PL239946B1 - Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów - Google Patents

Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów Download PDF

Info

Publication number
PL239946B1
PL239946B1 PL413941A PL41394115A PL239946B1 PL 239946 B1 PL239946 B1 PL 239946B1 PL 413941 A PL413941 A PL 413941A PL 41394115 A PL41394115 A PL 41394115A PL 239946 B1 PL239946 B1 PL 239946B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
formula
nucleotide
synthesis
sequence
compound
Prior art date
Application number
PL413941A
Other languages
English (en)
Other versions
PL413941A1 (pl
Inventor
Przemysław JUREK
Przemysław Jurek
Filip JELEŃ
Filip Jeleń
Maciej MAZUREK
Maciej Mazurek
Piotr JAKIMOWICZ
Piotr Jakimowicz
Original Assignee
Pure Biologics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pure Biologics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia filed Critical Pure Biologics Spolka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia
Priority to PL413941A priority Critical patent/PL239946B1/pl
Priority to US15/760,915 priority patent/US10450673B2/en
Priority to DK16846944.3T priority patent/DK3350195T3/da
Priority to PCT/PL2016/050038 priority patent/WO2017048147A1/en
Priority to PL16846944T priority patent/PL3350195T3/pl
Priority to LTEPPCT/PL2016/050038T priority patent/LT3350195T/lt
Priority to SI201631318T priority patent/SI3350195T1/sl
Priority to ES16846944T priority patent/ES2885824T3/es
Priority to PT168469443T priority patent/PT3350195T/pt
Priority to EP16846944.3A priority patent/EP3350195B9/en
Priority to HUE16846944A priority patent/HUE055954T2/hu
Publication of PL413941A1 publication Critical patent/PL413941A1/pl
Publication of PL239946B1 publication Critical patent/PL239946B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/06—Libraries containing nucleotides or polynucleotides, or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów. Przedmioty wynalazku znajdują zastosowanie w selekcji in vitro aptamerów, wykorzystywanych jako cząsteczki terapeutyczne, jak i podstawowe składniki molekularnych narzędzi diagnostycznych.
Aptamery to oligonukleotydy - jednoniciowe fragmenty kwasu rybonukleinowego lub deoksyrybonukleinowego (RNA lub DNA), zwykle o długości od kilkunastu do kilkudziesięciu nukleotydów, których określona sekwencja pozwala im na przyjęcie struktury trójwymiarowej dopasowanej do molekularnej struktury liganda i wiązanie go z wysoką czułością i selektywnością. Aptamery znajdują bardzo liczne zastosowania w biotechnologii i medycynie, zarówno jako cząsteczki terapeutyczne jak i podstawowe składniki molekularnych narzędzi diagnostycznych. To sprawia, że aptamery często przyrównywane są do powszechnie używanych przeciwciał. Jednakże pula potencjalnych ligandów, na które już udało się wyselekcjonować działające aptamery, jest znacznie szersza niż głównie białkowi partnerzy przeciwciał. Wśród ligandów zawierają się bowiem również związki niskocząsteczkowe o praktycznie dowolnej strukturze, takie jak np. jony metali, alkaloidy, barwniki organiczne, aminokwasy, nukleozydy, nukleotydy, porfiryny czy cukry [1-3]. Kolejnymi zaletami aptamerów, które w wielu zastosowaniach stawiają je ponad przeciwciałami, są: ich niewielki rozmiar (najmniejszy wyselekcjonowany działający aptamer ma długość 15 nukleotydów [4], co odpowiada masie około 4600 g/mol); niska lub zerowa immunogenność; tania i wydajna synteza chemiczna, dzięki której również otrzymujemy stuprocentowo homogenny preparat; możliwość wprowadzenia wielorakich modyfikacji chemicznych; wysoka odporność na niefizjologiczne warunki i możliwość spontanicznej renaturacji, oraz stosunkowo szybki proces selekcji aptamerów na wybrany cel molekularny.
Aptamery otrzymywane są za pomocą procesu „ewolucji in vitro”, zwanego metodą SELEX (ang. Systematic Evolution of Ligand by EXponential enrichment). Opiera się on na repetytywnym wiązaniu puli (zazwyczaj 1012-1014 cząsteczek w pierwszej rundzie selekcji) cząsteczek oligonukleotydów o różnych sekwencjach (zwanych biblioteką) z wybranym celem molekularnym, a następnie fizycznym oddzieleniu cząsteczek, które związały cel, od pozostałych. Po rozdziale oligonukleotydy wiążące cel są enzymatycznie powielane i proces jest powtarzany, zazwyczaj w zaostrzających się warunkach tak, aby wyselekcjonować cząsteczki o pożądanych parametrach wiązania celu [5, 6]. W ten sposób uzyskane aptamery poddaje się sekwencjonowaniu - poznanie sekwencji nukleotydowej pozwala na chemiczną syntezę czystego aptameru przeznaczanego do dalszych zastosowań, lub też do dalszej optymalizacji, polegającej na przykład na wprowadzaniu modyfikacji lub skracaniu oligonukleotydów.
