であることで、金属ナノ粒子による鎖切断後のＤＮＡ断片の解離が早くなり、ライゲーション効率が高くなりやすい。
（２）切断工程
　次に、切断工程について説明する。切断工程では、切断対象核酸と切断剤とを反応させて式（１）のＸの部分で切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる。図１では、銀ナノ粒子を使用して切断対象核酸（チオ化オリゴ核酸）を切断しており、切断後はＸの部分より５’末端側のオリゴ核酸が切除されて切断部はリン酸基となる。
　切断剤は、金属ナノ粒子を分散させた分散液の状態で使用することが好ましい。切断反応は、切断活性の高さの観点から、７０℃以上で行うことが好ましく、９０℃以上で行うことがより好ましく、９５℃以上で行うことが特に好ましい。切断反応の温度の上限は特に制限はなく、１００℃以下であることが好ましい。また、切断反応の反応時間は、反応温度に応じて適宜設定することができ、反応温度が高いほど反応時間を短く設定することが可能である。反応時間としては、５分以上、１２０分以下の範囲が好ましい。
２．核酸鎖切断装置
　次に、核酸鎖切断装置について説明する。本発明の核酸鎖切断装置は、上記の核酸鎖切断方法を実施するための装置である。核酸鎖切断装置は、式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製手段と、切断対象核酸と切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で切断対象核酸を切断し、式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断手段と、を備えている。
　核酸調整手段としては、上記の下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬、核酸自動合成装置、核酸合成に使用する各種試薬などが含まれる。また、核酸自動合成装置で合成した核酸をプライマーとして使用する場合は、テンプレートＤＮＡやＰＣＲ装置、ＰＣＲに使用する試薬なども核酸調整手段に含まれる。
　切断手段としては、核酸調整手段で合成した切断対象核酸、上記の切断剤、切断剤による切断対象核酸の切断反応を行うための各種装置（インキュベータなど）、反応に使用する各種試薬などが含まれる。
３．接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法
　次に、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造する方法について説明する。本発明の製造方法では、二本鎖ＤＮＡの一方の末端側又は両方の末端側に接着末端を形成させる。まず、二本鎖ＤＮＡ調製工程を行う。この工程では、センス鎖とアンチセンス鎖とからなる切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する。アンチセンス鎖は、上記のセンス鎖と相補的な配列を有している。このセンス鎖とアンチセンス鎖の少なくとも一方に、式（１）で示される構造を有している。図１の下段（四角で囲った部分）では、センス鎖とアンチセンス鎖の両方にそれぞれ式（１）の構造を有する場合について示している。このように、両方の鎖に式（１）の構造を導入することで、後述する接着末端生成工程で、両端が接着末端を有するＤＮＡを生成させることができる。
　次に、接着末端生成工程を行う（図１の「［Ｓｔｅｐ＿１］鎖切断」）。この工程では、切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて式（１）のＸの部分でセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖を切断する。この結果、式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡが生成する。切断条件等は上記の「（２）切断工程」で説明したとおりである。
３．接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置
　次に、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造する装置について説明する。本発明の装置は、上記の接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法を実施するための装置である。具体的には、切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する二本鎖ＤＮＡ調製手段と、切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを生成させる接着末端生成手段と、を備えている。
　二本鎖ＤＮＡ調製手段としては、上記の「核酸調整手段」で説明した、式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬、核酸自動合成装置、テンプレートＤＮＡ、ＰＣＲ装置、各種試薬などが含まれる。
　接着末端生成手段としては、上記の「切断手段」で説明した、核酸調整手段で合成した切断対象核酸、切断剤、インキュベータなどの各種装置、各種試薬などが含まれる。
　本発明では、切断剤として、従来使用されている金属イオンを使用せずに金属ナノ粒子を使用しているため、金属イオンと同等の高い切断活性を保持しつつ切断生成物であるＤＮＡの回収率がより高くなり、効率的に接着末端を形成することができる。さらに、このような接着末端を有するＤＮＡどうしを自由に連結することができる。例えば、標的ＤＮＡとベクターの両者に共通の接着末端を切断剤で形成させ、これらをライゲーションして組換えＤＮＡを調製し、これをクローニングやライブラリーの作成、大量発現系の構築などに使用することができる。また、接着末端を有する複数のゲノム配列を連結することで、試験管内でゲノムビルドアップ反応を行うことができる（図１の下段「Ｓｔｅｐ＿２」参照）。あるいは、平滑末端の状態で細胞内に二本鎖ＤＮＡを導入し、細胞内で脱保護処理を行うことで、細胞内でゲノムビルドアップ反応を行うこともできる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。
１．チオ化アミダイト試薬の改良合成とオリゴ核酸への導入
（１）チオ化アミダイト試薬（チミジン誘導体：Ｔ，シチジン誘導体：Ｃ）の合成
　チオ化アミダイト試薬（チミジン誘導体：Ｔ，シチジン誘導体：Ｃ）の合成スキームを下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（ａ）化合物２Ｔ
　５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）チミジン（化合物１Ｔ）（１．０ｇ，１．８ｍｍｏｌ）にトリフェニルホスフィン（０．７２ｇ，２．８ｍｍｏｌ）を加えたのち、ジクロロメタン（６．０ｍＬ）に溶解させた。氷浴下、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．５４ｍＬ，２．８ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。室温で３時間撹拌したのち、反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むメタノール／酢酸エチル混合溶媒＝０／１→１／４）で精製し、白色固体として０．８９ｇ（１．７ｍｍｏｌ）の化合物２Ｔを得た（収率９４％）。
　１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．５９（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，１Ｈ），７．３７－７．３０（ｍ，２Ｈ），７．３０－７．１１（ｍ，７Ｈ），６．８５－６．７６（ｍ，４Ｈ），５．８５（ｄ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，１Ｈ），５．２７（ｑ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄｄ，Ｊ＝７．８，４．８，２．５Ｈｚ，１Ｈ），３．６８（ｄ，Ｊ＝２．５Ｈｚ，６Ｈ），３．１３－２．９８（ｍ，２Ｈ），２．５４（ｄｄ，Ｊ＝１２．８，１．５Ｈｚ，１Ｈ），２．４４－２．３７（ｍ，１Ｈ），１．７３（ｄ，Ｊ＝１．１Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｂ）化合物３Ｔ
　化合物２Ｔ（１．０ｇ，１．９ｍｍｏｌ）及びチオ安息香酸セシウム（１．８ｇ，７．０ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（４０ｍＬ）に懸濁させ、１２０℃で一晩撹拌した。さらにチオ安息香酸セシウム（１．８ｇ，７．０ｍｍｏｌ）を加え、１３０℃で一晩攪拌した。反応溶液を室温まで冷却したのち、酢酸エチルで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で２回洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより濃縮した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むメタノール／ジクロロメタン混合溶媒＝０／１→１：６０）で精製し、１．１ｇ（１．７ｍｍｏｌ）の化合物３Ｔを茶色固体として得た（収率９０％）。
　１Ｈ　ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．９３－７．８６（ｍ，２Ｈ），７．７１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６１－７．５６（ｍ，１Ｈ），７．４７－７．４３（ｍ，４Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，４Ｈ），７．２６（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．０Ｈｚ，２Ｈ），７．２２－７．１７（ｍ，１Ｈ），６．８２－６．７７（ｍ，４Ｈ），６．３０（ｄｄ，Ｊ＝６．６，５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），４．１４（ｄｔ，Ｊ＝７．２，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，６Ｈ），３．５２（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，２．４Ｈｚ，１Ｈ），３．４５（ｄｄ，Ｊ＝１０．８，３．１Ｈｚ，１Ｈ），２．７５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．８，８．３，５．２Ｈｚ，１Ｈ），２．５３－２．４８（ｍ，１Ｈ），１．４８（ｄ，Ｊ＝１．３Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｃ）化合物４Ｔ
　３０分間のアルゴンバブリングによる脱酸素処理を行なったエタノール（３０ｍＬ）－１０Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（４ｍＬ）混合溶液に化合物３Ｔ（８４０ｍｇ，１．２６ｍｍｏｌ）を溶解したのち、アルゴンバブリング下、室温で２時間攪拌した。反応溶液を氷浴上で冷却し、１Ｍ塩酸水溶液（４０ｍＬ）をゆっくりと滴下することにより反応を停止させた。生成した沈殿物を吸引濾過により回収し、濾紙上で水により３回洗浄した。得られた固体をジクロロメタンに溶解したのち無水硫酸ナトリウムで乾燥後、ロータリーエバポレーターで溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むヘキサン／酢酸エチル混合溶媒＝１／１→１／３）にて精製し、５６０ｍｇ（０．９９５ｍｍｏｌ）の化合物５Ｔを茶色固体として得た（収率７９％）。
　１Ｈ　ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ７．６８（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１Ｈ），７．４１（ｄｄ，Ｊ＝７．５，１．７Ｈｚ，２Ｈ），７．３４－７．２０（ｍ，７Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．０Ｈｚ，４Ｈ），６．１４（ｄｄ，Ｊ＝７．１，３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．１０（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），３．８５（ｄｔ，Ｊ＝８．８，２．７Ｈｚ，１Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ），３．６３－３．５６（ｍ，２Ｈ），３．３９（ｄｄ，Ｊ＝１１．０，２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．５９（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．９，７．６，２．９Ｈｚ，１Ｈ），２．３５（ｄｄｄ，Ｊ＝１３．９，１０．２，７．１Ｈｚ，１Ｈ），１．５５（ｄ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ），１．４８（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，３Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｄ）化合物５Ｔ
　化合物４Ｔ（３６０ｍｇ，０．６４０ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（５．００ｍｌ）に溶解させたのち、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３１μＬ，１．９２ｍｍｏｌ）を加えた。つづいて、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１８５μＬ，０．８３０ｍｍｏｌ）を加えたのち、室温で２時間攪拌した。反応溶液をジクロロメタンで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むヘキサン／酢酸エチル混合溶媒＝２／１→１／１．５）で精製し、３１２ｍｇ（０．４１０ｍｍｏｌ）の化合物５Ｔを白色固体として得た（収率６４％）。
　１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ９．４１（ｓ，１Ｈ），７．５５－７．４０（ｍ，３Ｈ），７．３８－７．２４（ｍ，６Ｈ），７．２４－７．１４（ｍ，１Ｈ），６．８３（ｄｄ，Ｊ＝８．７，５．５Ｈｚ，４Ｈ），６．１８－５．９９（ｍ，１Ｈ），４．１０－３．９３（ｍ，２Ｈ），３．８６－３．７５（ｍ，１Ｈ），３．７３（ｓ，６Ｈ），３．７１－３．４４（ｍ，４Ｈ），３．４４－３．２８（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．５３（ｍ，２Ｈ），２．５３－２．３９（ｍ，１Ｈ），１．９５（ｓ，１Ｈ），１．５５－１．４２（ｍ，３Ｈ），１．３１－１．０５（ｍ，９Ｈ），１．０３（ｓ，１Ｈ），１．０１（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ　ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤ３ＣＮ）δ１６１．９６，１５８．４４ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｅ）化合物２Ｃ
　Ｎ４－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－デオキシシチジン（化合物１Ｃ）（１．００ｇ，１．５７ｍｍｏｌ）をトルエン（２０．０ｍＬ）で３回共沸した。トリフェニルホスフィン（０．４５６ｇ，１．７４ｍｍｏｌ）を加えたのち、ジクロロメタン（６．００ｍＬ）に溶解させた。氷浴下、アゾジカルボン酸ジイソプロピル（０．４５６ｍＬ，１．７４ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。その後、室温で１６時間撹拌をした。反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むメタノール／酢酸エチル混合溶媒＝０／１→１／４）にて精製後、白色個体として０．７８０ｇ（１．２６ｍｍｏｌ）の化合物２Ｃを得た（収率７８％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ７．８１（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６９（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），７．１８－７．３９（ｍ，１２Ｈ），６．８４（ｄｄ，Ｊ＝９．０，３．６Ｈｚ，４Ｈ），６．４２（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），５．９７（ｄ，Ｊ＝４．１Ｈｚ，１Ｈ），５．３３（ｓ，１Ｈ），４．４０（ｓ，１Ｈ），３．７０（ｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，７Ｈ），３．０４－３．１３（ｍ，２Ｈ），２．６３（ｄ，Ｊ＝１１．９Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｆ）化合物３Ｃ
