CN118043333A - 核酸链切割方法和核酸链切割装置、以及双链dna的制造方法和双链dna的制造装置 - Google Patents
核酸链切割方法和核酸链切割装置、以及双链dna的制造方法和双链dna的制造装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118043333A CN118043333A CN202280065258.2A CN202280065258A CN118043333A CN 118043333 A CN118043333 A CN 118043333A CN 202280065258 A CN202280065258 A CN 202280065258A CN 118043333 A CN118043333 A CN 118043333A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- cleavage
- dna
- strand
- cut
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 164
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 163
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 163
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 243
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 67
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 220
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 199
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims abstract description 98
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims abstract description 98
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 79
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 41
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims abstract description 20
- 229910052711 selenium Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000011669 selenium Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N Selenium Chemical group [Se] BUGBHKTXTAQXES-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 11
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 claims abstract description 11
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 94
- -1 dimethoxytrityl Chemical group 0.000 claims description 43
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 42
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 37
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 36
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 25
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 23
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 claims description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 19
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 18
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 claims description 18
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 13
- KKJFZIQEWZVVIV-UHFFFAOYSA-N 5-[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-2h-tetrazole Chemical compound FC(F)(F)C1=CC(C(F)(F)F)=CC(C2=NNN=N2)=C1 KKJFZIQEWZVVIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 101100134309 Bacillus subtilis (strain 168) nucB gene Proteins 0.000 claims 4
- 101150032913 nucA gene Chemical group 0.000 claims 4
- 101100134303 Mus musculus Nucb1 gene Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 116
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 112
- 239000000047 product Substances 0.000 description 93
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 90
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 81
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 81
- FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N Silver ion Chemical compound [Ag+] FOIXSVOLVBLSDH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 72
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 69
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 68
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 62
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 58
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 51
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 49
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 48
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 41
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 34
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 31
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 31
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 31
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 31
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 30
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 28
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 27
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 26
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 25
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 25
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 25
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 24
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 24
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 21
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 20
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 19
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 19
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 18
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 18
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 18
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 18
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 17
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 16
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Substances C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 15
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 15
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 15
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 14
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 13
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 12
- BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N Methylamine Chemical compound NC BAVYZALUXZFZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 12
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 12
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 12
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 12
- 150000003378 silver Chemical class 0.000 description 12
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 12
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 12
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 11
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 11
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethanethiol Chemical compound CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 11
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 11
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 11
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000003936 denaturing gel electrophoresis Methods 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 10
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 10
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 9
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 9
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 5-benzylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound C=1C=CC=CC=1CSC=1N=NNN=1 GXGKKIPUFAHZIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 8
- VVWRJUBEIPHGQF-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-propan-2-yloxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CC(C)OC(=O)N=NC(=O)OC(C)C VVWRJUBEIPHGQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N sulfamide Chemical compound NS(N)(=O)=O NVBFHJWHLNUMCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 7
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 7
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 7
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 7
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 7
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 7
- VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyhexanenitrile Chemical compound CCCCC(O)C#N VKIGAWAEXPTIOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 6
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 6
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102220563836 Glucagon receptor_H12S_mutation Human genes 0.000 description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 5
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 5
- KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 1H-tetrazole Chemical compound C=1N=NNN=1 KJUGUADJHNHALS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypicolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=NC=CC=C1O BRARRAHGNDUELT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004679 31P NMR spectroscopy Methods 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 150000003926 acrylamides Chemical class 0.000 description 4
- 150000003835 adenosine derivatives Chemical class 0.000 description 4
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 125000001731 2-cyanoethyl group Chemical group [H]C([H])(*)C([H])([H])C#N 0.000 description 3
- AXTCFXUJNPBCDB-UHFFFAOYSA-N Agarol Chemical compound CC(C)C1CC(=O)C2=COC3=C2C1CCC3O AXTCFXUJNPBCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VIULXZNWHKRQPB-KSQLKPTDSA-N Agarol Natural products O=C1c2c3[C@@H]([C@@H](C(C)C)C1)C[C@H](C)[C@H](O)c3oc2 VIULXZNWHKRQPB-KSQLKPTDSA-N 0.000 description 3
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N benzenecarbothioic s-acid Chemical compound SC(=O)C1=CC=CC=C1 UIJGNTRUPZPVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- QRPYHTZAJOUHAQ-UHFFFAOYSA-M cesium;thiobenzate Chemical compound [Cs+].[O-]C(=S)C1=CC=CC=C1 QRPYHTZAJOUHAQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 150000004662 dithiols Chemical class 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 3
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000011369 resultant mixture Substances 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 3
- 125000001981 tert-butyldimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([H])(C([H])([H])[H])[*]C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UBTJZUKVKGZHAD-UPRLRBBYSA-N 1-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-UPRLRBBYSA-N 0.000 description 2
- XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 1h-imidazole-4,5-dicarbonitrile Chemical compound N#CC=1N=CNC=1C#N XGDRLCRGKUCBQL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 2-amino-7-methyl-1,7-dihydro-6H-purin-6-one Chemical compound NC1=NC(O)=C2N(C)C=NC2=N1 FZWGECJQACGGTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CCZWSTFVHJPCEM-UHFFFAOYSA-N 2-iodopyridine Chemical compound IC1=CC=CC=N1 CCZWSTFVHJPCEM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 5-ethylsulfanyl-2h-tetrazole Chemical compound CCSC=1N=NNN=1 GONFBOIJNUKKST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical class C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- ZKJOXOJMGXFSPF-QYZPTAICSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2r,3s,4r,5r)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate;hydrate Chemical compound O.NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 ZKJOXOJMGXFSPF-QYZPTAICSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical class C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical class O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N dess–martin periodinane Chemical compound C1=CC=C2I(OC(=O)C)(OC(C)=O)(OC(C)=O)OC(=O)C2=C1 NKLCNNUWBJBICK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- MYSNCIZBPUPZMQ-VOTWKOMSSA-N n-[1-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-2-oxopyrimidin-4-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C(N=C(NC(=O)C=3C=CC=CC=3)C=C2)=O)O1 MYSNCIZBPUPZMQ-VOTWKOMSSA-N 0.000 description 2
- LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N n-[9-[(2r,4s,5r)-5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]purin-6-yl]benzamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OC[C@@H]1[C@@H](O)C[C@H](N2C3=NC=NC(NC(=O)C=4C=CC=CC=4)=C3N=C2)O1 LPICNYATEWGYHI-WIHCDAFUSA-N 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 2
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical class O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQTLJGATGSAFQV-KQYNXXCUSA-N (2R,3S,4S,5R)-2-(6-aminopurin-9-yl)-5-(hydroxymethyl)-4-sulfanyloxolan-3-ol Chemical class Nc1ncnc2n(cnc12)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](S)[C@H]1O WQTLJGATGSAFQV-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- LNRCBWCMVHSMBJ-GJMOJQLCSA-N 1-[(2r,4s,5r)-5-(hydroxymethyl)-4-sulfanyloxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](S)C1 LNRCBWCMVHSMBJ-GJMOJQLCSA-N 0.000 description 1
- JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 1-[chloro-(4-methoxyphenyl)-phenylmethyl]-4-methoxybenzene Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC(OC)=CC=1)C1=CC=CC=C1 JBWYRBLDOOOJEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CFIBTBBTJWHPQV-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-n-(6-oxo-3,7-dihydropurin-2-yl)propanamide Chemical compound N1C(NC(=O)C(C)C)=NC(=O)C2=C1N=CN2 CFIBTBBTJWHPQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FXGXEFXCWDTSQK-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfanyl-7h-purin-6-amine Chemical compound CSC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 FXGXEFXCWDTSQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLNPYWUJOZPPA-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 OTLNPYWUJOZPPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 5-bromouracil Chemical compound BrC1=CNC(=O)NC1=O LQLQRFGHAALLLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 5-chlorouracil Chemical compound ClC1=CNC(=O)NC1=O ZFTBZKVVGZNMJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LHMONDHOZZLPDF-UHFFFAOYSA-N 6-(dimethylamino)-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound CN(C)C1=CC=NC(O)=N1 LHMONDHOZZLPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QQJXZVKXNSFHRI-UHFFFAOYSA-N 6-Benzamidopurine Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1NC(=O)C1=CC=CC=C1 QQJXZVKXNSFHRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 6-amino-5-bromo-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound NC=1NC(=O)N=CC=1Br QFVKLKDEXOWFSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 6-methyladenine Chemical compound CNC1=NC=NC2=C1N=CN2 CKOMXBHMKXXTNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 9H-purine-2,6-diamine Chemical compound NC1=NC(N)=C2NC=NC2=N1 MSSXOMSJDRHRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940126062 Compound A Drugs 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N Heterophylliin A Natural products O1C2COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC2C(OC(=O)C=2C=C(O)C(O)=C(O)C=2)C(O)C1OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 NLDMNSXOCDLTTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 150000003838 adenosines Chemical class 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPPIWWONXCQFEZ-UHFFFAOYSA-N benzenecarboselenoic Se-acid Chemical compound [SeH]C(=O)C1=CC=CC=C1 CPPIWWONXCQFEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011208 chromatographic data Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001425 electrospray ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N ethionamide Chemical compound CCC1=CC(C(N)=S)=CC=N1 AEOCXXJPGCBFJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N pentamethylene Natural products C1CCCC1 RGSFGYAAUTVSQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 1
- 238000013186 photoplethysmography Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- VVWRJUBEIPHGQF-MDZDMXLPSA-N propan-2-yl (ne)-n-propan-2-yloxycarbonyliminocarbamate Chemical compound CC(C)OC(=O)\N=N\C(=O)OC(C)C VVWRJUBEIPHGQF-MDZDMXLPSA-N 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 1
- 102220013334 rs368367224 Human genes 0.000 description 1
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 description 1
- 125000003748 selenium group Chemical group *[Se]* 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000005987 sulfurization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010301 surface-oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N thiohydroxylamine Chemical compound SN RSPCKAHMRANGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种核酸链切割方法,其特征在于,包括:制备具有下式(1)所示的结构的切割对象核酸的核酸制备步骤;和使得该切割对象核酸与切割剂进行反应在式(1)的X的部分将切割对象核酸切断,并生成具有下式(2)所示的结构的核酸的切割步骤,切割剂是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。
Description
技术领域
本发明,涉及一种核酸链切割方法和核酸链切割装置以及双链DNA的制造方法和双链DNA的制造装置。
背景技术
在分子生物学等领域,为了进行基因重组和转化等,使用了将目标DNA组入宿主的载体。通常,目标DNA,当量较少时可通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增来使用。在PCR中,通过使用包含目标DNA序列的模板DNA,并使用与之互补地结合的引物多次反复进行热变性和退火的循环,从而对模板DNA进行扩增。
通过PCR扩增的模板DNA的扩增产物,原状是平末端,需要对其进行处理以使其与质粒DNA等宿主DNA进行结合(连接)。在这种情况下存在如下技术:使得扩增产物的3’端以及5’末端为黏端(Sticky Ends,也称作粘性末端、突出末端等),在宿主侧也同样地形成黏端并且构建将两者连接的载体。
为了在DNA上形成黏端,需要在双链DNA中的一个链的所需位置进行切割在DNA链上产生悬挂(overhang)。关于这一点,例如在非专利文献1中记载了:使用5’-O-单甲氧基三苯甲基胸苷3’-S-(2-氰乙基)-N,N-二异丙基硫代磷酸酰胺,使用自动DNA合成机制备含有3’-S-硫代磷酸酯键的寡聚核苷酸;使用Ag+在该部位特异性地对含有3’-S-硫代磷酸酯键的链进行化学切割等(摘要)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:“Sequence-and strand-specific cleavage inoligodeoxyribonucleotides and DNA containing 3’-thiothymidine.”JosephS.Vyle,et al.Biochemistry,31,3012(1992)
发明内容
发明要解决的技术问题
在非专利文献1中,作为对单链DNA进行切割的切割剂使用了银离子(Ag+)。由于银离子具有正的电荷,所以会与DNA的磷酸基等具有负的电荷的官能基或核酸碱基部发生静电相互作用,因此非特异性的相互作用引起凝集体的形成,进而导致目标DNA的回收率降低。
本发明的目的在于,提供一种切割效率高且目标核酸的回收率高的核酸链切割方法以及核酸链切割装置。另外,本发明的另一目的在于,提供一种黏端的形成效率高并且具有目标黏端的双链DNA的回收率高的、具有黏端的双链DNA的制造方法以及双链DNA的制造装置。
解决技术问题的方法
本发明人,为了解决上述问题进行了深入研究。结果发现,不使用金属离子而使用金属纳米粒子作为切割剂,可使切割对象的核酸的切割效率提高、可提高目标核酸的回收率,从而完成本发明。
〔1〕一种核酸链切割方法,其特征在于,包括:
核酸制备步骤,制备具有下式(1)所示的结构的切割对象核酸,和
切割步骤,使得所述切割对象核酸与切割剂进行反应以在所述式(1)的X的部分将所述切割对象核酸切断,生成具有下式(2)所示的结构的核酸,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。)
〔2〕如〔1〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,所述切割剂是银纳米粒子,所述X是硫。
〔3〕如〔1〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,所述金属纳米粒子的平均粒径在1~20nm的范围内。
〔4〕如〔1〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述金属纳米粒子的表面结合有聚乙二醇。
〔5〕如〔1〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,使用下述式(3)以及式(4)所示的酰胺(amidite)试剂通过亚磷酰胺法(phosphoramidite法)来合成所述切割对象核酸的一部分或全部。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒,DMTr表示二甲氧基三苯甲基。)
〔6〕如〔5〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,使用5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑作为活化剂通过亚磷酰胺法进行合成。
〔7〕如〔5〕所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,通过亚磷酰胺法合成所述切割对象核酸的一部分并用作引物,将具有与所述切割对象核酸互补的序列的模板DNA用作模板,将聚合酶链式反应循环多次,使得所述引物沿着所述模板DNA延伸,从而生成所述切割对象核酸。
〔8〕一种核酸链切割装置,其特征在于,具备:
核酸制备单元,制备具有下述式(1)所示的结构的切割对象核酸;和
切割单元,使得所述切割对象核酸与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分将所述切割对象核酸切断,生成具有下述式(2)所示的结构的核酸,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。)
〔9〕如〔8〕所述的核酸链切割装置,其特征在于,所述核酸制备单元,使用下述式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂通过亚磷酰胺法来合成所述切割对象核酸的一部分或全部。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒,DMTr表示二甲氧基三苯甲基。)
〔10〕如〔9〕所述的核酸链切割装置,其特征在于,所述核酸制备步骤中,使用5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑作为活化剂通过亚磷酰胺法进行合成。
〔11〕一种双链DNA的制造方法,所述方法用于制造具有具有黏端的双链DNA,其特征在于,包括:
用于制备切割对象双链DNA的双链DNA制备步骤,该切割对象双链DNA由正义链和具有与所述正义链互补的序列的反义链构成,并且所述正义链以及反义链中的至少一者具有用下述式(1)表示的结构,
黏端生成步骤,使得所述切割对象双链DNA与切割剂进行反应以在所述式(1)的X的部分将所述正义链和/或所述反义链切断,生成具下述式(2)所示的结构、且具有黏端的双链DNA,其中
所述切割剂,是含有从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。)
〔12〕如〔11〕所述的双链DNA的制造方法,其特征在于,所述切割对象双链DNA,具有多个所述式(1)所示的结构,且各个结构之间的核苷酸个数为10个以下。
〔13〕一种双链DNA的制造装置,用于制备具有黏端的双链DNA,其特征在于,具备:
用于制备切割对象双链DNA的双链DNA制备单元,所述切割对象双链DNA由正义链以及具有与所述正义链互补的序列的反义链构成,所述正义链以及反义链中的至少一者具有下述式(1)所示的结构;和
黏端生成单元,使得所述切割对象双链DNA与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分将所述正义链和/或所述反义链切断,生成具有下述式(2)所示的结构、且具有黏端的双链DNA,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。)
〔14〕如〔13〕所述的双链DNA的制造装置,其特征在于,所述切割对象双链DNA,具有多个所述式(1)所述的结构,并且各个结构之间的核苷酸个数为10个以下。
发明的效果
根据本发明,能够提供一种切割效率高且目标核酸的回收率高的核酸链切割方法以及核酸链切割装置。另外,根据本发明,能够提供一种黏端的形成效率高且具有目标黏端的双链DNA的回收率高的双链DNA的制造方法以及双链DNA的制造装置。
附图说明
图1是示出使用金属纳米粒子的核酸链切割反应,和制备具有黏端的双链DNA并进行连接的反应的概略的示意图。
图2是示出使用了硫化酰胺试剂的具有3’-硫代磷酸键的寡聚核苷酸的合成、反相HPLC以及MALDI-TOF-MS的分析结果的图。
图3是示出通过银纳米粒子处理进行的DNA链切割反应的研究,以及银纳米粒子尺寸和反应时间·反应温度依赖性的结果的图。
图4是示出银纳米粒子表面的聚合物修饰导致的DNA链切割活性提高的结果的图。
图5是示出双链短链DNA通过银纳米粒子处理制备3’悬挂黏端的结果的图。
图6是示出将硫化寡聚核酸引入DNA模板时的PCR的研究结果的图。
图7是示出PCR的DNA扩增、和通过BsaI或银纳米粒子处理制备黏接片段的示意图。
图8是示出使用T4 DNA连接酶对黏接片段进行连接的试验结果的图。
图9是示出通过现有技术的硝酸银处理来切割硫化寡聚核酸链的结果的图。
图10是示出通过现有技术的硝酸银处理来切割硫化寡聚核酸链中的切割生成物的MALDI-TOF-MS的分子量分析结果的图。
图11是示出对通过现有技术的硝酸银处理来切割硫化寡聚核酸链以及通过添加硫醇类来除去银离子进行研究的结果的图。
图12示出通过离心分离除去银纳米粒子(纳米粒子尺寸依赖性)的图。
图13是硫化寡聚核酸链切割中的硝酸银处理与银纳米粒子处理的比较。在凝胶图像中,Lane1是示出与切割后生成的DNA具有相同的碱基长度的DNA(15mer)5’-CACATTAATTGCGTT-FAM-3’的电泳结果的图。
图14是示出银纳米粒子的表面PEG修饰导致了分散性提高的图。
图15是示出表面PEG修饰导致了银纳米粒子的分散性提高的图。
图16是示出利用了银纳米粒子的DNA链切割来生成黏端的DNA连接反应的序列设计的图。
图17是示出在为了改良3’-硫化酰胺的反应条件而进行的二聚体模型合成中,对偶联条件进行最优化的研究的结果的图。
图18是示出在二聚体模型合成中、使用0.25M的BTFTH(13当量)时反应时间的影响的实验结果。
图19是示出在二聚体模型合成中明显出现的偶联反应中的副反应的推测机理的图。
图20是示出参考在二聚体合成中最优化的反应条件,应用于寡聚DNA合成并进行条件改良的结果的图。
图21是采用最优化的偶联条件进行合成研究的寡聚DNA(序列:5’-TAATsCATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成结果的图。
图22是示出在3个位置引入3’硫代磷酸链的51个碱基长度的寡聚DNA(5’-ATGAAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3’)的合成结果的图。
图23示出在4个位置和2个位置引入3’硫代磷酸键的PCR用引物DNA的序列及其合成结果的图。
图24是示出使用3’-硫化酰胺腺苷衍生物合成的3’硫代磷酸化寡聚DNA(5’-TAACAs CACATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成结果的图。
图25是示出通过银纳米粒子切割包含腺苷类似物的3’-硫代磷酸键DNA从而制备3’-悬挂黏端的研究结果的图。
图26是示出使用引入了多个修饰的引物时的黏端制备与连接的实验设计以及序列的图。
图27是示出使用引入了多个修饰的引物的黏端制备节和连接反应的示意图,并且是示出PCR产物的琼脂糖(Agarose)凝胶电泳结果的图。
图28示出了,对在PCR扩增产物的多个位置切断而得到的34个碱基长度的黏端DNA彼此间的连接及其连接效率进行比较的结果。
具体实施方式
1.核酸链切割方法
以下,对本发明的核酸链切割方法进行说明。本发明的核酸链切割方法,具备:核酸制备步骤,制备具有下述式(1)所示的结构的切割对象核酸;切割步骤,使该切割对象核酸与切割剂进行反应在式(1)的X的部分对切割对象核酸进行切割,并生成具有下述式(2)所示的结构的核酸。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒。NucA,由至少1个核苷酸构成,是切割对象核酸的一部分,表示以X为基准的5’端侧的部分。NucB,由至少1个核苷酸构成,是切割对象核酸的一部分,表示以X为基准的3’端侧的部分。)
其中,碱基B,具体地能够列举:腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、N-甲基腺嘌呤、N-苯甲酰基腺嘌呤、2-甲硫基腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤,N-异丁酰基鸟嘌呤、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-甲基胞嘧啶、4-N,N-二甲基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶或者5,6-二氢尿嘧啶等。
切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子。作为切割剂,基于毒性小、便宜等观点,特别优选银。在切割剂为银纳米粒子的情况下,切割对象核酸的式(1)中的X优选为硫。
金属纳米粒子平均粒径,基于提高对切割对象核酸的切割效率等观点,优选为100nm以下,更优选为50nm以下,特别优选为20nm以下。另外,金属纳米粒子的平均粒径的下限,没有特别限定,例如为0.1nm以上,优选为0.5nm以上,更优选为1nm以上。
金属纳米粒子,基于提高对于切割对象核酸的切割活性的观点,优选使用聚乙二醇进行表面处理以在表面结合聚乙二醇。通过使得聚乙二醇结合于金属纳米粒子的表面,可防止金属纳米粒子的表面的氧化,并且可提高金属纳米粒子在水溶液中的分散性。所以,与未经聚乙二醇表面处理的金属纳米粒子相比较,使用聚乙二醇进行了表面处理的属纳米粒子,对于切割对象核酸的切割活性提高。聚乙二醇,能够使用在末端进行了硫醇修饰的聚乙二醇与金属纳米粒子进行结合。聚乙二醇的平均分子量,优选在1,000~10,000的范围内。
(1)核酸制备步骤
接着,参照图1,对本发明的各个步骤进行说明。图1的上部(「由金属纳米粒子引起的核酸链切割反应[Step_1]),示意性地示出了本发明的核酸链切割方法。需要说明的是,虽然在图1中,对式(1)的X为硫、切割剂为银纳米粒子、将切割对象核酸(硫化寡聚核酸)用作PCR引物的情形进行了说明,但是本发明不限于此。例如当X为硒、切割剂为水银或镉时,也能够通过同样的原理对切割对象核酸进行切割。