Biblioteki to zbiory jednoniciowych kwasów nukleinowych, zawierających w sekwencji region o losowej sekwencji nukleotydów. Podczas procesu SELEX z biblioteki zostają wyselekcjonowane sekwencje (klony), które mają zdolność wiązania wybranego celu molekularnego, na który przeprowadzana była selekcja. Każda cząsteczka kwasu nukleinowego w bibliotece posiada tę samą strukturę dwa regiony starterowe na końcach, pozwalające na amplifikację biblioteki w reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. Polymerase Chain Reaction, PCR), oraz region o losowej sekwencji w środku.
Zarówno DNA jak i RNA są podatne na trawienie przez enzymy nukleolityczne. Zastosowanie aptamerów in vivo lub nawet in vitro z preparatami zawierającymi nukleazy (np. lizaty komórkowe) jest więc utrudnione ze względu na degradację kwasów nukleinowych przez te enzymy. By zniwelować ten problem, zaproponowano wiele modyfikacji łańcucha cukrowo-fosforanowego aptamerów, wprowadzając na przykład podstawienie grupy hydroksylowej przy węglu 2' grupą aminową, lub zamianę jednego z atomów tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym na atom siarki (tioaptamery). Innymi sposobami zmniejszenia podatności kwasów nukleinowych na trawienie enzymatyczne może być przykładowo wprowadzenie „spiegelmerów”, czyli oligonukleotydów, w których część cukrowa zbudowana jest z izomeru L rybozy, nie zaś z naturalnie występującego izomeru D, lub użycie LNA (ang. locked nucleic acid) - analogu, w którym cząsteczki rybozy posiadają dodatkowe wiązanie, łączące węgiel 4' i tlen 2' (zamykając w ten sposób rybozę w konformacji 3'-endo-, co wpływa na właściwości hybrydyzacyjne oligonukleotydu).
Osobnym problemem jest ubogi repertuar monomerów (nukleotydów), z których tworzone są łańcuchy kwasów nukleinowych w naturze. W skład naturalnie występujących kwasów nukleinowych wchodzą jedynie cztery różne cząsteczki zasad azotowych: adeniny, guaniny, cytozyny i tyminy (lub uracylu w przypadku RNA), posiadające jedynie kilka grup chemicznych, mogących brać udział w potencjalnym wiązaniu celu molekularnego. Wygenerowało to potrzebę wzbogacania bibliotek oligonukleotydowych
PL 239 946 B1 używanych do procesu SELEX w nowe, nienaturalne nukleotydy i grupy chemiczne - analogi naturalnie występujących nukleotydów, które mogą pomóc w wyselekcjonowaniu aptamerów o lepszych parametrach wiązania celu. By sprostać temu wyzwaniu, wiele grup badawczych prowadziło prace nad enzymatyczną inkorporacją modyfikowanych nukleotydów do bibliotek i zastosowaniu ich do selekcji [7-9].
W obecnym stanie techniki, modyfikowane nukleotydy uzyskiwane są przy użyciu zaawansowanych metod syntezy organicznej, często długich i wieloetapowych procesów o niskiej wydajności, niemożliwych do przeprowadzenia w laboratorium bez specjalnego wyposażenia do syntezy organicznej [8-11]. Istnieje więc zapotrzebowanie na prostszą, wydajniejszą i szybszą metodę syntezy modyfikowanych nukleotydów, które będą mogły być inkorporowane do kwasów nukleinowych metodami enzymatycznymi, dzięki czemu możliwe będzie ich zastosowanie do selekcji nowych, modyfikowa nych aptamerów, o lepszych parametrach niż aptamery zawierające jedynie naturalnie występujące nukleotydy.
Katalizowana miedzią (I) reakcja cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgena (Copper-catalysed Azide-Alkyne Cycloaddition - CuAAC) pozwala na wysoce selektywną, wydajną (często powyżej 90%), szybką (czas koniugacji może wynosić nawet poniżej godziny), przeprowadzaną w łagodnych warunkach (temperatura pokojowa, ciśnienie normalne, duży wybór możliwych rozpuszczalników, w tym woda, pH w przybliżonym zakresie od 4 do 12), jednoetapową koniugację dwóch związków, z których jeden posiada wolną grupę azydkową (-N3), a drugi terminalne wiązanie alkinowe (-C^CH). Reakcja zachodzi w obecności jonów miedzi (I) (będącej katalizatorem), zaś powstające stabilne kowalenc yjne wiązanie triazolowe zachowuje zawsze tę samą regioizomerię [12, 13]. Z tych powodów reakcję tę klasyfikuje się jako przykład tzw. „Click Chemistry”, czyli prostej i wydajnej niczym „sprzączka” chemii koniugacyjnej o szerokim zastosowaniu [14, 15].
Autorzy patentu US 6,175,001 B1 (Barbas i Kandasamy, 2001) [10] opisują wytworzenie i użycie do syntezy DNA trójfosforanów nukleozydów, posiadających modyfikację w pozycji 5 pierścienia pirymidynowego deoksyuracylu - składa się ona z łącznika w formie alliloaminy (prop-2-en-1-aminy), oraz grupy funkcyjnej przyłączanej do łącznika poprzez wiązanie amidowe. Jako grupy funkcyjne wykorzystano m.in. kwas benzoesowy, imidazol, pirydynę, benzyloaminę, czy fenol. Szereg reakcji syntezy organicznej, w której ze związku wyjściowego 5-jododeoksyrudyny powstał prekursorowy dla innych modyfikacji trójfosforan 5-(3-aminopropen)-deoksyurydyny, osiągnął w tym przypadku wydajność 24%. Następnie, z tego prekursora autorzy uzyskali modyfikowane trójfosforany nukleozydów w reakcjach, których wydajność kształtowała się w zakresie 58-73%.