　化合物２Ｃ（２．８ｇ，４．８ｍｍｏｌ）及びチオ安息香酸セシウム（６．０ｇ，２４ｍｍｏｌ）を１，４－ジオキサン（６０ｍＬ）に溶解させ、室温で５時間撹拌した。その後、反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（１００ｍＬ）にて２回、飽和食塩水にて２回洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１→７／１）にて精製し、２．０ｇ（２．７ｍｍｏｌ）の化合物３Ｃを茶色固体として得た（収率５６％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．２９（ｓ，１Ｈ），８．５５（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．８８（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ），７．５０－７．７３（ｍ，４Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），７．１４－７．２７（ｍ，９Ｈ），６．８２（ｑ，Ｊ＝４．５Ｈｚ，５Ｈ），６．１２（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２３（ｓ，１Ｈ），３．６９（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），３．６６（ｓ，６Ｈ），２．６５（ｓ，２Ｈ），２．３６（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｇ）化合物４Ｃ、化合物５Ｃ
　３０分間のアルゴンバブリングによる脱酸素処理を行なったメタノール（１５ｍＬ）－ＴＨＦ（２１ｍＬ）－０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（２２ｍＬ，１１ｍｍｏｌ）混合溶液に化合物３Ｃ（１．６４ｇ，２．２ｍｍｏｌ）を溶解したのち、アルゴンバブリング下、－１０℃で３０分間攪拌した。反応溶液に対して、１Ｍリン酸二水素カリウム水溶液（４６．６ｍＬ，４６．６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下することにより反応を停止させた。酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈したのち、水（１００ｍＬ）で２回洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むメタノール／ジクロロメタン混合溶媒＝１／５０→１／１０）にて精製後、１．１８ｇの化合物４Ｃを白色固体として得た。得られた化合物４Ｃを０．９４ｇ（１．４３ｍｍｏｌ）測り取り、ジクロロメタン（１５．２ｍＬ）に溶解させたのち、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（０．３５ｍＬ，１．５７ｍｍｏｌ）及び２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（０．３５ｍＬ，１．５７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌した。反応溶液をジクロロメタン（２０ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶媒＝３／７）にて精製後、１．０ｇ（１．２ｍｍｏｌ）の化合物５Ｃを白色固体として得た（２段階通算収率６８％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．１９（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２－８．０５（ｍ，２Ｈ），７．５１－７．６３（ｍ，３Ｈ），７．３７－７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．３１（ｍ，５Ｈ），７．１８－７．２５（ｍ，３Ｈ），６．７７－６．８１（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７７（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，６Ｈ），３．５７－３．６７（ｍ，５Ｈ），３．４１－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．０７－３．１４（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），２．４４（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ），１．１８－１．２２（ｍ，６Ｈ），１．１３－１．１７（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．５７，１６１．６８ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（２）チオ化アミダイト試薬（アデノシン誘導体：Ａ）の合成
　チオ化アミダイト試薬（アデノシン誘導体：Ａ）の合成スキームを下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（ａ）化合物２Ａ、化合物３Ａ
　Ｎ６－ベンゾイル－５’－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２’－デオキシアデノシン（化合物１Ａ）（１０．０ｇ，１５．２ｍｍｏｌ）、４－ニトロ安息香酸（５．０８ｇ，３０．４ｍｍｏｌ）及びトリフェニルホスフィン（１６．０ｇ，６１．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（８００ｍＬ）に溶解させ、０℃で撹拌しながらアゾジカルボン酸ジイソプロピル（１１．９ｍＬ，６１．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。０℃で２時間攪拌後、反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝７／３）にて精製し、１８．５ｇの化合物２Ａを白色固体として得た。得られた化合物２Ａを１０．０ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）測り取り、炭酸カリウム（１．７１ｇ，４９．６ｍｍｏｌ）を加えたのち、メタノール（１２５ｍＬ）に溶解させた。氷浴下２時間攪拌したのち、反応溶液を濃縮した。残渣を酢酸エチル（７５ｍＬ）に溶解させ、水（７５ｍＬ）で２回洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）にて精製し、１．４０ｇ（２．１０ｍｍｏｌ）の化合物３Ａを白色固体として得た（２段階通算収率３８％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．１８（ｓ，１Ｈ），８．７５（ｓ，１Ｈ），８．４７（ｓ，１Ｈ），８．０３（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），７．５３－７．６６（ｍ，３Ｈ），７．１７－７．３９（ｍ，９Ｈ），６．７５－６．８３（ｍ，４Ｈ），６．５０（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，１Ｈ），５．４８（ｄ，Ｊ＝４．３Ｈｚ，１Ｈ），４．３１（ｄ，Ｊ＝４４．２Ｈｚ，２Ｈ），３．６６－３．７４（ｍ，６Ｈ），３．３７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），３．２０（ｄ，Ｊ＝１０．３Ｈｚ，１Ｈ），２．７８（ｓ，１Ｈ），２．３８（ｄ，Ｊ＝１４．６Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｂ）化合物４Ａ、化合物５Ａ、化合物６Ａ
　トリフェニルホスフィン（２．４ｇ，９．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５３ｍＬ）に溶解させ、氷浴下撹拌しながらアゾジカルボン酸ジイソプロピル（１．７５ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。氷浴下３０分間攪拌したのち、チオ安息香酸（１．０８ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下で更に３０分間撹拌した。つづいて、化合物３Ａ（２．０ｇ，３．０ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下１６時間撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮し、残渣をカラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１→２／１）にて精製し、２．３ｇの化合物４Ａを白色固体として得た。得られた化合物４Ａを２．３ｇ（３．０ｍｍｏｌ）測り取り、３０分間のアルゴンバブリングによる脱酸素処理を行なったメタノール（４２ｍＬ）－ＴＨＦ（２８ｍＬ）－０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１８ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）混合溶液に溶解したのち、アルゴンバブリング下、－１０℃で３０分間攪拌した。反応溶液に対して、１Ｍリン酸二水素カリウム水溶液（３８ｍＬ，１９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下することにより反応を停止させた。生成した沈殿物を吸引濾過により回収し、濾紙上で水（２００ｍＬ）により３回洗浄した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むメタノール／ジクロロメタン混合溶媒＝１／５０→１／２０）にて精製し、１．６２ｇの化合物５Ａを白色固体として得た。得られた化合物５Ａを１．５ｇ（２．３ｍｍｏｌ）測り取り、５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．３０ｇ，２．３ｍｍｏｌ）を加えたのち、ジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解させた。つづいて、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．１ｍＬ，３．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液をジクロロメタン（５０ｍＬ）で希釈したのち、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝２／１→８／１）にて精製し、０．４６ｇ（０．５４ｍｍｏｌ）の化合物６Ａを白色固体として得た（３段階通算収率１７％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ９．１９（ｓ，１Ｈ），８．７８（ｓ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，１Ｈ），８．０２－８．０５（ｍ，２Ｈ），７．５１－７．６３（ｍ，３Ｈ），７．３７－７．４２（ｍ，２Ｈ），７．２７－７．３１（ｍ，５Ｈ），７．１８－７．２５（ｍ，３Ｈ），６．７７－６．８１（ｍ，４Ｈ），６．４２（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．５Ｈｚ，１Ｈ），４．２１－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．９０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），３．７９－３．８５（ｍ，１Ｈ），３．７６－３．７７（ｍ，７Ｈ），３．５７－３．６７（ｍ，５Ｈ），３．４１－３．４５（ｍ，１Ｈ），３．０７－３．１４（ｍ，１Ｈ），２．６０（ｔ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，１Ｈ），１．１８－１．２２（ｍ，６Ｈ），１．１３－１．１７（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６５．２２ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（３）チオ化アミダイト試薬（グアノシン誘導体：Ｇ）の合成
　チオ化アミダイト試薬（グアノシン誘導体：Ｇ）の合成スキームを下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
（ａ）化合物２Ｇ
　化合物１Ｇ（７．３ｇ，１６ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（３７０ｍＬ）に溶解させ、Ｄｅｓｓ－Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（３４ｇ，８０ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（２１ｇ）を加えた。氷浴下で２時間、つづいて室温で３時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３７０ｍｌ）及びチオ硫酸ナトリウム（３７０ｍＬ）を加え、ジクロロメタン（７３０ｍＬ）で２回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。得られた２’－ケト体をテトラヒドロフラン（２６０ｍＬ）に溶解させ、－７８℃で３０分間撹拌した。つづいて、１Ｍ　Ｌ－ｓｅｌｅｃｔｒｉｄｅ／テトラヒドロフラン溶液（４０ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を滴下し、－７８℃で１６時間撹拌した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液（５０ｍＬ）を加えることで反応を終了させ、酢酸エチルで３回抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：メタノール／ジクロロメタン＝１／１５）にて精製し、３．６ｇ（８．０ｍｍｏｌ）の化合物２Ｇを白色固体として得た（収率５０％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．０６（ｓ，１Ｈ），１１．７０（ｓ，１Ｈ），８．１２－８．１９（ｍ，１Ｈ），６．１２（ｄｄ，Ｊ＝８．２，１．９Ｈｚ，１Ｈ），５．３５－５．３９（ｍ，１Ｈ），４．２９－４．３７（ｍ，１Ｈ），３．９２－４．１１（ｍ，２Ｈ），３．７３－３．７９（ｍ，１Ｈ），２．６５－２．８１（ｍ，２Ｈ），２．２１－２．３２（ｍ，１Ｈ），１．０８－１．１５（ｍ，６Ｈ），０．８３－０．８６（ｍ，９Ｈ），０．１６～－０．１４（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｂ）化合物３Ｇ、化合物４Ｇ
　トリフェニルホスフィン（１１ｇ，４０ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１４０ｍＬ）に溶解させ、氷浴下撹拌しながらアゾジカルボン酸ジイソプロピル（７．８ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下した。氷浴下３０分間攪拌し、チオ安息香酸（４．７ｍＬ，４０ｍｍｏｌ）を加え、更に３０分間０度で撹拌した。その後、化合物２Ｇ（３．０ｇ，６．７ｍｍｏｌ）を加え、氷浴下３時間、更に室温で１６時間攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮したのち、カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）にて精製したのち、２５ｇの化合物３Ｇを白色固体として得た。得られた化合物３Ｇ（２５ｇ，６．７ｍｏｌ）をテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）に溶解させたのち、トリエチルアミン三フッ化水素塩（１６ｍｌ，１００ｍｍｏｌ）を加え、室温で１６時間攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮したのち、カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：メタノール／ジクロロメタン＝１／１５）にて精製した。さらに、ジクロロメタンで再結晶を行い、２．４ｇ（５．２ｍｍｏｌ）の化合物４Ｇを白色固体として得た（２段階通算収率７８％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．０９（ｓ，１Ｈ），１１．６９（ｓ，１Ｈ），８．３４（ｄ，Ｊ＝１５．６Ｈｚ，１Ｈ），７．９３（ｄｄ，Ｊ＝８．３，０．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６７－７．７４（ｍ，１Ｈ），７．５４－７．６３（ｍ，２Ｈ），６．２４（ｔ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，１Ｈ），５．２０（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３４（ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，１Ｈ），４．０９－４．１４（ｍ，１Ｈ），３．６０－３．７４（ｍ，２Ｈ），３．０１－３．０５（ｍ，１Ｈ），２．７２－２．７９（ｍ，１Ｈ），２．５８－２．６３（ｍ，１Ｈ），１．１１（ｄｄ，Ｊ＝７．０，２．２Ｈｚ，６Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｃ）化合物５Ｇ