首先,对核酸制备步骤进行说明。核酸制备步骤,是制备具有式(1)所示的结构的切割对象核酸的步骤。在该步骤中,能够使用下述式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂通过亚磷酰胺法来合成切割对象核酸的一部分或全部。
(其中,B表示碱基,X表示硫或硒,DMTr(dimethoxytrityl-)表示二甲氧基三苯甲基。)
式(3)所示的酰胺试剂(硫化酰胺试剂(thioamide amidite)或者硒化酰胺试剂(selenated amidite)),能够通过以下的方法合成。首先,准备碱基的氨基用酰胺键进行保护、且5’碳用二甲氧基三苯甲基(DMTr基)或者叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS基:tert-Butyldimethylsilyl)进行保护的核苷衍生物。接着,让该核苷衍生物与三苯基膦(PPh3)、偶氮二甲酸二异丙脂(DIAD:Diisopropyl azodicarboxylate)等进行反应使得3’羟基进行立体旋转,使该3’羟基与硫代苯甲酸或硒代苯甲酸进行反应。接着,通过使得苯甲酸进行碱性水解,得到核苷衍生物的3’羟基的氧被置换成硫或者硒的核苷类化合物。最后,使得2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺等酰胺类化合物进行反应,得到目标的酰胺试剂。
切割对象核酸,能够使用式(3)所示的硫化或者硒化的酰胺试剂、式(4)所示的通常的(即,未经硫化或硒化的)酰胺试剂,使用公知的核酸自动合成装置来进行合成。通过使用式(4)所示的酰胺试剂来合成所需的序列的核酸,并且在目标位置使用式(3)所示的酰胺试剂,能够合成将硫化或硒化的核苷酸配置于所需的位置的切割对象核酸。
在合成切割对象核酸时,优选添加活化剂(activator)。作为活化剂,能够列举:1H-四唑(1H-tet)、5-苄硫基-1H-四唑(BTT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(BTFTH)等。其中,基于减少副生成物(二硫醇物)的生成量并提高目标切割对象核酸的产率,最优选BTFTH。进一步,在使用BTFTH作为活化剂的情况下,偶联时间优选在60~120秒的范围内,基于提高产率的观点,优选以该偶联时间进行多次(例如2~7次)偶联反应。
切割对象核酸,能够使用上述的核酸自动合成装置来合成全长,但是也能够使用核酸自动合成装置仅仅合成切割对象核酸的一部分,并将其用作引物且以具有与切割对象核酸互补的序列的模板DNA为模板,进行多次聚合酶链式反应(PCR)循环,从而合成切割对象核酸的全长。即,通过PCR,使得引物沿着模板DNA延伸,从而生成切割对象核酸。构成引物的核苷酸的个数,能够根据目的进行适当设置,例如可以是5mer以上、50mer以下。
如下文所述,通过让本发明的切割对象核酸形成黏端,并与其他的具有黏端的DNA链进行连接(ligation),能够构建载体等。当黏端中的突出的一侧的单链DNA的长度例如为20个碱基以上的长度时,优选在其互补链那一侧的多个位点引入上述式(1)所示的结构。在这种情况下,如下文所述的实施例所示,基于连接效率的观点,式(1)的结构之间的核苷酸个数nt(碱基数:b),优选为15个以下,更优选为10个以下。通过使得该核苷酸个数为15以下,进行由金属纳米粒子引起的链切割后的DNA片段的脱离变快、连接效率容易变高。
(2)切割步骤
接下来,对切割步骤进行说明。在切割步骤中,使得切割对象核酸与切割剂进行反应在式(1)的X的部分对切割对象核酸进行切割,生成具有下述式(2)所示的结构的核酸。在图1中,使用银纳米粒子对切割对象核酸(硫化寡聚核酸)进行切割,在切割后比X的部分更靠5’端侧的寡聚核酸被切除且切割部分成为磷酸基。
切割剂,优选在使得金属纳米粒子分散的分散液的状态下使用。切割反应,基于切割活性的高的观点,优选在70℃以上进行,更优选在90℃以上进行,特别优选在95℃以上进行。切割反应的温度的上限没有特别限制,优选为100℃以下。另外,切割反应的反应时间,能够根据反应温度进行适当设置,反应温度越高则反应时间能够设置得越短。作为反应时间,优选在5分钟以上且120分钟以下的范围内。
2.核酸链切割装置
接下来,对核酸链切割装置进行说明。本发明的核酸链切割装置,是用于实施上文所述的核酸链切割方法的装置。核酸链切割装置,具备:核酸制备单元,制备具有式(1)所示的结构的切割对象核酸;和切割单元,使得切割对象核酸与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分对切割对象核酸进行切割,生成具有式(2)所示的结构的核酸。
作为核酸制备单元,包含:上文所述的下述式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂、核酸自动合成装置、在核酸合成中使用的各种试剂等。另外,在将由核酸自动合成装置合成的核酸用作引物的情况下,模板DNA和PCR装置、PCR中使用的试剂等也包含在核酸制备单元中。
作为切割单元,包含:用核酸制备单元合成的切割对象核酸、上文所述的切割剂、用于进行由切割剂引起的切割对象核酸的切割反应的各种装置(培养箱(incubator)等)、反应中使用的各种试剂等。
3.具有黏端的双链DNA的制造方法
接下来,对制造具有黏端的双链DNA的方法进行说明。在本发明的制造方法中,在双链DNA的一个末端侧或两个末端侧形成黏端。首先,进行双链DNA制备步骤。在该步骤中,制备由正义链和反义链构成的切割对象双链DNA。反义链,具有与上述的正义链互补的序列。该正义链和反义链中的至少一者,具有式(1)所示的结构。在图1的下部(方框包围的部分),示出了正义链和反义链双方均具有式(1)的结构的情况。像这样,通过在两条链中引入式(1)的结构,能够通过下文所述的黏端生成步骤,生成两端具有黏端的DNA。
接下来,进行黏端生成步骤(图1的“[Step_1]链切割”)。在该步骤中,使得切割对象双链DNA与切割剂进行反应,在式(1)的X的部分将正义链和/或反义链切断。其结果是,生成具有式(2)所示的结构、并且具有黏端的双链DNA。切割条件等通过上文所述的“(2)切割步骤”进行了说明。
3.具有黏端的双链DNA的制造装置
接下来,对制造具有黏端的双链DNA的装置进行说明。本发明的装置,是用于实施上文所述的具有黏端的双链DNA的制造方法的装置。具体地,具备:制备切割对象双链DNA的双链DNA制备单元;和使得切割对象双链DNA与切割剂反应生成具有式(2)所示的结构、并且具有黏端的双链DNA的黏端生成单元。
作为双链DNA制备单元,包括在上文的“核酸制备单元”中说明的式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂、核酸自动合成装置、模板DNA、PCR装置,和各种试剂等。
作为黏端生成单元,包括在上文的“切割单元”中说明的使用核酸制备单元合成的切割对象核酸、切割剂、培养箱等各种装置、和各种试剂等。
在本发明中,作为切割剂,没有使用以往所使用的金属离子而使用了金属纳米粒子,所以能够在保持与金属离子同等的较高的切割活性的同时,进一步提高作为切割生成物的DNA的回收率,能够高效地形成黏端。进一步,具有这样的黏端的DNA彼此之间能够自由地进行连接。例如,利用切割剂让目标DNA与载体双方形成共同的黏端,并将它们连接以制备重组DNA,能够被用于克隆、文库的制作、大量表达体系的构建等。另外,通过将具有黏端的多个基因组序列进行连接,能够在试管内进行基因组构建(genome buildup)反应(参照图1的下部的[Step_2]。或者,通过以平末端的状态将双链DNA引入细胞内,在细胞内进行脱保护处理,能够在细胞内进行基因组构建反应。
实施例
以下,基于实施例具体地说明本发明,但这不对本发明的目的进行限定。另外,下文的实施例中的“%”符号,只要没有特别否定则是质量基准(质量百分比)。
1.硫化酰胺试剂的改良合成和向寡聚核酸的引入
(1)硫化酰胺试剂(胸苷衍生物:T,胞苷衍生物:C)的合成
在下文示出硫化酰胺试剂(胸苷衍生物:T,胞苷衍生物:C)的合成方案。
(a)化合物2T
在5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)胸苷(化合物1T)(1.0g,1.8mmol)中添加三苯基膦(0.72g,2.8mmol)之后,溶解于二氯甲烷(6.0mL)。在冰浴下,缓慢地滴下偶氮二甲酸二异丙脂(Diisopropyl azodicarboxylate)(0.54mL,2.8mmol)。在室温下搅拌3小时之后,使用旋转蒸发器浓缩反应溶液。使用柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂=0/1至1/4)进行纯化,作为白色固体得到0.89g(1.7mmol)的化合物2T(产率94%)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.59(d,J=1.3Hz,1H),7.37-7.30(m,2H),7.30-7.11(m,7H),6.85-6.76(m,4H),5.85(d,J=3.7Hz,1H),5.27(q,J=2.2Hz,1H),4.37(ddd,J=7.8,4.8,2.5Hz,1H),3.68(d,J=2.5Hz,6H),3.13-2.98(m,2H),2.54(dd,J=12.8,1.5Hz,1H),2.44-2.37(m,1H),1.73(d,J=1.1Hz,3H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(b)化合物3T
使得化合物2T(1.0g,1.9mmol)以及硫代苯甲酸铯(1.8g,7.0mmol)悬浊在1,4-二恶烷(40mL)中,在120℃下搅拌一晚。再添加硫代苯甲酸铯(1.8g,7.0mmol),在130℃下搅拌一晚。将反应溶液冷却到室温后,用乙酸乙酯稀释,使用饱和碳酸氢钠水溶液进行2次清洗。通过无水硫酸钠对有机相进行干燥之后,通过旋转蒸发器进行浓缩。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的甲醇/二氯甲烷混合溶剂=0/1至1:60)进行纯化,作为茶色固体得到1.1g(1.7mmol)的化合物3T(产率90%)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.93-7.86(m,2H),7.71(d,J=1.4Hz,1H),7.61-7.56(m,1H),7.47-7.43(m,4H),7.34-7.31(m,4H),7.26(dd,J=8.4,7.0Hz,2H),7.22-7.17(m,1H),6.82-6.77(m,4H),6.30(dd,J=6.6,5.2Hz,1H),4.49(q,J=7.4Hz,1H),4.14(dt,J=7.2,2.7Hz,1H),3.73(d,J=4.4Hz,6H),3.52(dd,J=10.8,2.4Hz,1H),3.45(dd,J=10.8,3.1Hz,1H),2.75(ddd,J=13.8,8.3,5.2Hz,1H),2.53-2.48(m,1H),1.48(d,J=1.3Hz,3H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(c)化合物4T
在进行了30分钟的通氩气的脱氧处理后的乙醇(30mL)-10M氢氧化钠水溶液(4mL)混合溶液中溶解化合物3T(840mg,1.26mmol)之后,在通氩气下,在室温下搅拌2小时。在冰浴上冷却反应溶液,缓慢地滴下1M盐酸水溶液(40mL)来使反应停止。通过吸引过滤回收所生成的沉淀物,在滤纸上用水清洗3次。将得到的固体溶解在二氯甲烷中之后使用无水硫酸钠进行干燥后,使用旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的己烷/乙酸乙酯混合溶剂=1/1至1/3)进行纯化,作为茶色固体得到560mg(0.995mmol)的化合物5T(产率79%)。
1H NMR(600MHz,CDCl3)δ7.68(d,J=1.4Hz,1H),7.41(dd,J=7.5,1.7Hz,2H),7.34-7.20(m,7H),6.83(dd,J=8.8,2.0Hz,4H),6.14(dd,J=7.1,3.0Hz,1H),4.10(q,J=7.1Hz,1H),3.85(dt,J=8.8,2.7Hz,1H),3.77(s,6H),3.63-3.56(m,2H),3.39(dd,J=11.0,2.9Hz,1H),2.59(ddd,J=13.9,7.6,2.9Hz,1H),2.35(ddd,J=13.9,10.2,7.1Hz,1H),1.55(d,J=6.9Hz,1H),1.48(d,J=1.2Hz,3H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(d)化合物5T
将化合物4T(360mg,0.640mmol)溶解于二氯甲烷(5.00ml)后,添加N,N-二异丙基乙胺(331μL,1.92mmol)。接下来,添加2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(185μL,0.830mmol)之后,在室温下搅拌2小时。用二氯甲烷稀释反应溶液,用饱和碳酸氢钠水溶液进行清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的己烷/乙酸乙酯混合溶剂=2/1至1/1.5)进行纯化,作为白色固体得到312mg(0.410mmol)的化合物5T(产率64%)。
1H NMR(400MHz,CD 3CN)δ9.41(s,1H),7.55-7.40(m,3H),7.38-7.24(m,6H),7.24-7.14(m,1H),6.83(dd,J=8.7,5.5Hz,4H),6.18-5.99(m,1H),4.10-3.93(m,2H),3.86-3.75(m,1H),3.73(s,6H),3.71-3.44(m,4H),3.44-3.28(m,1H),2.66-2.53(m,2H),2.53-2.39(m,1H),1.95(s,1H),1.55-1.42(m,3H),1.31-1.05(m,9H),1.03(s,1H),1.01(s,1H)ppm.
31P NMR(162MHz,CD 3CN)δ161.96,158.44ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(e)化合物2C
将N4-苯甲酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧胞苷(化合物1C)(1.00g,1.57mmol)用甲苯(20.0mL)共沸3次。添加三苯基膦(0.456g,1.74mmol)之后,溶解于二氯甲烷(6.00mL)。在冰浴下,缓慢滴下偶氮二甲酸二异丙脂(0.456mL,1.74mmol)。之后,在室温下搅拌16小时。通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩,通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的甲醇/乙酸乙酯混合溶剂=0/1至1/4)进行纯化后,作为白色固体得到0.780g(1.26mmol)的化合物2C(产率78%)。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J=7.1Hz,2H),7.69(d,J=7.5Hz,1H),7.51(t,J=7.3Hz,1H),7.18-7.39(m,12H),6.84(dd,J=9.0,3.6Hz,4H),6.42(d,J=7.5Hz,1H),5.97(d,J=4.1Hz,1H),5.33(s,1H),4.40(s,1H),3.70(d,J=2.4Hz,7H),3.04-3.13(m,2H),2.63(d,J=11.9Hz,1H)ppm.色谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(f)化合物3C
将化合物2C(2.8g,4.8mmol)以及硫代苯甲酸铯(6.0g,24mmol)溶解于1,4-二恶烷(60mL),在室温下搅拌5小时。之后,用乙酸乙酯(100mL)稀释反应溶液,通过饱和碳酸氢钠水溶液(100mL)清洗2次,通过饱和食盐水清洗2次。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=1/1至7/1)进行纯化,作为茶色固体得到2.0g(2.7mmol)的化合物3C(产率56%)。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ11.29(s,1H),8.55(d,J=7.5Hz,1H),8.00(d,J=7.5Hz,2H),7.88(d,J=7.1Hz,2H),7.50-7.73(m,4H),7.38(d,J=7.5Hz,2H),7.14-7.27(m,9H),6.82(q,J=4.5Hz,5H),6.12(d,J=9.2Hz,1H),4.40(t,J=9.0Hz,1H),4.23(s,1H),3.69(d,J=5.4Hz,1H),3.66(s,6H),2.65(s,2H),2.36(s,1H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(g)化合物4C、化合物5C
在通过30分钟的通氩气进行了脱氧处理后的甲醇(15mL)-THF(21mL)-0.5M氢氧化钠水溶液(22mL,11mmol)混合溶液中溶解化合物3C(1.64g,2.2mmol)之后,在通氩气下,在-10℃下搅拌30分钟。对于反应溶液,缓慢滴下1M磷酸二氢钾水溶液(46.6mL,46.6mmol)以使反应停止。通过乙酸乙酯(100mL)进行稀释之后,用水(100mL)清洗2次。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的甲醇/二氯甲烷混合溶剂=1/50至1/10)进行纯化后,作为白色固体得到1.18g的化合物4C。将所得的化合物4C量取0.94g(1.43mmol),溶解于二氯甲烷(15.2mL)之后,添加N,N-二异丙基乙胺(0.35mL,1.57mmol)以及2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺(0.35mL,1.57mmol),在室温下搅拌2小时。用二氯甲烷(20mL)稀释反应溶液,用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的乙腈/二氯甲烷混合溶剂=3/7)进行纯化后,作为白色固体得到1.0g(1.2mmol)的化合物5C(2个阶段总计产率68%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.19(s,1H),8.78(s,1H),8.30(d,J=19.5Hz,H),8.02-8.05(m,2H),7.51-7.63(m,3H),7.37-7.42(m,2H),7.27-7.31(m,5H),7.18-7.25(m,3H),6.77-6.81(m,4H),6.42(dd,J=7.0,2.5Hz,1H),4.21-4.25(m,1H),3.90(t,J=6.2Hz,1H),3.79-3.85(m,1H),3.77(d,J=4.3Hz,6H),3.57-3.67(m,5H),3.41-3.45(m,1H),3.07-3.14(m,1H),2.60(t,J=6.2Hz,1H),2.44(t,J=6.3Hz,2H),1.18-1.22(m,6H),1.13-1.17(m,6H)ppm.
31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ165.57,161.68ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(2)硫化酰胺试剂(腺苷衍生物:A)的合成
硫化酰胺试剂(腺苷衍生物:A)的合成方案如下所示。
(a)化合物2A、化合物3A
将N6-苯甲酰基-5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脱氧腺苷(化合物1A)(10.0g,15.2mmol)、4-硝基苯甲酸(5.08g,30.4mmol)以及三苯基膦(16.0g,61.0mmol)溶解于THF(800mL),在0℃下一边搅拌一边缓慢滴下偶氮二甲酸二异丙脂(11.9mL,61.0mmol)。在0℃下搅拌2小时后,通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩,通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=7/3)进行纯化,作为白色固体得到18.5g的化合物2A。将所得的化合物2A量取10.0g(12.6mmol),添加碳酸钾(1.71g,49.6mmol)之后,溶解于甲醇(125mL)。在冰浴下搅拌2小时之后,对反应溶液进行浓缩。将残渣溶解于乙酸乙酯(75mL),用水(75mL)清洗2次。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器蒸馏除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=1/1)进行纯化,作为白色固体得到1.40g(2.10mmol)的化合物3A(2段階总计产率38%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d 6)δ11.18(s,1H),8.75(s,1H),8.47(s,1H),8.03(d,J=7.6Hz,2H),7.53-7.66(m,3H),7.17-7.39(m,9H),6.75-6.83(m,4H),6.50(d,J=7.4Hz,1H),5.48(d,J=4.3Hz,1H),4.31(d,J=44.2Hz,2H),3.66-3.74(m,6H),3.37(d,J=8.1Hz,1H),3.20(d,J=10.3Hz,1H),2.78(s,1H),2.38(d,J=14.6Hz,1H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(b)化合物4A、化合物5A、化合物6A
将三苯基膦(2.4g,9.0mmol)溶解于THF(53mL),在冰浴下一边搅拌一边缓慢滴下偶氮二甲酸二异丙脂(1.75mL,9.0mmol)。在冰浴下搅拌30分钟之后,添加硫代苯甲酸(1.08mL,9.0mmol),在冰浴下再搅拌30分钟。接下来,添加化合物3A(2.0g,3.0mmol),在冰浴下搅拌16小时。通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩,通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=1/1至2/1)对残渣进行纯化,作为白色固体得到2.3g的化合物4A。将得到的化合物4A量取2.3g(3.0mmol),溶解于通过30分钟的通氩气进行了脱氧处理后的甲醇(42mL)-THF(28mL)-0.5M氢氧化钠水溶液(18mL,9.0mmol)混合溶液中,在通氩气下,在-10℃下搅拌30分钟。对于反应溶液,缓慢滴下1M磷酸二氢钾水溶液(38mL,19mmol)由此使反应停止。通过吸引过滤来回收所生成的沉淀物,在滤纸上用水(200mL)进行3次清洗。将得到的固体通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的甲醇/二氯甲烷混合溶剂=1/50至1/20)进行纯化,作为白色固体得到1.62g的化合物5A。将得到的化合物5A量取1.5g(2.3mmol),添加5-(乙硫基)-1H-四唑(0.30g,2.3mmol)之后,溶解于二氯甲烷(10mL)。接着,添加2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基磷二酰胺(1.1mL,3.5mmol),在室温下搅拌1小时。将反应溶液用二氯甲烷(50mL)稀释之后,用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)进行清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=2/1至8/1)进行纯化,作为白色固体得到0.46g(0.54mmol)的化合物6A(3阶段总计产率17%)。
1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ9.19(s,1H),8.78(s,1H),8.30(d,J=19.5Hz,1H),8.02-8.05(m,2H),7.51-7.63(m,3H),7.37-7.42(m,2H),7.27-7.31(m,5H),7.18-7.25(m,3H),6.77-6.81(m,4H),6.42(dd,J=7.0,2.5Hz,1H),4.21-4.25(m,1H),3.90(t,J=6.2Hz,1H),3.79-3.85(m,1H),3.76-3.77(m,7H),3.57-3.67(m,5H),3.41-3.45(m,1H),3.07-3.14(m,1H),2.60(t,J=6.2Hz,1H),1.18-1.22(m,6H),1.13-1.17(m,6H)ppm.