Z publikacji naukowej „Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection”, Vaught i współ., JACS 2010, 132, 4141-4151 [9], znane są struktury i sposób uzyskania modyfikowanych trójfosforanów nukleozydów. Autorzy użyli 5-jododeoksyurydyny w reakcji karboksyamidacji katalizowanej palladem, by uzyskać pochodne, których grupy funkcyjne (m.in. benzylowa, izobutanowa, metylonaftalenowa, imidazol-4-etanowa czy (1H-indol-3-ylo)etanowa), przyłączone są do węgla numer 5 pierścienia pirymidynowego wiązaniem amidowym. Sama reakcja koniugacji jest jednoetapowa, trwa jednak 48-72 godziny. Ponadto wymaga uprzedniego przygotowania substratu poprzez wprowadzenie grup ochronnych dla grup hydroksylowych w kilku reakcjach. Wydajność procesu została przedstawiona przez autorów jako średnia do dobrej - 30 do 60%. Następnie autorzy przeprowadzili testy, w których wykazali, że modyfikowane nukleotydy są inkorporowane do DNA w reakcji wydłużania startera (ang. Primer Extension Reaction, PER) przez DNA-zależne polimerazy DNA (KOD XL, Pfu (exo-), D. Vent (exo-), Tth, Taq, KF (exo-)), oraz że oligonukleotydy, zawierające w sekwencji modyfikowane nukleotydy, mogą również być użyte jako matryca w reakcji PER. Modyfikowane nukleotydy nie mogły być jednak z sukcesem wykorzystane w reakcji PCR.
Z kolei autor publikacji naukowej „Synthesis of Deoxynucleoside Triphosphates that Include Proline, Urea, or Sulfonamide Groups and Their Polymerase Incorporation into DNA”, Marcel Hollenstein, Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 [16], zaprezentował syntezę i inkorporację, do cząsteczek DNA, nukleotydów wzbogaconych o rozbudowane grupy funkcyjne (zawierające m.in. reszty proliny, ugrupowanie mocznikowe, ugrupowanie sulfamidowe) przyłączone do węgla numer 5 pierścienia pirymid ynowego za pomocą łącznika w formie alliloaminy (prop-2-en-1-aminy) i wiązania amidowego. Przygotowanie pośredniego prekursora z 5-jodourydyny przeprowadzone zostało z wydajnością 31%. Następnie prekursor ten został wykorzystany do syntezy pięciu różnych trójfosforanów nukleozydów - łańcuch syntez o najwyższej wydajności pozwolił uzyskać ok. 23% produktu z prekursora.
Prezentowane sposoby uzyskania modyfikowanych nukleotydów wymagają wielu reagentów, specjalistycznego wyposażenia do syntezy organicznej, cechują się też niewielką wydajnością oraz wieloetapowością, co wydłuża czas uzyskania finalnego, pożądanego związku.
PL 239 946 B1
Problemem technicznym stawianym przed niniejszym wynalazkiem jest zaproponowanie takiego sposobu syntezy zmodyfikowanych nukleotydów i/lub nukleozydów, który będzie pozwalał uzyskać zmodyfikowane nukleotydy i/lub nukleozydy, które będą mogły być inkorporowane do kwasów nukleinowych metodami enzymatycznymi, dzięki czemu możliwe będzie ich zastosowanie do selekcji nowych, modyfikowanych aptamerów, o lepszych parametrach niż aptamery zawierające jedynie naturalnie występujące nukleotydy, przy czym sposób ten nie będzie wymagał wykorzystania skomplikowanego i drogiego specjalistycznego sprzętu laboratoryjnego, będzie stanowił proces o wysokiej wydajności, nie wymagający uprzedniego przygotowania substratu, przy tym będzie relatywnie prosty i szybki, a uzyskany produkt będzie cechował się wysokim stopniem czystości. Nieoczekiwanie wspomniane problemy techniczne i cele rozwiązał prezentowany wynalazek.
Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, stanowiącego mono-, di- lub trójfosforan, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej Huisgena związku o wzorze ogólnym 1 ze związkiem o wzorze ogólnym 2 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 3 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 4 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 5, przy czym mieszanina reakcyjna zawiera bufor trietyloamina-kwas octowy, askorbinian sodu i DMSO, przy czym synteza związku opisanego wzorem 6 jest prowadzona w czasie 2 godzin i w temperaturze 40°C, ze związku opisanego wzorem 2, przy czym synteza związków o wzorami 7-9 jest prowadzona w czasie 1-6 godzin i w temperaturze 40°C-55°C z odpowiednich związków opisanych wzorami 3-5 i oczyszczanie produktu reakcji jest wykonywane techniką chromatografii na odwróconej fazie.
Drugim przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowany nukleotyd, stanowiący mono-, di- lub trójfosforan, zawierający jako zasadę azotową pochodną cytozyny lub uracylu, która w pozycji 5' pierścienia heterocyklicznego posiada grupę 1,2,3-triazolową lub łańcuch alkanowy lub alkinowy, posiadający terminalną grupę 1,2,3-triazolową, oraz podstawiony do tej grupy 1,2,3-triazolowej w pozycji 1' podstawnik, będący pochodną jednego z grupy związków o wzorach ogólnych od 2 do 5, i który to zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd posiada wzór ogólny 1.
Trzecim przedmiotem wynalazku jest cząsteczka DNA, zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch DNA, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji dowolnej lub obu nici jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku. Równie korzystnie cząsteczka według wynalazku charakteryzuje się tym, że pozycja jed nego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna. Korzystniej cząsteczka DNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
Czwartym przedmiotem wynalazku jest biblioteka oligonukleotydów posiadająca w sekwencji region z sekwencją dowolną o długości co najmniej 10 nukleotydów, oraz flankujące go dwa regiony o sekwencjach stałych o długości co najmniej 10 nukleotydów lub pozbawiona regionów flankujących, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w drugim przedmiocie wynalazku. Równie korzystnie biblioteka charakteryzuje się tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna. Najkorzystniej biblioteka według wynalazku charakteryzuje się tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
Piątym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie biblioteki oligonukleotydów, określonej w czwartym przedmiocie wynalazku do otrzymywania aptamerów techniką SELEX i pochodnymi. Przedstawiony sposób pozwolił ograniczyć liczbę etapów syntezy i oczyszczania celem uzyskania zmodyfikowanych nukleotydów i/lub nukleozydów, przy czym nie wymagał wykorzystania skomplikowanych urządzeń laboratoryjnych. Synteza i oczyszczanie cechują się wysoką wydajnością procesu, nie wymagają wcześniejszego przygotowania substratów i przebiegają w sposób szybki, a uzyskane produkty charakteryzują się wysokim stopniem czystości. Również enzymatyczna inkorporacja modyfikowanych nukleotydów do oligonukleotydów charakteryzuje się wysoką wydajnością, porównywalną z inkorporacją naturalnie występujących nukleotydów. Oligonukleotydy opisane w trzecim przedmiocie wynalazku, zawierające w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy, charakteryzują się również tym, że mogą stanowić matrycę dla reakcji PER lub PCR, w której z użyciem naturalnie występujących nukleotydów zostają zsyntetyzowane niemodyfikowane oligonukleotydy o sekwencjach komplementarnych do użytego lub użytych jako matryca oligonukleotydów modyfikowanych - warunek ten jest konieczny, by zastosować
PL 239 946 B1 modyfikowaną bibliotekę do selekcji aptamerów techniką SELEX i pochodnymi, jak opisano w piątym przedmiocie wynalazku.
Przykładowe realizacje wynalazku zaprezentowano w przykładach realizacji oraz na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia ogólny schemat katalizowanej miedzią reakcji cykloaddycji azydkowo-alkinowej Huisgena, fig. 2 przedstawia schematy reakcji według niniejszego wynalazku, fig. 3 przedstawia chromatogram nukleotydu o wzorze 6 uzyskany chromatografią odwróconych faz, fig. 4 przedstawia reprezentatywne widmo masowe nukleotydu o wzorze 6 uzyskane z analizy masowej MS-TOF, fig. 5 przedstawia obraz analizy elektroforetycznej produktu enzymatycznej syntezy oligonukleotydu zawierającego w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 9, natomiast fig. 6 przedstawia obraz analizy elektroforetycznej produktu enzymatycznej syntezy oligonukleotydu niemodyfikowanego, dla którego matrycą w reakcji syntezy był oligonukleotyd zawierający w sekwencji nukleotydy o wzorze 6.
P r z y k ł a d 1 - Synteza i oczyszczanie modyfikowanego nukleotydu o wzorze 6
Reakcję syntezy nukleotydu o wzorze 6 przygotowano w 200 μl. Do 4,0 μl roztworu 100 mM EdUTP (5-etynylo deoksyurydyno trójfosforan - wzór 1. a). c). e); 400 nmol) dodano 20 μl buforu 10x TEAA (trietyloamina-kwas octowy 500 mM pH 7,0) i 30 μl rozpuszczonego w DMSO kwasu (S)-2-azydo-3-metylobutanowy (wzór 2) o stężeniu 200 mM (6,0 μmol, 15 ekwiwalentów molowych EdUTP). Następnie dodano 10 μl przygotowanej wcześniej mieszaniny Cu-TBTA (10 mM CuSO4, 25 mM TBTA (trzy[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)metyl]amina), 50% DMSO, 16,6% tert-butanol), do końcowego stężenia miedzi w reakcji 0,5 mM (0,25 ekwiwalenta molowego EdUTP). Mieszaninę uzupełniono do 180 μl używając DMSO, wymieszano, a następnie dodano 20 μl askorbinianu sodu o stężeniu 200 mM (do końcowego stężenia 20 mM, 10 ekwiwalentów molowych EdUTP), inicjując reakcję poprzez redukcję miedzi do I stopnia utlenienia, i szczelnie zamknięto probówkę. Równolegle przygotowano próbę negatywną w objętości 20 μl, zachowując stężenia jak w próbie pozytywnej, zastąpiwszy askorbinian sodu wodą dejonizowaną. Reakcję prowadzono w zamkniętej probówce przez 2 godziny w 40°C z mocnym wytrząsaniem.
Następnie produkt oczyszczono używając chromatografii odwróconych faz, stosując bufor TEAA 100 mM oraz metanol jako fazę ruchomą (system chromatograficzny NGC firmy Bio-Rad, kolumna AccQ-Tag Column, 60 A, 4 μm, 3,9 mm x 150 mm firmy Waters). Chromatogram z analizy zarówno próby kontrolnej negatywnej jak i próby pozytywnej reprezentuje figura 3. Zebrane frakcje zawierające oczyszczony nukleotyd o wzorze 6 połączono, odparowano w koncentratorze próżniowym (CentriVap Benchtop Centrifugal Vacuum Concentrator firmy Labconco) i zawieszono w znanej objętości 25% DMSO. Następnie próbkę poddano analizie masowej MS-TOF (spektofotometr Xevo G2-XS QTof firmy Waters) w trybie ujemnej jonizacji elektrospray'u: masa zmierzona 634,04 Da, masa teoretyczna 634,30 Da. Reprezentatywne widmo masowe przedstawia figura 4.
P r z y k ł a d 2 - Synteza i oczyszczanie modyfikowanych nukleotydów o wzorach 7-9
Reakcje syntezy nukleotydów o wzorach 7-9 przeprowadzono analogicznie do syntezy związku o wzorze 6 (Przykład 1), używając azydków o wzorach 3-5 w miejscu związku o wzorze 2. Temperatura reakcji 40-55°C, czas reakcji 1-6 godzin.
Analiza masowa produktów o wzorach 7-9: nukleotyd o wzorze 7: masa zmierzona 634,04 Da, masa teoretyczna 634,30 Da; nukleotyd o wzorze 8: masa zmierzona 721,0 Da, masa teoretyczna 721,38 Da; nukleotyd o wzorze 9: masa zmierzona 658,50 Da, masa teoretyczna 658,75 Da.
P r z y k ł a d 3 - Enzymatyczna synteza jednoniciowego DNA z użyciem modyfikowanego nukleotydu
Enzymatyczną syntezę oligonukleotydu zawierającego w sekwencji modyfikowane nukleotydy o wzorze 9 przeprowadzono w objętości 10 μl z użyciem jednoniciowej matrycy D56 (Sekwencja 1) i startera LHAb (Sekwencja 2; dołączony do końca 5' startera łańcuch polyA pozwala na dyskryminację matrycy i produktu pod względem masy) w procesie PER. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą D56 w stężeniu 2 μM, LHAb w stężeniu 4 μM, polimerazę Pwo 0,5 U, jednokrotnie stężony bufor z magnezem dostarczony przez producenta polimerazy, wodę dejonizowaną, oraz trójfosforany nukleotydów: dATP, dCTP i DTP, do stężenia 200 μM każdy. Kontrola negatywna (próba N) nie zawierała innych nukleotydów, kontrola pozytywna (próba P) zawierała dodatkowo TTP w stężeniu 100 μM, a próba testowa (próba T) zawierała dodatkowo nukleotyd o wzorze 9 (przygotowany jak w Przykładzie 2) w dziesięciokrotnym rozcieńczeniu. Mieszaniny reakcyjne inkubowano przez minutę w temperaturze 95°C, dwie minuty w temperaturze 50°C i 30 minut w temperaturze 70°C. Po zakończonej reakcji próby poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym
PL 239 946 B1 (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green (Nippon Genetics) - figura 5.
Analogiczne eksperymenty wykonano dla nukleotydów o wzorach 6-8 potwierdzając ich poprawną inkorporację do DNA w reakcji PER. Potwierdzono również uzyskanie produktu z użyciem innej polimerazy - DeepVent(exo-), jak i z użyciem innych matryc niż oligonukleotyd D56.
Potwierdzono również możliwość syntezy DNA przez polimerazę Pwo na biotynylowanej matrycy zimmobilizowanej na magnetycznych mikrokulkach opłaszczonych streptawidyną, analogicznie do wcześniejszych doniesień [9].
P r z y k ł a d 4 - Enzymatyczna synteza jednoniciowej biblioteki DNA zawierającej w regionie losowym modyfikowane nukleotydy
Syntezę jednoniciowej biblioteki DNA przeprowadzono za pomocą reakcji PER analogicznie jak w Przykładzie 3, ze zmianami: jako matrycę zastosowano bibliotekę niemodyfikowaną (Sekwencja 3), jako starter zastosowano starter L4 (Sekwencja 4).
Jednoniciowa biblioteka zawierająca modyfikowany nukleotyd lub nukleotydy o wzorze 6, 7, 8 lub 9 została uzyskana poprzez rozdział nici dwuniciowego produktu z użyciem magnetycznych mikrokulek opłaszczonych streptawidyną, analogicznie do wcześniejszych doniesień [9], a jej czystość została oceniona poprzez elektroforezę (jak w Przykładzie 3).
Innym sposobem uzyskania jednoniciowej biblioteki zawierającej modyfikowany nukleotyd lub nukleotydy o wzorze 6, 7, 8 lub 9 był rozdział nici produktu dwuniciowego w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green, a następnie wycięto prążki odpowiadające nici zmodyfikowanej i przeprowadzono ich oczyszczanie zgodnie ze standardowymi protokołami.
P r z y k ł a d 5 - Enzymatyczna synteza niemodyfikowanego jednoniciowego DNA używając matrycy zawierającej w sekwencji modyfikowane nukleotydy
Używając jako matrycy oczyszczonego jednoniciowego oligonukleotydu komplementarnego do Sekwencji 1, zawierającego w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 6 (uzyskanego jak w Przykładzie 3 oraz oczyszczonego z żelu poliakrylamidowego zgodnie ze standardowymi protokołami), przeprowadzono enzymatyczną syntezę niemodyfikowanego jednoniciowego DNA (produkt reakcji to odtworzony oligonukleotyd D56 o sekwencji Sekwencja 1). Reakcję przeprowadzono w objętości 20 μl z użyciem wyżej opisanej matrycy i startera L4 (Sekwencja 4) w procesie PER. Przygotowano mieszaninę reakcyjną zawierającą matrycę w stężeniu 0,1-2,0 μM, L4 w stężeniu 2-5 μM, polimerazę DeepVent 1 U lub polimerazę Pwo 1 U, jednokrotnie stężony bufor dostarczony przez producenta (odpowiedni do użytej polimerazy), siarczan magnezu w stężeniu 2,0 mM, trójfosforany nukleozydów TTP, dATP, dCTP i dGTP w stężeniu 400 μM każdy, oraz wodę dejonizowaną. Kontrola negatywna (próba N) nie została poddana inkubacji (inkubowana w 4°C). Próbę testową 1 (próba T1) inkubowano przez minutę w temperaturze 95°C, minutę w temperaturze 50°C i 60 minut w temperaturze 70°C. Próbę testową 2 (próba T2) poddano 10 cyklom inkubacji: przez minutę w temperaturze 95°C, minutę w temperaturze 50°C i 20 minut w temperaturze 70°C.
Po zakończonej reakcji próby poddano elektroforezie w 10% żelu poliakrylamidowym (akrylamid 19:1 bis-akrylamid) denaturującym (7 M mocznik), podgrzanym do 55°C, przy stałym napięciu 300 V. Żel zwizualizowano używając barwnika Midori Green - figura 6.
Analogiczne eksperymenty wykonano dla matryc oligonukleotydowych zawierających w sekwencji zmodyfikowane nukleotydy o wzorze 7, 8 lub 9.
PL 239 946 B1
Bibliografia:
1. Famulok, M. Oligonucleotide aptamers that recognize small molecules. Curr. Opin.
Struct. Biol. 9, 324-329 (1999).
2. Mayer, G. The Chemical Biology of Aptamers. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 2672-2689 (2009).
3. Radom, F., Jurek, P. M., Mazurek, M. P., Otlewski, J. & Jeleń, F. Aptamers: Molecules of great potential. Biotechnol. Adv. (2013). doi:10.1016/j.biotechadv.2013.04.007
4. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H. & Toole, J. J. Selection of singlestranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature 355, 564-566 (1992).
5. Klug, S. J. & Famulok, M. All you wanted to know about SELEX. Mol. Biol. Rep. 20, 97107 (1994).
6. Gold, L. & Tuerk, C. Nucleic Acid Ligands. (1995).
7. Capek, P. et al. An efficient method for the construction of functionalized DNA bearing amino acid groups through cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by primer extension or PCR. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 13, 6196-6203 (2007).
8. Schoetzau, T. et al. Aminomodified Nucleobases: Functionalized Nucleoside Triphosphates Applicable for SELEX. Bioconjug. Chem. 14, 919-926 (2003).
9. Vaught, J. D. et al. Expanding the chemistry of DNA for in vitro selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
10. Barbas, C. F. & Kandasamy, S. Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same. (2001).
11. Gourlain, T. et al. Enhancing the catalytic repertoire of nucleic acids. II. Simultaneous incorporation of amino and imidazolyl functionalities by two modified triphosphates during PCR. Nucleic Acids Res. 29, 1898-1905 (2001).
12. Himo, F. et al. Copper(I)-Catalyzed Synthesis of Azoles. DFT Study Predicts Unprecedented Reactivity and Intermediates. J. Am. Chem. Soc. 127, 210-216 (2005).
13. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V. & Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective 'ligation' of azides and terminal alkynes. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
14. Kolb, H. C. & Sharpless, K. B. The growing impact of click chemistry on drug discovery. Drug Discov. Today 8, 1128-1137 (2003).
15. Kolb, H. C., Finn, M. G. & Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).
16. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfonamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Weinh. Bergstr. Ger. 18, 13320-13330 (2012).
PL 239 946 Β1
Sekwencja 1 - D56
Wykaz sekwencji
Sekwencja 2 'Starter LHAb
Sekwencja 4 - starter L4
5’—G TATACCTGCAGCTGAG G—31

Claims (9)

1. Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, stanowiącego mono-, di- lub trójfosforan, znamienny tym, że przeprowadza się reakcję katalizowanej miedzią cykloaddycji alkinowo-azydkowej Huisgena związku o wzorze ogólnym 1:
Wzór 1 gdzie:
PL 239 946 Β1
ze związkiem o wzorze ogólnym 2:
Wzór 2 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 3:
Wzór 3 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 4:
Wzór 4 lub ze związkiem o wzorze ogólnym 5:
Wzór 5 ci przy czym mieszanina reakcyjna zawiera bufor trietyloamina - kwas octowy, askorbinian sodu i DMSO, przy czym synteza związku opisanego wzorem 6 jest prowadzona w czasie 2 godzin i w temperaturze 40°C,
PL 239 946 Β1
Wzór 6 ze związku opisanego wzorem 2, przy czym synteza związkowo wzorami 7-9 jest prowadzona w czasie 1-6 godzin i w temperaturze 40°C-55°C:
Wzór 7 lub
Wzór 8 lub
PL 239 946 Β1
Wzór 9 z odpowiednich związków opisanych wzorami 3-5, i oczyszczanie produktu reakcji jest wykonywane chromatografii na odwróconej fazie.
2. Zmodyfikowany nukleotyd, stanowiący mono-, trójfosforan, zawierający jako zasadę azotową cytozyny lub uracylu, która w pozycji 5' pierścienia heterocyklicznego posiada grupę 1,2,3-triazolową lub łańcuch alkanowy lub alkinowy, posiadający terminalną grupę 1,2,3-triazolową, oraz podstawiony do tej grupy 1,2,3-triazolowej w pozycji 1' podstawnik, będący pochodną jednego z grupy związków o wzorach ogólnych od 2 do 5, i który to zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd posiada wzór ogólny 1:
Wzór 1 gdzie:
PL 239 946 Β1
R1 = rs= 1-3
3. Cząsteczka DNA, zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch DNA, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji dowolnej lub obu nici jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w zastrz. 2.
4. Cząsteczka DNA według zastrz. 3, znamienna tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna.
5. Cząsteczka DNA według zastrz. 3 albo 4, znamienna tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
6. Biblioteka oligonukleotydów posiadająca w sekwencji region z sekwencją dowolną o długości co najmniej 10 nukleotydów, oraz flankujące go dwa regiony o sekwencjach stałych o długości co najmniej 10 nukleotydów lub pozbawiona regionów flankujących, znamienna tym, że zawiera w jednej lub większej liczbie pozycji sekwencji jeden lub większą liczbę zmodyfikowanych nukleotydów, jak określono w zastrz. 2.
7. Biblioteka według zastrz. 6, znamienna tym, że pozycja jednego lub większej liczby zmodyfikowanych nukleotydów w sekwencji jest dowolna.
8. Biblioteka według zastrz. 6 albo 7, znamienna tym, że została uzyskana za pomocą enzymatycznej reakcji PCR, PER lub za pomocą chemicznej syntezy oligonukleotydów.
9. Zastosowanie biblioteki oligonukleotydów, określonej w zastrz. 7 albo 8, do otrzymywania aptamerów techniką SELEX i pochodnymi.
PL413941A 2015-09-17 2015-09-17 Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów PL239946B1 (pl)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL413941A PL239946B1 (pl) 2015-09-17 2015-09-17 Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów
US15/760,915 US10450673B2 (en) 2015-09-17 2016-09-13 Method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a DNA molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library
DK16846944.3T DK3350195T3 (da) 2015-09-17 2016-09-13 Fremgangsmåde til syntese og oprensning af nukleosid og/eller nukleotid, modificeret nukleosid og/eller nukleotid, dna-molekyle og oligonukleotidbibliotek omfattende det modificerede nukleosid og/eller nukleotid og anvendelse af oligonukleotidet
PCT/PL2016/050038 WO2017048147A1 (en) 2015-09-17 2016-09-13 The method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a dna molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library
PL16846944T PL3350195T3 (pl) 2015-09-17 2016-09-13 Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów
LTEPPCT/PL2016/050038T LT3350195T (lt) 2015-09-17 2016-09-13 Nukleozido ir/arba nukleotido sintezės ir gryninimo būdas, modifikuotas nukleozidas ir/arba nukleotidas, dnr molekulė ir oligonukleotidu biblioteka, apimanti šį modifikuotą nukleozidą ir/arba nukleotidą, ir šios oligonukleotidu bibliotekos panaudojimas
SI201631318T SI3350195T1 (sl) 2015-09-17 2016-09-13 Postopek sinteze in čiščenja nukleozida in/ali nukleotida, modificiranega nukleozida in/ali nukleotida, molekule DNA in knjižnice oligonukleotidov, ki vsebije navedeni modificirani nukleozid in/ali nukleotid, ter uporaba navedene knjižnice oligonukleotidov
ES16846944T ES2885824T3 (es) 2015-09-17 2016-09-13 Procedimiento de síntesis y purificación de un nucleósido y/o un nucleótido, un nucleósido y/o nucleótido modificados, una molécula de ADN y una biblioteca de oligonucleótidos que comprende dicho nucleósido y/o nucleótido modificados y la utilización de dicha biblioteca de oligonucleótidos
PT168469443T PT3350195T (pt) 2015-09-17 2016-09-13 Método de síntese e purificação de um nucleósido e/ou um nucleótido, um nucleósido e/ou nucleótido modificado, uma molécula de adn e uma biblioteca de oligonucleótidos compreendendo o referido nucleósido e/ou nucleótido modificado e a utilização da referida biblioteca de oligonucleótidos
EP16846944.3A EP3350195B9 (en) 2015-09-17 2016-09-13 The method of synthesis and purification of a nucleoside and/or a nucleotide, a modified nucleoside and/or nucleotide, a dna molecule and an oligonucleotide library comprising said modified nucleoside and/or nucleotide and the use of said oligonucleotide library
HUE16846944A HUE055954T2 (hu) 2015-09-17 2016-09-13 Eljárás nukleozid és/vagy nukleotid szintézisére és tisztítására, módosított nukleozid és/vagy nukleotid, DNS-molekula és oligonukleotidkönyvtár a módosított nukleoziddal és/vagy nukleotiddal, és az oligonukleotidkönyvtár alkalmazása

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL413941A PL239946B1 (pl) 2015-09-17 2015-09-17 Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL413941A1 PL413941A1 (pl) 2017-03-27
PL239946B1 true PL239946B1 (pl) 2022-01-31

Family

ID=58289513

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL413941A PL239946B1 (pl) 2015-09-17 2015-09-17 Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów
PL16846944T PL3350195T3 (pl) 2015-09-17 2016-09-13 Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL16846944T PL3350195T3 (pl) 2015-09-17 2016-09-13 Sposób syntezy i oczyszczania nukleozydu i/lub nukleotydu, zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleozyd i/lub nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów

Country Status (10)

Country Link
US (1) US10450673B2 (pl)
EP (1) EP3350195B9 (pl)
DK (1) DK3350195T3 (pl)
ES (1) ES2885824T3 (pl)
HU (1) HUE055954T2 (pl)
LT (1) LT3350195T (pl)
PL (2) PL239946B1 (pl)
PT (1) PT3350195T (pl)
SI (1) SI3350195T1 (pl)
WO (1) WO2017048147A1 (pl)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL442186A1 (pl) * 2022-09-02 2024-03-04 Pure Biologics Spółka Akcyjna Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu i/lub nukleozydu, zmodyfikowany nukleotyd i/lub nukleozyd, cząsteczka DNA zawierająca jedno- lub dwuniciowy łańcuch oligonukleotydów, biblioteka oligonukleotydów, zastosowanie biblioteki oligonukleotydów

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6175001B1 (en) 1998-10-16 2001-01-16 The Scripps Research Institute Functionalized pyrimidine nucleosides and nucleotides and DNA's incorporating same
US9096856B2 (en) 2007-07-19 2015-08-04 Georgia State University Research Foundation, Inc. Nucleotides and aptamers containing boronic acid groups having biased binding to glycosylated proteins, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP3350195A1 (en) 2018-07-25
DK3350195T3 (da) 2021-08-30
HUE055954T2 (hu) 2022-01-28
US10450673B2 (en) 2019-10-22
EP3350195B9 (en) 2021-09-29
PL413941A1 (pl) 2017-03-27
LT3350195T (lt) 2021-09-10
EP3350195B1 (en) 2021-06-02
PL3350195T3 (pl) 2021-10-11
ES2885824T3 (es) 2021-12-15
WO2017048147A1 (en) 2017-03-23
SI3350195T1 (sl) 2021-11-30
US20180265862A1 (en) 2018-09-20
PT3350195T (pt) 2021-09-06
EP3350195A4 (en) 2019-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020256391B2 (en) A method for the site-specific enzymatic labelling of nucleic acids in vitro by incorporation of unnatural nucleotides
Ménová et al. Scope and limitations of the nicking enzyme amplification reaction for the synthesis of base-modified oligonucleotides and primers for PCR
Hirao et al. An efficient unnatural base pair for PCR amplification
JP2002527523A (ja) 機能付与したピリミジン誘導体
KR20140059256A (ko) Dna-코딩된 라이브러리에 태그부착하는 방법
US20040018530A1 (en) In vitro evolution of functional RNA and DNA using electrophoretic selection
JP2022504712A (ja) 酵素によるｒｎａ合成
Bugaut et al. SELEX and dynamic combinatorial chemistry interplay for the selection of conjugated RNA aptamers
Petkovic et al. Synthesis and engineering of circular RNAs
PL239946B1 (pl) Sposób syntezy i oczyszczania nukleotydu, zmodyfikowany nukleotyd, cząsteczka DNA i biblioteka oligonukleotydów zawierające zmodyfikowany nukleotyd oraz zastosowanie biblioteki oligonukleotydów
RU2699522C2 (ru) Способ ферментативного получения модифицированных ДНК для создания реагентов, специфично связывающихся с гидрофобными участками высокомолекулярных органических соединений
Schwarz et al. A four-helix bundle DNA nanostructure with binding pockets for pyrimidine nucleotides
Eremeeva et al. Enzymatic synthesis using polymerases of modified nucleic acids and genes
Flamme et al. Enzymatic formation of an artificial base pair using a modified adenine nucleoside triphosphate
Potowski et al. Investigations Into Chemically Stabilized Four-Letter DNA for DNA-Encoded Chemistry
Wiesmayr et al. An on-bead tailing/ligation approach for sequencing resin-bound RNA libraries
JP7016511B2 (ja) 核酸合成法
EP3546471B1 (en) Nucleoside derivative or salt thereof, polynucleotide synthesis reagent, method for producing a polynucleotide, polynucleotide and method for producing a binding nucleic acid molecule
Balke et al. Synthesis of Site-Specifically Modified Long-mer RNAs
Figazzolo Synthesis and biochemical characterization of novel moieties to be incorporated in aptamers
WO2018051581A1 (ja) ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
WO2018051580A1 (ja) ヌクレオシド誘導体またはその塩、ポリヌクレオチドの合成試薬、ポリヌクレオチドの製造方法、ポリヌクレオチド、および結合核酸分子の製造方法
Blain et al. Chapter Five: Site-specific ‘click’chemistry with RNA transcripts
WO2011034895A1 (en) Compositions, methods and uses for nucleotide analogues
US20070172842A1 (en) Methods for isolating and identifying novel target-specific structuremers for use in the biological sciences