　化合物４Ｇ（１．５ｇ，３．３ｍｍｏｌ）及び４，４’－ジメトシキトリチルクロリド（２．２ｇ，６．６ｍｍｏｌ）をピリジン（３０ｍＬ）に溶解させ、室温で１６時間攪拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターにより濃縮したのち、残渣をジクロロメタン（５０ｍＬ）に溶解させ、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：メタノール／ジクロロメタン＝１／２０）にて精製後、２．４１ｇ（３．２ｍｍｏｌ）の化合物５Ｇを白色固体として得た（収率９７％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１２．１１（ｓ，１Ｈ），１１．７０（ｄ，Ｊ＝１７．３Ｈｚ，１Ｈ），８．１７－８．２６（ｍ，１Ｈ），７．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．３，１．２Ｈｚ，２Ｈ），７．５２－７．７９（ｍ，３Ｈ），７．１４－７．４０（ｍ，９Ｈ），６．７３－６．８２（ｍ，４Ｈ），６．３０（ｑ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４５－４．５７（ｍ，１Ｈ），４．２０－４．２３（ｍ，１Ｈ），３．６１－３．７９（ｍ，６Ｈ），３．２２－３．３１（ｍ，２Ｈ），３．１７（ｄｑ，Ｊ＝１３．７，３．９Ｈｚ，１Ｈ），２．６１－２．８２（ｍ，２Ｈ），１．１３（ｄｄ，Ｊ＝６．８，１．４Ｈｚ，６Ｈ）ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（ｄ）化合物６Ｇ、化合物７Ｇ
　化合物５Ｇ（２．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）をメタノール／テトラヒドロフラン混合溶媒（３／２，９０ｍＬ）に溶解させ、氷浴下３０分間攪拌した。次いで、０．５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１８ｍＬ，９．０ｍｍｏｌ）を加えたのち、アルゴンバブリングによる脱酸素条件下、０℃で２時間、室温で３０分間処理した。反応溶液に対して、１Ｍリン酸二水素カリウム水溶液（３３ｍＬ，３３ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下することにより反応を停止させた。つづいて、反応溶液を酢酸エチル（３００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）及び飽和食塩水（３００ｍｌ）で洗浄を行なった。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去し、１．７ｇの化合物６Ｇを白色個体として得た。得られた化合物６Ｇ（１．７ｇ，２．６ｍｍｏｌ）に５－（エチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．３４ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を加え、ジクロロメタン（４０ｍＬ）に溶解させた。つづいて、２－シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロジアミダイト（１．３ｍＬ，４．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液をジクロロメタン（３００ｍＬ）で希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３００ｍＬ）で２回洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムにより乾燥したのち、ロータリーエバポレーターにより溶媒留去した。カラムクロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、展開溶媒：１％トリエチルアミンを含むアセトニトリル／ジクロロメタン混合溶媒＝１／４）で精製し、１．２ｇ（１．４ｍｍｏｌ）の化合物７Ｇを白色固体として得た（収率５３％）。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１２．００（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４５（ｄ，Ｊ＝３４．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８３－７．８７（ｍ，１Ｈ），７．４１－７．４３（ｍ，２Ｈ），７．２９－７．３１（ｍ，４Ｈ），７．１７－７．２４（ｍ，３Ｈ），６．７３－６．８２（ｍ，４Ｈ），６．１４－６．１７（ｍ，１Ｈ），４．１９－４．２５（ｍ，１Ｈ），３．８７－３．５５（１１Ｈ），３．５４－３．２７（２Ｈ），３．００－３．１２（ｍ，１Ｈ），２．３２－２．６８（ｍ，４Ｈ），１．０９－１．２１（ｍ，１８Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１６０．８１，１５９．９７ｐｐｍ．スペクトルデータは文献値と良い一致を示した。
（４）チオ化アミダイト試薬（化合物５Ｔ）を用いた３’－チオリン酸結合を有するオリゴヌクレオチドの合成と逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析
（ａ）ＤＮＡ合成
　化合物５Ｔ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を合成した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端にはフルオレセイン（ＦＡＭ）を導入した。各種アミダイト試薬は７０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしては０．３Ｍ　ＢＴＴ、酸化剤としては０.０５Ｍのヨウ素（ピリジン/水；v/v：９/１）溶液を使用した。また、固相担体として６－ＦＡＭ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　５００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いることにより３’末端へＦＡＭが導入される設計とした。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。オリゴヌクレオチドのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量測定はマトリックスとして３－ヒドロキシピコリン酸を使用し、ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）のリニアーポジティブモードを用いて行った。
（ｂ）分析結果
　図２は、チオ化アミダイト試薬（化合物５Ｔ）を用いた３’－チオリン酸結合を有するオリゴヌクレオチドの合成と逆相ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分析結果を示している。
　図の（ａ）は、化合物５Ｔを用いて５’側から４塩基目と５塩基目の間に３’－チオリン酸結合を有する２０塩基長のオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を合成し、逆相ＨＰＬＣで分析した結果を示している。（ａ，ｂ）ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
＜使用システム＞
・カラム：ＹＭＣ　Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（カラムサイズ：２５０ｘ　１０.０ｍｍ）
・溶離液Ａ：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），
・溶離液Ｂ：アセトニトリル，
＜グラジエント条件＞
・流速：３ｍＬ／分，
・カラム温度：５０℃，
・検出波長：２６０ｎｍ．
　逆相ＨＰＬＣの結果、保持時間１８．８分付近に見られるメインピークが２０ｍｅｒの目的物ＤＮＡであり、５’－水酸基保護基としてＤＭＴｒ基が残った状態となっている。それに対して、一部、化合物５Ｔの導入段階で合成が停止した産物も保持時間１２．７～１３．５分付近に観測されたが、２０ｍｅｒの目的物のオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）とは容易に分離可能であった。保持時間１８．８分付近のピークを分取することにより、目的物ＤＮＡの５’－ＤＭＴｒ保護体を得た。
　図の（ｂ）は、逆相ＨＰＬＣにより分取精製した５’－ＤＭＴｒ保護体を、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、得られたＤＮＡを逆相ＨＰＬＣにより分析した結果を示している。その結果、保持時間１２．３分付近に一本のピークが観測され、９９％以上の高純度で目的物ＤＮＡが得られたことが確認できた。
　図の（ｃ）は、上記で得られたＤＮＡのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分子量解析結果を示している。この結果、目的物に由来するｍ／ｚ　６６５０．７のピークが観測された。
２．チオ化オリゴ核酸の金属ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断反応
（１）銀ナノ粒子処理によるＤＮＡ鎖切断反応の銀ナノ粒子サイズ
（ａ）銀ナノ粒子処理
　３μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を１０μＬ測りとり、５０μＬの銀ナノ粒子分散液（１０ｎｍ，０．０２ｍｇ／ｍＬ）を加え、３７℃で３１時間インキュベーションした。反応溶液を２０μＬ測りとり２０μＬの２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミド電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
（ｂ）銀ナノ粒子処理によるＤＮＡ鎖切断反応の反応時間・反応温度依存性
　３μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を１０μＬ測りとり、５０μＬの銀ナノ粒子分散液（１０ｎｍ，０．０２ｍｇ／ｍＬ）を加え、７０℃又は９５℃で所定の時間インキュベーションした。反応溶液を３０μＬ測りとり３０μＬの２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミド電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
（ｃ）結果
　図３は、銀ナノ粒子処理によるＤＮＡ鎖切断反応の検討と銀ナノ粒子サイズ及び反応時間・反応温度依存性の結果を示す図である。
　図の（ａ）は、銀ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断の銀ナノ粒子サイズ依存性の結果を示している。１０ｎｍ，２０ｎｍ，１００ｎｍの銀ナノ粒子を用い、２０ｍｅｒ　ＤＮＡ　５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’の鎖切断による１５ｍｅｒ　ＤＮＡ　５’－ｐＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’の生成を変性ゲル電気泳動により分析した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端には蛍光色素としてＦＡＭが導入されている。切断後１５ｍｅｒ　ＤＮＡの５’末端にはリン酸（ｐ）が残る設計になっている。切断反応は３７℃で３１時間行なった。ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、１０ｎｍ，２０ｎｍ，１００ｎｍの銀ナノ粒子を用いた際の切断効率はそれぞれ３５．９％，２１．９％，１３．１％となりナノ粒子サイズが大きくなるにつれて切断効率が低下することが明らかになった。
　図の（ｂ）は、銀ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断の反応時間及び反応温度依存性を示している。１０ｎｍの銀ナノ粒子を用い７０℃又は９５℃にて２０ｍｅｒ　ＤＮＡの鎖切断反応を行なった。反応は１５，３０，６０，１２０分間行いそれぞれの反応溶液を変性ゲル電気泳動により分析し、ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、各温度・時間における切断効率を算出し、横軸に反応時間、縦軸に切断効率をプロットした。その結果、反応時間依存的な鎖切断効率の向上が見られ、反応開始２時間後には７０℃では５０％程度、９５℃では９０％以上の鎖切断が観測され、温度上昇に伴い切断活性が向上することが明らかになった。このことから、市販のナノ粒子では高効率なＤＮＡ鎖切断を誘起するためには高温条件を要することがわかった。
（２）表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を用いたＤＮＡ鎖切断
（ａ）銀ナノ粒子表面のポリマー修飾
　３．４μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を９μＬ計りとり、５１μＬの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液（１０ｎｍ）を加え、所定の時間・温度でインキュベーションした。表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液は、５０μＬの市販の銀ナノ粒子分散液（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製、１０ｎｍ，０．０２ｍｇ／ｍＬ）に対して２３．９ｇ／Ｌの末端チオール化ＰＥＧ（Ｏ－［２－（３－メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］－Ｏ’－メチルポリエチレングリコール、平均分子量５，０００、シグマアルドリッチ社製）水溶液（１μＬ）を加えることで調製した。反応溶液を２０μＬ測りとり２０μＬの２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミド電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
（ｂ）結果
　図４は、銀ナノ粒子表面のポリマー修飾によるＤＮＡ鎖切断活性向上の結果を示す図である。
　図の（ａ）は、ポリマー修飾を施した銀ナノ粒子表面を表す模式図である。末端チオール修飾した平均分子量５,０００のポリエチレングリコール修飾を行なった。表面修飾ナノ粒子は市販の銀ナノ粒子分散液に対して任意の量のポリマーを混合することにより容易に調製可能である。添加するポリマー量を調節することにより修飾量をコントロールすることも可能である。
　図の（ｂ）は、１ｎｍの銀ナノ粒子の表面修飾の有無におけるＤＮＡ鎖切断活性の比較を行った結果を示している。図中のＰＥＧ－ＳＨは末端チオールを有するポリエチレングリコールを示す。反応は３７℃で３１時間行い、反応溶液を変性ゲル電気泳動により分析し、ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析を行い、切断効率を算出した。その結果、ＰＥＧ－ＳＨ修飾無しの場合には、切断効率は３５．９％となったのに対して、ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子の場合には９１．８％の切断活性を示し、表面ＰＥＧ修飾により大幅に切断活性が向上した。この切断活性向上効果はＰＥＧ修飾による銀ナノ粒子の表面酸化防止と水溶液内での分散性向上によって説明される。
　図の（ｃ）は、１ｎｍの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を用いたＤＮＡ鎖切断の反応時間依存性の結果を示している。反応は５０℃で１５，３０，６０分間行いそれぞれの反応溶液を変性ゲル電気泳動により分析し、ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、各反応時間における切断効率を算出した。その結果、反応時間依存的な鎖切断効率の向上が見られ、反応開始６０分後には９０％以上の切断が観測された。この結果から、市販の銀ナノ粒子表面をＰＥＧ修飾することにより、比較的温和な温度条件において高効率なＤＮＡ鎖切断が可能になった。
（３）二重鎖短鎖ＤＮＡの銀ナノ粒子処理による３’オーバーハング接着末端の調製
（ａ）３’オーバーハング接着末端の調製