31P-NMR(162MHz,CDCl3)δ165.22ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(3)硫化酰胺试剂(鸟苷衍生物:G)的合成
硫化酰胺试剂(鸟苷衍生物:G)的合成方案如下所示。
(a)化合物2G
将化合物1G(7.3g,16mmol)溶解于二氯甲烷(370mL),添加戴斯马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane)(34g,80mmol)以及碳酸氢钠(21g)。在冰浴下搅拌2小时,接着在室温下搅拌3小时。反应结束后,添加饱和碳酸氢钠水溶液(370ml)以及硫代硫酸钠(370mL),使用二氯甲烷(730mL)进行2次萃取。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器蒸馏除去溶剂。将得到的2’-酮体溶解于四氢呋喃(260mL),在-78℃下搅拌30分钟。接下来,缓慢滴下1M的L-selectride(三仲丁基硼氢化锂)/四氢呋喃溶液(40mL,40mmol),在-78℃下搅拌16小时。在反应溶液中添加饱和氯化铵水溶液(50mL)使反应结束,使用乙酸乙酯进行3次萃取。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:甲醇/二氯甲烷=1/15)进行纯化,作为白色固体得到3.6g(8.0mmol)的化合物2G(产率50%)。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.06(s,1H),11.70(s,1H),8.12-8.19(m,1H),6.12(dd,J=8.2,1.9Hz,1H),5.35-5.39(m,1H),4.29-4.37(m,1H),3.92-4.11(m,2H),3.73-3.79(m,1H),2.65-2.81(m,2H),2.21-2.32(m,1H),1.08-1.15(m,6H),0.83-0.86(m,9H),0.16~-0.14(m,6H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(b)化合物3G、化合物4G
将三苯基膦(11g,40mmol)溶解于四氢呋喃(140mL),在冰浴下一边搅拌一边缓慢滴下偶氮二甲酸二异丙脂(7.8mL,40mmol)。在冰浴下搅拌30分钟,添加硫代苯甲酸(4.7mL,40mmol),再在0度下搅拌30分钟。之后,添加化合物2G(3.0g,6.7mmol),在冰浴下搅拌3小时,再在室温下搅拌16小时。通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩之后,通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:乙酸乙酯/己烷=1/1)进行纯化后,作为白色固体得到25g的化合物3G。将得到的化合物3G(25g,6.7mol)溶解于四氢呋喃(100mL)之后,添加三乙胺三氟化氢盐(16ml,100mmol),在室温下搅拌16小时。通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩之后,通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:甲醇/二氯甲烷=1/15)进行纯化。进一步,通过二氯甲烷进行再结晶,作为白色固体得到2.4g(5.2mmol)的化合物4G(2阶段总计产率78%)。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.09(s,1H),11.69(s,1H),8.34(d,J=15.6Hz,1H),7.93(dd,J=8.3,0.8Hz,2H),7.67-7.74(m,1H),7.54-7.63(m,2H),6.24(t,J=5.9Hz,1H),5.20(t,J=5.4Hz,1H),4.34(q,J=7.1Hz,1H),4.09-4.14(m,1H),3.60-3.74(m,2H),3.01-3.05(m,1H),2.72-2.79(m,1H),2.58-2.63(m,1H),1.11(dd,J=7.0,2.2Hz,6H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(c)化合物5G
将化合物4G(1.5g,3.3mmol)以及4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(2.2g,6.6mmol)溶解于吡啶(30mL),在室温下搅拌16小时。通过旋转蒸发器对反应溶液进行浓缩之后,将残渣溶解于二氯甲烷(50mL),用饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)进行清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器蒸馏除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:甲醇/二氯甲烷=1/20)进行纯化后,作为白色固体得到2.41g(3.2mmol)的化合物5G(产率97%)。
1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)δ12.11(s,1H),11.70(d,J=17.3Hz,1H),8.17-8.26(m,1H),7.89(dd,J=8.3,1.2Hz,2H),7.52-7.79(m,3H),7.14-7.40(m,9H),6.73-6.82(m,4H),6.30(q,J=3.5Hz,1H),4.45-4.57(m,1H),4.20-4.23(m,1H),3.61-3.79(m,6H),3.22-3.31(m,2H),3.17(dq,J=13.7,3.9Hz,1H),2.61-2.82(m,2H),1.13(dd,J=6.8,1.4Hz,6H)ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(d)化合物6G、化合物7G
将化合物5G(2.0g,2.6mmol)溶解于甲醇/四氢呋喃混合溶剂(3/2,90mL),在冰浴下搅拌30分钟。接下来,添加0.5M氢氧化钠水溶液(18mL,9.0mmol)之后,在通氩气进行脱氧的条件下,在0℃下处理2小时,在室温下处理30分钟。对于反应溶液,缓慢滴下1M磷酸二氢钾水溶液(33mL,33mmol)以使反应停止。接下来,用乙酸乙酯(300mL)稀释反应溶液,用饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)以及饱和食盐水(300ml)进行清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂,作为白色固体得到1.7g的化合物6G。在得到的化合物6G(1.7g,2.6mmol)中添加5-(乙硫基)-1H-四唑(0.34g,2.6mmol),并溶解于二氯甲烷(40mL)。接下来,添加2-氰乙基N,N,N’,N’-四异丙基磷二酰胺(1.3mL,4.0mmol),在室温下搅拌1小时。用二氯甲烷(300mL)稀释反应溶液,用饱和碳酸氢钠水溶液(300mL)进行2次清洗。通过无水硫酸钠干燥有机相之后,通过旋转蒸发器除去溶剂。通过柱层析色谱法(中性闪式硅胶,展开溶剂:含有1%三乙胺的乙腈/二氯甲烷混合溶剂=1/4)进行纯化,作为白色固体得到1.2g(1.4mmol)的化合物7G(产率53%)。
1H-NMR(600MHz,CDCl3)δ12.00(d,J=10.2Hz,1H),8.45(d,J=34.0Hz,1H),7.83-7.87(m,1H),7.41-7.43(m,2H),7.29-7.31(m,4H),7.17-7.24(m,3H),6.73-6.82(m,4H),6.14-6.17(m,1H),4.19-4.25(m,1H),3.87-3.55(11H),3.54-3.27(2H),3.00-3.12(m,1H),2.32-2.68(m,4H),1.09-1.21(m,18H)ppm.
31P-NMR(243MHz,CDCl3)δ160.81,159.97ppm.波谱数据与文献值示出了良好的一致性。
(4)使用硫化酰胺试剂(化合物5T)的具有3’-硫代磷酸键的寡聚核苷酸的合成和反相HPLC以及MALDI-TOF-MS的分析
(a)DNA合成
使用化合物5T以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常的方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成了寡聚脱氧核糖核苷酸5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’末端引入荧光素(FAM)。各种酰胺试剂使用了70mM的乙腈溶液,只有化合物5T使用了150mM的乙腈溶液。作为活化剂使用0.3M BTT,作为氧化剂使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液。另外,采取了通过使用6-FAM-glycerol support(6-FAM-甘油支持物)(ChemGenes公司制造)作为固相载体从而在3’末端引入FAM的设计。合成中设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器在减压下干燥滤液。将所得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,通过测定260nm下的吸收从而计算出浓度。寡聚核苷酸的MALDI-TOF分子量测定使用3-羟基吡啶甲酸作为基质,并使用UltrafleXtreme(Bruker公司制造)的线性正模式。
(b)分析结果
图2,示出了使用了硫化酰胺试剂(化合物5T)的具有3’-硫代磷酸键的寡聚核苷酸的合成、和反相HPLC以及MALDI-TOF-MS的分析结果。
图2(a),示出了使用化合物5T合成在从5’侧开始第4个碱基和第5个碱基之间具有3’-硫代磷酸键的20个碱基长度的寡聚脱氧核糖核苷酸5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’,并通过反相HPLC进行分析的结果。图2(a)、图2(b)的HPLC分析条件如下所述。
<使用系统>
·柱:YMC Hydrosphere C18(柱尺寸:250x10.0mm)
·洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),
·洗脱液B:乙腈,
<梯度条件>
·流速:3mL/分钟,
·柱温度:50℃,
·检测波长:260nm.
反相HPLC的结果是,在保留时间为18.8分钟附近看到的主峰为20mer的目标物DNA,是DMTr基作为5’-羟基保护基而残留的状态。与之相对地,在保留时间为12.7~13.5分钟附近还观测到了一部分的、在化合物5T的引入阶段停止合成的产物,但是能够容易将其与20mer的目标物的寡聚脱氧核糖核苷酸(DNA)分离。通过分离取出保留时间为18.8分钟附近的峰,得到了目标物DNA的5’-DMTr保护物。
图2(b)示出了,将通过反相HPLC分离取出并纯化后的5’-DMTr保护物,添加于10%醋酸水溶液,并在室温下进行一小时处理从而将DMTr基脱保护,并通过反相HPLC对所得到的DNA进行分析的结果。其结果是,在保留时间12.3分钟附近观测到了一个峰,并且可确认以99%以上的高纯度得到了目标物DNA。
图2(c)示出了上文得到的DNA的MALDI-TOF-MS分子量分析结果。其结果是,观测到了来自目标物的m/z 6650.7的峰。
2.硫化寡聚核酸的由金属纳米粒子引起的DNA链切割反应
(1)通过银纳米粒子处理进行的DNA链切割反应的银纳米粒子尺寸
(a)银纳米粒子处理
将3μM的PS修饰DNA(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)量取10μL,并添加50μL的银纳米粒子分散液(10nm,0.02mg/mL),在37℃下孵育31小时。将反应溶液量取20μL并添加20μL的2x loading buffer(上样缓冲液)。在95℃下进行5分钟加热处理后,通过15%变性丙烯酰胺电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分钟,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(b)通过银纳米粒子处理进行的DNA链切割反应的反应时间·反应温度依赖性
将3μM的PS修饰DNA(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)量取10μL,并添加50μL的银纳米粒子分散液(10nm,0.02mg/mL),在70℃或者95℃下以规定的时间进行孵育。将反应溶液量取30μL并添加30μL的2x loading buffer。在95℃下进行5分钟的加热处理之后,通过15%变性丙烯酰胺电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分钟,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(c)结果
图3是示出通过银纳米粒子处理进行的DNA链切割反应的研究、和银纳米粒子尺寸以及反应时间·反应温度依赖性的结果的图。
图3(a)示出了由银纳米粒子引起的DNA链切割中的银纳米粒子尺寸依赖性的结果。使用10nm、20nm、100nm的银纳米粒子,通过变性凝胶电泳对20mer DNA 5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’的链切割所导致的15mer DNA 5’-pCACATTAATTGCGTT-FAM-3’的生成进行分析。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’末端引入FAM作为荧光色素。成为切割后15mer DNA的5’末端残留有磷酸(p)的设计。切割反应在37℃下进行31小时。通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,可知使用10nm、20nm、100nm的银纳米粒子时的切割效率分别为35.9%、21.9%、13.1%,随着纳米粒子尺寸变大而切割效率降低。
图3(b),示出了由银纳米粒子引起的DNA链切割的反应时间以及反应温度依赖性。使用10nm的银纳米粒子在70℃或者95℃下进行20mer DNA的链切割反应。反应进行15、30、60、120分钟并通过变性凝胶电泳对各个反应溶液进行分析,通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,由此计算出各个温度·时间下的切割效率,在横轴绘制反应时间,在纵轴绘制切割效率。其结果是,可看到依赖于反应时间的链切割效率的提高,在反应开始2小时后,在70℃下观测到了50%左右的链切割,在95℃下观测到了90%以上的链切割,可知伴随着温度上升而切割活性提高。由此可知,在市售的纳米粒子的情况下,为了诱发高效率的DNA链切割需要高温条件。
(2)使用了表面PEG修饰银纳米粒子的DNA链切割
(a)银纳米粒子表面的聚合物修饰
将3.4μM的PS修饰DNA(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)量取9μL,添加51μL的表面PEG修饰银纳米粒子分散液(10nm),以规定的时间·温度进行孵育。表面PEG修饰银纳米粒子分散液,通过在50μL的市售的银纳米粒子分散液(sigma-aldrich公司制造,10nm,0.02mg/mL)中添加23.9g/L的末端硫醇化PEG(O-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-O’-甲基聚乙二醇,平均分子量5,000,Sigma-Aldrich公司制造)水溶液(1μL),由此制备。将反应溶液量取20μL并添加20μL的2x loading buffer。以95℃加热处理5分钟后,通过15%变性丙烯酰胺电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)来取得凝胶电泳图像。
(b)结果
图4是示出银纳米粒子表面的聚合物修饰所引起的DNA链切割活性提高的结果。
图4(a),是表示进行了聚合物修饰的银纳米粒子表面的示意图。进行聚乙二醇修饰,该聚乙二醇是进行了末端硫醇修饰的平均分子量5,000的聚乙二醇。表面修饰纳米粒子,通过在市售的银纳米粒子分散液中混合任意的量的聚合物,能够容易地进行制备。通过对所添加的聚合物量进行调节,能够对修饰量进行控制。
图4(b),示出了1nm的银纳米粒子有无表面修饰时的DNA链切割活性进行比较的结果。图中的PEG-SH表示具有末端硫醇的聚乙二醇。反应在37℃下进行31小时,通过变性凝胶电泳对反应溶液进行分析,并通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,从而计算出切割效率。其结果是,在没有PEG-SH修饰的情况下,切割效率为35.9%,然而在PEG修饰银纳米粒子的情况下示出了91.8%的切割活性,通过表面PEG修饰大幅地提高了切割活性。该切割活性提高效果,可通过PEG修饰所引起的防止银纳米粒子的表面氧化和提高在水溶液内的分散性来解释说明。
图4(c)示出了,使用1nm的表面PEG修饰银纳米粒子的DNA链切割的反应时间依赖性的结果。反应在50℃下分别进行15、30、60分钟,通过变性凝胶电泳对各个反应溶液进行分析,并通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,由此计算出各反应时间下的切割效率。其结果是,可观测到依赖于反应时间的链切割效率的提高,在反应开始60分钟后观测到了90%以上的切割。根据该结果,通过对市售的银纳米粒子表面进行PEG修饰,能够在比较温和的条件下进行高效率的DNA链切割。
(3)双链短链DNA的通过银纳米粒子处理制备3’悬挂黏端
(a)3’悬挂黏端的制备
以分别为分别为3μM的方式混合PS修饰DNA(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)和互补链DNA(5’-AACGCAATTAATGTGAGTTA-3’),在95℃下进行3分钟处理后,在冰浴上冷却10分钟以上进行退火。将退火后的溶液量取9μL并添加51μL的表面PEG修饰银纳米粒子分散液(10nm),以50℃孵育规定的时间。表面PEG修饰银纳米粒子分散液,通过对50μL的市售的银纳米粒子分散液(sigma-aldrich公司制造,10nm,0.02mg/mL)添加1μL的末端硫醇PEG水溶液(23.9g/L),从而制备。将反应溶液量取30μL并添加30μL的2x loading buffer。在95℃下加热处理5分钟之后,通过15%变性丙烯酰胺电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分钟,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(b)结果
图5示出了,双链短链DNA的通过银纳米粒子处理制备3’悬挂黏端的结果。使用1nm的表面PEG修饰银纳米粒子进行具有3’-SP键的20mer的双链DNA的切割。SP键位于从5’末端开始第5个碱到第6个碱基之间,设计成如果发生切割则能够制备第5碱基突出的黏端。反应在50℃下分别进行15、30、60分钟,通过变性凝胶电泳对各个反应溶液进行分析,通过检测来自FAM的荧光分析凝胶的带强度,由此计算出各个反应时间下的切割效率。对有无互补链下的切割效率进行比较,在纵轴绘制出各反应时间下的切割效率,在横轴绘制出反应时间。其结果是,具有互补链的情况,与没有互补链的情况相比较,虽然切割活性略微降低,但是在反应开始2小时后示出了大致相同等程度的切割活性,90%以上的DNA被切断。由此可知,由表面PEG修饰银纳米粒子引起的DNA链切割能够应用于黏端DNA制备。
3.将硫化寡聚核酸用作聚合酶链延伸反应(PCR)用引物的、在寡聚核酸连接中的应用(1)实验项
(a)使用硫化DNA作为模板的PCR的研究
混合110μM硫化模板DNA(0.37μL)与15μL引物DNA(1.34μL),按照各种聚合酶的制造商推荐条件,添加dNTP混合物、各种聚合酶(KOD-Pkus-Neo,PrimeSTAR HS,PhusionHigh Fidelity,Q5 High Fidelity,Deep Vent,Taq DNA polymeras),添加附带聚合酶的缓冲液,使得总液量为20μL。接下来,进行变性(95℃,1分钟)-退火(50℃,30秒)-链延伸(72℃,30分),用2x loading buffer(20μL)稀释反应溶液。通过20%变性凝胶电泳(含有7.5M尿素,20x22cm,20W,2h)进行分析。使用1x SYBR Green II溶液进行30分钟振荡从而进行凝胶的染色,通过凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(b)使用硫化DNA引物的PCR
将20μM硫化正向引物(1.25μL)、20μM硫化反向引物(1.25μL)、10ng/μL模板DNA(2.5μL)、2mM dNTP混合物(5μL)、25mM硫酸镁(3μL)、KOD-Plus-Neo的10x PCR Buffer(5μL)和超去离子水(31μL)进行混合,添加1U/μL KOD-Plus-Neo(1μL)之后,使用热循环仪(BioRad公司制造),在95℃下进行2分钟处理。接下来,将变性(95℃,15秒)-退火(55℃,15秒)-链延伸(68℃,30秒)的循环进行30次,从而扩增DNA。使用wizard column(Promega公司制造),按照制造商推荐协议对PCR产物进行纯化,得到硫化DNA。
(c)通过金属纳米粒子处理进行的黏接片段的制备
将7.5nM PCR产物硫化DNA(225fmol/sample)溶解于超去离子水制备4.5μL的水溶液。通过将10nm的银纳米粒子(Sigma-Aldrich公司制造,200μg/mL柠檬酸缓冲液悬浊液,25μL)与末端硫醇修饰PEG(Sigma-Aldrich公司制造,23.9g/L水溶液,0.5μL)进行混合,制备了PEG修饰银纳米粒子。将所制备的PCR产物硫化DNA水溶液(4.5μL)与PEG修饰银纳米粒子分散液(25.5μL)混合之后,在50℃下处理2~4小时从而进行SP键的切割以制备黏端。
(d)由DNA连接酶引起的连接和凝胶解析
将7.5nM银纳米粒子处理产物DNA_1(3.6μL)、7.5nM银纳米粒子处理产物DNA_2(3.6μL)、10x T4 DNA Ligase Reaction Buffer(连接酶反应缓冲液)(New EnglandBioLabs公司制造,0.90μL)、超去离子水(0.45μL)混合之后,添加T4 DNA连接酶(NewEngland BioLabs公司制造,2000U/μL,0.45μL),在25℃下孵育3小时。对于反应溶液(9μL),添加1μL的10x加样缓冲液(loading buffer),通过1%琼脂糖(Agarol)凝胶电泳(电泳缓冲液:1x TBE,100V,30分钟)进行分析。通过使用10,000x SYBR green I溶液振荡30分钟来进行凝胶的染色,通过凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(2)结果
图6示出了将硫化寡聚核酸引入DNA模板时的PCR的研究结果。对于在从5’末端开始第14个碱基与第15个碱基之间引入了3’-SP键的模板DNA 5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’,使用22mer的5’-FAM化DNA引物5’-FAM-AACGCAATTAATGTGAGTTAGC-3’进行退火,利用各种聚合酶(KOD-Pkus-Neo,PrimeSTARHS,Phusion High Fidelity,Q5 High Fidelity,Deep Vent,Taq DNA polymerase)进行聚合酶延伸反应。当延伸在3’-SP修饰部位停止时,产生了从22mer的引物延伸了4个碱基或者5个碱基的产物。另一方面,当没有问题地延伸过3’-SP修饰部位时,生成了完整长度的41mer的DNA。通过20%变性凝胶电泳(含有7.5M尿素,20x22cm,20W,2小时)分析反应溶液,利用来自5’-FAM的荧光检测通过凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)使得带可视化。其结果是,在使用任一种聚合酶的情况下均可看到来自完整长度41mer的DNA的带,没有观察到在3’-SP修饰部位的停止延伸的产物。由此可知,引入了3’-SP修饰的DNA能够作为引物发挥作用。
图7,示出了PCR的DNA扩增和通过BsaI或银纳米粒子处理制备黏接片段的示意图。图7(a),示出了使用限制酶BsaI来制备4碱基悬挂黏端的结果。图7(b),示出了利用由银纳米粒子处理引起的3’-SP键切割来制备8碱基悬挂黏端的结果。银纳米粒子使用进行了表面PEG修饰的10nm尺寸的粒子。
图8,示出了使用T4 DNA连接酶的黏接片段的连接实验结果。
图8(a)示出了,通过银纳米粒子处理或者通过作为对比实验的限制酶BsaI处理来制备2条黏接片段DNA、利用T4 DNA连接酶连接2条黏接片段DNA,并通过1%琼脂糖(Agarol)凝胶电泳(电泳缓冲液:1x TBE,100V,30分钟)进行分析的结果。反应在25℃下进行3小时,分别进行60、120、180、240分钟的PCR产物DNA的银纳米粒子处理并使用各个反应时间下的切割反应生成物,对这些产物的由T4 DNA连接酶引起的连接效率进行比较。根据凝胶的结果能够确认,在所有的连接反应条件下,均生成了838bp的连接产物。
图8(b)所示的图表,示出了各个银纳米粒子处理时间下的产物以及BsaI处理得到的产物的连接效率。随着银纳米粒子处理时间变长,连接产物量增多。在连接通过240分钟的银纳米粒子处理制备的DNA片段时,与通过BsaI处理制备的DNA片段的连接相比较,示出了较高的连接效率。
4.硫化寡聚核酸链切割中的硝酸银处理(现有技术)与银纳米粒子处理(本发明的技术)的比较
(1)硝酸银处理的硫化寡聚核酸链切割
使用30μM的PS修饰DNA 20mer(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)。需要说明的是,Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’端引入FAM作为荧光色素。将该PS修饰DNA量取1μL,与50mM的硝酸银水溶液(29μL)混合之后,在室温下孵育5~40分钟进行切割反应。达到规定的时间后,将反应溶液分别每次量取5μL,通过添加60mM的乙硫醇水溶液(5μL)使得反应停止。此时,可看到来自银离子的白色沉淀的生成。对于该混合物(10μL),添加2xloading buffer(10μL)。在95℃下进行5分钟加热处理之后,通过15%改性丙烯酰胺凝胶电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。其结果在图9中示出。
图9,是示出了通过现有技术的硝酸银处理切割硫化寡聚核酸链的结果的图。20mer的PS-DNA 5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’通过硝酸银处理得到的链切割生成物为15mer DNA 5’-pCACATTAATTGCGTT-FAM-3’,通过变性凝胶电泳分析该生成物的生成。成为在切割后15mer DNA的5’末端残留有磷酸(p)的设计。通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,示出了在反应开始5分钟有90%以上的DNA被切断。
(2)利用硝酸银处理的硫化寡聚核酸链切割中的切割生成物的MALDI-TOF-MS分子量分析
将110μM的PS修饰DNA 41mer(5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’)量取3μL,与50mM的硝酸银水溶液(67μL)混合之后,在室温下孵育22小时。将反应溶液使用超过滤离心式过滤器(Amicon Ultra 3K,Merck公司制造),按照制造商推荐协议,截断(cut-off)分子量小于3K的分子,从而除去硝酸银。通过该操作,能够大致地除去反应体系中含有的银离子等。回收超过滤后残留的溶液,进行MALDI-TOF-MS分子量分析。MALDI-TOF-MS分子量分析使用3-羟基吡啶甲酸作为基质,使用UltraFleXtreme(Bruker公司制造)的线性负模式进行测定。其结果在图10中示出。
图10示出了通过现有技术的硝酸银处理切割硫化寡聚核酸链时的切割生成物的MALDI-TOF-MS的分子量分析结果。
图10(a),示出了切割目标DNA(41mer)5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’及其切割生成物DNA片段的序列。设计是在图中箭头所示的3’-SP件部位进行切割,5’-片段(15mer)侧成为3’-SH(5’-AGGGGTGCCTAATGTs-3’)、3’-片段(26mer)成为5’-磷酸物(5’-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’,p表示磷酸基)。
图10(b),是示出了硝酸银处理的切割反应液的MALDI-TOF-MS分子量分析的图。可观测到与切割所生成的5’-片段(15mer)和3’-片段(26mer)的分子量466.2,8040.2相对应的峰,所以可认为生成了目标的DNA片段。
图10(c),是来自硝酸银处理的切割生成物5’-片段(15mer)的MALDI-TOF-MS色谱峰区域的放大图。
图10(d),是来自硝酸银处理的切割生成物3’-片段(26mer)的MALDI-TOF-MS色谱峰区域的放大图。
图10(c)、图10(d)表示,切割生成物,以多个银离子附加在磷酸结合部位的形式存在。在MALDI-TOF-MS色谱上,检测出了银离子附加个数不同的、具有簇状的分子量分布的峰。这些结果表示,在通过硝酸银处理进行的硫化寡聚核酸链切割中,难以通过简单的超过滤程度的处理除去过剩地添加的银离子。银离子,会与生理条件·生化学实验所使用的缓冲液中包含的氯化物离子(Cl-)牢固地结合,形成水难溶性的AgCl并生成沉淀(AgCl的水溶性为192μg/100m:J.Phys.Chem.C.,2015,119,20632-20641)。因此,即便高效率地引起了DNA切割反应,银离子会残留在溶液中这样的银离子的切割体系,也难以应用于DNA切割反应后的连接反应。
(3)通过硝酸银处理进行的硫化寡聚核酸链切割、和通过添加硫醇类除去银离子后的切割生成物DNA的回收量的比较
已有银离子可通过与硫醇类的高的相互作用从而作为沉淀被除去的报道。因此,通过在切割反应溶液中添加二硫苏糖醇(DTT)、乙硫醇(EtSH)使得反应停止,并通过离心分离除去所生成的来自于银的沉淀。回收其上清液,通过变性凝胶电泳进行分析。
将110μM的PS修饰DNA 41mer(5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’)量取10μL(1.10nmol),与50mM的硝酸银水溶液(90μL)混合后,在室温下孵育1天进行切割反应。将反应溶液量取20μL(220pmol),通过添加60mM二硫苏糖醇(DTT)水溶液(20μL)或者60mM乙硫醇(EtSH)水溶液(20μL)使得反应停止。此时,看到了来自银离子的白色沉淀的生成。用超去离子水(160μL)稀释该混合物之后,在室温下孵育20分钟。接下来,通过进行离心分离(15,000rpm,15分钟)除去来自银离子的沉淀物。回收上清液,使用超过滤离心式过滤器(Amicon Ultra 3K,Merck公司制造),按照制造商推荐协议,进行浓缩。
将浓缩后的样品溶液,通过使用NanoDrop测定来自于核酸的260nm的吸光度,来对切割生成物进行定量,并由此计算出生成物的回收量。在计算出切割生成物量的基础上,使用两个切割生成物的260nm下的摩尔吸光系数的合计值ε260=396,900L·mol-1·cm-1,或者使用3’侧的切割生成物(5’-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’)的260nm下的摩尔吸光系数ε260=250,000L·mol-1·cm-1,通过朗伯比尔定律进行DNA的定量。将浓缩后的样品溶液量取5μL,与2x loading buffer(5μL)混合。在95℃下进行10分钟处理之后,通过15%改性丙烯酰胺凝胶电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分钟,添加6μL)进行分析。取出电泳后的凝胶,浸入在1x SYBR Green II水溶液中,振荡20分钟对凝胶中存在的DNA带进行染色。通过检测来自于与DNA结合的SYBR Green II的荧光,使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。其结果在图11中示出。
图11,是对通过现有技术的硝酸银处理进行的硫化寡聚核酸链切割、和通过添加硫醇类来除去银离子进行研究的结果。设计是使用41mer的5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’作为切割目标DNA,如图中所示,在3’-SP键部位被切断,生成5’-片段(15mer)5’-AGGGGTGCCTAATGTs-3’)和3’-片段(26mer)5’-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’。
在凝胶分析的DNA的染色中使用SYBR Green II,通过检测来自于与DNA结合的SYBR Green II荧光从而使凝胶上的带可视化。其结果是,在将DTT用于停止反应的体系中,与切割生成物5’-片段、3’-片段一起,还观测到了来自于5’-片段的硫醇部位通过二硫键发生二聚化后的产物的带。来自于二聚化的带,与原料的切割目标DNA即41mer的5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’有大致相同的移动度,难以判别,但是将凝胶的带切出并从凝胶片中萃取DNA之后,进行萃取物的MALDI-TOF-MS分子量分析,结果表明是5’-片段的二聚化物。
在将EtSH用于停止反应的体系中,来自于切割目标DNA即41mer的5’-AGGGGTGCCTAATGTsGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’的带完全消失,在凝胶上只观测到了切割生成物的3’-片段(26mer)5’-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’。可认为这是由于,5’侧的切割生成物即5’-片段(15mer)5’-AGGGGTGCCTAATGTs-3’与EtSH牢固地结合,与银离子一起形成了沉淀,所以在除去银离子沉淀后,只有3’侧的切割生成物即3’-片段(26mer)5’-pGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTT-3’作为上清液被回收。
进一步,通过测定来自于DNA的260nm的吸光度,对添加硫醇类而产生的银离子沉淀被除去后的上清液中含有的DNA量进行定量,其结果在图中的表中示出。每单位反应溶液的DNA总量为220pmol,切割生成物DNA回收量在添加DTT的体系的情况下为92pmol,在添加EtSH的体系的情况下为88pmol,回收率在任一体系中均为40%左右。该结果表示,利用硫醇类的银离子沉淀除去法中,60%左右的切割生成物DNA与银离子一起共沉淀,切割生成物的产量降低。由此也可知,现有技术的通过硝酸银进行的硫化寡聚核酸链切割法难以实际应用。
(4)通过离心分离除去银纳米粒子的证实
已知,银纳米粒子由于表面等离子体共振效应会示出依赖于粒子直径的在350~700nm的范围的吸收。因此,获取分散液的吸收光谱,能够根据吸收度估算出分散液中存在的纳米粒子量。