　ＰＳ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）と相補鎖ＤＮＡ（５’－ＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡ－３’）をそれぞれ３μＭとなるように混合し、９５℃で３分間処理後、氷浴上にて１０分以上冷却することによりアニーリングを行なった。アニーリング後の溶液を９μＬ測りとり５１μＬの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液（１０ｎｍ）を加え、５０℃で所定の時間インキュベーションした。表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液は、５０μＬの市販の銀ナノ粒子分散液（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製、１０ｎｍ，０．０２ｍｇ／ｍＬ）に対して１μＬの末端チオールＰＥＧ水溶液（２３．９ｇ／Ｌ）を加えることで調製した。反応溶液を３０μＬ測りとり３０μＬの２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミド電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
（ｂ）結果
　図５は、二重鎖短鎖ＤＮＡの銀ナノ粒子処理による３’オーバーハング接着末端の調製を行った結果を示している。３’－ＳＰ結合を有する２０ｍｅｒの二重ＤＮＡの切断を１ｎｍの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を用いて行なった。ＳＰ結合は５’末端から５塩基目と６塩基目の間に位置し、切断が起こると５塩基突出した接着末端が調製できるように設計した。反応は５０℃で１５，３０，６０分間行いそれぞれの反応溶液を変性ゲル電気泳動により分析し、ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、各反応時間における切断効率を算出した。相補鎖有りと無しとで切断効率の比較を行い、各反応時間における切断効率を縦軸に、反応時間を横軸にプロットした。その結果、相補鎖有りの場合、相補鎖無しと比較して僅かに切断活性が低下したものの反応開始２時間後においてはほぼ同程度の切断活性を示し、９０％以上のＤＮＡが切断された。このことから、表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断が接着末端ＤＮＡ調製に応用可能であることが明らかになった。
３．チオ化オリゴ核酸をポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）用プライマーとして利用したオリゴ核酸ライゲーションへの応用
（１）実験項
（ａ）チオ化ＤＮＡをテンプレートとして用いたＰＣＲの検討
　１１０μＭチオ化テンプレートＤＮＡ（０．３７μＬ）と１５μＬプライマーＤＮＡ（１．３４μＬ）を混合し、各種ポリメラーゼのメーカー推奨条件に従い、ｄＮＴＰ混合物、各種ポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｋｕｓ－Ｎｅｏ，ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ，Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，Ｑ５　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）、ポリメラーゼ添付バッファーを加え、総液量２０μＬとした。つづいて、変性（９５℃、１分）－アニーリング（５０℃、３０秒）－鎖伸長（７２℃、３０分）を行い、反応溶液を２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（２０μＬ）で希釈した。２０％変性ゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素含有、２０ｘ　２２ｃｍ、２０Ｗ、２ｈ）により分析した。１ｘ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ溶液を用い３０分間振盪することによりゲルの染色を行い、ゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）によりゲル泳動像を取得した。
（ｂ）チオ化ＤＮＡプライマーを用いたＰＣＲ
　２０μＭチオ化Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（１．２５μＬ）、２０μＭチオ化Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（１．２５μＬ）、１０ｎｇ／μＬテンプレートＤＮＡ（２．５μＬ）、２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物（５μＬ）、２５ｍＭ硫酸マグネシウム（３μＬ）、１０ｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（５μＬ）、超脱イオン水（３１μＬ）を混合し、１Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（１μＬ）を加えたのち、サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、９５℃で２分間処理した。つづいて、変性（９５℃、１５秒）－アニーリング（５５℃、１５秒）－鎖伸長（６８℃、３０秒）を３０サイクル行うことによりＤＮＡ増幅した。ＰＣＲ産物をｗｉｚａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ（プロメガ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルに従い精製し、チオ化ＤＮＡを得た。
（ｃ）金属ナノ粒子処理による接着断片の調製
　７．５ｎＭ　ＰＣＲ産物チオ化ＤＮＡ（２２５ｆｍｏｌ／ｓａｍｐｌｅ）を超脱イオン水に溶解し４．５μＬの水溶液を調製した。１０ｎｍの銀ナノ粒子（シグマアルドリッチ社製、２００μｇ／ｍＬクエン酸バッファー懸濁液、２５μＬ）と末端チオール修飾ＰＥＧ（シグマアルドリッチ社製、２３．９ｇ／Ｌ水溶液、０．５μＬ）を混合することにより、ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を調製した。調製したＰＣＲ産物チオ化ＤＮＡ水溶液（４．５μＬ）とＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液（２５．５μＬ）を混合したのち、５０℃で２～４時間処理することによりＳＰ結合の切断を行い接着末端を調製した。
（ｄ）ＤＮＡリガーゼによるライゲーションとゲル解析
　７．５ｎＭ銀ナノ粒子処理産物ＤＮＡ＿１（３．６μＬ）、７．５ｎＭ銀ナノ粒子処理産物ＤＮＡ＿２（３．６μＬ）、１０ｘ　Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、０．９０μＬ）、超脱イオン水（０．４５μＬ）を混合したのち、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、２０００Ｕ／μＬ、０．４５μＬ）を加え、２５℃で３時間インキュベーションした。反応溶液（９μＬ）に対して、１μＬの１０ｘ　ローディングバッファーを加え、１％アガロールゲル電気泳動（泳動バッファー：１ｘ　ＴＢＥ、１００Ｖ、３０分）により分析した。１０，０００ｘ　ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　Ｉ溶液を用い３０分間振盪することによりゲルの染色を行い、ゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）によりゲル泳動像を取得した。
（２）結果
　図６は、チオ化オリゴ核酸をＤＮＡテンプレートへ導入した際のＰＣＲの検討結果を示している。５’末端から１４塩基目と１５塩基目の間に３’－ＳＰ結合を導入したテンプレートＤＮＡ　５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’に対して２２ｍｅｒの５’－ＦＡＭ化ＤＮＡプライマー５’－ＦＡＭ－ＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＴＴＡＧＣ－３’をアニーリングさせ、各種ポリメラーゼ（ＫＯＤ－Ｐｋｕｓ－Ｎｅｏ，　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳ，　Ｐｈｕｓｉｏｎ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，　Ｑ５　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ，　Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ，　Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）によるポリメラーゼ伸長反応を行なった。３’－ＳＰ修飾部位で伸長が止まる場合、２２ｍｅｒのプライマーから４塩基又は５塩基伸長した産物が生じる。一方、３’－ＳＰ修飾部位を問題なく伸長した場合、完全長の４１ｍｅｒのＤＮＡが生成する。反応溶液は２０％変性ゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、２０ｘ　２２ｃｍ、２０Ｗ、２時間）により分析し、５’－ＦＡＭ由来の蛍光検出を利用してゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）によりバンドを可視化した。その結果、いずれのポリメラーゼを用いた場合においても完全長４１ｍｅｒのＤＮＡ由来のバンドが見られ、３’－ＳＰ修飾部位での伸長停止産物は観測されなかった。このことから、３’－ＳＰ修飾を導入したＤＮＡがプライマーとして機能しうることが明らかになった。
　図７は、ＰＣＲによるＤＮＡ増幅とＢｓａＩ又は銀ナノ粒子処理による接着断片の調製の模式図を示している。図の（ａ）は、制限酵素ＢｓａＩを用いた４塩基オーバーハング接着末端の調製結果を示している。図の（ｂ）は、銀ナノ粒子処理による３’－ＳＰ結合切断を利用した８塩基オーバーハング接着末端の調製結果を示している。銀ナノ粒子は表面ＰＥＧ修飾を施した１０ｎｍサイズのものを使用した。
　図８は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いた接着断片の連結実験結果を示している。
　図の（ａ）は、銀ナノ粒子処理又はコントロール実験として制限酵素ＢｓａＩ処理により調製した２本の接着断片ＤＮＡのＴ４　ＤＮＡリガーゼによる連結を行い、１％アガロールゲル電気泳動（泳動バッファー：１ｘ　ＴＢＥ、１００Ｖ、３０分）により分析した結果を示している。反応は２５℃で３時間行い、ＰＣＲ産物ＤＮＡの銀ナノ粒子処理を６０，１２０，１８０，２４０分行い各反応時間における切断反応生成物を使用し、それらのＴ４　ＤＮＡリガーゼによる連結効率の比較を行なった。ゲルの結果より全ての連結反応条件において８３８ｂｐの連結産物の生成が確認された。
　図の（ｂ）は、各銀ナノ粒子処理時間における産物及びＢｓａＩ処理による産物の連結効率を示すグラフを示している。銀ナノ粒子処理時間を長くするにつれ、連結産物量が増加した。２４０分間の銀ナノ粒子処理により調製したＤＮＡ断片を連結した際に、ＢｓａＩ処理により調製したＤＮＡ断片の連結と比較して高い連結効率を示した。
４．チオ化オリゴ核酸鎖切断における硝酸銀処理（既存技術）と銀ナノ粒子処理（本発明の技術）との比較
（１）硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断
　３０μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ　２０ｍｅｒ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を使用した。なお、Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端には蛍光色素としてＦＡＭが導入されている。このＰＳ修飾ＤＮＡを１μＬ測りとり、５０ｍＭの硝酸銀水溶液（２９μＬ）と混合したのち、室温で５～４０分間インキュベートして切断反応を行った。所定の時間に達したら、反応溶液をそれぞれ５μＬずつ測りとり、６０ｍＭのエタンチオール水溶液（５μＬ）を加えることにより反応を停止させた。この時、銀イオン由来の白色沈殿の生成を確認した。この混合物（１０μＬ）に対して、２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（１０μＬ）を加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。その結果を図９に示す。
　図９は、既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断結果を示す図である。２０ｍｅｒのＰＳ－ＤＮＡ　５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’の硝酸銀処理による鎖切断生成物である１５ｍｅｒ　ＤＮＡ　５’－ｐＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’の生成を変性ゲル電気泳動により分析した。切断後１５ｍｅｒ　ＤＮＡの５’末端にはリン酸（ｐ）が残る設計になっている。ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、反応開始５分で９０％以上のＤＮＡが切断されることが示された。
（２）硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断における切断生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量解析
　１１０μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ　４１ｍｅｒ（５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’）を３μＬ測りとり、５０ｍＭの硝酸銀水溶液（６７μＬ）と混合したのち、室温で２２時間インキュベートした。反応溶液を限外濾過遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　３Ｋ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルにしたがい、分子量３Ｋよりも小さい分子をカットオフすることで、硝酸銀を除去した。この操作により、反応系中に含まれる銀イオンなどを大雑把に取り除くことができる。限外濾過後に残った溶液を回収し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分子量解析を行った。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分子量解析はマトリックスとして３－ヒドロキシピコリン酸を用い、ＵｌｔｒａＦｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ社製）のリニアーネガティブモードで測定した。その結果を図１０に示す。
　図１０は、既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断における切断生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる分子量解析結果を示す図である。
　図の（ａ）は、切断標的ＤＮＡ（４１ｍｅｒ）５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’とその切断生成物ＤＮＡ断片の配列を示す。図中の矢印で示す３’－ＳＰ結合部位で切断され、５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（１５ｍｅｒ）側が３’－ＳＨとなり（５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓ－３’）、３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）は５’－リン酸体（５’－ｐＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’、ｐはリン酸基を示す）となる設計である。
　図の（ｂ）は、硝酸銀処理による切断反応液のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分子量解析を示す図である。切断によって生成する５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（１５ｍｅｒ）と３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）の分子量４６６．２、８０４０．２に対応するピークが観測されたことがら目的のＤＮＡ断片が生成したと考えられる。
　図の（ｃ）は、硝酸銀処理による切断生成物５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（１５ｍｅｒ）に由来するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルピーク領域の拡大図である。
　図の（ｄ）は、硝酸銀処理による切断生成物３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）に由来するＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトルピーク領域の拡大図である。