将具有10、20、100nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取700μL,用超去离子水(700μL)稀释之后,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)测定吸收光谱。测定所使用的装置是日本分光公司制造的紫外可见分光高度计V-650。测定条件,设定为数据间隔:0.5nm,带宽:1.0nm,响应:medium,扫描速度:100nm/分钟。测定吸收光谱后,将使用超去离子水(700μL)稀释后的银纳米粒子分散液转移至小离心管(eppendorf tub),以15,000rpm进行1小时离心分离从而使得纳米粒子沉淀,将其上清液回收并再次转移至石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)后,对吸收光谱进行测定。其结果在图12中示出。
图12,是示出通过离心分离将银纳米粒子除去(纳米粒子尺寸依赖性)的图。图12(a)示出了使用粒子直径10nm的银纳米粒子时的结果。图12(b)示出了使用粒子直径20nm的银纳米粒子时的结果。图12(c)示出了使用粒子直径100nm的银纳米粒子时的结果。图中的蓝色的光谱来自于0.01mg/mL的银纳米粒子分散液。图中的桔色的光谱,是将纳米粒子分散液以15,000rpm进行1小时离心分离以使纳米粒子沉淀,回收所得到的上清液进行测定的结果。
其结果是,观测到离心所导致的400~500nm附近的吸光度降低程度,粒子直径10nm的银纳米粒子分散液为29.9%,粒子直径20nm的银纳米粒子分散液为82.4%,粒子直径100nm的银纳米粒子分散液大致为100%。该结果意味着,通过离心分离操作,在散液中浮游的纳米粒子发生沉淀。因此可知,通过离心分离,能够将粒子直径10~100nm的银纳米粒子以沉淀的方式从反应溶液中除去。还示出了,银纳米粒子尺寸越大越容易通过离心从反应体系中除去,如果是具有20nm以上的粒子直径的纳米粒子,则能够通过离心除去。
(5)硫化寡聚核酸链切割的硝酸银处理与银纳米粒子处理的比较(寡聚核酸回收量的计算)
(a)硝酸银处理
将122μM的PS修饰DNA 20mer(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)量取2μL,与50mM的硝酸银水溶液(38μL)混合之后,在室温下孵育1.5小时。达到规定的时间后,向反应溶液(40μL)添加60mM的DTT水溶液(40μL)从而使得反应停止。此时,看到了来自银离子的白色沉淀的生成。将该混合物(80μL)用超去离子水(20μL)稀释并均匀混合后,以15,000rpm进行1小时离心分离从而除去沉淀物。回收上清液,使用超过滤离心式过滤器(AmiconUltra 3K,Merck公司制造),按照制造商推荐协议,进行浓缩。将浓缩后的样品溶液,使用NanoDrop测定来自核酸的260nm的吸光度从而对切割生成物进行定量,由此计算出生成物的回收量。浓缩后的样品溶液用超去离子水进行稀释,制备0.50μM水溶液。将0.50μM的切割生成物溶液量取5μL,与2x loading buffer(5μL)混合。在95℃下进行5分钟处理之后,通过15%改性丙烯酰胺凝胶电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分,添加5μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
(b)银纳米粒子处理
将122μM的PS修饰DNA 20mer(5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)量取2μL,与具有100nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)(98μL)混合之后,在90℃下孵育25小时。将反应溶液以15,000rpm进行1小时离心分离,以沉淀的方式除去银纳米粒子。回收上清液,使用超过滤离心式过滤器(AmiconUltra 3K,Merck公司制造),按照制造商推荐协议,进行浓缩。将浓缩后的样品溶液,使用NanoDrop测定来自核酸的260nm的吸光度从而对切割生成物进行定量,由此计算出生成物的回收量。浓缩后的样品溶液用超去离子水进行稀释,制备0.50μM水溶液。将0.50μM的切割生成物溶液量取5μL,与2x loading buffer(5μL)混合。在95℃下进行5分钟处理之后,通过15%改性丙烯酰胺凝胶电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分,添加5μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。其结果在图13中示出。
图13,是硫化寡聚核酸链切割的硝酸银处理与银纳米粒子处理的比较。凝胶图像中,Lane1是与切割后生成的DNA的碱基长度相同的DNA(15mer)5’-CACATTAATTGCGTT-FAM-3’的电泳结果。Lane2是切割目标DNA(20mer)5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’的电泳结果。序列中Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’末端引入了FAM作为荧光色素。Lane3,是使用粒子直径100nm的银纳米粒子进行硫化寡聚核酸链切割时的反应生成物的电泳结果。在添加银纳米粒子后,在90℃下孵育25小时,由此进行反应。反应溶液中的银纳米粒子,以15,000rpm进行1小时离心分离以沉淀的方式被除去之后,进行电泳。其结果表示,切割目标DNA(20mer)几乎全部消失,转变成了切割生成物DNA(15mer)(89.6%)。Lane4,是使用硝酸银进行硫化寡聚核酸链切割时的反应生成物的电泳结果。添加硝酸银后,在室温下孵育1.5小时,从而进行反应。反应溶液中的银离子,通过添加DTT以沉淀的方式被除去之后,进行电泳。其结果是,切割目标DNA(20mer)被切断,转变成了切割生成物DNA(15mer)(98.7%)。
[表1]
上表示出了硝酸银处理和银纳米粒子处理的切割生成物DNA的回收量的比较。在硝酸银处理的情况下,通过测定来自DNA的260nm的吸光度,对通过添加DTT除去银离子沉淀后的上清液中所包含的DNA量进行定量。在银纳米粒子处理的情况下,通过离心分离以沉淀的方式除去银纳米粒子后,通过测定来自DNA的260nm的吸光度,对上清中所包含的DNA量进行定量。其结果是,每单位反应溶液的DNA总量为244pmol,与之相对地,硝酸银处理的情况下切割生成物DNA回收量为35.1pmol,回收率仅仅为14.4%,可认为大部分的切割生成物在通过添加DTT除去银离子沉淀时发生了共沉淀。另一方面,银纳米粒子处理的情况下为240pmol,大致定量地回收了切割生成物DNA。基于该结果,作为现有技术的通过硝酸银进行的硫化寡聚核酸链切割法,产量大幅降低所以难以实际应用,采用银纳米粒子的切割法能够高效率地回收切割生成物,是能够实际应用的技术。
(6)评价与银纳米粒子的表面PEG修饰相伴随的分散性
银纳米粒子的表面修饰,通过将末端硫醇化的聚乙二醇(PEG-SH)与市售的银纳米粒子分散液(作为防氧化剂含有柠檬酸,粒子直径20nm)混合,能够容易地制备。使用平均分子量为5,000的PEG-SH。通过测定纳米粒子分散液的基于表面等离子体共振效应的吸收光谱,对纳米粒子的分散性进行评价。
没有表面修饰的银纳米粒子分散液的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,用超去离子水(1050μL)稀释之后,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)来进行测定。没有表面修饰的银纳米粒子分散液的、在缓冲液·盐类的存在下的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,用超去离子水(630μL)稀释之后,添加100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)(140μL)、500mM氯化钾水溶液(140μL)、15mM氯化镁水溶液(140μL)从而制备样品,并使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)来进行测定。
表面PEG修饰银纳米粒子分散液的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,添加23.9g/L的末端硫醇化PEG(O-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-O’-甲基聚乙二醇,平均分子量5,000,Sigma-Aldrich公司制造)水溶液(140μL)之后,用超去离子水(910μL)稀释,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)来进行测定。表面PEG修饰银纳米粒子分散液的、在缓冲液·盐类的存在下的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,添加23.9g/L的末端硫醇化PEG(O-[2-(3-巯基丙酰基氨基)乙基]-O’-甲基聚乙二醇,平均分子量5,000,Sigma-Aldrich公司制造)水溶液(140μL)之后,用超去离子水(490μL)稀释,接下来,添加100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)(140μL)、500mM氯化钾水溶液(140μL)、15mM氯化镁水溶液(140μL)从而制备样品,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)来进行测定。测定所使用的装置是日本分光公司制造的紫外可见分光高度计V-650。测定条件设定为:数据间隔:0.5nm,带宽:1.0nm,响应:medium,扫描速度:100nm/分钟。其结果在图14中示出。
图14示出了银纳米粒子的表面PEG修饰导致分散性提高。图中的蓝色光谱是来自于市售的银纳米粒子分散液的吸收光谱,在396nm观测到了最大吸收。向该纳米粒子分散液添加在生化学实验中,特别是,利用DNA连接酶的连接中经常使用的Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、作为盐的氯化钾以及氯化镁水溶液发现,如红色的光谱所示在396nm附近的吸收消失。该结果表示,添加缓冲液、盐类导致银纳米粒子表面被AgCl覆盖,由于范德瓦尔斯(van der Waal’s)相互作用纳米粒子彼此结合以凝聚物的方式发生沉淀。另一方面,进行了表面PEG修饰的银纳米粒子也如灰色光谱所示具有与市售的银纳米粒子同等的吸收特性,但是表面PEG修饰银纳米粒子如桔色光谱所示,即便添加了缓冲液、盐类在396nm附近也观测到了强的吸收。由此可知,表面PEG修饰银纳米粒子,纳米粒子表面由于PEG的排斥体积效应而得到保护,在缓冲液、盐类的存在下也发挥了较高的分散性。
(7)评价银纳米粒子在PEG4000存在下的分散性
PEG4000(聚乙二醇4,000,平均分子量2700~3300,富士胶卷-和光纯药公司制造)存在下的银纳米粒子分散液的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,用超去离子水(910μL)稀释后,添加15.8g/L的PEG4000水溶液(140μL)从而制备样品,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)进行测定。缓冲液·盐类存在下的吸收光谱,是将具有20nm的粒子直径的银纳米粒子的分散液(Sigma-Aldrich公司制造,0.02mg/mL柠檬酸钠水溶液)量取350μL,使用超去离子水(490μL)稀释后,添加15.8g/L的PEG4000水溶液(140μL)、100mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)(140μL)、500mM氯化钾水溶液(140μL)、15mM氯化镁水溶液(140μL)从而制备样品,使用石英池(光路长度:1cm,光路宽度:1cm)进行测定。测定所使用的装置是日本分光公司制造的紫外可见分光高度计V-650。测定条件设定为,数据间隔:0.5nm,带宽:1.0nm,响应:medium,扫描速度:100nm/分钟。其结果在图15中示出。
图15是为了证明表面修饰用PEG的硫醇基与银纳米粒子的相互作用非常重要,通过表面PEG修饰可提高银纳米粒子的分散性的图。在该实验中,通过测定吸收光谱,对作为比较的、被认为不会与银纳米粒子直接相互作用的硫醇未修饰PEG4000(平均分子量2700~3300,富士胶卷-和光纯药公司制造)的存在下的银纳米粒子(粒子直径20nm)分散液中的举动进行分析。图中的蓝色光谱示出了,在银纳米粒子分散液中添加了1.58g/L的PEG4000的分散液的吸收举动。与原本的市售的银纳米粒子分散液同样地,观测到了在396nm有极大吸收的色谱。但是,在该分散液中添加Tris-HCl缓冲液(pH8.3)、作为盐的氯化钾以及氯化镁水溶液后发现,如灰色和红色的光谱所示,396nm附近的吸收几乎消失,这表示在不会发生银纳米粒子的表面修饰的PEG4000的情况下,无法获得银纳米粒子表面的保护效果且无法期待分散性提高。由此可认为,由硫醇化PEG进行的表面修饰对于银纳米粒子的活性提高和活性维持来说是不可欠缺的。
图16,示出了DNA连接反应的序列设计,反应中利用了通过银纳米粒子切割DNA而生成黏端。该设计是:连接产物DNA的全长为848碱基对,使用具有用Ts表示的3’-SP键的两种DNA引物Rev for F1(用于F1的反向引物):5’-AGCGCCATsTCGCCATTCAGG-3’和Fw forF1(用于F1的正向引物):5’-ATGGCGCTsTTGCCTGGTTTC-3’,通过PCR分别扩增出为298碱基对、558碱基对的DNA片段,通过对所得到的PCR扩增产物进行银纳米粒子处理,能够制备在5’-侧有8个碱基突出的黏端。连接产物序列中的红色下划线部(ATGGCGCT)相当于8个碱基突出部分的序列。在对PCR扩增后的298碱基对和558碱基对的DNA进行银纳米粒子处理后,利用T4 DNA连接酶进行连接,从而能够合成全长848碱基对的连接产物DNA。两种DNA引物Rev for F1:5’-AGCGCCATsTCGCCATTCAGG-3’和Fw for F1:5’-ATGGCGCTsTTGCCTGGTTTC-3’通过核酸自动合成机来合成。
(8)以3’-硫化酰胺的反应条件改良为目的的二聚体模型合成的偶联条件最优化
反应追踪实验:将化合物5T(100mg,0.13mmol,1.0eq.)、3,5-双[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-1,2,4-三唑(3,5-Bis[3,5-bis(trifluoromethyl)phenyl]-1H-1,2,4-triazole)(533mg,1.69mmol,13eq.)、d4T(88mg,0.39mmol,3.0eq.)溶解在乙腈(6.76ml)中,在常温下搅拌2~120分钟。在反应开始2、5、10、30、45、60、120分钟后将反应液取样650μL,转移至NMR样品试管,测定P-NMR(磷核磁共振)。
二聚体模型化合物的合成·单独分离
将化合物5T(100mg,0.13mmol,1.0eq.)、3,5-双[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-1,2,4-三唑(82mg,0.26mmol,2.0eq.)、d4T(88mg,0.39mmol,3.0eq.)溶解在乙腈(13ml)中,在常温下搅拌1小时后,添加四丁基铵高碘酸(74mg,0.17mmol,1.3eq.),再在常温下搅拌7分钟。添加硫代硫酸钠饱和水溶液(10ml),使用二氯甲烷(20ml)进行2次萃取。使用旋转蒸发器浓缩反应溶液,通过色谱法(中性闪式硅胶,甲醇/二氯甲烷=1/7,1%三乙胺)进行纯化后,得到50mg(0.065mmol,50%)的白色固体。
1H-NMR(600MHz,氯仿-D)δ9.15-9.29(m,1H),9.01(s,0H),6.98-7.65(m,15H),6.75-6.85(m,4H),6.19-6.31(m,2H),5.90-5.93(m,1H),4.95(d,J=40.5Hz,1H),4.01-4.36(m,6H),3.67-3.91(m,6H),3.48-3.66(m,1H),3.38-3.46(m,1H),2.55-2.80(m,4H),1.87-2.00(m,3H),1.78(d,J=32.0Hz,3H),1.34-1.56(m,3H),1.15-1.33(m,1H)ppm.
31P-NMR(243MHz,氯仿-D)27.509,26.278ppm.
二聚体模型化合物的合成·单独分离
将化合物7G(30mg,0.035mmol,1.0eq.)、3,5-双[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-1,2,4-三唑(14mg,0.50mmol,13eq.)、d4T(24mg,0.12mmol,3.0eq.)溶解于乙腈(2.0ml),在常温下搅拌1小时之后,添加0.01M I2(4.0ml,0.040mmol,1.1eq.),再在常温下搅拌7分钟。添加硫代硫酸钠饱和水溶液(10ml),使用二氯甲烷(20ml)进行2次萃取。使用旋转蒸发器浓缩反应溶液,通过色谱法(中性闪式硅胶,甲醇/二氯甲烷=1/7,1%三乙胺)进行纯化后,得到31mg(0.032mmol,89%)的白色固体。
1H-NMR(600MHz,氯仿-D)δ11.92(d,J=23.1Hz,1H),10.30-10.13(1H),8.60-8.68(m,2H),7.60-7.72(m,2H),7.11-7.30(m,15H),6.92-6.98(m,1H),6.67-6.83(m,4H),6.31(dtd,J=58.3,3.8,2.0Hz,1H),5.94-6.04(m,2H),5.04-5.11(m,1H),4.80-4.93(m,1H),4.31-4.43(m,2H),4.19-4.24(m,1H),3.97-4.12(m,2H),3.75(d,J=5.4Hz,6H),3.26-3.40(m,3H),2.79-2.87(m,1H),2.49-2.68(m,3H),1.87(t,J=1.5Hz,3H),1.14-1.25(m,7H)ppm.