　図（ｃ）、（ｄ）より、切断生成物は、リン酸結合部位に複数の銀イオンが付加した形で存在することが示された。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳスペクトル上では、銀イオン付加数が異なるクラスター状の分子量分布を持ったピークとして検出された。これらの結果より、硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断においては、過剰に添加された銀イオンを簡単な限外濾過程度の処理では取り除くことが困難であることが示された。銀イオンは生理的条件・生化学実験に用いられるバッファー中に含まれる塩化物イオン（Ｃｌ－）と強固に結合し、難水溶性のＡｇＣｌが形成され沈殿が生じる（ＡｇＣｌの水溶性は１９２μｇ／１００ｍ：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃ．，２０１５，１１９，２０６３２－２０６４１）。したがって、ＤＮＡ切断反応が高効率で起こったとしても銀イオンが溶液中に残ってしまうような銀イオンによる切断系は、ＤＮＡ切断反応後のライゲーション反応への応用が困難であった。
（３）硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断とチオール類添加による銀イオン除去後の切断生成物ＤＮＡの回収量の比較
　銀イオンはチオール類との高い相互作用により沈殿として取り除けることが報告されている。したがって、切断反応溶液に対してジチオスレイトール（ＤＴＴ）やエタンチオール（ＥｔＳＨ）を加えることにより反応を停止させ、生成した銀に由来する沈殿を遠心分離により取り除いた。その上清を回収し、変性ゲル電気泳動により分析した。
　１１０μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ　４１ｍｅｒ（５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’）を１０μＬ（１．１０ｎｍｏｌ）測りとり、５０ｍＭの硝酸銀水溶液（９０μＬ）と混合したのち、室温で１日間インキュベートして切断反応を行った。反応溶液を２０μＬ（２２０ｐｍｏｌ）測りとり、６０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）水溶液（２０μＬ）又は６０ｍＭエタンチオール（ＥｔＳＨ）水溶液（２０μＬ）を加えることで反応を停止させた。この時、銀イオン由来の白色沈殿の生成を確認した。この混合物を超脱イオン水（１６０μＬ）で希釈したのち、室温で２０分間インキュベートした。つづいて、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，１５分）を行うことにより銀イオンに由来する沈殿物を除去した。上清を回収し、限外濾過遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　３Ｋ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルにしたがい、濃縮した。
　濃縮したサンプル溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて核酸由来の２６０ｎｍの吸光度を測定することにより切断生成物の定量を行うことにより生成物の回収量を算出した。切断生成物量を算出する上では、両切断生成物の２６０ｎｍにおけるモル吸光係数の合計値であるε２６０＝３９６，９００Ｌ・ｍｏｌ－１・ｃｍ－１又は、３’側の切断生成物（５’－ｐＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’）の２６０ｎｍにおけるモル吸光係数であるε２６０＝２５０，０００Ｌ・ｍｏｌ－１・ｃｍ－１を使用し、ランベルト・ベールの法則によりＤＮＡの定量を行った。濃縮後のサンプル溶液を５μＬ測りとり、２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）と混合した。９５℃で１０分間処理したのち、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。泳動後のゲルを取り出し、１ｘ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ水溶液に浸し、２０分間振盪することでゲル中に存在するＤＮＡバンドの染色を行った。ＤＮＡに結合したＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ由来蛍光検出により、ゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。その結果を図１１に示す。
　図１１は、既存技術である硝酸銀処理によるチオ化オリゴ核酸鎖切断とチオール類添加による銀イオン除去を検討した結果である。切断標的ＤＮＡとして、４１ｍｅｒの５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’を用い、図中に示されるように、３’－ＳＰ結合部位で切断され、５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（１５ｍｅｒ）５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓ－３’）と３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）５’－ｐＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’が生成する設計である。
　ゲル分析によるＤＮＡの染色においてはＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩを用い、ＤＮＡに結合したＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＩＩ由来蛍光検出によるゲル上のバンドを可視化した。その結果、ＤＴＴを反応停止に用いた系においては切断生成物５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ、３’－ｆｒａｇｍｅｎｔとともに５’－ｆｒａｇｍｅｎｔのチオール部位がジスルフィド結合により二量化したものに由来するバンドが観測された。二量化に由来するバンドは原料の切断標的ＤＮＡである４１ｍｅｒの５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’とほぼ同じ移動度であり、判別が困難であったが、ゲルのバンドを切り出しゲル片からＤＮＡを抽出したのち、抽出物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分子量解析の結果、５’－ｆｒａｇｍｅｎｔの二量化体であることが判明した。
　ＥｔＳＨを反応停止に用いた系においては切断標的ＤＮＡである４１ｍｅｒの５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’に由来するバンドは完全に消失し、切断生成物の３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）５’－ｐＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’のみがゲル上で観測された。これは、５’側の切断生成物である５’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（１５ｍｅｒ）５’－ＡＧＧＧＧＴＧＣＣＴＡＡＴＧＴｓ－３’がＥｔＳＨと強固に結合し、銀イオンとともに沈殿を形成したため、銀イオン沈殿除去後、３’側の切断生成物である３’－ｆｒａｇｍｅｎｔ（２６ｍｅｒ）５’－ｐＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－３’のみが上清として回収されてためと考えられる。
　さらに、チオール類添加による銀イオン沈殿除去後の上清に含まれるＤＮＡ量をＤＮＡ由来２６０ｎｍの吸光度測定により定量した結果を図中の表に示す。反応溶液あたりのＤＮＡ総量は２２０ｐｍｏｌであったが、切断生成物ＤＮＡ回収量はＤＴＴ添加系の場合は９２ｐｍｏｌ、ＥｔＳＨ添加系の場合は８８ｐｍｏｌとなり、回収率はどちらの系においても４０％程度であった。この結果より、チオール類による銀イオン沈殿除去法は銀イオンとともに６０％程度の切断生成物ＤＮＡが共沈してしまい、切断生成物の収量を低下させることが示された。このことからも、既存技術である硝酸銀によるチオ化オリゴ核酸鎖切断法は実用化が困難であることが明らかになった。
（４）銀ナノ粒子の遠心分離による除去の実証
　銀ナノ粒子は表面プラズモン共鳴効果により粒子径に依存した３５０～７００ｎｍの範囲に及ぶ吸収を示すことが知られている。したがって、分散液の吸収スペクトルを取得することにより、分散液中に存在するナノ粒子量を吸光度から見積もることができる。
　１０，２０，１００ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を７００μＬ測りとり、超脱イオン水（７００μＬ）で希釈したのち、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて吸収スペクトル測定を行った。測定に用いた装置は日本分光社製の紫外可視分光高度計Ｖ－６５０である。測定条件としては、データ間隔：０．５ｎｍ、バンド幅：１．０ｎｍ、レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ、走査速度：１００ｎｍ／分、に設定した。吸収スペクトル測定後、超脱イオン水（７００μＬ）で希釈した銀ナノ粒子分散液をエッペンドルフチューブへ移し、１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することによりナノ粒子を沈殿させ、その上清を回収し再び石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）へ移したのち、吸収スペクトルを測定した。その結果を図１２に示す。
　図１２は、銀ナノ粒子の遠心分離による除去（ナノ粒子サイズ依存性）を示す図である。図の（ａ）は、粒子径１０ｎｍの銀ナノ粒子を用いた際の結果を示している。図の（ｂ）は、粒子径２０ｎｍの銀ナノ粒子を用いた際の結果を示している。図の（ｃ）は、粒子径１００ｎｍの銀ナノ粒子を用いた際の結果を示している。図中の青色のスペクトルは０．０１ｍｇ／ｍＬの銀ナノ粒子分散液に由来するものである。図中のオレンジ色のスペクトルはナノ粒子分散液を１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することによりナノ粒子を沈殿させ、得られた上清を回収し測定した結果である。
　その結果、粒子径１０ｎｍの銀ナノ粒子分散液では２９．９％、粒子径２０ｎｍの銀ナノ粒子分散液では８２．４％、粒子径１００ｎｍの銀ナノ粒子分散液ではほぼ１００％、遠心により４００～５００ｎｍ付近の吸光度の減少が観測された。この結果は、遠心分離操作により分散液中に浮遊していたナノ粒子が沈殿したことを意味する。したがって、遠心分離により粒子径１０～１００ｎｍの銀ナノ粒子が沈殿として反応溶液から除去可能であることがわかった。さらに、銀ナノ粒子サイズが大きくなるほど遠心により反応系から取り除くことが容易になり、２０ｎｍ以上の粒子径を有するナノ粒子であれば遠心により取り除くことができることが示された。
（５）チオ化オリゴ核酸鎖切断における硝酸銀処理と銀ナノ粒子処理の比較（オリゴ核酸回収量の算出）
（ａ）硝酸銀処理
　１２２μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ　２０ｍｅｒ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を２μＬ測りとり、５０ｍＭの硝酸銀水溶液（３８μＬ）と混合したのち、室温で１．５時間インキュベートした。所定の時間に達したら、反応溶液（４０μＬ）に対して６０ｍＭのＤＴＴ水溶液（４０μＬ）を加えることにより反応を停止させた。この時、銀イオン由来の白色沈殿の生成を確認した。この混合物（８０μＬ）を超脱イオン水（２０μＬ）で希釈しよく混合したのち、１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することにより沈殿物を除去した。上清を回収し、限外濾過遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　３Ｋ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルにしたがい、濃縮した。濃縮したサンプル溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて核酸由来の２６０ｎｍの吸光度を測定することにより切断生成物の定量を行うことにより生成物の回収量を算出した。濃縮後のサンプル溶液を超脱イオン水で希釈し、０．５０μＭ水溶液を調製した。０．５０μＭの切断生成物溶液を５μＬ測りとり、２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）と混合した。９５℃で５分間処理したのち、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，５μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
（ｂ）銀ナノ粒子処理
　１２２μＭのＰＳ修飾ＤＮＡ　２０ｍｅｒ（５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を２μＬ測りとり、１００ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）（９８μＬ）と混合したのち、９０℃で２５時間インキュベートした。反応溶液を１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することにより銀ナノ粒子を沈殿として除去した。上清を回収し、限外濾過遠心式フィルター（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　３Ｋ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルにしたがい、濃縮した。濃縮したサンプル溶液を、ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて核酸由来の２６０ｎｍの吸光度を測定することにより切断生成物の定量を行うことにより生成物の回収量を算出した。濃縮後のサンプル溶液を超脱イオン水で希釈し、０．５０μＭ水溶液を調製した。０．５０μＭの切断生成物溶液を５μＬ測りとり、２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（５μＬ）と混合した。９５℃で５分間処理したのち、１５％変性アクリルアミドゲル電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ　１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，５μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。その結果を図１３に示す。
　図１３は、チオ化オリゴ核酸鎖切断における硝酸銀処理と銀ナノ粒子処理の比較。ゲル画像中、Ｌａｎｅ１は切断後に生じるＤＮＡと同じ塩基長のＤＮＡ（１５ｍｅｒ）５’－ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を泳動した結果である。Ｌａｎｅ２は切断標的ＤＮＡ（２０ｍｅｒ）５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を泳動した結果である。配列中のＴｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端には蛍光色素としてＦＡＭが導入されている。Ｌａｎｅ３は、粒子径１００ｎｍの銀ナノ粒子を用いてチオ化オリゴ核酸鎖切断を行った時の反応生成物を泳動した結果である。反応は銀ナノ粒子を添加後、９０℃で２５時間インキュベートすることにより行った。反応溶液中の銀ナノ粒子は、１５，０００ｒｐｍで１時間遠心分離することにより沈殿として除去したのち、電気泳動を行った。その結果、切断標的ＤＮＡ（２０ｍｅｒ）はほぼ全て消失し、切断生成物ＤＮＡ（１５ｍｅｒ）に変換されたことが示された（８９．６％）。Ｌａｎｅ４は、硝酸銀を用いてチオ化オリゴ核酸鎖切断を行った時の反応生成物を泳動した結果である。反応は硝酸銀を添加後、室温で１．５時間インキュベートすることにより行った。反応溶液中の銀イオンは、ＤＴＴを加えることにより沈殿として除去したのち電気泳動を行った。その結果、切断標的ＤＮＡ（２０ｍｅｒ）が切断され、切断生成物ＤＮＡ（１５ｍｅｒ）に変換されたことが示された（９８．７％）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
　上記は、硝酸銀処理と銀ナノ粒子処理における切断生成物ＤＮＡの回収量の比較を示す表である。硝酸銀処理の場合、ＤＴＴ添加による銀イオン沈殿除去後の上清に含まれるＤＮＡ量をＤＮＡ由来２６０ｎｍの吸光度測定により定量した。銀ナノ粒子処理の場合、遠心分離により銀ナノ粒子を沈殿として除去した後、上清に含まれるＤＮＡ量をＤＮＡ由来２６０ｎｍの吸光度測定により定量した。その結果、反応溶液あたりのＤＮＡ総量は２４４ｐｍｏｌだったのに対して、硝酸銀処理の場合は切断生成物ＤＮＡ回収量が３５．１ｐｍｏｌ、回収率は僅か１４．４％となり、ほとんどの切断生成物はＤＴＴ添加による銀イオン沈殿除去の際に共沈してしまったと考えられる。一方、銀ナノ粒子処理の場合は２４０ｐｍｏｌとなり、ほぼ定量的に切断生成物ＤＮＡが回収された。この結果より、既存技術である硝酸銀によるチオ化オリゴ核酸鎖切断法は収量が大幅に低下するため実用化が困難であるが、銀ナノ粒子による切断法は高効率に切断生成物を回収でき実用的な技術である。
（６）銀ナノ粒子の表面ＰＥＧ修飾に伴う分散性評価
　銀ナノ粒子の表面修飾は末端チオール化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ－ＳＨ）を市販の銀ナノ粒子分散液（酸化防止剤としてクエン酸を含む、粒子径２０ｎｍ）と混合することにより容易に調製できる。ＰＥＧ－ＳＨの平均分子量は５，０００のものを使用した。ナノ粒子分散液の表面プラズモン共鳴効果に基づく吸収スペクトルを測定することにより、ナノ粒子の分散性を評価した。
　表面修飾無し銀ナノ粒子分散液の吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、超脱イオン水（１０５０μＬ）で希釈したのち、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。表面修飾無し銀ナノ粒子分散液のバッファー・塩類存在下における吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、超脱イオン水（６３０μＬ）で希釈したのち、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）（１４０μＬ）、５００ｍＭ塩化カリウム水溶液（１４０μＬ）、１５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（１４０μＬ）を加えることによりサンプル調製し、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。
　表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液の吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、２３．９ｇ／Ｌの末端チオール化ＰＥＧ（Ｏ－［２－（３－メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］－Ｏ’－メチルポリエチレングリコール、平均分子量５，０００、シグマアルドリッチ社製）水溶液（１４０μＬ）を加えたのち、超脱イオン水（９１０μＬ）で希釈し、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液のバッファー・塩類存在下における吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、２３．９ｇ／Ｌの末端チオール化ＰＥＧ（Ｏ－［２－（３－メルカプトプロピオニルアミノ）エチル］－Ｏ’－メチルポリエチレングリコール、平均分子量５，０００、シグマアルドリッチ社製）水溶液（１４０μＬ）を加えたのち、超脱イオン水（４９０μＬ）で希釈、次いで、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）（１４０μＬ）、５００ｍＭ塩化カリウム水溶液（１４０μＬ）、１５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（１４０μＬ）を加えることによりサンプル調製し、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。測定に用いた装置は日本分光社製の紫外可視分光高度計Ｖ－６５０である。測定条件としては、データ間隔：０．５ｎｍ、バンド幅：１．０ｎｍ、レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ、走査速度：１００ｎｍ／分に設定した。その結果を図１４に示す。
　図１４は、銀ナノ粒子の表面ＰＥＧ修飾により分散性が向上したことを示す図である。図中の青色スペクトルは市販の銀ナノ粒子分散液に由来する吸収スペクトルであり、３９６ｎｍに極大吸収が観測された。このナノ粒子分散液に対して生化学実験、特にＤＮＡリガーゼによるライゲーションによく用いられるトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．３）、塩として塩化カリウム及び塩化マグネシウム水溶液を加えたところ赤色のスペクトルで示されるように３９６ｎｍ付近の吸収が消失した。この結果は、バッファーや塩類を添加することにより銀ナノ粒子表面がＡｇＣｌでコーティングされ、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌ’ｓ相互作用によりナノ粒子同士が結合し凝集体として沈殿したことを示している。一方、表面ＰＥＧ修飾を施した銀ナノ粒子も灰色スペクトルで示すように市販の銀ナノ粒子と同等の吸収特性を有するが、表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子はオレンジ色スペクトルで示すようにバッファーや塩類を加えても３９６ｎｍ付近に強い吸収が観測された。このことから、表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子はナノ粒子表面がＰＥＧの排除体積効果により保護されており、バッファーや塩類存在下においても高い分散性を発揮することがわかった。
（７）銀ナノ粒子のＰＥＧ４０００存在下における分散性評価
　ＰＥＧ４０００（ポリエチレングリコール４，０００、平均分子量２７００～３３００、富士フィルム－和光純薬社製）存在下における銀ナノ粒子分散液の吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、超脱イオン水（９１０μＬ）で希釈したのち、１５．８ｇ／ＬのＰＥＧ４０００水溶液（１４０μＬ）を加えることによりサンプル調製し、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。バッファー・塩類存在下における吸収スペクトルは、２０ｎｍの粒子径を持つ銀ナノ粒子の分散液（シグマアルドリッチ社製，０．０２ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム水溶液）を３５０μＬ測りとり、超脱イオン水（４９０μＬ）で希釈したのち、１５．８ｇ／ＬのＰＥＧ４０００水溶液（１４０μＬ）、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．３）（１４０μＬ）、５００ｍＭ塩化カリウム水溶液（１４０μＬ）、１５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液（１４０μＬ）を加えることによりサンプル調製し、石英セル（光路長：１ｃｍ、光路幅：１ｃｍ）を用いて測定した。測定に用いた装置は日本分光社製の紫外可視分光高度計Ｖ－６５０である。測定条件としては、データ間隔：０．５ｎｍ、バンド幅：１．０ｎｍ、レスポンス：ｍｅｄｉｕｍ、走査速度：１００ｎｍ／分に設定した。その結果を図１５に示す。
　図１５は、表面修飾用ＰＥＧのチオール基が銀ナノ粒子との相互作用に重要であり、表面ＰＥＧ修飾により銀ナノ粒子の分散性が向上したことを証明するための図である。この実験では、比較として、銀ナノ粒子と直接相互作用しないと考えられるチオール未修飾ＰＥＧ４０００（平均分子量２７００～３３００、富士フィルム－和光純薬社製）存在下において銀ナノ粒子（粒子径２０ｎｍ）の分散液中での挙動を吸収スペクトル測定により解析した。図中の青色スペクトルは銀ナノ粒子分散液に対してＰＥＧ４０００を１．５８ｇ／Ｌ添加した分散液の吸収挙動を示すものである。市販の銀ナノ粒子分散液そのものと同様に３９６ｎｍに極大吸収を示すスペクトが観測された。しかしながら、この分散液にトリス塩酸バッファー（ｐＨ８．３）、塩として塩化カリウム及び塩化マグネシウム水溶液を加えたところ、灰色及び赤色のスペクトルで示すように、３９６ｎｍ付近の吸収がほぼ消失したことから、銀ナノ粒子の表面修飾が起こらないＰＥＧ４０００では銀ナノ粒子表面の保護効果が得られず分散性向上は期待できないことが示された。このことから、チオール化ＰＥＧによる表面修飾が銀ナノ粒子の活性向上と活性維持に必要不可欠であると考えられる。
　図１６は、銀ナノ粒子によるＤＮＡ鎖切断による接着末端生成を利用したＤＮＡ連結反応の配列デザインを示す図である。連結産物ＤＮＡの全長は８４８塩基対であり、Ｔｓで示される３’－ＳＰ結合を有する二種類のＤＮＡプライマー　Ｒｅｖ　ｆｏｒ　Ｆ１：　５’－ＡＧＣＧＣＣＡＴｓＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ－３’とＦｗ　ｆｏｒ　Ｆ１：　５’－ＡＴＧＧＣＧＣＴｓＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣ－３’を用いることによりそれぞれ２９８塩基対、５５８塩基対のＤＮＡ断片をＰＣＲにより増幅し、得られたＰＣＲ増幅産物を銀ナノ粒子処理することにより５’－側が８塩基突出した接着末端を調製できる設計となっている。連結産物配列中の赤色下線部（ＡＴＧＧＣＧＣＴ）が８塩基突出部分の配列に相当する。ＰＣＲ増幅後の２９８塩基対と５５８塩基対のＤＮＡを銀ナノ粒子処理後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによりライゲーションすることで全長８４８塩基対の連結産物ＤＮＡが合成できる。二種類のＤＮＡプライマー　Ｒｅｖ　ｆｏｒ　Ｆ１：　５’－ＡＧＣＧＣＣＡＴｓＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧ－３’とＦｗ　ｆｏｒ　Ｆ１：　５’－ＡＴＧＧＣＧＣＴｓＴＴＧＣＣＴＧＧＴＴＴＣ－３’は核酸自動合成機により合成した。
（８）３’－チオ化アミダイトの反応条件改良を目指した二量体モデル合成におけるカップリング条件最適化
　反応追跡実験：化合物５Ｔ（１００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、３，５－Ｂｉｓ［３，５－ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌｅ（５３３ｍｇ，１．６９ｍｍｏｌ，１３ｅｑ．）、ｄ４Ｔ（８８ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）をアセトニトリル（６．７６ｍｌ）に溶解させ、常温で２～１２０分間撹拌した。反応開始、２、５、１０、３０、４５、６０、１２０分後に反応液を６５０μＬサンプリングし、ＮＭＲサンプルチューブへ移し、リンＮＭＲを測定した。
　二量体モデル化合物の合成・単離
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
 　化合物５Ｔ（１００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、３，５－Ｂｉｓ［３，５－ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌｅ（８２ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ，２．０ｅｑ．）、ｄ４Ｔ（８８ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）をアセトニトリル（１３ｍｌ）に溶解させ、常温で１時間撹拌ののち、テトラブチルアンモニウム過ヨウ素酸（７４ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ．）を加え、更に常温で７分間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液（１０ｍｌ）を加え、ジクロロメタン（２０ｍｌ）で２回抽出した。反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、クロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、メタノール／ジクロロメタン＝１／７、１％トリエチルアミン）にて精製後、５０ｍｇ（０．０６５ｍｍｏｌ，５０％）の白色固体を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－Ｄ）δ　９．１５－９．２９（ｍ，１Ｈ），９．０１（ｓ，０Ｈ），６．９８－７．６５（ｍ，１５Ｈ），６．７５－６．８５（ｍ，４Ｈ），６．１９－６．３１（ｍ，２Ｈ），５．９０－５．９３（ｍ，１Ｈ），４．９５（ｄ，Ｊ＝４０．５Ｈｚ，１Ｈ），４．０１－４．３６（ｍ，６Ｈ），３．６７－３．９１（ｍ，６Ｈ），３．４８－３．６６（ｍ，１Ｈ），３．３８－３．４６（ｍ，１Ｈ），２．５５－２．８０（ｍ，４Ｈ），１．８７－２．００（ｍ，３Ｈ），１．７８（ｄ，Ｊ＝３２．０Ｈｚ，３Ｈ），１．３４－１．５６（ｍ，３Ｈ），１．１５－１．３３（ｍ，１Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－Ｄ）２７．５０９，２６．２７８ｐｐｍ．
　二量体モデル化合物の合成・単離
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
 　化合物７Ｇ（３０ｍｇ，０．０３５ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、３，５－Ｂｉｓ［３，５－ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌｅ（１４ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ，１３ｅｑ．）、ｄ４Ｔ（２４ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）をアセトニトリル（２．０ｍｌ）に溶解させ、常温で１時間撹拌ののち、０．０１Ｍ　Ｉ２（４．０ｍｌ，０．０４０ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ．）を加え、更に常温で７分間撹拌した。チオ硫酸ナトリウム飽和水溶液（１０ｍｌ）を加え、ジクロロメタン（２０ｍｌ）で２回抽出した。反応溶液をロータリーエバポレーターで濃縮し、クロマトグラフィー（中性フラッシュシリカ、メタノール／ジクロロメタン＝１／７、１％トリエチルアミン）にて精製後、３１ｍｇ（０．０３２ｍｍｏｌ，８９％）の白色固体を得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－Ｄ）δ　１１．９２（ｄ，Ｊ＝２３．１Ｈｚ，１Ｈ），１０．３０－１０．１３（１Ｈ），８．６０－８．６８（ｍ，２Ｈ），７．６０－７．７２（ｍ，２Ｈ），７．１１－７．３０（ｍ，１５Ｈ），６．９２－６．９８（ｍ，１Ｈ），６．６７－６．８３（ｍ，４Ｈ），６．３１（ｄｔｄ，Ｊ＝５８．３，３．８，２．０Ｈｚ，１Ｈ），５．９４－６．０４（ｍ，２Ｈ），５．０４－５．１１（ｍ，１Ｈ），４．８０－４．９３（ｍ，１Ｈ），４．３１－４．４３（ｍ，２Ｈ），４．１９－４．２４（ｍ，１Ｈ），３．９７－４．１２（ｍ，２Ｈ），３．７５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，６Ｈ），３．２６－３．４０（ｍ，３Ｈ），２．７９－２．８７（ｍ，１Ｈ），２．４９－２．６８（ｍ，３Ｈ），１．８７（ｔ，Ｊ＝１．５Ｈｚ，３Ｈ），１．１４－１．２５（ｍ，７Ｈ）ｐｐｍ．
　３１Ｐ－ＮＭＲ（２４３ＭＨｚ，ＣＨＬＯＲＯＦＯＲＭ－Ｄ）２９．９８３，２８．４３８ｐｐｍ．
　図２（ａ）に示すように、５’末端から４塩基目に３’－チオ化修飾を導入した１９塩基のＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡＣＴｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の合成において、１５塩基長の伸長停止産物（ＨＰＬＣピーク面積から約５０％程度）が観測された。伸長停止産物はＨＰＬＣチャート上で１３～１４分付近に二種類のピークとして現れ、それらは３’－チオ化アミダイトの反応に失敗した未カップリングと３’－チオ化アミダイトが反応した後、ヨウ素－ピリジン酸化条件にて鎖切断されて生じた１５塩基長の５’リン酸化体の混合物であった。このような副生成物の生成がオリゴマー合成における収率低下の原因であると考えられる。そこで、二量体モデル合成において反応条件の最適化を行うことでオリゴマー合成の改良条件の探索を行なった。
　図１７は、二量体モデル合成における各種活性化剤と、活性剤の濃度、カップリング時間を検討し、目的物の二量体の生成収率を解析した結果である。活性化剤として、１Ｈ－テトラゾール（１Ｈ－ｔｅｔ）、５－ベンジルチオ－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＴ）、４，５－ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾール（ＢＴＦＴＨ）を用いた。目的物の収率はリンＮＭＲ解析により原料の３’－チオ化アミダイト由来シグナル（１６０ｐｐｍ付近）、目的物由来シグナル（１９０ｐｐｍ）及び副生生物由来シグナル（ジチオレート体：１４０ｐｐｍ付近）の積分比を比較することにより算出した。その結果、１Ｈ－ｔｅｔを用いた場合には、目的物の収率は１．４％だったのに対して（エントリー１）、より酸性度の高いＢＴＴを用いることにより収率１９％まで向上した（エントリー２）。より求核性の高い活性化剤であるＤＣＩを用いた場合には、ＢＴＴと収率に変化が見られなかった（エントリー３）。さらに、高い酸性度を有するＢＴＦＴＨを用いると収率が６６％まで向上した（エントリー４）。ＢＴＦＴＨが最適な活性化剤であると考え、ＢＴＦＴＨの濃度を０．０２Ｍから０．２５Ｍまで増やしたところ、反応時間２分でほぼ定量的に反応が進行した（エントリー５）。しかしながら、ＢＴＦＴＨを０．２５Ｍで用いた条件において、反応時間を１時間まで伸ばしたところ、目的物の収率は低下し、副生成物であるジチオレート体の生成が確認された（エントリー６）。この結果より、高濃度のＢＴＦＴＨを用い、短時間で反応を終わらせることが目的物の収率を最大化する上で重要であり、反応時間を増やすことにより目的生成物が更に反応し副生成物へと変換され収率が低下することが示された。３’－チオ化アミダイトのカップリング反応後、酸化剤として、０．０１Ｍヨウ素／ピリジン／水溶液又はテトラブチルアンモニウム過ヨウ素酸を加えることにより、リン原子の３価から５価への酸化を行い、３’チオリン酸結合を有する二量体モデルを合成した。
（９）二量体モデル合成において、０．２５ＭのＢＴＦＴＨ（１３当量）を用いた際の反応時間の影響
　化合物５Ｔ（１００ｍｇ，０．１３ｍｍｏｌ，１．０ｅｑ．）、３，５－Ｂｉｓ［３，５－ｂｉｓ（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ］－１Ｈ－１，２，４－ｔｒｉａｚｏｌｅ（５３３ｍｇ，１．６９ｍｍｏｌ，１３ｅｑ．）、ｄ４Ｔ（８８ｍｇ，０．３９ｍｍｏｌ，３．０ｅｑ．）をアセトニトリル（６．７６ｍｌ）に溶解させ、常温で２～１２０分間撹拌した。反応開始、２、５、１０、３０、４５、６０、１２０分後に反応液を６５０μＬサンプリングし、ＮＭＲサンプルチューブへ移し、リンＮＭＲを測定した。
　図１８は二量体モデル合成において、０．２５ＭのＢＴＦＴＨ（１３当量）を用いた際の反応時間の影響を示す実験結果である。図１８（Ａ）は化合物の相対存在量と反応時間をプロットした結果であり、所望の反応は反応開始２分で完了し、更に反応時間を伸ばすことにより目的物が分解し、ジチオレート体へと変換されることがわかった。図１８（Ｂ）は反応生成物（反応開始２時間後）のリンＮＭＲスペクトルである。１９０ｐｐｍ付近に目的物のシグナル、１４０ｐｐｍ付近に副生成物であるジチオレート体に由来するシグナルが観測された。
　図１９は推定される副反応のメカニズムを示す。目的物である二量体が形成されたのち、活性化剤により更に活性化され、鎖切断後、ジチオレート体が生成する。
（１０）二量体合成において最適化した反応条件を参考にし、オリゴＤＮＡ合成へと応用し条件改良
　化合物５Ｔ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を合成した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端にはフルオレセイン（ＦＡＭ）を導入した。各種アミダイト試薬は５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしてはＢＴＦＴＨ、酸化剤としては０．０５Ｍのヨウ素（ピリジン／水；ｖ／ｖ：９／１）溶液を使用した。カップリング条件の検討として、０．２５Ｍ又は１．０ＭのＢＴＦＴＨを用い、２０～４５０秒間で２～５回のカップリングを検討した。また、固相担体として６－ＦＡＭ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　５００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いることにより３’末端へＦＡＭが導入される設計とした。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。生成物を逆相ＨＰＬＣで分析することにより５’－水酸基保護基としてＤＭＴｒ基が残った状態の目的物に由来するピーク（保持時間１７．２分）と３’チオ化アミダイト５Ｔの導入段階で合成が停止した産物及び切断された産物に由来するピーク（保持時間８．０～１２．０分付近）とのピーク面積比を算出した。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０ｘ　１０．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ－５μｍ，１２ｎｍ，ＨＳ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３１ＥＡ９００２３）、溶離液　Ａ：５％　アセトニトリルを含む５０ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），溶離液Ｂ：アセトニトリル，グラジエント条件：流速：３ｍＬ／分，カラム温度：５０℃，検出波長：２６０ｎｍ．
　図２０は、二量体合成において最適化した反応条件を参考にし、オリゴＤＮＡ合成へと応用し、条件改良した結果を示す。活性化剤としては、二量体合成において最も優れていることが明らかになったＢＴＦＴＨを用い、活性化剤濃度、カップリング時間、カップリング回数を検討し、得られる１７塩基長オリゴＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の逆相ＨＰＬＣピーク上での生成比を算出した。図２０の表には、目的物と鎖切断物＋未反応物（１３塩基長：配列：５’－ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）とのピーク比が示されている。酸化剤としては、最も一般的なヨウ素ピリジン溶液を用いた。条件検討のコントロールとして０．２５ＭのＢＴＴを用いて４５０秒で二回カップリングした際には、目的物比は５％であった（エントリー１）。０．２５ＭのＢＴＦＴＨを用い４５０秒で二回カップリングした際には、目的物比は４６％となり（エントリー２）、カップリング時間を２０秒へ減らしたところ目的物比は４３％とほぼ変化が見られなかった（エントリー３）。次に、ＢＴＦＴＨ濃度を１．０Ｍまで増やし、４５０秒で二回カップリングを検討したところ、２０％程度目的物比が向上し（エントリー４）、更にカップリング時間を６０秒、カップリング回数を５回へと変更したところ僅かに目的物比が向上し、６９％となった（エントリー５）。つづいて、０．２５ＭのＢＴＦＴＨを用いて９０秒で５回カップリングを行なったところ、目的物比が８７％まで向上した（エントリー６）。これらの結果から、オリゴＤＮＡの固相合成においては、短いカップリング時間で複数回カップリングサイクルを繰り返すことにより目的物生成比が最大化できることが分かった。
（１１）最適化したカップリング条件を採用し合成検討したオリゴＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の合成
　化合物５Ｔ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’を合成した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。また、３’末端にはフルオレセイン（ＦＡＭ）を導入した。各種アミダイト試薬は５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしては０．２５Ｍ　ＢＴＦＴＨ（９０秒で５回カップリング）、酸化剤としては０．０５Ｍのヨウ素（ピリジン／水；ｖ／ｖ：９／１）溶液を使用した。また、固相担体として６－ＦＡＭ－ｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｓｕｐｐｏｒｔ　５００Å（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いることにより３’末端へＦＡＭが導入される設計とした。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。５’－ＤＭＴｒ保護ＤＮＡを逆相ＨＰＬＣで分取したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のオリゴＤＮＡを得た。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０ｘ　１０．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ－５μｍ，１２ｎｍ，ＨＳ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３１ＥＡ９００２３）、溶離液Ａ：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），溶離液Ｂ：アセトニトリル，グラジエント条件：流速：３ｍＬ／分，カラム温度：５０℃，検出波長：２６０ｎｍ．
　図２１は、図２０の実験で最適化したカップリング条件（エントリー６）を採用し合成検討したオリゴＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の合成結果を示す。図２１の逆相ＨＰＬＣ分析結果より３’－チオリン酸結合を含む１７塩基長の目的物は、副生生物（鎖切断物）由来ピークと比較したピーク面積比から８７％の比率で得られた（保持時間１６．９分）。保持時間１６．９分の目的物ピークを分取精製したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のＤＮＡ（５’－ＴＡＡ　Ｔｓ　ＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３）を得た。
（１２）３’チオリン酸結合を３箇所導入した５１塩基長のオリゴＤＮＡ（５’－ＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴｓＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴｓＡＡＴＴＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴｓＧ－３’）の合成
　化合物５Ｔ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴｓＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴｓＡＡＴＴＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴｓＧ－３’を合成した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。各種アミダイト試薬は５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしては０．２５Ｍ　ＢＴＦＴＨ（９０秒で５回カップリング）、酸化剤としては０．０５Ｍのヨウ素（ピリジン／水；ｖ／ｖ：９／１）溶液を使用した。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。５’－ＤＭＴｒ保護ＤＮＡを逆相ＨＰＬＣで分取したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のオリゴＤＮＡを得た。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０ｘ　１０．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ－５μｍ，１２ｎｍ，ＨＳ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３１ＥＡ９００２３）、溶離液Ａ：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），溶離液Ｂ：アセトニトリル，グラジエント条件：流速：３ｍＬ／分，カラム温度：５０℃，検出波長：２６０ｎｍ．
　図２２は、３’チオリン酸結合を３箇所導入した５１塩基長のオリゴＤＮＡ（５’－ＡＴＧＡＡＡＣＧＣＣＧＡＧＴＴｓＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴｓＡＡＴＴＣＧＣＧＴＣＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴｓＧ－３’）を合成し、逆相ＨＰＬＣで分析した結果を示す。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。逆相ＨＰＬＣの結果、保持時間１７．２分付近に見られるメインピークが５１ｍｅｒの目的物ＤＮＡであり、５’－水酸基保護基としてＤＭＴｒ基が残った状態となっている。それに対して、一部、化合物５Ｔの導入段階で合成が停止した産物及び切断された産物も保持時間８．０～１２．０分付近に観測されたが、５１ｍｅｒの目的物のＤＮＡとは容易に分離可能であった。保持時間１７．２分付近のピークを分取することにより、目的物ＤＮＡの５’－ＤＭＴｒ保護体を得た。ＨＰＬＣにより分取精製した５’－ＤＭＴｒ保護体をＥＳＩ－ＴＯＦ－ＭＳ分析によって、目的物由来のｍ／ｚ　１６，１１０．２のピークであることが確認された。１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のＤＮＡを得た。
（１３）３’チオリン酸結合を４箇所及び２箇所導入したＰＣＲ用プライマーＤＮＡの配列とその合成
　化合物５Ｔ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチドを合成した。Ｔｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。各種アミダイト試薬は５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしては０．２５Ｍ　ＢＴＦＴＨ（９０秒で５回カップリング）、酸化剤としては０．０５Ｍのヨウ素（ピリジン／水；ｖ／ｖ：９／１）溶液を使用した。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。５’－ＤＭＴｒ保護ＤＮＡを逆相ＨＰＬＣで分取したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のオリゴＤＮＡを得た。ＨＰＬＣ分析条件は以下の通りである。
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０ｘ　１０．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ－５μｍ，１２ｎｍ，ＨＳ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３１ＥＡ９００２３）、溶離液Ａ：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），溶離液Ｂ：アセトニトリル，グラジエント条件：流速：３ｍＬ／分，カラム温度：５０℃，検出波長：２６０ｎｍ．
　図２３は、３’チオリン酸結合を複数箇所に導入した４種類のＰＣＲ用プライマーＤＮＡの配列と、その合成結果を示す。合成を行なったプライマーは、ＰＣＲ増幅後銀ナノ粒子切断により４か所で切断され、３４塩基の接着末端を生ずるＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿８及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿８、それに対して、ＰＣＲ増幅後銀ナノ粒子切断により２か所で切断され、３４塩基の接着末端を生ずるＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿１６及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿１６である。合成した４種オリゴＤＮＡは逆相ＨＰＬＣで分析した。５’－水酸基保護基としてＤＭＴｒ基が残った状態の目的長オリゴＤＮＡのピーク（保持時間１５分付近）をそれぞれ分取精製したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のＤＮＡを得た。
（１４）３’－チオ化アミダイトアデノシン誘導体を用いて合成した３’チオリン酸化オリゴＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＡｓ　ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）の合成
　化合物６Ａ及び市販のホスホロアミダイト試薬（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）を用い、常法に従い核酸自動合成機ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ（日本テクノサービス社製）によりオリゴデオキシリボヌクレオチド５’－ＴＡＡＣＡｓ　ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３を合成した。Ａｓは３’チオ化を施したチミジン塩基を示す。各種アミダイト試薬は５０ｍＭのアセトニトリル溶液とし、化合物５Ｔのみ１５０ｍＭのアセトニトリル溶液として使用した。アクチベーターとしては０．２５Ｍ　ＢＴＦＴＨ（４５０秒で２回カップリング）、酸化剤としては０．０５Ｍのヨウ素（ピリジン／水；ｖ／ｖ：９／１）溶液を使用した。合成はＦｉｎａｌ　ＤＭＴｒ－ＯＮに設定し、５’－末端水酸基上のＤＭＴｒ基を残した状態で取り出した。合成終了後、固相担体に濃アンモニア水（５００μＬ）と４０％メチルアミン水溶液（５００μＬ）を加え、６５℃で１時間処理することにより固相担体からの切り出し及び脱保護を行った。上清をＭｉｌｌｅｘ　ＬＨフィルター（０．４５μｍ，メルク社製）を用いてろ過したのち、ろ液を遠心エバポレーターにより減圧下乾固した。得られオリゴヌクレオチドを超脱イオン水に再溶解し、２６０ｎｍにおける吸収を測定することで濃度を算出した。５’－ＤＭＴｒ保護ＤＮＡを逆相ＨＰＬＣで分取したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のオリゴＤＮＡを得た。ＨＰＬＣ　分析条件は以下の通りである。
　カラム：Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０ｘ　１０．０ｍｍｌ．Ｄ．，Ｓ－５μｍ，１２ｎｍ，ＨＳ１２Ｓ０５－２５１０ＷＴ，Ｓｅｒ．Ｎｏ．１３１ＥＡ９００２３）、溶離液Ａ：５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７．０），溶離液Ｂ：アセトニトリル，グラジエント条件：流速：３ｍＬ／分，カラム温度：５０℃，検出波長：２６０ｎｍ．
　図２４は、３’－チオ化アミダイトアデノシン誘導体（化合物６Ａ）を用い、アデノシン誘導体を含む３’－チオリン酸化オリゴＤＮＡ（配列：５’－ＴＡＡＣＡｓ　ＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）を合成した結果を示す。ＢＴＦＴＨを活性化剤として用いて合成したオリゴＤＮＡを逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果、逆相ＨＰＬＣピーク面積比から、保持時間１６．８分付近の５’－ＤＭＴｒ保護目的物オリゴＤＮＡの比率は４０％であり、未カップリング体及び鎖切断体（保持時間１１．５分付近）とは明確に分離可能であった。目的長オリゴＤＮＡのピークを分取精製したのち、１０％酢酸水溶液を加え、室温で一時間処理することによりＤＭＴｒ基を脱保護し、目的のＤＮＡを得た。
（１５）アデノシンアナログを含む３’－チオリン酸結合ＤＮＡの銀ナノ粒子による切断による３’－オーバーハング接着末端の調整
　ＰＳ修飾ＤＮＡ（５’－ＴＡＡＣＡｓＣＡＣＡＴＴＡＡＴＴＧＣＧＴＴ－ＦＡＭ－３’）と相補鎖ＤＮＡ（５’－ＡＡＣＧＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＧＴＧＴＴＡ－３’）をそれぞれ３μＭとなるように混合し、９５℃で３分間処理後、氷浴上にて１０分以上冷却することによりアニーリングを行なった。アニーリング後の溶液を９μＬ測りとり５１μＬの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液（１０ｎｍ）を加え、５０℃で所定の時間インキュベーションした。表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液は、５０μＬの市販の銀ナノ粒子分散液（ｓｉｇｍａ－ａｌｄｒｉｃｈ社製、１０ｎｍ，０．０２ｍｇ／ｍＬ）に対して１μＬの末端チオールＰＥＧ水溶液（２３．９ｇ／Ｌ）を加えることで調製した。反応溶液を３０μＬ測りとり３０μＬの２ｘ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒを加えた。９５℃で５分間加熱処理したのち、１５％変性アクリルアミド電気泳動（７．５Ｍ尿素を含む、１０ｘ１２ｃｍ，３０ｍＡ，２０分，６μＬアプライ）により分析した。ＦＡＭ由来蛍光検出によりゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いてゲル泳動像を取得した。
　図２５は、二重鎖短鎖ＤＮＡの銀ナノ粒子処理による３’オーバーハング接着末端の調製を行った結果を示している。ここでは、図２４に示す実験で合成した、３’－チオアデノシンアナログの切断を１ｎｍの表面ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を用いて行なった。ＳＰ結合は５’末端から５塩基目と６塩基目の間に位置し、切断が起こると５塩基突出した接着末端が調製できるように設計した。反応は５０℃で１５，３０，６０、１２０分間行いそれぞれの反応溶液を変性ゲル電気泳動により分析し、ＦＡＭ由来蛍光検出によるゲルのバンド強度解析より、各反応時間における切断効率を算出した。相補鎖有りと無しとで切断効率の比較を行い、各反応時間における切断効率を縦軸に、反応時間を横軸にプロットした。その結果、相補鎖有りの場合、相補鎖無しと比較して僅かに切断活性が低下したものの反応開始２時間後においてはほぼ同程度の切断活性を示し、９０％以上のＤＮＡが切断された。さらに、この切断活性は図Ｘに示すチミジンアナログの切断実験結果と比較してほぼ同程度であったことから、修飾部位の塩基種が変わっても切断活性に影響が無いことが示された。
（１６）複数修飾導入プライマーを用いた接着末端調整と連結反応
　図２６は、図２３で合成した４種プライマーＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅産物の銀ナノ粒子切断による３４塩基長の接着末端調整とそれらの切断産物のライゲーション産物の配列を示す実験系の模式図である。
（ａ）４種プライマーを用いたＰＣＲ
　２０μＭチオ化Ｆｏｒｗａｒｄプライマー（１．２５μＬ）、２０μＭチオ化Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー（１．２５μＬ）、１０ｎｇ／μＬテンプレートＤＮＡ（２．５μＬ）、２ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物（５μＬ）、２５ｍＭ硫酸マグネシウム（３μＬ）、１０ｘ　ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ　ｆｏｒ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（５μＬ）、超脱イオン水（３１μＬ）を混合し、１Ｕ／μＬ　ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（１μＬ）を加えたのち、サーマルサイクラー（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて、９５℃で２分間処理した。つづいて、変性（９５℃、１５秒）－アニーリング（５５℃、１５秒）－鎖伸長（６８℃、３０秒）を３０サイクル行うことによりＤＮＡ増幅した。ＰＣＲ産物をｗｉｚａｒｄ　ｃｏｌｕｍｎ（プロメガ社製）を用い、メーカー推奨プロトコルに従い精製し、チオ化ＤＮＡを得た。
（ｂ）銀ナノ粒子による切断による接着末端調整
　７．５ｎＭ　ＰＣＲ産物チオ化ＤＮＡ（２２５ｆｍｏｌ／ｓａｍｐｌｅ）を超脱イオン水に溶解し４．５μＬの水溶液を調製した。１０ｎｍの銀ナノ粒子（シグマアルドリッチ社製、２００μｇ／ｍＬクエン酸バッファー懸濁液、２５μＬ）と末端チオール修飾ＰＥＧ（シグマアルドリッチ社製、２３．９ｇ／Ｌ水溶液、０．５μＬ）を混合することにより、ＰＥＧ修飾銀ナノ粒子を調製した。調製したＰＣＲ産物チオ化ＤＮＡ水溶液（４．５μＬ）とＰＥＧ修飾銀ナノ粒子分散液（２５．５μＬ）を混合したのち、５０℃で４時間処理することによりＳＰ結合の切断を行い、接着末端を調製した。
　図２７は、図２３で合成した４種プライマーＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅産物の銀ナノ粒子処理切断による３４塩基長の接着末端調整とそれらの切断産物のライゲーション実験の流れとＰＣＲ産物ＤＮＡのアガロース電気泳動結果を示す。５２９－ｂｐ、３０７－ｂｐ、５２９－ｂｐ、３０７－ｂｐのそれぞれ４種類の所望の長さのＰＣＲ産物が得られたことを確認した。
（１７）ＰＣＲ増幅産物の複数箇所での切断により得られた３４塩基長の接着末端ＤＮＡ同士の連結との連結効率の比較
７．５ｎＭ銀ナノ粒子処理産物ＤＮＡ＿１（３．６μＬ）、７．５ｎＭ銀ナノ粒子処理産物ＤＮＡ＿２（３．６μＬ）、１０ｘ　Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、０．９０μＬ）、超脱イオン水（０．４５μＬ）を混合したのち、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ社製、２０００Ｕ／μＬ、０．４５μＬ）を加え、２５℃で３時間インキュベーションした。反応溶液（９μＬ）に対して、１μＬの１０ｘ　ローディングバッファーを加え、１％アガロールゲル電気泳動（泳動バッファー：１ｘ　ＴＢＥ、１００Ｖ、３０分）により分析した。１０，０００ｘ　ＳＹＢＲ　ｇｒｅｅｎ　Ｉ溶液を用い３０分間振盪することによりゲルの染色を行い、ゲルイメージアナライザー（ＢｉｏＲａｄ社製）によりゲル泳動像を取得した。
　図２８は、Ｒｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿８及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿８を用いてＰＣＲ増幅した産物を銀ナノ粒子により切断し得られた３４塩基長の接着末端ＤＮＡ同士の連結とＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿１６及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿１６を用いてＰＣＲ増幅した産物を銀ナノ粒子により切断し得られた３４塩基長の接着末端ＤＮＡ同士の連結との連結効率を比較した結果である。Ｒｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿８及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿８を用いてＰＣＲ増幅した産物には、８塩基ごとにチオリン酸修飾が導入されるのに対して、Ｒｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ１＿１６及びＲｅｖ＿ｐｒｉｍｅｒ　ｆｏｒ　Ｆ２＿１６を用いてＰＣＲ増幅した産物には、１６塩基ごとにチオリン酸修飾が導入される設計となっている。したがって、これらの連結効率を比較することにより、銀ナノ粒子による切断後、切断断片ＤＮＡの解離効率がライゲーションに与える影響が明らかになる。つまり、銀ナノ粒子切断後のＤＮＡ断片が８塩基のものは切断後速やかに解離し比較的高いライゲーション効率を示すが、銀ナノ粒子切断後のＤＮＡ断片が１６塩基のものは切断後の解離が比較的遅く、低いライゲーション効率を示すことが予想される。実験の結果、二か所で切断される系（Ｔｓ修飾ｘ２）では連結効率は２９％となり、４か所で切断される系（Ｔｓ修飾ｘ４）では連結効率が４４％となり、複数箇所の切断により切断後のＤＮＡ断片の解離が促進され高い連結効率を示すことが示された。図中のスカベンジャー鎖とは、接着末端同士が相補鎖を組んではいるが、連結されていない産物を引き剥がす働きをもち、ゲル分析にて、連結産物を非連結産物とを明確に区別するために用いた。

Claims (14)

  1. 　下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製工程と、
    　前記切断対象核酸と切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断工程と、を備え、
    　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする核酸鎖切断方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
  2. 　前記切断剤が銀ナノ粒子であり、前記Ｘが硫黄であることを特徴とする請求項１に記載の核酸鎖切断方法。
  3. 　前記金属ナノ粒子の平均粒径が１～２０ｎｍの範囲内であることを特徴とする請求項１に記載の核酸鎖切断方法。
  4. 　前記金属ナノ粒子の表面にポリエチレングリコールが結合していることを特徴とする請求項１に記載の核酸鎖切断方法。
  5. 　前記核酸調製工程は、下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬を用いて前記切断対象核酸の一部又は全部をホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする請求項１に記載の核酸鎖切断方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を示す。）
  6. 　前記核酸調製工程は、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾールを活性化剤としてホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする請求項５に記載の核酸鎖切断方法。
  7. 　前記核酸調製工程は、前記切断対象核酸の一部をホスホロアミダイト法で合成してプライマーとし、前記切断対象核酸と相補的な配列を有するテンプレートＤＮＡを鋳型として、ポリメラーゼ連鎖反応を複数サイクル行い、前記テンプレートＤＮＡに沿って前記プライマーを伸長させることで前記切断対象核酸を生成することを特徴とする請求項５に記載の核酸鎖切断方法。
  8. 　下記式（１）で示される構造を有する切断対象核酸を調製する核酸調製手段と、
    　前記切断対象核酸と切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記切断対象核酸を切断し、下記式（２）で示される構造を有する核酸を生成させる切断手段と、
    を備え、
    　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする核酸鎖切断装置。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
  9. 　前記核酸調製手段は、下記式（３）及び式（４）で示されるアミダイト試薬を用いて前記切断対象核酸の一部又は全部をホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする請求項８に記載の核酸鎖切断装置。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示し、ＤＭＴｒはジメトキシトリチル基を示す。）
  10. 　前記核酸調製手段は、５－［３，５－ビス（トリフルオロメチル）フェニル］－１Ｈ－テトラゾールを活性化剤としてホスホロアミダイト法で合成することを特徴とする請求項９に記載の核酸鎖切断装置。
  11. 　接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
    　センス鎖と、前記センス鎖と相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、から構成される切断対象二本鎖ＤＮＡであって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に下記式（１）で示される構造を有する切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する二本鎖ＤＮＡ調製工程と、
    　前記切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖を切断し、下記式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを生成させる接着末端生成工程と、を備え、
    　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
  12. 　前記切断対象二本鎖ＤＮＡは、前記式（１）で示される構造を複数有しており、各構造の間のヌクレオチド数が１０以下であることを特徴とする請求項１１に記載の二本鎖ＤＮＡの製造装置。
  13. 　接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、
    　センス鎖と、前記センス鎖と相補的な配列を有するアンチセンス鎖と、から構成される切断対象二本鎖ＤＮＡであって、前記センス鎖及びアンチセンス鎖の少なくとも一方に下記式（１）で示される構造を有する切断対象二本鎖ＤＮＡを調製する二本鎖ＤＮＡ調製手段と、
    　前記切断対象二本鎖ＤＮＡと切断剤とを反応させて前記式（１）のＸの部分で前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖を切断し、下記式（２）で示される構造を有し、かつ接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを生成させる接着末端生成手段と、を備え、
    　前記切断剤が、銀、水銀及びカドミウムからなる群より選択される原子を含む金属ナノ粒子であることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｘは硫黄又はセレンを示す。ＮｕｃＡは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として５’末端側の部分を示す。ＮｕｃＢは、少なくとも１つのヌクレオチドで構成され、前記切断対象核酸の一部であり、前記Ｘを基準として３’末端側の部分を示す。）
  14. 　前記切断対象二本鎖ＤＮＡは、前記式（１）で示される構造を複数有しており、各構造の間のヌクレオチド数が１０以下であることを特徴とする請求項１３に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
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