31P-NMR(243MHz,氯仿-D)29.983,28.438ppm.
如图2(a)所示,在从5’末端开始第4个碱基引入了3’-硫化修饰的19个碱基的DNA(序列:5’-TAACTsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成中,观测到了15个碱基长度的延伸停止产物(根据HPLC峰面积,为约50%左右)。延伸停止产物在HPLC图上表现为13~14分钟附近的两种峰,它们是:3’-硫化酰胺的反应失败的未偶联物,以及在3’-硫化酰胺反应之后、在碘-吡啶氧化条件下链被切割而生成的15个碱基长的5’磷酸化物的混合物。可认为这样的副生成物的生成,是寡聚物合成中产率降低的原因。因此,在二聚体模型合成中,通过进行反应条件的最优化来探索寡聚物合成的改良条件。
图17,是对二聚体模型合成中的各种活化剂、活性剂的浓度、偶联时间进行研究,并对目标物的二聚体的生成产率进行分析的结果。作为活化剂,使用了1H-四唑(1H-tet)、5-苄硫基-1H-四唑(BTT)、4,5-二氰基咪唑(DCI)、5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑(BTFTH)。目标物的产率,通过P-NMR分析,对来自原料的3’-硫化酰胺的信号(160ppm附近)、来自目标物的信号(190ppm)以及来自副生生物的信号(二硫醇物:140ppm附近)的积分比进行比较,从而计算出。其结果是,在使用1H-tet的情况下,目标物的产率为1.4%(项目1),与之相对地,通过使用酸性度更高的BTT可将产率提高到19%(项目2)。在使用求核性更高的活化剂之DCI的情况下,产率与BTT相比没有看到变化(项目3)。进一步,若使用具有高酸性度的BTFTH,则产率提高到66%(项目4)。可认为BTFTH是最优选的活化剂,将BTFTH的浓度从0.02M增加到0.25M发现,在反应时间2分钟时大致定量地进行了反应(项目5)。但是,在使用0.25M的BTFTH的条件下,将反应时间延长至1小时发现,目标物的产率降低,可确认生成了作为副生成物的二硫醇物(项目6)。该结果表示,使用高浓度的BTFTH,并且在短时间内结束反应,对于目标物的产率最大化来说至关重要,增加反应时间会导致目的生成物进一步反应而转化成副生成物且产率降低。3’-硫化酰胺的偶联反应后,通过添加0.01M碘/吡啶/水溶液或者四丁基铵高碘酸作为氧化剂,将磷原子从3价向5价氧化,合成了具有3’硫代磷酸键的二聚体模型。
(9)在二聚体模型合成中,使用0.25M的BTFTH(13当量)时的反应时间的影响
将化合物5T(100mg,0.13mmol,1.0eq.)、3,5-双[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-1,2,4-三唑(533mg,1.69mmol,13eq.)、d4T(88mg,0.39mmol,3.0eq.)溶解在乙腈(6.76ml)中,在常温下搅拌2~120分钟。在反应开始2、5、10、30、45、60、120分钟后将反应液取样650μL,转移至NMR样品试管,测定P-NMR。
图18是示出在二聚体模型合成中、使用0.25M的BTFTH(13当量)时的反应时间的影响的实验结果。图18(A)是绘制出化合物的相对存在量与反应时间的结果,可知所需的反应在反应开始2分钟结束,进一步延长反应时间导致目标物分解,向二硫醇物转变。图18(B)是反应生成物(反应开始2小时后)的P-NMR谱。在190ppm附近观测到目标物的信号,在140ppm附近观测到了来自作为副生成物的二硫醇物的信号。
图19示出了推测的副反应的原理。目标物的二聚体形成之后,被活化剂进一步活性化,在链被切割后,生成二硫醇物。
(10)参考二聚体合成中的最优化的反应条件,应用于寡聚DNA合成并进行条件改良
使用化合物5T以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成寡聚脱氧核糖核苷酸5’-TAATs CATTAATTGCGTT-FAM-3’。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’末端引入荧光素(FAM)。各种酰胺试剂使用50mM的乙腈溶液,仅仅有化合物5T的150mM的乙腈溶液。使用BTFTH作为活化剂,使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液作为氧化剂。作为偶联条件的研究,使用0.25M或1.0M的BTFTH,对20~450秒钟和2~5次的偶联进行研究。另外,采用了使用6-FAM-glycerol support (ChemGenes公司制造)作为固相载体向3’末端引入FAM的设计。合成是,设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器对滤液进行减压下干燥固化。将得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,测定260nm下的吸收从而计算出浓度。通过反相HPLC分析生成物,计算来自于作为5’-羟基保护基的DMTr基残留的状态下的目标物的峰(保留时间17.2分钟)、与来自于在引入3’硫化酰胺5T的阶段停止合成的产物和切断后的产物的峰(保留时间8.0~12.0分钟附近)的峰面积之比。HPLC分析条件如下所述。/>
柱:Hydrosphere C18(250x10.0mml.D.,S-5μm,12nm,HS12S05-2510WT,Ser.No.131EA90023),洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),洗脱液B:乙腈,梯度条件:流速:3mL/分钟,柱温度:50℃,检测波长:260nm.
图20示出了参考在二聚体合成中最优化的反应条件,应用于寡聚DNA合成并进行条件改良的结果。使用在二聚体合成中被证明为最优的BTFTH作为活化剂,对活化剂浓度、偶联时间、偶联次数进行研究,并计算出所得到的17个碱基长度寡聚DNA(序列:5’-TAATsCATTAATTGCGTT-FAM-3’)的反相HPLC峰上的生成比。图20的表中,示出了目标物与链切割物+未反应物(13碱基长度:序列:5’-CATTAATTGCGTT-FAM-3’)的峰比。作为氧化剂,使用最常用的碘吡啶溶液。作为条件研究的对照,使用0.25M的BTT以450秒进行两次偶联时,目标物比为5%(项目1)。使用0.25M的BTFTH以450秒进行两次偶联时,目标物比为46%(项目2),将偶联时间减少到20秒时的目标物比为43%几乎没有看到变化(项目3)。接下来,对于将BTFTH浓度增加到1.0M、以450秒进行两次偶联进行研究,发现目标物比提高了20%左右(项目4),再将偶联时间改变为60秒、将偶联次数改变为5次,发现目标物比略微提高,成为69%(项目5)。接下来,使用0.25M的BTFTH以90秒进行5次偶联,发现目标物比提高到87%(项目6)。基于这些结果可知,在寡聚DNA的固相合成中,通过以较短的偶联时间将偶联反复循环多次,能够使得目标物生成比最大化。
(11)采用最优化的偶联条件进行了合成研究的寡聚DNA(序列:5’-TAA TsCATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成
使用化合物5T以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成了寡聚脱氧核糖核苷酸5’-TAATs CATTAATTGCGTT-FAM-3’。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。另外,在3’端引入了荧光素(FAM)。各种酰胺试剂使用了50mM乙腈溶液,只有化合物5T使用了150mM的乙腈溶液。使用0.25MBTFTH(以90秒进行5次偶联)作为活化剂,使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液作为氧化剂。另外,采用了使用6-FAM-glycerol support(ChemGenes公司制造)作为固相载体向3’末端引入FAM的设计。合成是,设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体中添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出取出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器在减压下干燥固化滤液。将得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,通过测定260nm下的吸收计算出浓度。通过反相HPLC分取出5’-DMTr保护DNA之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的寡聚DNA。HPLC分析条件如下所述。
柱:Hydrosphere C18(250x10.0mml.D.,S-5μm,12nm,HS12S05-2510WT,Ser.No.131EA90023),洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),洗脱液B:乙腈,梯度条件:流速:3mL/分钟,柱温度:50℃,检测波长:260nm.
图21示出了采用在图20的实验中最优化的偶联条件(项目6)进行了合成研究的寡聚DNA(序列:5’-TAA Ts CATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成结果。根据图21的反相HPLC分析结果,与来自于副生成物(链切割物)的峰进行比较得到峰面积比,根据峰面积比可知以87%的比率得到了含有3’-硫代磷酸键的17个碱基长度的目标物(保留时间16.9分钟)。对保留时间16.9分钟的目标物峰进行分取纯化之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理从而将DMTr基脱保护,得到目标的DNA(5’-TAA Ts CATTAATTGCGTT-FAM-3)。
(12)在3个位点引入3’硫代磷酸键的51个碱基长度的寡聚DNA(5’-ATGAAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3’)的合成
使用化合物5T以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成寡聚脱氧核糖核苷酸5’-ATGAAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3’。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。各种酰胺试剂使用了50mM的乙腈溶液,只有化合物5T使用了150mM的乙腈溶液。使用0.25MBTFTH作为活化剂(以90秒进行5次偶联),使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液作为氧化剂。合成是,设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器在减压下干燥固化滤液。将得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,通过测定260nm下的吸收计算出浓度。通过反相HPLC分取5’-DMTr保护DNA之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理从而将DMTr基脱保护,得到目标的寡聚DNA。HPLC分析条件如下所述。
柱:Hydrosphere C18(250x10.0mml.D.,S-5μm,12nm,HS12S05-2510WT,Ser.No.131EA90023),洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),洗脱液B:乙腈,梯度条件:流速:3mL/分钟,柱温度:50℃,检测波长:260nm.
图22示出了,合成在3个位点引入了3’硫代磷酸键的51个碱基长度的寡聚DNA(5’-ATGAAACGCCGAGTTsAACGCCATCAAAAATsAATTCGCGTCTGGCCTTCCTsG-3’),并通过反相HPLC进行分析的结果。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。反相HPLC的结果是,在保留时间17.2分钟附近看到的主峰为51mer的目标物DNA,成为DMTr基作为5’-羟基保护基而残留的状态。与之相对地,在保留时间8.0~12.0分钟附近还观察到了一部分的、在引入化合物5T的阶段停止合成的产物以及切断后的产物,但是能够容易地与51mer的目标物的DNA分离。通过对保留时间17.2分钟附近的峰进行分取,得到了目标物DNA的5’-DMTr保护物。对通过HPLC分取纯化的5’-DMTr保护物进行ESI-TOF-MS分析,可确认是来自目标物的m/z 16,110.2的峰。添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的DNA。
(13)在4个位点以及2个位点引入了3’硫代磷酸键的PCR用引物DNA的序列及其合成
使用化合物5T以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成寡聚脱氧核糖核苷酸。Ts表示进行了3’硫化的胸苷碱基。各种酰胺试剂使用了50mM的乙腈溶液,只有化合物5T使用了150mM的乙腈溶液。使用0.25M的BTFTH作为活化剂(以90秒进行5次偶联),使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液作为氧化剂。合成是设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器在减压下干燥固化滤液。将得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,通过测定260nm下的吸收计算出浓度。通过反相HPLC分取出5’-DMTr保护DNA之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的寡聚DNA。HPLC分析条件如下所述。
柱:Hydrosphere C18(250x10.0mml.D.,S-5μm,12nm,HS12S05-2510WT,Ser.No.131EA90023),洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),洗脱液B:乙腈,梯度条件:流速:3mL/分钟,柱温度:50℃,检测波长:260nm.
图23示出了,在多个位点引入了3’硫代磷酸键的4种PCR用引物DNA的序列及其合成结果。进行合成的引物是:PCR扩增后通过银纳米粒子切割在4个位置被切断,而产生34个碱基的黏端的Rev_primer for F1_8(用于F1_8的反向引物)以及Rev_primer forF2_8(用于F2_8的反向引物),与之相对地,PCR扩增后通过银纳米粒子切割在2个位置被切断,而产生34个碱基的黏端的Rev_primer for F1_16(用于F1_16的反向引物)以及Rev_primer for F2_16(用于F2_16的反向引物)。通过反相HPLC分析合成的4种寡聚DNA。将DMTr基作为5’-羟基保护基残留的状态下的目标长度寡聚DNA的峰(保留时间15分钟附近)分别进行分取纯化之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的DNA。
(14)使用3’-硫化酰胺腺苷衍生物合成的3’硫代磷酸化寡聚DNA(5’-TAACAsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)的合成
使用化合物A以及市售的亚磷酰胺试剂(ChemGenes),按照通常方法使用核酸自动合成机NR-2A 7MX(日本Techno Service公司制造)合成寡聚脱氧核糖核苷酸5’-TAACAsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’。As表示进行了3’硫化的胸苷碱基。各种酰胺试剂使用了50mM的乙腈溶液,只有化合物5T使用了150mM的乙腈溶液。使用0.25M的BTFTH(以450秒进行2次偶联)作为活化剂,使用0.05M的碘(吡啶/水;v/v:9/1)溶液作为氧化剂。合成是,设定为Final DMTr-ON,在5’-末端羟基上的DMTr基残留的状态下取出。合成结束后,向固相载体添加浓氨水(500μL)和40%甲胺水溶液(500μL),在65℃下处理1小时来进行从固相载体的切出以及脱保护。使用Millex LH过滤器(0.45μm,默克公司制造)过滤上清液后,通过离心蒸发器在减压下干燥固化滤液。将得到的寡聚核苷酸再次溶解于超去离子水,通过测定260nm下的吸收计算出浓度。通过反相HPLC分取出5’-DMTr保护DNA之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的寡聚DNA。HPLC分析条件如下所示。
柱:Hydrosphere C18(250x10.0mml.D.,S-5μm,12nm,HS12S05-2510WT,Ser.No.131EA90023),洗脱液A:含有5%乙腈的50mM醋酸三乙基铵(pH7.0),洗脱液B:乙腈,梯度条件:流速:3mL/分钟,柱温度:50℃,检测波长:260nm.
图24示出了,使用3’-硫化酰胺腺苷衍生物(化合物6A),合成含有腺苷衍生物的3’-硫代磷酸化寡聚DNA(序列:5’-TAACAs CACATTAATTGCGTT-FAM-3’)的结果。通过反相HPLC,对使用BTFTH作为活化剂而合成的寡聚DNA进行分析。其结果是,根据反相HPLC峰面积比可知,保留时间16.8分钟附近的5’-DMTr保护目标物寡聚DNA的比率为40%,能够明显地与未偶联物以及链切割物(保留时间11.5分钟附近)分离。在对目标长度寡聚DNA的峰进行分取纯化之后,添加10%醋酸水溶液,在室温下进行一小时处理将DMTr基脱保护,得到目标的DNA。
(15)含有腺苷类似物的3’-硫代磷酸键DNA的、通过银纳米粒子的切割来制备3’-悬挂黏端
将PS修饰DNA(5’-TAACAsCACATTAATTGCGTT-FAM-3’)与互补链DNA(5’-AACGCAATTAATGTGTGTTA-3’)分别混合3μM,以95℃进行3分钟处理后,在冰浴冷却10分钟以上进行退火。将退火后的溶液量取9μL,添加51μL的表面PEG修饰银纳米粒子分散液(10nm),以50℃孵育规定的时间。表面PEG修饰银纳米粒子分散液,是在50μL的市售的银纳米粒子分散液(sigma-aldrich公司制造,10nm,0.02mg/mL)中添加1μL的末端硫醇PEG水溶液(23.9g/L),从而制备的。将反应溶液量取30μL,添加30μL的2x loading buffer。在95℃下进行5分钟加热处理之后,通过15%变性丙烯酰胺电泳(含有7.5M尿素,10x12cm,30mA,20分钟,添加6μL)进行分析。通过来自FAM的荧光检测使用凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
图25,示出了双链短链DNA通过银纳米粒子处理制备了3’悬挂黏端的结果。其中,使用1nm的表面PEG修饰银纳米粒子,对通过图24所示的实验合成的3’-硫代腺苷类似物进行切割。设计成SP键位于从5’末端开始第5个碱基与第6个碱基之间,若发生切断则能够制备5个碱基突出的黏端。反应在50℃下进行15、30、60、120分钟,并通过变性凝胶电泳对各个反应溶液进行分析,通过检测来自FAM的荧光来分析凝胶的带强度,由此计算出各反应时间下的切割效率。将有互补链和无互补链时的切割效率进行比较,在纵轴绘制各反应时间的切割效率,在横轴绘制反应时间。其结果是,在有互补链的情况下,与没有互补链相比较,虽然切割活性略微降低,但是在反应开始2小时后示出了大致相同程度的切割活性,90%以上的DNA被切断。进一步,该切割活性,与图X所示的胸苷类似物的切割实验结果相比较,为大致相同程度,这表示即便修饰部位的碱基种类发生变化,对切割活性也没有影响。
(16)使用了导入多个修饰的引物的黏端制备和连接反应
图26是实验体系的示意图,示出了使用在图23中合成的4种引物DNA得到PCR扩增产物、并对扩增产物进行银纳米粒子切割从而制备的34个碱基长度的黏端以及这些切割产物的连接产物。
(a)使用了4种引物的PCR
将20μM硫化正向引物(1.25μL)、20μM硫化反向引物(1.25μL)、10ng/μL模板DNA(2.5μL)、2mM dNTP混合物(5μL)、25mM硫酸镁(3μL)、10x PCR Buffer for KOD-Plus-Neo(用于KOD-Plus-Neo酶的PCR缓冲液)(5μL)、超去离子水(31μL)进行混合,并添加1U/μL的KOD-Plus-Neo(1μL)之后,使用热循环仪(BioRad公司制造),以95℃进行2分钟处理。接下来,将变性(95℃,15秒)-退火(55℃,15秒)-链延伸(68℃,30秒)循环30次,从而对DNA进行扩增。将PCR产物使用wizard column(Promega公司制造)、按照制造商推荐协议进行纯化,得到硫化DNA。
(b)通过银纳米粒子的切割来制备黏端
将7.5nM PCR产物硫化DNA(225fmol/sample)溶解于超去离子水,制备4.5μL的水溶液。通过将10nm的银纳米粒子(Sigma-Aldrich公司制造,200μg/mL柠檬酸缓冲液悬浊液,25μL)与末端硫醇修饰PEG(Sigma-Aldrich公司制造,23.9g/L水溶液,0.5μL)进行混合,制备PEG修饰银纳米粒子。将制备的PCR产物硫化DNA水溶液(4.5μL)与PEG修饰银纳米粒子分散液(25.5μL)混合之后,通过以50℃进行4小时处理来进行SP键的切割,制备黏端。
图27示出了,使用在图23中合成的4种引物DNA得到PCR扩增产物、并对扩增产物进行银纳米粒子处理切割从而制备34碱基长度的黏端以及这些切割产物的连接实验的流程、和PCR产物DNA的琼脂糖(Agarose)凝胶电泳结果。可确认分别得到了529-bp、307-bp、529-bp、307-bp各4种所需的长度的PCR产物。
(17)在PCR扩增产物的多个位置进行切割而得到的34个碱基长度的黏端DNA彼此的连接和连接效率的比较
将7.5nM银纳米粒子处理产物DNA_1(3.6μL)、7.5nM银纳米粒子处理产物DNA_2(3.6μL)、10x T4 DNA连接酶反应缓冲液(New England BioLabs公司制造,0.90μL),超去离子水(0.45μL)混合之后,添加T4 DNA连接酶(New England BioLabs公司制造,2000U/μL,0.45μL),在25℃下孵育3小时。对于反应溶液(9μL),添加1μL的10x加样缓冲液,通过1%琼脂糖(Agarol)凝胶电泳(电泳缓冲液:1x TBE,100V,30分钟)进行分析。使用10,000x SYBRgreen I溶液进行30分钟振荡,从而进行凝胶的染色,通过凝胶图像分析仪(BioRad公司制造)取得凝胶电泳图像。
图28是,将使用Rev_primer for F1_8(用于F1_8的反向引物)以及Rev_primer for F2_8(用于F2_8反向引物)进行PCR扩增的产物通过银纳米粒子进行切割而得到的34个碱基长度的黏端DNA彼此之间的连接,以及将使用Rev_primer for F1_16(用于F1_16的反向引物)以及Rev_primer for F2_16(用于F2_16的反向引物)进行PCR扩增的产物通过银纳米粒子进行切割而得到的34个碱基长度的黏端DNA彼此之间的连接,以及两者的连接效率的比较结果。使用Rev_primer for F1_8以及Rev_primer for F2_8进行PCR扩增的产物设计成,每8个碱基分别引入了硫代磷酸修饰,与之相对地,使用Rev_primer for F1_16以及Rev_primer for F2_16进行PCR扩增的产物设计成,每16个碱基分别引入硫代磷酸修饰。因此,对它们的连接效率进行比较可知,在通过银纳米粒子进行切割后,切割片段DNA的解离效率对连接产生了影响。也就是说,可以设想,银纳米粒子切割后的DNA片段为8个碱基的情况下,在切割后迅速解离示出了比较高的连接效率,但是银纳米粒子切割后的DNA片段为16个碱基的情况下,在切割后的解离比较慢,示出了较低的连接效率。实验的结果是,在2个位置被切割的体系(Ts修饰x2)中连接效率为29%,在4个位置被切割的体系(Ts修饰x4)中连接效率为44%,这表示通过在多个位置切割,可促进切割后的DNA片段的解离且示出较高的连接效率。虽然图中的清道夫链,黏端彼此组成了互补链,但是清道夫链具有将没有发生连接的产物清除的作用,在凝胶分析中,被用于将连接产物和非连接产物明确区分开。
Claims (14)
1.一种核酸链切割方法,其特征在于,包括:
核酸制备步骤,制备具有下式(1)所示的结构的切割对象核酸;和
切割步骤,使得所述切割对象核酸与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分将所述切割对象核酸切断,生成具有下式(2)所示的结构的核酸,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒;NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分;NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。
2.如权利要求1所述的核酸链切割方法,其特征在于,所述切割剂是银纳米粒子,所述X是硫。
3.如权利要求1所述的核酸链切割方法,其特征在于,所述金属纳米粒子的平均粒径在1~20nm的范围内。
4.如权利要求1所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述金属纳米粒子的表面结合有聚乙二醇。
5.如权利要求1所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,使用下式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂通过亚磷酰胺法来合成所述切割对象核酸的一部或者全部,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒,DMTr表示二甲氧基三苯甲基。
6.如权利要求5所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,使用5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑作为活化剂通过亚磷酰胺法进行合成。
7.如权利要求5所述的核酸链切割方法,其特征在于,在所述核酸制备步骤中,通过亚磷酰胺法合成所述切割对象核酸的一部分并用作引物,将具有与所述切割对象核酸互补的序列的模板DNA用作模板,将聚合酶链式反应循环多次,使得所述引物沿着所述模板DNA延伸,从而生成所述切割对象核酸。
8.一种核酸链切割装置,其特征在于,具备:
核酸制备单元,制备具有下式(1)所示的结构的切割对象核酸;和
切割单元,使得所述切割对象核酸与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分将所述切割对象核酸切断,生成具有下式(2)所示的结构的核酸,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒;NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分;NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。
9.如权利要求8所述的核酸链切割装置,其特征在于,所述核酸制备单元,使用下式(3)以及式(4)所示的酰胺试剂通过亚磷酰胺法来合成所述切割对象核酸的一部分或者全部,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒,DMTr表示二甲氧基三苯甲基。
10.如权利要求9所述的核酸链切割装置,其特征在于,所述核酸制备单元,使用5-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-1H-四唑作为活化剂通过亚磷酰胺法进行合成。
11.一种双链DNA的制造方法,所述方法用于制造具有黏端的双链DNA,其特征在于,包括:
用于制备切割对象双链DNA的双链DNA制备步骤,所述切割对象双链DNA由正义链和具有与所述正义链互补的序列的反义链构成,所述正义链以及反义链中的至少一者具有下式(1)所示的结构;和
黏端生成步骤,使得所述切割对象双链DNA与切割剂进行反应以在所述式(1)的X的部分将所述正义链和/或所述反义链切断,生成具有下式(2)所示的结构并且具有黏端的双链DNA,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒;NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端側的部分;NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。
12.如权利要求11所述的双链DNA的制造装置,其特征在于,所述切割对象双链DNA,具有多个所述式(1)所示的结构,且各个结构之间的核苷酸个数为10个以下。
13.一种双链DNA制造装置,用于制造具有黏端的双链DNA,其特征在于,具备:
用于制备切割对象双链DNA的双链DNA制备单元,所述切割对象双链DNA由正义链和具有与所述正义链互补的序列的反义链构成,所述正义链以及反义链中的至少一者具有下式(1)所示的结构;和
黏端生成单元,使得所述切割对象双链DNA与切割剂进行反应在所述式(1)的X的部分将所述正义链和/或所述反义链切断,生成具有下式(2)所示的结构并且具有黏端的双链DNA,其中
所述切割剂,是包含从银、水银以及镉所构成的群组中选择的原子的金属纳米粒子,
其中,B表示碱基,X表示硫或硒;NucA,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的5’端侧的部分;NucB,由至少1个核苷酸构成,是所述切割对象核酸的一部分,表示以所述X为基准的3’端侧的部分。
14.如权利要求13所述的双链DNA的制造方法,其特征在于,所述切割对象双链DNA具有多个所述式(1)所示的结构,各结构之间的核苷酸数为10个以下。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2021-158659 | 2021-09-29 | ||
JP2021158659 | 2021-09-29 | ||
PCT/JP2022/036009 WO2023054391A1 (ja) | 2021-09-29 | 2022-09-27 | 核酸鎖切断方法及び核酸鎖切断装置並びに二本鎖dnaの製造方法及び二本鎖dnaの製造装置 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN118043333A true CN118043333A (zh) | 2024-05-14 |
Family
ID=85782773
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202280065258.2A Pending CN118043333A (zh) | 2021-09-29 | 2022-09-27 | 核酸链切割方法和核酸链切割装置、以及双链dna的制造方法和双链dna的制造装置 |
Country Status (3)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPWO2023054391A1 (zh) |
CN (1) | CN118043333A (zh) |
WO (1) | WO2023054391A1 (zh) |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB2236852B (en) * | 1989-09-25 | 1994-04-06 | Scotgen Ltd | DNA probe based assays and intermediates useful in the synthesis of cleavable nucleic acids for use in such assays |
-
2022
- 2022-09-27 CN CN202280065258.2A patent/CN118043333A/zh active Pending
- 2022-09-27 JP JP2023551551A patent/JPWO2023054391A1/ja active Pending
- 2022-09-27 WO PCT/JP2022/036009 patent/WO2023054391A1/ja active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2023054391A1 (ja) | 2023-04-06 |
JPWO2023054391A1 (zh) | 2023-04-06 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2006317195B2 (en) | Polynucleotide containing a phosphate mimetic | |
KR101551985B1 (ko) | 모노뉴클레오시드 또는 모노뉴클레오티드로부터 유도되는 구조를 갖는 화합물, 핵산, 표지 물질, 핵산 검출 방법 및 키트 | |
US20100029008A1 (en) | Polymerase-independent analysis of the sequence of polynucleotides | |
BG61484B1 (bg) | 3'-(2')-амино-и тиолмодифицирани, свързани с флуоресциращо багрило нуклеозиди,нуклеотиди и олигонуклеотиди и метод за тяхното получаване и приложението им | |
US5714597A (en) | Use of carbocation scavenger during oligonucleotide synthesis | |
JP2003511386A (ja) | ヒドロキシル基を保護するための化合物及びその使用方法 | |
JPH07506345A (ja) | オリゴチオヌクレオチド | |
WO2010110775A1 (en) | Reagents for reversibly terminating primer extension | |
WO2007106907A2 (en) | Nucleic acid monomers with 2'-chemical moieties | |
CA2873370C (en) | Nucleic acid probe, method for designing nucleic acid probe, and method for detecting target sequence | |
US9499576B2 (en) | Compound, nucleic, acid, method for producing nucleic acid, and kit for producing nucleic acid | |
CN118043333A (zh) | 核酸链切割方法和核酸链切割装置、以及双链dna的制造方法和双链dna的制造装置 | |
EP2475674B1 (en) | Probes comprising fluorescent artificial nucleobases and use thereof for detection of single base alteration | |
CN114302965A (zh) | 引物和使用了该引物的双链dna的制造装置以及双链dna的制造方法 | |
JPH10503773A (ja) | 5’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチド | |
Milecki et al. | 5-Fluoro-4-thiouridine phosphoramidite: New synthon for introducing photoaffinity label into oligodeoxynucleotides | |
JP4665758B2 (ja) | チオヌクレオシド−s−ニトロシル誘導体 | |
JP2008125470A (ja) | ビピリジン修飾ヌクレオシド又はヌクレオチド、及びそれを用いたメチルシトシンの検出法 | |
Mori | Metal-Dependent Base Pair Switching of N, N-Dicarboxymethyl-5-Aminouracil Nucleosides | |
Moriguchi et al. | Novel method of the synthesis and hybridization properties of an oligonucleotide containing non-ionic diisopropylsilyl internucleotide linkage | |
Brennan et al. | Syntheses of 2′-C-amidoalkyl and 2′-C-cyanoalkyl containing oligodeoxyribonucleotides and assessment of their hybridisation affinity for complementary DNA and RNA | |
PL239946B1 (pl) | Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów | |
WO2007026823A1 (ja) | 人工核酸プローブを用いた三重鎖核酸形成を基盤とした標的核酸の検出 | |
Singh et al. | Supporting Information: Fast, Copper-Free Click Chemistry, A Convenient Solid-Phase Approach to Oligonucleotide Conjugation | |
Domingo | Investigations into the effect of nucleoside modifications on the physicochemical properties and biological function of DNA and RNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |