JP2022504712A - 酵素によるｒｎａ合成 - Google Patents

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Abstract

Figure 2022504712000001
本明細書において提供されるのは、酵素触媒を用いる制御されたＲＮＡオリゴヌクレオチドのデノボ合成のための方法である。例えば、本明細書において提供されるのは、酵素触媒を介して、制御された、鋳型に依存しない、イニシエーターオリゴヌクレオチド３’末端へのヌクレオチドの付加を介して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製するための方法である（また、ターミナルトランスフェラーゼ活性とも称される）。単一のヌクレオチドを、適合性のポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼなどのポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）により、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、反復的に付加することができる。また提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用なヌクレオチドおよびポリメラーゼである。

Description

関連出願
本願は、２０１８年１０月１２日に出願された米国仮出願ｕ．ｓ．ｓ．ｎ．６２／７４５，１３６に対する３５ｕ．ｓ．ｃ．§１１９（ｅ）下における優先権を主張し、当該仮出願の全内容は、本明細書において参考として援用される。
政府の支援
本発明は、米国エネルギー省により授与された助成金番号ｄｅ－ｆｇ０２－０２ｅｒ６３４４５下において政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
合成オリゴヌクレオチドは、学術および産業の両方のセッティングにおける生物工学研究の多くの側面にとって重要である。より長い、より安価な、およびエラーフリーのオリゴヌクレオチドに対する高い要求にもかかわらず、現在の産業のリーダーは、数十年前に開発された古典的な化学合成方法の多くの限定要因には取り組んでいない。このことは、デノボＲＮＡオリゴヌクレオチド合成について、特に真実である。デノボＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は、ゲノム工学技術、ＲＮＡベースの診断および治療剤、ＲＮＡベースのシークエンシング技術、高密度核酸ベースの情報の保存、ならびに生物学的計算を促進することにおいて大量に投資されたものに対しては、ほぼアクセス不可能なままである（Kaczmarek、KowalskiおよびAnderson、2017年）。ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化学合成のために使用される方法に対していくらかの改善はあったが、全体的な化学は、１９７０年代からほぼ変化していない（HughesおよびEllington、2017年）。化学合成は、過酷な化学試薬および生物学的に非適合性の有機溶媒の両方を必要とする多くの複雑な反応ステップにより悩まされている。これらの反応条件は、ヌクレオチド塩基の脱プリン、配列全体からの予期せぬ挿入または欠失、および望ましくない短縮された生成物をもたらすオリゴヌクレオチドの先行的な（preemptive）不可逆性のキャッピングをもたらす。この全体的な合成のエラー率の多大な増大は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの最大の長さを１２０ヌクレオチド未満に限定し、認識可能な収量の所望される生成物を得るために、より長いリード時間を必要とする。さらに、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの化学合成は、１塩基あたり＄０．１におけるＤＮＡオリゴヌクレオチド合成の現在の価格と比較して、極めて高価であり（Carlson、2018年）、ＲＮＡ合成は、長い、または複雑なＲＮＡオリゴヌクレオチドでなくとも、ほぼ１００倍高い。したがって、現在のＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の限定要因に取り組むことは重要である。
発明の要旨
本明細書において提供されるのは、酵素触媒を用いる制御されたＲＮＡオリゴヌクレオチドのデノボ合成のための、化合物、酵素、組成物、系、キットおよび方法である。例えば、本明細書において提供されるのは、制御された、鋳型に依存しない、酵素触媒（別名、ターミナルトランスフェラーゼ活性）を介した、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端へのヌクレオチドの付加を介して、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製するための方法である。単一のヌクレオチドを、適合性のポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼなどのポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）により、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が合成されるまで、反復的に付加することができる。
本開示は、特定のポリメラーゼ酵素は、鋳型に依存しない、多様な修飾および未修飾ヌクレオチドとのターミナルトランスフェラーゼ反応を、効果的に触媒することができるという発見に基づく。一側面において、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、ここで、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上のヌクレオチドを、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端上に組み込む。中でもポリ（Ｕ）およびポリ（Ａ）ポリメラーゼなどの特定のポリメラーゼが、修飾ヌクレオチドを含む多様なヌクレオチドとのターミナルトランスフェラーゼ反応を触媒することができることを見出した。ポリ（Ｎ）ポリメラーゼがターミナルトランスフェラーゼを介して１つ以上のヌクレオチドを組み込んだ後で、プロセスは、任意に異なるヌクレオチドを用いて、１つ以上の反復ステップにおいて、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られるまで繰り返すことができる。また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用であるポリ（Ｎ）ポリメラーゼ酵素（例えば、変異体ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）である。
一側面において、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製するための方法であって、該方法は、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）、および１つ以上の修飾ヌクレオチドを組み合わせ、それによりＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成することを含む。方法は、反復ステップにおいて、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られるまで、１つ以上のさらなるヌクレオチド（修飾または未修飾）を、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドに付加することを、さらに含んでもよい。また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用である化合物（例えば、修飾ヌクレオチド）である。
制御されたデノボＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のための他の方法が、本明細書において提供される。例えば、別の側面において、本明細書において提供されるのは、伸長されたイニシエーターオリゴヌクレオチドに対するポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）などのポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）の結合アフィニティーを可逆的に変化させる修飾ヌクレオチド（すなわち「可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチド」、例えば、２’－または３’－Ｏ－保護されたヌクレオチド）を組み込む方法である。この結合アフィニティーにおける変化は、さらなるヌクレオチド付加の停止をもたらし、（ｎ＋１）オリゴヌクレオチド生成物を生成し、これは、温和な脱保護化学を介して、修飾された基がその天然の状態（例えば、２’－または３’－ＯＨ基）に回復された後で、さらに伸長させることができる。「（ｎ＋１）オリゴヌクレオチド」は、単一のヌクレオチドがイニシエーター配列に付加された生成物である。これらの方法は、図２において示される一般的スキームにおいて例示される。ある態様において、修飾オリゴヌクレオチドは、２’－または３’－修飾された可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチドである。ある態様において、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）、および可逆性ターミネーターヌクレオチド（例えば、２’－または３’－修飾された可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチド）を組み合わせること；その後、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドを、可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された位置において、脱保護するステップを含む。脱保護された後で、結果として生じる（ｎ＋１）伸長されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られるまで、その後の１つ以上の修飾または未修飾ヌクレオチドを含むターミナルトランスフェラーゼ反応を受けることができる。また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用である、２’－または３’－修飾された可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチド（例えば、２’－または３’－Ｏ－保護されたヌクレオチド）である。
別の側面において、本明細書において提供されるのは、非加水分解性ヌクレオチドを使用するＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のための方法である。これらの方法において、ポリメラーゼが、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端においてヌクレオチドを組み込む速度は、酵素の活性部位について競合する非加水分解性ヌクレオチドを導入することにより制御される。これらの方法は、図１において示される一般的スキームにおいて例示される。オリゴヌクレオチド合成の速度は、加水分解性ヌクレオチドと非加水分解性ヌクレオチドとの比により、競合的阻害を通して、直接的に影響を受ける。これらのヌクレオチドの比に加えて、制御された合成のために反応速度を調節するために、他の反応パラメーターを細かく調整することができる。ある態様において、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成する方法であって、該方法は、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの加水分解性ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の非加水分解性ヌクレオチドを組み合わせること、ここで、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼによる１つ以上のヌクレオチドの付加の速度を阻害するために十分である；それによりＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成すること、を含む。方法は、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られるまで、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドに、１つ以上のさらなるヌクレオチド（修飾または未修飾）を付加することをさらに含んでもよい。また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用である、非加水分解性ヌクレオチドである。
加えて、本明細書において提供されるのは、２つのオリゴヌクレオチドをライゲーションして、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じる方法である。ある態様において、方法は、第１のオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、５’－三リン酸基を含む；第２のオリゴヌクレオチドを提供すること；ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；第２のオリゴヌクレオチドの３’末端への第１のオリゴヌクレオチドのライゲーションのために十分な条件下において、第１および第２のオリゴヌクレオチドならびにポリ（Ｕ）ポリメラーゼを組み合わせること、を含む。この態様は、３’－位においてオリゴヌクレオチドを有する５’－三リン酸ヌクレオチドが、本明細書において記載されるポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、野生型および変異したポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）のための実行可能な基質であるという発見により、可能である。
加えて、これらの方法により生成されるＲＮＡオリゴヌクレオチドは、逆転写（ＲＴ）を受けて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介してＤＮＡポリメラーゼにより増幅される相補的ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を生じ得る。
また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される任意の方法により生成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
本明細書において記載される方法は、酵素触媒を含む。酵素触媒は、生物学的に適合性の反応条件下において起こるので、化学合成により現在のところ経験されているＲＮＡ分子の望ましくない分解を、除外することができる。本発明の方法は、しばしば過酷な反応条件下においてホスホラミダイト化学により行われるデノボＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の現在の状態に対して、改善を行う。化学的なＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の過酷な反応条件は、例えば＞１００ヌクレオチド長の長いＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することを困難かつ高価にする。認識可能な収量の長いＲＮＡオリゴヌクレオチドを化学合成を介して生成する場合、オリゴヌクレオチドのエラー率が非常に高くなることがあり得る。本明細書において記載される酵素によるアプローチを用いることにより、長いＲＮＡオリゴヌクレオチド合成に関連する現在の問題の多くが解決される。本明細書において記載される方法の適用は、ＲＮＡの直接合成、ならびに核酸ナノテクノロジーのための材料作製、ゲノム工学技術、ならびに新規のＲＮＡおよびＤＮＡ治療剤を含む。本明細書において記載される方法は、微少流体の形式において小型化されるか、または微小滴プリンティングなどの高度に並列化した様式において行われる能力を有する。本明細書において提供される方法はまた、固相において行うこともできる。
また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載されるポリ（Ｎ）ポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドを含む、組成物およびキットである。
本発明のある態様の詳細を、以下に記載されるとおり、ある態様の詳細な説明において記載する。本発明の他の特徴、目的および利点は、定義、例、図面および請求の範囲から明らかであろう。
定義
一般的定義
本明細書において用いられる場合、用語「ポリメラーゼ」とは、一般に、ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを合成することができる酵素を指す。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、鋳型に依存しない様式において、オリゴヌクレオチドを合成することができる。他の態様において、ポリメラーゼは、鋳型依存的な様式において、オリゴヌクレオチドを合成することができる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、逆転写酵素である。ポリメラーゼは、任意のソース、例えば、組み換えポリメラーゼ、細菌のポリメラーゼに由来していてもよい。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）、またはポリ（Ｇ）ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、ヌクレオチド、例えばヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド、例えばイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することができる。いくつかの態様において、ポリメラーゼは、単一のヌクレオチド種、例えばポリ（Ｕ）ポリメラーゼの場合においてはウラシル塩基を含むヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド、例えばイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に、選択的に付加する。
本明細書において用いられる場合、用語「ＲＮＡオリゴヌクレオチド」とは、一般に、ヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこれらのアナログのポリマーを指す。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の配列を有していてよい。本明細書において用いられる場合、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてよく、任意の機能を行ってよく、これらは、当業者に公知であっても、または知られていなくてもよい。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在するものであっても、合成であってもよい。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、組み換えオリゴヌクレオチド、分枝状オリゴヌクレオチド、任意の配列の、単離された、または合成のＲＮＡオリゴヌクレオチド、プローブ、および／またはプライマーであってよい。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在する塩基、例えばアデニンまたはウラシルを含むヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在しないかまたは修飾されたヌクレオチド、例えば糖修飾、塩基修飾、例えば、プリンまたはピリミジン修飾を含むヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在する、天然に存在しない、および修飾されたヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された骨格または架橋、例えば、ホスホロチオエート骨格または架橋を含んでもよい。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。他の態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、二本鎖である。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、鋳型に依存しない合成を介して合成される。いくつかの態様において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ヌクレオチド長である。
本明細書において用いられる場合、用語「ＤＮＡオリゴヌクレオチド」とは、一般に、ＤＮＡヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログのポリマーを指す。本明細書において用いられる場合、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、任意の三次元構造を有していてよく、任意の機能を行ってよく、これらは、当業者に公知であっても、または知られていなくてもよい。ＤＮＡオリゴヌクレオチド天然に存在するものであっても、合成であってもよい。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、エクソン、イントロン、ｃＤＮＡ配列、組み換えオリゴヌクレオチド、分枝状オリゴヌクレオチド、プラスミド、ベクター、および／または任意の配列の単離されたＤＮＡであってよい。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在する塩基、例えばアデニン、シトシン、グアニンまたはチミンを含むＤＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在しないか、または修飾されたＤＮＡヌクレオチド、例えば、糖修飾、プリンまたはピリミジン修飾を含むＤＮＡヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、天然に存在する、天然に存在しない、および修飾されたＤＮＡヌクレオチドの組み合わせを含む。いくつかの態様において、ＤＮＡヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾された骨格または架橋、例えば、ホスホロチオエート骨格または架橋を含んでもよい。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。他の態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、二本鎖である。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、逆転写を介して合成される。いくつかの態様において、ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００ＤＮＡ、少なくとも３００、少なくとも４００、または少なくとも５００ＤＮＡヌクレオチド長である。
本明細書において用いられる場合、用語「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」とは、一般に、リボース糖、リン酸基およびヌクレオベースを含む、ヌクレオチドモノマーを指す。ヌクレオチドは、天然に存在するものであっても、天然に存在しないものであっても、修飾されたものであってもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、ヌクレオベースまたは塩基、例えば、プリンまたはピリミジン塩基を含む。いくつかの態様において、塩基は、天然に存在する塩基、例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシルまたはイノシンである。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、天然に存在しないヌクレオベースを含んでもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、修飾されたヌクレオベースを含んでもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、例えば２’位におけるリボース糖の修飾、例えば、２’－Ｆ、２’－Ｏ－アルキル、２’－アミノ、または２’－アジドを含んでもよい。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、非加水分解性ヌクレオチドであり、例えば、修飾された三リン酸基を含んでもよい。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチド、例えば、２’－または３’－ＯＨ保護されたヌクレオチドである。
本明細書において用いられる場合、用語「イニシエーターオリゴヌクレオチド」は、一般に、鋳型に依存しない合成を開始させることができる、短い一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドを指す。イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ある態様において、２０ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０未満、１８未満、１５未満、１２未満、１０未満、８未満、また５ヌクレオチド未満の長さである。いくつかの態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’末端において標識され、例えばフルオロフォアで標識される。いくつかの態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、その５’末端において、基質に付着している。いくつかの態様において、基質は、ガラス表面、ビーズ、生体分子、または鋳型に依存しない合成のために好適な任意の考え得る基質であってよい。
本明細書において用いられる場合、用語「鋳型に依存しない」とは、一般に、鋳型ＤＮＡオリゴヌクレオチドを必要としないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成を指す。鋳型に依存しない合成は、一般に、イニシエーターオリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ、例えばポリ（Ｎ）ポリメラーゼの使用を含むであろう。鋳型に依存しない合成を用いて合成されるオリゴヌクレオチド、例えばＲＮＡオリゴヌクレオチドは、一般に、ヌクレオチド、例えばヌクレオチドを、既存のオリゴヌクレオチド、例えばイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することにより合成される。
化学的定義
特定の官能基および化学用語の定義を、以下により詳細に記載する。化学元素は、元素周期表、ＣＡＳバージョン、Handbook of Chemistry and Physics、第７５版、表紙裏に従って同定され、特定の官能基は、一般に、本明細書において記載されるとおりに定義される。加えて、有機化学の一般的原理、ならびに特定の官能性部分および反応性は、以下において記載される：Organic Chemistry、Thomas Sorrell、University Science Books、Sausalito（1999年）；SmithおよびMarch、March’s Advanced Organic Chemistry、第５版、John Wiley & Sons, Inc., New York（2001年）；Larock、Comprehensive Organic Transformations、VCH Publishers, Inc., New York（1989年）；およびCarruthers、Some Modern Methods of Organic Synthesis、第３版、Cambridge University Press, Cambridge（1987年）。
本明細書において記載される化合物は、１つ以上の不斉中心を含んでもよく、したがって、多様な立体異性体の形態、例えばエナンチオマーおよび／またはジアステレオマーにおいて存在し得る。例えば、本明細書において記載される化合物は、個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、もしくは幾何異性体の形態におけるものであってよく、または、立体異性体の混合物（１つ以上の立体異性体が濃縮されたラセミ混合物を含む）の形態におけるものであってよい。異性体は、キラル高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ならびにキラル塩の形成および結晶化を含む当業者に公知の方法により混合物から単離することができる；または、好ましい異性体を、不斉合成により調製することができる。例えば、以下を参照：Jacquesら、Enantiomers, Racemates and Resolutions（Wiley Interscience, New York, 1981）；Wilenら、Tetrahedron 33:2725（1977）；Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds（McGraw-Hill, NY, 1962）；およびWilen, S.H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268（E.L. Eliel編、Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972）。本発明は、加えて、他の異性体を実質的に含まない個々の異性体としての、およびあるいは、多様な異性体の混合物としての化合物を包含する。
別段に記述されない限り、本明細書において列挙される構造はまた、１つ以上の同位体が濃縮された原子の存在においてのみ異なる化合物を含むことを意図される。例えば、ジュウテリウムまたはトリチウムによる水素の置き換え、１８Ｆによる１９Ｆの置き換え、１３Ｃまたは１４Ｃによる１２Ｃの置き換えを除いて、本発明の構造を有する化合物は、本開示の範囲内である。かかる化合物は、例えば生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
範囲が列記される場合、当該範囲内の各々の値および部分範囲を包含することが意図される。例えば「Ｃ１－６アルキル」は、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ１－６、Ｃ１－５、Ｃ１－４、Ｃ１－３、Ｃ１－２、Ｃ２－６、Ｃ２－５、Ｃ２－４、Ｃ２－３、Ｃ３－６、Ｃ３－５、Ｃ３－４、Ｃ４－６、Ｃ４－５、およびＣ５－６アルキルを包含することが意図される。
用語「アルキル」とは、直鎖状または分枝状の飽和炭化水素基のラジカルであって、１～１０個の炭素原子を有するものを指す（「Ｃ１－１０アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～９個の炭素原子を有する（「Ｃ１－９アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～８個の炭素原子を有する子（「Ｃ１－８アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～７個の炭素原子を有する（「Ｃ１－７アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ１－６アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～５個の炭素原子を有する（「Ｃ１－５アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ１－４アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１－３アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ１－２アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、１個の炭素原子を有する（「Ｃ１アルキル」）。いくつかの態様において、アルキル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２－６アルキル」）。Ｃ１－６アルキル基の例として、メチル（Ｃ１）、エチル（Ｃ２）、プロピル（Ｃ３）（例えば、ｎ－プロピル、イソプロピル）、ブチル（Ｃ４）（例えば、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、イソ－ブチル）、ペンチル（Ｃ５）（例えば、ｎ－ペンチル、３－ペンタニル、アミル、ネオペンチル、３－メチル－２－ブタニル、三級アミル）、およびヘキシル（Ｃ６）（例えば、ｎ－ヘキシル）が挙げられる。アルキル基のさらなる例として、ｎ－ヘプチル（Ｃ７）、ｎ－オクチル（Ｃ８）などが挙げられる。別段に特定されない限り、アルキル基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換アルキル」）、または１つ以上の置換基（例えば、Ｆなどのハロゲン）で置換されている（「置換アルキル」）。ある態様において、アルキル基は、置換されていないＣ１－１０アルキル（例えば、未置換Ｃ１－６アルキル、例えば、－ＣＨ３（Ｍｅ）、未置換エチル（Ｅｔ）、未置換プロピル（Ｐｒ、例えば、未置換ｎ－プロピル（ｎ－Ｐｒ）、未置換イソプロピル（ｉ－Ｐｒ））、未置換ブチル（Ｂｕ、例えば、未置換ｎ－ブチル（ｎ－Ｂｕ）、未置換ｔｅｒｔ－ブチル（ｔｅｒｔ－Ｂｕもしくはｔ－Ｂｕ）、未置換ｓｅｃ－ブチル（ｓｅｃ－Ｂｕ）、未置換イソブチル（ｉ－Ｂｕ））である。ある態様において、アルキル基は、置換されているＣ１－１０アルキル（例えば置換Ｃ１－６アルキル、例えば－ＣＦ３、Ｂｎ）である。
用語「ハロアルキル」とは、置換されたアルキル基であって、水素原子のうちの１つ以上が、独立して、ハロゲン、例えば、フルオロ、ブロモ、クロロ、またはヨードにより置き換えられているものである。いくつかの態様において、ハロアルキル部分は、１～８個の炭素原子を有する子（「Ｃ１－８ハロアルキル」）。いくつかの態様において、ハロアルキル部分は、１～６個の炭素原子を有する（「Ｃ１－６ハロアルキル」）。いくつかの態様において、ハロアルキル部分は、１～４個の炭素原子を有する（「Ｃ１－４ハロアルキル」）。いくつかの態様において、ハロアルキル部分は、１～３個の炭素原子を有する（「Ｃ１－３ハロアルキル」）。いくつかの態様において、ハロアルキル部分は、１～２個の炭素原子を有する（「Ｃ１－２ハロアルキル」）。ハロアルキル基の例として、－ＣＨＦ２、－ＣＨ２Ｆ、－ＣＦ３、－ＣＨ２ＣＦ３、－ＣＦ２ＣＦ３、－ＣＦ２ＣＦ２ＣＦ３、－ＣＣｌ３、－ＣＦＣｌ２、－ＣＦ２Ｃｌなどが挙げられる。
用語「ヘテロアルキル」とは、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１，２、３または４個のヘテロ原子）を、親鎖の中に（すなわち、その隣接する炭素原子の間に挿入されている）および／または１つ以上の末端の位置において含む、アルキル基を指す。
用語「アルケニル」とは、２～１０個の炭素原子および１つ以上の炭素－炭素二重結合（例えば、１，２、３または４つの二重結合）を有する、直鎖状または分枝状炭化水素基のラジカルを指す。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２－９アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２－８アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２－７アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２－６アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２－５アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２－４アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２－３アルケニル」）。いくつかの態様において、アルケニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルケニル」）。１つ以上の炭素－炭素二重結合は、内部（２－ブテニルにおけるものなど）であっても、または末端（１－ブテニルにおけるものなど）であってもよい。Ｃ２－４アルケニル基の例として、エテニル（Ｃ２）、１－プロペニル（Ｃ３）、２－プロペニル（Ｃ３）、１－ブテニル（Ｃ４）、２－ブテニル（Ｃ４）、ブタジエニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２－６アルケニル基の例として、前述のＣ２－４アルケニル基、ならびにペンテニル（Ｃ５）、ペンタジエニル（Ｃ５）、ヘキセニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルケニルのさらなる例として、ヘプテニル（Ｃ７）、オクテニル（Ｃ８）、オクタトリエニル（Ｃ８）などが挙げられる。別段に特定されない限り、アルケニル基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換アルケニル」）、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換アルケニル」）。ある態様において、アルケニル基は、未置換のＣ２－１０アルケニルである。ある態様において、アルケニル基は、置換Ｃ２－１０アルケニルである。アルケニル基において、立体化学が特定されていないＣ＝Ｃ二重結合（例えば、－ＣＨ＝ＣＨＣＨ３または
Figure 2022504712000002
 ）は、（Ｅ）－または（Ｚ）－二重結合であってよい。
用語「ヘテロアルケニル」とは、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１，２、３または４個のヘテロ原子）を、親鎖の中に（すなわち、その隣接する炭素原子の間に挿入されている）および／または１つ以上の末端の位置において含む、アルケニル基を指す。
用語「アルキニル」とは、２～１０個の炭素原子および１つ以上の炭素－炭素三重結合（例えば、１，２、３または４個の三重結合）を有する、直鎖状または分枝状炭化水素基のラジカルを指す（「Ｃ２－１０アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～９個の炭素原子を有する（「Ｃ２－９アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～８個の炭素原子を有する（「Ｃ２－８アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～７個の炭素原子を有する（「Ｃ２－７アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～６個の炭素原子を有する（「Ｃ２－６アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～５個の炭素原子を有する（「Ｃ２－５アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～４個の炭素原子を有する（「Ｃ２－４アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２～３個の炭素原子を有する（「Ｃ２－３アルキニル」）。いくつかの態様において、アルキニル基は、２個の炭素原子を有する（「Ｃ２アルキニル」）。１つ以上の炭素－炭素三重結合は、内部（２－ブチニルにおけるものなど）であっても、または末端（１－ブチニルにおけるものなど）であってもよい。Ｃ２－４アルキニル基の例として、限定することなく、エチニル（Ｃ２）、１－プロピニル（Ｃ３）、２－プロピニル（Ｃ３）、１－ブチニル（Ｃ４）、２－ブチニル（Ｃ４）などが挙げられる。Ｃ２－６アルケニル基の例として、前述のＣ２－４アルキニル基、ならびにペンチニル（Ｃ５）、ヘキシニル（Ｃ６）などが挙げられる。アルキニルのさらなる例として、ヘプチニル（Ｃ７）、オクチニル（Ｃ８）などが挙げられる。別段に特定されない限り、アルキニル基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換アルキニル」）、または置換されている（「置換アルキニル」）１つ以上の置換基で。ある態様において、アルキニル基は、未置換のＣ２－１０アルキニルである。ある態様において、アルキニル基は、置換Ｃ２－１０アルキニルである。
用語「ヘテロアルキニル」とは、酸素、窒素、または硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、１，２、３または４個のヘテロ原子）を、親鎖の中に（すなわち、その隣接する炭素原子の間に挿入されている）および／または１つ以上の末端の位置において含む、アルキニル基を指す。
用語「カルボシクリル」または「炭素環式」とは、非芳香族環式炭化水素基のラジカルであって、非芳香族環系中に、３～１４個の環炭素原子（「Ｃ３－１４カルボシクリル」）およびゼロ個のヘテロ原子を有するものを指す。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、３～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－１０カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、３～８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－８カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、３～７個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－７カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、３～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－６カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、４～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４－６カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、５～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５－６カルボシクリル」）。いくつかの態様において、カルボシクリル基は、５～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５－１０カルボシクリル」）。例示的なＣ３－６カルボシクリル基として、限定することなく、シクロプロピル（Ｃ３）、シクロプロペニル（Ｃ３）、シクロブチル（Ｃ４）、シクロブテニル（Ｃ４）、シクロペンチル（Ｃ５）、シクロペンテニル（Ｃ５）、シクロヘキシル（Ｃ６）、シクロヘキセニル（Ｃ６）、シクロヘキサジエニル（Ｃ６）などが挙げられる。例示的なＣ３－８カルボシクリル基として、限定することなく、前述のＣ３－６カルボシクリル基、ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）、シクロヘプテニル（Ｃ７）、シクロヘプタジエニル（Ｃ７）、シクロヘプタトリエニル（Ｃ７）、シクロオクチル（Ｃ８）、シクロオクテニル（Ｃ８）、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル（Ｃ７）、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（Ｃ８）などが挙げられる。例示的なＣ３－１０カルボシクリル基として、限定することなく、前述のＣ３－８カルボシクリル基、ならびにシクロノニル（Ｃ９）、シクロノネニル（Ｃ９）、シクロデシル（Ｃ１０）、シクロデセニル（Ｃ１０）、オクタヒドロ－１Ｈ－インデニル（Ｃ９）、デカヒドロナフタレニル（Ｃ１０）、スピロ［４．５］デカニル（Ｃ１０）などが挙げられる。前述の例が説明するとおり、ある態様において、カルボシクリル基は、単環式（「単環式カルボシクリル」）または多環式（例えば、二環系（「二環式カルボシクリル」）または三環系（「三環式カルボシクリル」）などの縮合、架橋、またはスピロ環系を含む）のいずれかであり、飽和していても、１つ以上の炭素－炭素二重または三重結合を含んでもよい。「カルボシクリル」はまた、上で定義されるとおりのカルボシクリル環が、１つ以上のアリールまたはヘテロアリール基に縮合しており、ここで付着の点カルボシクリル環上にある環系を含み、かかる場合において、炭素の数は、炭素環式環系中の炭素の数を指定し続ける。別段に特定されない限り、カルボシクリル基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換カルボシクリル」）、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換カルボシクリル」）。ある態様において、カルボシクリル基は、未置換のＣ３－１４カルボシクリルである。ある態様において、カルボシクリル基は、置換Ｃ３－１４カルボシクリルである。
いくつかの態様において、「カルボシクリル」は、３～１４個の環炭素原子を有する、単環式の、飽和カルボシクリル基である（「Ｃ３－１４シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、３～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－１０シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、３～８個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－８シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、３～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ３－６シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、４～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ４－６シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、５～６個の環炭素原子を有する（「Ｃ５－６シクロアルキル」）。いくつかの態様において、シクロアルキル基は、５～１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ５－１０シクロアルキル」）。Ｃ５－６シクロアルキル基の例として、シクロペンチル（Ｃ５）およびシクロヘキシル（Ｃ５）が挙げられる。Ｃ３－６シクロアルキル基の例として、前述のＣ５－６シクロアルキル基、ならびにシクロプロピル（Ｃ３）およびシクロブチル（Ｃ４）が挙げられる。Ｃ３－８シクロアルキル基の例として、前述のＣ３－６シクロアルキル基、ならびにシクロヘプチル（Ｃ７）およびシクロオクチル（Ｃ８）が挙げられる。別段に特定されない限り、シクロアルキル基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換シクロアルキル」）、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換シクロアルキル」）である。ある態様において、シクロアルキル基は、未置換のＣ３－１４シクロアルキルである。ある態様において、シクロアルキル基は、置換Ｃ３－１４シクロアルキルである。
用語「ヘテロシクリル」または「ヘテロ環式」とは、環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する３～１４員の非芳香族環系のラジカルを指し、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「３～１４員のヘテロシクリル」）。１つ以上の窒素原子を含むヘテロシクリル基において、付着の点は、結合価の許容する限り、炭素または窒素原子であってよい。ヘテロシクリル基は、単環式（「単環式ヘテロシクリル」）であっても、多環式（例えば、二環系（「二環式ヘテロシクリル」）または三環系（「三環式ヘテロシクリル」）などの縮合、架橋、またはスピロ環系）であってもよく、飽和していても、１つ以上の炭素－炭素二重または三重結合を含んでもよい。ヘテロシクリル多環式環系は、一方または両方の環中に１つ以上のヘテロ原子を含んでもよい。「ヘテロシクリル」はまた、上で定義されるとおりのヘテロシクリル環が１つ以上のカルボシクリル基と縮合しており、ここで付着の点がカルボシクリル環もしくはヘテロシクリル環のいずれかの上にある環系、または上で定義されるとおりのヘテロシクリル環が１つ以上のアリールもしくはヘテロアリール基に縮合しており、ここで、付着の点がヘテロシクリル環上にある環系を含み、かかる場合において、環員の数は、ヘテロシクリル環系中の環員の数を指定し続ける。別段に特定されない限り、ヘテロシクリルの各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換ヘテロシクリル」）、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換ヘテロシクリル」）。ある態様において、ヘテロシクリル基は、未置換の３～１４員のヘテロシクリルである。ある態様において、ヘテロシクリル基は、置換された３～１４員のヘテロシクリルである。
いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する５～１０員の非芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～１０員のヘテロシクリル」）。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する５～８員の非芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～８員のヘテロシクリル」）。いくつかの態様において、ヘテロシクリル基は、環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する５～６員の非芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～６員のヘテロシクリル」）。いくつかの態様において、５～６員のヘテロシクリルは、窒素、酸素および硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの態様において、５～６員のヘテロシクリルは、窒素、酸素および硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの態様において、５～６員のヘテロシクリルは、窒素、酸素および硫黄から選択される１つの環ヘテロ原子を有する。
用語「アリール」とは、単環式または多環式（例えば、二環式または三環式）の４ｎ＋２の芳香族環系のラジカル（例えば、環アレイ中に共有される６、１０または１４個のπ電子を有する）であって、芳香族環系中に提供される６～１４環炭素原子およびゼロ個のヘテロ原子を有する者を指す（「Ｃ６－１４アリール」）。いくつかの態様において、アリール基は、６個の環炭素原子を有する（「Ｃ６アリール」；例えば、フェニル）。いくつかの態様において、アリール基は、１０個の環炭素原子を有する（「Ｃ１０アリール」；例えば、１－ナフチルおよび２－ナフチルなどのナフチル）。いくつかの態様において、アリール基は、１４個の環炭素原子を有する（「Ｃ１４アリール」；例えば、アントラシル）。「アリール」はまた、上で定義されるとおりのアリール環が１つ以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基に縮合しており、ここでラジカルまたは付着の点がアリール環上にある環系を含み、かかる場合において、炭素原子の数は、アリール環系中の炭素原子の数を指定し続ける。別段に特定されない限り、アリール基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換アリール」）、または１つ以上の置換基で置換されている（「置換アリール」）。ある態様において、アリール基は、未置換のＣ６－１４アリールである。ある態様において、アリール基は、置換Ｃ６－１４アリールである。
用語「ヘテロアリール」とは、５～１４員の単環式または多環式（例えば、二環式、三環式）の４ｎ＋２芳香族環系のラジカル（例えば、環アレイ中に共有される６、１０または１４個のπ電子を有する）であって、芳香族環系中に環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有するものを指し、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～１４員のヘテロアリール」）。１つ以上の窒素原子を有するヘテロアリール基において、付着の点は、結合価の許容する限り、炭素または窒素原子であってよい。ヘテロアリール多環式環系は、一方または両方の環中に１つ以上のヘテロ原子を含んでもよい。「ヘテロアリール」は、上で定義されるとおりのヘテロアリール環が１つ以上のカルボシクリルまたはヘテロシクリル基に縮合しており、ここで付着の点がヘテロアリール環上にある環系を含み、かかる場合において、環員の数は、ヘテロアリール環系中の環員の数を指定し続ける。「ヘテロアリール」はまた、上で定義されるとおりのヘテロアリール環が１つ以上のアリール基に縮合しており、ここで付着の点がアリールまたはヘテロアリール環のいずれかの上にある環系を含み、かかる場合において、環員の数は、縮合した多環式（アリール／ヘテロアリール）環系中の環員の数を指定する。１つの環がヘテロ原子（例えば、インドリル、キノリニル、カルバゾリルなど）を含まない多環式ヘテロアリール基において、付着の点は、いずれの環、すなわち、ヘテロ原子を保有する環（例えば、２－インドリル）、またはヘテロ原子を含まない環（例えば、５～インドリル）のいずれの上にあってもよい。
いくつかの態様において、ヘテロアリール基は、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する、５～１０員の芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～１０員のヘテロアリール」）。いくつかの態様において、ヘテロアリール基は、５～８員の芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～８員のヘテロアリール」）。いくつかの態様において、ヘテロアリール基は、芳香族環系中に提供される環炭素原子および１～４個の環ヘテロ原子を有する５～６員の芳香族環系であって、ここで、各々のヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素および硫黄から選択される（「５～６員のヘテロアリール」）。いくつかの態様において、５～６員のヘテロアリールは、窒素、酸素および硫黄から選択される１～３個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの態様において、５～６員のヘテロアリールは、窒素、酸素および硫黄から選択される１～２個の環ヘテロ原子を有する。いくつかの態様において、５～６員のヘテロアリールは、窒素、酸素および硫黄から選択される１つの環ヘテロ原子を有する。別段に特定されない限り、ヘテロアリール基の各々の場合は、独立して、置換されていないか（「未置換ヘテロアリール」）、または１つ以上の置換基により置換されている（「置換ヘテロアリール」）。ある態様において、ヘテロアリール基は、置換されていない５～１４員のヘテロアリールである。ある態様において、ヘテロアリール基は、置換された５～１４員のヘテロアリールである。
基は、別段に明示的に提供されない限り、任意に置換されている。用語「任意に置換されている」とは、置換されているもの、または置換されていないものを指す。ある態様において、アルキル,アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリール基は、任意に置換されている。「任意に置換されている」とは、置換されていても、置換されていなくてもよい基を指す。一般的に、用語「置換されている」とは、基上に存在する少なくとも１つの水素が、許容可能な置換基、例えば置換により、安定な化合物、例えば自発的には転移（rearrangement）、環化、脱離（elimination）、または他の反応などによる形質転換を起こさない化合物をもたらす置換基により置き換えられていることを意味する。別段に示されない限り、「置換されている」基は、当該基の１つ以上の置換可能な位置において置換基を有し、任意の所与の構造における１つ以上の位置が置換された場合、置換基は、各々の位置において同じであっても異なっていてもよい。用語「置換されている」とは、有機化合物の全ての許容可能な置換基による置換を含むことを企図され、本明細書において記載される置換基のうちのいずれかであって、安定な化合物の形成をもたらすものを含む。本発明は、安定な化合物に到達するために、かかる組み合わせのうちのいずれかまたは全てを企図する。本発明の目的のために、窒素などのヘテロ原子は、素置換基、および／または、当該ヘテロ原子の結合価を満たし、安定な部分の形成をもたらす、本明細書において記載されるような任意の好適な置換基を有していてもよい。本発明は、決して、本明細書において記載される例示的な置換基により限定されることを意図されない。
例示的な置換基として、これらに限定されないが、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－ＯＮ（Ｒｂｂ）２、－Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ－、－Ｎ（ＯＲｃｃ）Ｒｂｂ、－ＳＨ、－ＳＲａａ、－ＳＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＨＯ、－Ｃ（ＯＲｃｃ）３、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＣＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＳＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２ＯＲａａ、－ＯＳＯ２Ｒａａ、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｓｉ（Ｒａａ）３、－ＯＳｉ（Ｒａａ）３、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｓ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、－ＳＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）２、－Ｐ（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（Ｒｃｃ）４、－Ｐ（ＯＲｃｃ）４、－ＯＰ（Ｒｃｃ）２、－ＯＰ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）２、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（Ｒｃｃ）４、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）４、－Ｂ（Ｒａａ）２、－Ｂ（ＯＲｃｃ）２、－ＢＲａａ（ＯＲｃｃ）、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０パーハロアルキル、Ｃ２－１０アルケニル、Ｃ２－１０アルキニル、ヘテロＣ１－１０アルキル、ヘテロＣ２－１０アルケニル、ヘテロＣ２－１０アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、３～１４員のヘテロシクリル、Ｃ６－１４アリール、および５～１４員のヘテロアリールが挙げられ、ここで、各々のアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基で置換されており；ここで、Ｘ－は、対イオンであるか；
または炭素原子上の２個のジェミナルな水素は、基＝Ｏ、＝Ｓ、＝ＮＮ（Ｒｂｂ）２、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、＝ＮＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）ＯＲａａ、＝ＮＮＲｂｂＳ（＝Ｏ）２Ｒａａ、＝ＮＲｂｂまたは＝ＮＯＲｃｃにより置き換えられ；
Ｒａａの各々の場合は、独立して、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０パーハロアルキル、Ｃ２－１０アルケニル、Ｃ２－１０アルキニル、ヘテロＣ１－１０アルキル、ヘテロＣ２－１０アルケニル、ヘテロＣ２－１０アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、３～１４員のヘテロシクリル、Ｃ６－１４アリール、および５～１４員のヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲａａ基は、連結されて、３～１４員のヘテロシクリルまたは５～１４員のヘテロアリール環を形成し；
Ｒｂｂの各々の場合は、独立して、水素、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｒｃｃ、－ＳＯ２ＯＲｃｃ、－ＳＯＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｃｃ）２）２、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０パーハロアルキル、Ｃ２－１０アルケニル、Ｃ２－１０アルキニル、ヘテロＣ１－１０アルキル、ヘテロＣ２－１０アルケニル、ヘテロＣ２－１ ０アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、３～１４員のヘテロシクリル、Ｃ６－１４アリール、および５～１４員のヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｂｂ基は、連結されて、３～１４員のヘテロシクリルまたは５～１４員のヘテロアリール環を形成し；
Ｒｃｃの各々の場合は、独立して、水素、Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０パーハロアルキル、Ｃ２－１０アルケニル、Ｃ２－１０アルキニル、ヘテロＣ１－１０アルキル、ヘテロＣ２－１０アルケニル、ヘテロＣ２－１０アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、３～１４員のヘテロシクリル、Ｃ６－１４アリール、および５～１４員のヘテロアリールから選択されるか、または２個のＲｃｃ基は、連結されて、３～１４員のヘテロシクリルまたは５～１４員のヘテロアリール環を形成し；
Ｒｄｄの各々の場合は、独立して、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、－ＳＯ２Ｈ、－ＳＯ３Ｈ、－ＯＨ、－ＯＣ１－６アルキル、－ＯＮ（Ｃ１－６アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－Ｎ（Ｃ１－６アルキル）３ ＋Ｘ－、－ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）２ ＋Ｘ－、－ＮＨ２（Ｃ１－６アルキル）＋Ｘ－、－ＮＨ３ ＋Ｘ－、－Ｎ（ＯＣ１－６アルキル）（Ｃ１－６アルキル）、－Ｎ（ＯＨ）（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨ（ＯＨ）、－ＳＨ、－ＳＣ１－６アルキル、－ＳＳ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）、－ＣＯ２Ｈ、－ＣＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＣＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）、－Ｎ（Ｃ１－６アルキル）Ｃ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨＣＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、－Ｃ（＝ＮＨ）Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＯＣ１－６アルキル、－Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｃ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＯＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、－ＮＨＳＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－ＳＯ２Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、－ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、－ＳＯ２ＮＨ２、－ＳＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－ＳＯ２Ｏ（Ｃ１－６アルキル）、－ＯＳＯ２（Ｃ１－６アルキル）、－ＳＯ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｓｉ（Ｃ１－６アルキル）３、－ＯＳｉ（Ｃ１－６アルキル）３、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｃ１－６アルキル）２、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ（Ｃ１－６アルキル）、Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ（Ｃ１－６アルキル）、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＣ１－６アルキル、－ＳＣ（＝Ｓ）ＳＣ１－６アルキル、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＣ１－６アルキル）２、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｃ１－６アルキル）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＣ１－６アルキル）２、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６パーハロアルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、ヘテロＣ１－６アルキル、ヘテロＣ２－６アルケニル、ヘテロＣ２－６アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、Ｃ６－１０アリール、３－１０員のヘテロシクリル、５～１０員のヘテロアリールであるか；
または、２つのジェミナルなＲｄｄ置換基は、連結されて、＝Ｏまたは＝Ｓを形成してもよい。
用語「ハロ」または「ハロゲン」とは、フッ素（フルオロ、－Ｆ）、塩素（クロロ、－Ｃｌ）、臭素（ブロモ、－Ｂｒ）、またはヨウ素（ヨード、－Ｉ）を指す。
用語「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」とは、基－ＯＨを指す。用語「置換されたヒドロキシル」または「置換されたヒドロキシル」とは、拡大解釈すれば、親分子に直接付着している酸素原子が水素以外の基で置換されているヒドロキシル基を指し、－ＯＲａａ、－ＯＮ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＣＯ２Ｒａａ、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－ＯＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＯＳ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＯＳＯ２Ｒａａ、－ＯＳｉ（Ｒａａ）３、－ＯＰ（Ｒｃｃ）２、－ＯＰ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）２、－ＯＰ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－ＯＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２および－ＯＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２から選択される基を含み、ここで、Ｘ－、Ｒａａ、ＲｂｂおよびＲｃｃは、本明細書において定義されるとおりである。
用語「アミノ」とは、基－ＮＨ２を指す。用語「置換されたアミノ」とは、拡大解釈すれば、一置換アミノ、二置換アミノ、または三置換アミノを指す。ある態様において、「置換されたアミノ」は、一置換アミノまたは二置換アミノ基である。用語「一置換アミノ」とは、親分子に直接付着している窒素原子が１つの水素および１つの水素以外の基で置換されているアミノ基を指し、－ＮＨ（Ｒｂｂ）、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＮＨＣＯ２Ｒａａ、－ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＨＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＨＳＯ２Ｒａａ、－ＮＨＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２および－ＮＨＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２から選択される基を含み、ここで、Ｒａａ、ＲｂｂおよびＲｃｃは、本明細書において定義されるとおりであり、およびここで、基－ＮＨ（Ｒｂｂ）のＲｂｂは、水素ではない。用語「二置換アミノ」とは、親分子に直接付着している窒素原子が２つの水素以外の基で置換されているアミノ基を指し、－Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＣ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－ＮＲｂｂＳＯ２Ｒａａ、－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２および－ＮＲｂｂＰ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ）２）２から選択される基を含み、ここで、Ｒａａ、ＲｂｂおよびＲｃｃは、本明細書において定義されるとおりであり、ただし、親分子に直接付着している窒素原子は、水素では置換されていない。用語「三置換アミノ」とは、親分子に直接付着している窒素原子が３つの基で置換されているアミノ基を指し、－Ｎ（Ｒｂｂ）３および－Ｎ（Ｒｂｂ）３ ＋Ｘ－から選択される基を含み、ここで、ＲｂｂおよびＸ－は、本明細書において定義されるとおりである。
用語「チオ」または「チオール」とは、基－ＳＨを指す。用語「置換されたチオ」または「置換されたチオール」とは、拡大解釈すれば、親分子に直接付着している硫黄原子が水素以外の基で置換されているチオール基を指す。ある態様において、硫黄原子上に存在する置換基は、硫黄保護基（また「チオール保護基」として言及される）である。硫黄保護基として、これらに限定されないが、－Ｒａａ、－Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＣＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｂｂ）Ｎ（Ｒｂｂ）２、－Ｓ（＝Ｏ）Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｓｉ（Ｒａａ）３、－Ｐ（Ｒｃｃ）２、－Ｐ（Ｒｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（ＯＲｃｃ）２、－Ｐ（ＯＲｃｃ）３ ＋Ｘ－、－Ｐ（＝Ｏ）（Ｒａａ）２、－Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲｃｃ）２および－Ｐ（＝Ｏ）（Ｎ（Ｒｂｂ） ２）２が挙げられ、ここで、Ｒａａ、Ｒｂｂ、およびＲｃｃは本明細書において定義されるとおりである。
用語「アシル」とは、一般式：－Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲＸ１、－Ｃ（＝Ｏ）－Ｏ－Ｃ（＝Ｏ）ＲＸ１、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲＸ１、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（ＲＸ１）２、－Ｃ（＝Ｓ）ＲＸ１、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（ＲＸ１）２、－Ｃ（＝Ｓ）Ｏ（ＲＸ１）、－Ｃ（＝Ｓ）Ｓ（ＲＸ１）、－Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＲＸ１、－Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＯＲＸ１、－Ｃ（＝ＮＲＸ１）ＳＲＸ１および－Ｃ（＝ＮＲＸ１）Ｎ（ＲＸ１）２を有する基を指し、ここで、ＲＸ１は、水素；ハロゲン；置換または未置換のヒドロキシル；置換または未置換のチオール；置換または未置換のアミノ；置換または未置換のアシル、環式または非環式の、置換または未置換の、分枝状または非分枝状の脂肪族；環式または非環式の、置換または未置換の、分枝状または非分枝状のヘテロ脂肪族；環式または非環式の、置換または未置換の、分枝状または非分枝状のアルキル；環式または非環式の、置換または未置換の、分枝状または非分枝状のアルケニル；置換または未置換のアルキニル；置換または未置換のアリール、置換または未置換のヘテロアリール、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、モノ－またはジ－脂肪族アミノ、モノ－またはジ－ヘテロ脂肪族アミノ、モノ－またはジ－アルキルアミノ、モノ－またはジ－ヘテロアルキルアミノ、モノ－またはジ－アリールアミノ、またはモノ－またはジ－ヘテロアリールアミであるか；または２個のＲＸ１基は、一緒にされて、５～６員のヘテロ環式環を形成する。例示的なアシル基として、アルデヒド（－ＣＨＯ）、カルボン酸（－ＣＯ２Ｈ）、ケトン、アシルハライド、エステル、アミド、イミン、カーボネート、カルバメートおよびウレアが挙げられる。アシル置換基として、これらに限定されないが、本明細書において記載される置換基のいずれかであって、安定な部分の形成をもたらすものが挙げられる（例えば、脂肪族、アルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロ脂肪族、ヘテロ環、アリール、ヘテロアリール、アシル、オキソ、イミノ、チオオキソ、シアノ、イソシアノ、アミノ、アジド、ニトロ、ヒドロキシル、チオール、ハロ、脂肪族アミノ、ヘテロ脂肪族アミノ、アルキルアミノ、ヘテロアルキルアミノ,アリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、アルキルアリール、アリールアルキル、脂肪族オキシ、ヘテロ脂肪族オキシ、アルキルオキシ、ヘテロアルキルオキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ、脂肪族チオキシ、ヘテロ脂肪族チオキシ、アルキルチオキシ、ヘテロアルキルチオキシ、アリールチオキシ、ヘテロアリールチオキシ、アシルオキシなど；これらの各々は、さらに置換されていても、置換されていなくてもよい）。
用語「アミノ酸」とは、アミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を指す。アミノ酸は、その構造を以下に表すアルファ－アミノ酸およびベータ－アミノ酸を含む。ある態様において、アミノ酸は、アルファアミノ酸である。
Figure 2022504712000003
 好適なアミノ酸として、限定することなく、天然のアルファ－アミノ酸、例えばペプチド中に見出される２０個の一般的な天然に存在するアルファ－アミノ酸（例えば、以下に提供されるような、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｃ、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）、非天然のアルファ－アミノ酸天然のベータ－アミノ酸（例えば、ベータ－アラニン）および非天然のベータ－アミノ酸の、Ｄ－およびＬ－異性体が挙げられる。例示的な天然のアルファ－アミノ酸として、Ｌ－アラニン（Ａ）、Ｌ－アルギニン（Ｒ）、Ｌ－アスパラギン（Ｎ）、Ｌ－アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ－システイン（Ｃ）、Ｌ－グルタミン酸（Ｅ）、Ｌ－グルタミン（Ｑ）、グリシン（Ｇ）、Ｌ－ヒスチジン（Ｈ）、Ｌ－イソロイシン（Ｉ）、Ｌ－ロイシン（Ｌ）、Ｌ－リジン（Ｋ）、Ｌ－メチオニン（Ｍ）、Ｌ－フェニルアラニン（Ｆ）、Ｌ－プロリン（Ｐ）、Ｌ－セリン（Ｓ）、Ｌ－スレオニン（Ｔ）、Ｌ－トリプトファン（Ｗ）、Ｌ－チロシン（Ｙ）、およびＬ－バリン（Ｖ）が挙げられる。例示的な非天然のアルファ－アミノ酸として、Ｄ－アルギニン、Ｄ－アスパラギン、Ｄ－アスパラギン酸、Ｄ－システイン、Ｄ－グルタミン酸、Ｄ－グルタミン、Ｄ－ヒスチジン、Ｄ－イソロイシン、Ｄ－ロイシン、Ｄ－リジン、Ｄ－メチオニン、Ｄ－フェニルアラニン、Ｄ－プロリン、Ｄ－セリン、Ｄ－スレオニン、Ｄ－トリプトファン、Ｄ－チロシン、Ｄ－バリン、Ｄｉ－ビニル、α－メチル－アラニン（Ａｉｂ）、α－メチル－アルギニン、α－メチル－アスパラギン、α－メチル－アスパラギン酸、α－メチル－システイン、α－メチル－グルタミン酸、α－メチル－グルタミン、α－メチル－ヒスチジン、α－メチル－イソロイシン、α－メチル－ロイシン、α－メチル－リジン、α－メチル－メチオニン、α－メチル－フェニルアラニン、α－メチル－プロリン、α－メチル－セリン、α－メチル－スレオニン、α－メチル－トリプトファン、α－メチル－チロシン、α－メチル－バリン、ノルロイシン、末端が不飽和なアルファ－アミノ酸およびビスアルファ－アミノ酸（例えば、修飾システイン、修飾リジン、修飾トリプトファン、修飾セリン、修飾スレオニン、修飾プロリン、修飾ヒスチジン、修飾アラニンなど）が挙げられる。これらは、多くの既知の非天然のアミノ酸であり、これらのうちのいずれかを本発明のペプチドにおいてふくむことができる。例えば、S. Hunt、The Non-Protein Amino Acids: In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids、G. C. Barrett編、Chapman and Hall（1985年）を参照。
ある態様において、窒素原子上に存在する置換基は、窒素保護基である（本明細書においてまた、「アミノ保護基」として言及される）。窒素保護基として、これらに限定されないが、－ＯＨ、－ＯＲａａ、－Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ、－Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＣＯ２Ｒａａ、－ＳＯ２Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｒａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）ＯＲａａ、－Ｃ（＝ＮＲｃｃ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｎ（Ｒｃｃ）２、－ＳＯ２Ｒｃｃ、－ＳＯ２ＯＲｃｃ、－ＳＯＲａａ、－Ｃ（＝Ｓ）Ｎ（Ｒｃｃ）２、－Ｃ（＝Ｏ）ＳＲｃｃ、－Ｃ（＝Ｓ）ＳＲｃｃ、Ｃ１－１０アルキル（例えば、アラルキル、ヘテロアラルキル）、Ｃ２－１０アルケニル、Ｃ２－１０アルキニル、ヘテロＣ１－１０アルキル、ヘテロＣ２－１０アルケニル、ヘテロＣ２－１０アルキニル、Ｃ３－１０カルボシクリル、３～１４員のヘテロシクリル、Ｃ６－１４アリール、および５～１４員のヘテロアリール基が挙げられ、ここで、各々のアルキル、アルケニル、アルキニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボシクリル、ヘテロシクリル、アラルキル、アリールおよびヘテロアリールは、独立して、０、１、２、３、４または５個のＲｄｄ基で置換されており、およびここで、Ｒａａ、Ｒｂｂ、ＲｃｃおよびＲｄｄは、本明細書において定義されるとおりである。窒素保護基は、当該分野において周知であり、本明細書において参考として援用されるProtecting Groups in Organic Synthesis、T. W. GreeneおよびP. G. M. Wuts、第３版、John Wiley & Sons（1999年）において詳細に記載されるものを含む。
例えば、アミド基（例えば－Ｃ（＝Ｏ）Ｒａａ）などの保護基（例えば、窒素または酸素保護基）として、これらに限定されないが、ホルムアミド、アセタミド、クロロアセタミド、トリクロロアセタミド、トリフルオロアセタミド、フェニルアセタミド、３－フェニルプロパンアミド、ピコリナミド、３－ピリジルカルボキサミド、Ｎ－ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、ｐ－フェニルベンズアミド、ｏ－ニトロフェニルアセタミド、ｏ－ニトロフェノキシアセタミド、アセトアセタミド、（Ｎ’－ジチオベンジルオキシアシルアミノ）アセタミド、３－（ｐ－ヒドロキシフェニル）プロパンアミド、３－（ｏ－ニトロフェニル）プロパンアミド、２－メチル－２－（ｏ－ニトロフェノキシ）プロパンアミド、２－メチル－２－（ｏ－フェニルアゾフェノキシ）プロパンアミド、４－クロロブタンアミド、３－メチル－３－ニトロブタンアミド、ｏ－ニトロシンナミド、Ｎ－アセチルメチオニン誘導体、ｏ－ニトロベンズアミドおよびｏ－（ベンゾイルオキシメチル）ベンズアミドが挙げられる。
カルバメート基（例えば－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲａａ）などの保護基（例えば、窒素または酸素保護基）として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：メチルカルバメート、エチルカルバメート、９－フルオレニルメチルカルバメート（Ｆｍｏｃ）、９－（２－スルホ（フルオレニルメチルカルバメート、９－（２，７－ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、２，７－ジ－ｔ－ブチル－［９－（１０，１０－ジオキソ－１０，１０，１０，１０－テトラヒドロチオキサンチル）］メチルカルバメート（ＤＢＤ－Ｔｍｏｃ）、４－メトキシフェナシルカルバメート（Ｐｈｅｎｏｃ）、２，２，２－トリクロロエチルカルバメート（Ｔｒｏｃ）、２－トリメチルシリルエチルカルバメート（Ｔｅｏｃ）、２－フェニルエチルカルバメート（ｈＺ）、１－（１－アダマンチル）－１－メチルエチルカルバメート（Ａｄｐｏｃ）、１，１－ジメチル－２－ハロエチルカルバメート、１，１－ジメチル－２，２－ジブロモエチルカルバメート（ＤＢ－ｔ－ＢＯＣ）、１，１－ジメチル－２，２，２－トリクロロエチルカルバメート（ＴＣＢＯＣ）、１－メチル－１－（４－ビフェニリル）エチルカルバメート（Ｂｐｏｃ）、１－（３，５－ジ－ｔ－ブチルフェニル）－１－メチルエチルカルバメート（ｔ－Ｂｕｍｅｏｃ）、２－（２’－および４’－ピリジル）エチルカルバメート（Ｐｙｏｃ）、２－（Ｎ，Ｎ－ジシクロヘキシルカルボキサミド）エチルカルバメート、ｔ－ブチルカルバメート（ＢＯＣまたはＢｏｃ）、１－アダマンチルカルバメート（Ａｄｏｃ）、ビニルカルバメート（Ｖｏｃ）、アリルカルバメート（Ａｌｌｏｃ）、１－イソプロピルアリルカルバメート（Ｉｐａｏｃ）、シンナミルカルバメート（Ｃｏｃ）、４－ニトロシンナミルカルバメート（Ｎｏｃ）、８－キノリルカルバメート、Ｎ－ヒドロキシピペリジニルカルバメート、アルキルジチオカルバメート、ベンジルカルバメート（Ｃｂｚ）、ｐ－メトキシベンジルカルバメート（Ｍｏｚ）、ｐ－ニトロベンジルカルバメート、ｐ－ブロモベンジルカルバメート、ｐ－クロロベンジルカルバメート、２，４－ジクロロベンジルカルバメート、４－メチルスルフィニルベンジルカルバメート（Ｍｓｚ）、９－アントリルメチルカルバメート、ジフェニルメチルカルバメート、２－メチルチオエチルカルバメート、２－メチルスルホニルエチルカルバメート、２－（ｐ－トルエンスルホニル）エチルカルバメート、［２－（１，３－ジチアニル）］メチルカルバメート（Ｄｍｏｃ）、４－メチルチオフェニルカルバメート（Ｍｔｐｃ）、２，４－ジメチルチオフェニルカルバメート（Ｂｍｐｃ）、２－ホスホニオエチルカルバメート（Ｐｅｏｃ）、２－トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバメート（Ｐｐｏｃ）、１，１－ジメチル－２－シアノエチルカルバメート、ｍ－クロロ－ｐ－アシルオキシベンジルカルバメート、ｐ－（ジヒドロキシボリル）ベンジルカルバメート、５－ベンズイソキサゾリルメチルカルバメート、２－（トリフルオロメチル）－６－クロモニルメチルカルバメート（Ｔｃｒｏｃ）、ｍ－ニトロフェニルカルバメート、３，５－ジメトキシベンジルカルバメート、ｏ－ニトロベンジルカルバメート、３，４－ジメトキシ－６－ニトロベンジルカルバメート、フェニル（ｏ－ニトロフェニル）メチルカルバメート、ｔ－アミルカルバメート、Ｓ－ベンジルチオカルバメート、ｐ－シアノベンジルカルバメート、シクロブチルカルバメート、シクロヘキシルカルバメート、シクロペンチルカルバメート、シクロプロピルメチルカルバメート、ｐ－デシルオキシベンジルカルバメート、２，２－ジメトキシアシルビニルカルバメート、ｏ－（Ｎ，Ｎ－ジメチルカルボキサミド）ベンジルカルバメート、１，１－ジメチル－３－（Ｎ，Ｎ－ジメチルカルボキサミド）プロピルカルバメート、１，１－ジメチルプロピニルカルバメート、ジ（２－ピリジル）メチルカルバメート、２－フラニルメチルカルバメート、２－ヨードエチルカルバメート、イソボルニルカルバメート、イソブチルカルバメート、イソニコチニルカルバメート、ｐ－（ｐ’－メトキシフェニルアゾ）ベンジルカルバメート、１－メチルシクロブチルカルバメート、１－メチルシクロヘキシルカルバメート、１－メチル－１－シクロプロピルメチルカルバメート、１－メチル－１－（３，５－ジメトキシフェニル）エチルカルバメート、１－メチル－１－（ｐ－フェニルアゾフェニル）エチルカルバメート、１－メチル－１－フェニルエチルカルバメート、１－メチル－１－（４－ピリジル）エチルカルバメート、フェニルカルバメート、ｐ－（フェニルアゾ）ベンジルカルバメート、２，４，６－トリ－ｔ－ブチルフェニルカルバメート、４－（トリメチルアンモニウム）ベンジルカルバメート、および２，４，６－トリメチルベンジルカルバメート。
スルホンアミド基（例えば－Ｓ（＝Ｏ）２Ｒａａ）などの保護基（例えば、窒素または酸素保護基）として、これらに限定されないが、ｐ－トルエンスルホンアミド（Ｔｓ）、ベンゼンスルホンアミド、２，３，６－トリメチル－４－メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｒ）、２，４，６－トリメトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｂ）、２，６－ジメチル－４－メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｐｍｅ）、２，３，５，６－テトラメチル－４－メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｅ）、４－メトキシベンゼンスルホンアミド（Ｍｂｓ）、２，４，６－トリメチルベンゼンスルホンアミド（Ｍｔｓ）、２，６－ジメトキシ－４－メチルベンゼンスルホンアミド（ｉＭｄｓ）、２，２，５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホンアミド（Ｐｍｃ）、メタンスルホンアミド（Ｍｓ）、β－トリメチルシリルエタンスルホンアミド（ＳＥＳ）、９－アントラセンスルホンアミド、４－（４’，８’－ジメトキシナフチルメチル）ベンゼンスルホンアミド（ＤＮＭＢＳ）、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミド、およびフェナシルスルホンアミドが挙げられる。
他の保護基（例えば、窒素または酸素保護基）として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：フェノチアジニル－（１０）－アシル誘導体、Ｎ’－ｐ－トルエンスルホニルアミノアシル誘導体、Ｎ’－フェニルアミノチオアシル誘導体、Ｎ－ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、Ｎ－アセチルメチオニン誘導体、４，５－ジフェニル－３－オキサゾリン－２－オン、Ｎ－フタルイミド、Ｎ－ジチアサクシニミド（Ｄｔｓ）、Ｎ－２，３－ジフェニルマレイミド、Ｎ－２，５－ジメチルピロール、Ｎ－１，１，４，４－テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物（ＳＴＡＢＡＳＥ）、５－置換１，３－ジメチル－１，３，５－トリアザシクロヘキサン－２－オン、５－置換１，３－ジベンジル－１，３，５－トリアザシクロヘキサン－２－オン、１－置換３，５－ジニトロ－４－ピリドン、Ｎ－メチルアミン、Ｎ－アリルアミン、Ｎ－［２－（トリメチルシリル）エトキシ］メチルアミン（ＳＥＭ）、Ｎ－３－アセトキシプロピルアミン、Ｎ－（１－イソプロピル－４－ニトロ－２－オキソ－３－ピロリン－３－イル）アミン、四級アンモニウム塩、Ｎ－ベンジルアミン、Ｎ－ジ（４－メトキシフェニル）メチルアミン、Ｎ－５－ジベンゾスベリルアミン、Ｎ－トリフェニルメチルアミン（Ｔｒ）、Ｎ－［（４－メトキシフェニル）ジフェニルメチル］アミン（ＭＭＴｒ）、Ｎ－９－フェニルフルオレニルアミン（ＰｈＦ）、Ｎ－２，７－ジクロロ－９－フルオレニルメチレンアミン、Ｎ－フェロセニルメチルアミノ（Ｆｃｍ）、Ｎ－２－ピコリルアミノＮ’－オキシド、Ｎ－１，１－ジメチルチオメチレンアミン、Ｎ－ベンジリデンアミン、Ｎ－ｐ－メトキシベンジリデンアミン、Ｎ－ジフェニルメチレンアミン、Ｎ－［（２－ピリジル）メシチル］メチレンアミン、Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノメチレン）アミン、Ｎ，Ｎ’－イソプロピリデンジアミン、Ｎ－ｐ－ニトロベンジリデンアミン、Ｎ－サリチリデンアミン、Ｎ－５－クロロサリチリデンアミン、Ｎ－（５－クロロ－２－ヒドロキシフェニル）フェニルメチレンアミン、Ｎ－シクロヘキシリデンアミン、Ｎ－（５，５－ジメチル－３－オキソ－１－シクロヘキセニル）アミン、Ｎ－ボラン誘導体、Ｎ－ジフェニルボリン酸誘導体、Ｎ－［フェニル（ペンタアシルクロム－またはタングステン）アシル］アミン、Ｎ－銅キレート、Ｎ－亜鉛キレート、Ｎ－ニトロアミン、Ｎ－ニトロソアミン、アミンＮ－オキシド、ジフェニルホスフィンアミド（Ｄｐｐ）、ジメチルチオホスフィンアミド（Ｍｐｔ）、ジフェニルチオホスフィンアミド（Ｐｐｔ）、ジアルキルホスホルアミデート、ジベンジルホスホルアミデート、ジフェニルホスホルアミデート、ベンゼンスルフェンアミド、ｏ－ニトロベンゼンスルフェンアミド（Ｎｐｓ）、２，４－ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、２－ニトロ－４－メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、および３－ニトロピリジンスルフェンアミド（Ｎｐｙｓ）。ある態様において、保護基（例えば、窒素または酸素保護基）は、ベンジル（Ｂｎ）、ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、トリフルオロアセチル、トリフェニルメチル、アセチル（Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、３，４－ジメトキシベンジル（ＤＭＰＭ）、ｐ－メトキシフェニル（ＰＭＰ）、２，２，２－トリクロロエチルオキシカルボニル（Ｔｒｏｃ）、トリフェニルメチル（Ｔｒ）、トシル（Ｔｓ）、ブロシル（Ｂｓ）、ノシル（Ｎｓ）、メシル（Ｍｓ）、トリフリル（Ｔｆ）、またはダンシル（Ｄｓ）である。
本明細書において用いられる場合、用語「塩」とは、任意および全ての塩を指し、薬学的に受入可能な塩を包含する。用語「薬学的に受入可能な塩」とは、健全な医学的判断の範囲内において、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などを伴うことなく、ヒトおよびより低級な動物の組織と接触しての使用のために好適であり、妥当な利益／リスク比と釣り合う塩を指す。薬学的に受入可能な塩は、当該分野において周知である。例えば、Bergeらは、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19において薬学的に受入可能な塩を詳細に記載し、これは、本明細書において参考として援用される。本発明の化合物薬学的に受入可能な塩は、好適な無機および有機の酸および塩基から誘導されるものを含む。薬学的に受け入れ可能な、非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸により、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸により、あるいはイオン交換などの当該分野において公知の他の方法を用いることにより形成される、アミノ基の塩である。他の薬学的に受入可能な塩として、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、硫酸水素塩、ホウ酸、酪酸、カンファー酸、カンファースルホン酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、ジグルコン酸、ドデシル硫酸、エタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グリセロリン酸、グルコン酸、ヘミ硫酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヨウ化水素酸、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸、ラクトビオン酸、乳酸、ラウリン酸、ラウリル硫酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、ペクチン酸、過硫酸、３－フェニルプロピオン酸、リン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、チオシアン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ウンデカン酸、吉草酸の塩などが挙げられる。適切な塩基から誘導される塩として、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウムおよびＮ＋（Ｃ１－４アルキル）４ －の塩が挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩として、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらなる薬学的に受入可能な塩として、適切である場合には、非毒性のアンモニウム、四級アンモニウム、ならびに、ハライド、水酸化物、カルボン酸、硫酸、リン酸、硝酸、低級アルキルスルホン酸およびアリールスルホン酸などの対イオンを用いて形成されたアミンカチオンが挙げられる。
本明細書の一部を形成する添付の図面は、本発明のいくつかの態様を説明し、説明と一緒に、本発明の原理を説明するために役立つ。
妨害的な反応条件下における、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端における天然のリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）の制御された組み込みについての反応図。ｒＮＴＰ組み込み（Ｋｎ）の速度は、三リン酸のα－、β－またはγ－リン酸の修飾を有するものなどの、加水分解性ヌクレオチド組み込みの競合的阻害剤として作用する非加水分解性または不適合性のヌクレオチドの付加を通して制御される。組み込みイベントの数（ｎ＝ゼロ～数百の場合）は、伸長反応において存在する非加水分解性または不適合性のヌクレオチドのパーセンテージ（０％～１００％）により決定され、それにより、より高いパーセンテージの競合的阻害剤ヌクレオチドは、反応により生成されるＲＮＡオリゴヌクレオチドの長さを限定する。イニシエーターオリゴヌクレオチドが切断可能な共有結合性連結（Ｘ）通して表面に付着している場合、ＲＮＡオリゴヌクレオチド塩基の組成は、反応条件の迅速な切り替えを通して可変性であり得る。
伸長反応を１ヌクレオチドのみの付加に限定するイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端における修飾ｒＮＴＰの組み込みについての反応図。修飾ｒＮＴＰの組み込みは、伸長されたオリゴヌクレオチドが温和なＲＮＡ耐性脱保護剤により処置されて天然のヒドロキシル基を生じるまで、さらなる伸長イベントを可逆的に妨害する。イニシエーターオリゴヌクレオチドが切断可能な共有結合性連結（Ｘ）通して表面に付着している場合、、成長中のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、先の組み込みイベントからのヌクレオチドを除去するための精製を必要することなしに、反復的に伸長させることができる。可逆性ターミネーターｒＮＴＰは、ヌクレオチドの２’－、３’－、または２’－および３’－位（ＲおよびＲ’）において、ヌクレオチド上の他の部位（例えば、ヌクレオチド塩基）への修飾に加えて、例えば、非天然の化学的ドメインを有していてもよい。任意に、酵素触媒後に、温和な脱保護処置およびその後の伸長の前に、（ｎ＋１）の組み込みイベントを検証するために、各々の修飾を、リンカーおよびフルオロフォアを含むように、さらに誘導体化してもよい。
図３Ａは、多様な二価のカチオンおよび二価のカチオンの組み合わせによる、２００μＭのｄＮＴＰによる漸減濃度による、ポリメラーゼμＲ３８７Ｋの初期活性スクリーンのバープロットを示す。 それぞれｄＡＴＰおよびｒＡＴＰについての、２００～５０μＭおよび５．０～０．６２ｍＭのヌクレオチド濃度におけるｄＡＴＰ組み込みの変性ゲル電気泳動分析（図３Ｂ）およびｒＡＴＰ組み込み（図３Ｃ）。これらの反応に、０．２５ｍＭのＭｎ２＋およびＭｇ２＋を補充した。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。全ての反応について、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣにより精製されたポリｄＴ－１５マーであった。 それぞれｄＡＴＰおよびｒＡＴＰについての、２００～５０μＭおよび５．０～０．６２ｍＭのヌクレオチド濃度におけるｄＡＴＰ組み込みの変性ゲル電気泳動分析（図３Ｂ）およびｒＡＴＰ組み込み（図３Ｃ）。これらの反応に、０．２５ｍＭのＭｎ２＋およびＭｇ２＋を補充した。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。全ての反応について、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣにより精製されたポリｄＴ－１５マーであった。
図４Ａおよび４Ｂ。図４Ａは、S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼによる修飾ヌクレオチド（２’－アミノ－ｒＡＴＰ、２’－Ｏ－メチル－ｒＡＴＰ、２’－Ｆ－ｒＡＴＰ、および２’－アジド－ｒＡＴＰ）の組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。全ての２’－修飾リボヌクレオチドは、２．５ｍＭの最終濃度であり、３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。 図４Ｂは、ヌクレオチド濃度（２５０μＭ～４０００μＭ）の範囲にわたり３７℃で６０分間にわたりインキュベートしたS. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼによる可逆性ターミネーター２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。陰性反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。
図５Ａは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる天然のリボヌクレオチド組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。天然のリボヌクレオチドはいずれも、１．０ｍＭの最終濃度であり、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。 図５Ｂは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる天然のリボヌクレオチド組み込みの動態学的分析を示す；一本鎖ＲＮＡの合計濃度を、時間の関数として測定する。エラーバーは、Ｎ＝３による平均値からの標準偏差を示す。
S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる修飾リボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチル）の組み込みの変性ゲル電気泳動分析。全ての修飾リボヌクレオチドは、２．５ｍＭの最終濃度であり、３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。
図７Ａは、２つの異なるイニシエーターオリゴヌクレオチド（５’－ＦＡＭ－ｒＡ－１５マーおよび５’－Ｃｙ５－ｒＵ－１５マー）の存在下における、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる天然のリボヌクレオチド組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。４つの天然のリボヌクレオチドは全て、１．０ｍＭの最終濃度であり、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。対照反応は、各々のイニシエーターオリゴヌクレオチドについて、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。 図７Ｂは、強力なヘアピン形成を介する二次構造を有するイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いる、可逆性ターミネーター２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰまたは－ＵＴＰの組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。各々のオリゴヌクレオチドは、３’末端と比較したヘアピンの位置が、以下を生成するように変化したことを除いて、配列において類似した：３’末端から１塩基（Ｈ１）、３’末端から５塩基（Ｈ５）、３’末端から１０塩基（Ｈ１０）、および３’末端から２０塩基。配列塩基組成を示す。オリゴヌクレオチドのヘアピンが、酵素による伸長の前に正確に形成されることをほしょうするために、オリゴヌクレオチドを、９５℃まで加熱し、次いで、サーモサイクラーにおいて、適切な酵素反応バッファー中で、０．１℃／分の速度で１５℃までゆっくりと冷却した。冷却後、残りの反応成分を、ヘアピンイニシエーターオリゴヌクレオチドに加えて、５分間にわたり３７℃で伸長反応を行った。
図８Ａは、天然のリボヌクレオチドの各々についての、無機ピロホスファターゼ（ＰＰｉ－アーゼ）あり（＋）およびなし（－）での、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。動態学的分析は、ＰＰｉ－アーゼの存在下におけるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＡＴＰ（図８Ｂ）およびＵＴＰ（図８Ｃ）の組み込みの速度の増大を示す。 図８Ａは、天然のリボヌクレオチドの各々についての、無機ピロホスファターゼ（ＰＰｉ－アーゼ）あり（＋）およびなし（－）での、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。動態学的分析は、ＰＰｉ－アーゼの存在下におけるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＡＴＰ（図８Ｂ）およびＵＴＰ（図８Ｃ）の組み込みの速度の増大を示す。 図８Ａは、天然のリボヌクレオチドの各々についての、無機ピロホスファターゼ（ＰＰｉ－アーゼ）あり（＋）およびなし（－）での、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。対照反応は、ヌクレオチドを除いて、全ての反応成分からなった。動態学的分析は、ＰＰｉ－アーゼの存在下におけるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＡＴＰ（図８Ｂ）およびＵＴＰ（図８Ｃ）の組み込みの速度の増大を示す。
図９Ａは、非修飾ｒＵＴＰおよび塩基修飾シュードウリジン（ＰｓＵＴＰ）による、ヌクレオチドの様々な濃度におけるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。反応を、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。 図９Ｂは、修飾アデノシン、ウリジン、シチジン、グアノシン、またはユニバーサルな塩基イノシンを有するヌクレオシド三リン酸のアレイによるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。示されるリストの番号は、１ｍＭの各々の個々のヌクレオチドの存在下におけるポリ（Ｕ）ポリメラーゼの活性を分析した、ゲルのレーンに対応する。比較を目的として、天然のヌクレオシド三リン酸をインキュベートし、並行して分析した。ゲル上で「Ｃ」により表された対照反応は、ヌクレオシド三リン酸を例外とした全てのＲＮＡ合成反応成分による反応を示す。イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－Ｃｙ５フルオロフォアを有するポリ－ｒＵ－１５マーであった。全ての反応を、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした
漸増濃度の非加水分解性リボヌクレオチドウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸およびＵＴＰと共にインキュベートしたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析。反応を、３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、対照反応は、非加水分解性リボヌクレオチドを除く全ての反応成分からなった。
図１１Ａは、濃度１ｍＭの２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ、２’－ブロック（blocked）可逆性ターミネーターと共に、ポリ－ｒＵ－１５マーまたはポリ－ｒＡ－１５マーのいずれかのイニシエーターオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応の変性ゲル電気泳動分析を示す。酵素活性を示すために、２’－Ｏ－メチル－ＡＴＰ（S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより組み込まれることが先に確認されている）を補充した対照反応を示す。加えて、ヌクレオシド三リン酸を除いて全ての反応成分を補充した陰性対照反応を、変性ゲルに含めた。可逆性ターミネーター反応について、第２のバンドは、陰性対照反応と比較して、（ｎ＋１）の伸長イベントをもたらす陽性の組み込みを示す。全てのＲＮＡ合成反応を、１０ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチドと共に、３７℃で３０分間にわたりインキュベートした。 図１１Ｂは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーター組み込みの動態学の変性ゲル電気泳動分析を示す。反応を、０．５、５、１０、３０および６０分間にわたり３７℃でインキュベートした。各々の時点において、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターを例外として全ての反応成分を有する陰性対照を含め、ゲル上でマイナス（－）記号により示す。２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターと共にインキュベートされた反応は、ゲル上でプラス（＋）記号により示す。全ての反応について、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－Ｃｙ５フルオロフォアで標識されたポリ－ｒＵ－１５マーであった。 図１１Ｃは、組み込まれた２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターの生体適合性の脱ブロックにおけるバッファーの組成およびｐＨの最適化の変性ゲル電気泳動分析を示す。脱ブロック反応を、５０℃で１０分間にわたりインキュベートし、オリゴヌクレオチド材料を、次いで精製し、濃縮し、および次いで、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ最良反応条件を用いてさらに伸長させた。各々のバッファーについて、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターを例外として全ての反応成分を有する陰性対照を含め、ゲル上でマイナス（－）記号により示す。２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターと共にインキュベートされた反応は、ゲル上でプラス（＋）記号により示す。（Ｓ）により示される出発材料は、完全な合成サイクルを描出するために含めた。 出発材料（Ｓまたはｎ＋０）から（ｎ＋２）への合成サイクルの高分解能変性ゲル電気泳動分析を、図１１Ｄにおいて示す。前と同様に、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターを例外として全ての反応成分を有する陰性対照を含め、ｉｓゲル上でマイナス（－）記号により示す。 図１１Ｅは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよび２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターを用いる（ｎ＋５）のオリゴヌクレオチド合成の変性ゲル電気泳動分析を示す。各々のサイクルは、１分間にわたる３７℃でのバルク溶液伸長反応および最適化された条件を用いる１０分間にわたる５０℃でのバルク溶液脱ブロック反応からなった。各々のサイクルの後で、材料の小さなアリコートを、ゲル分析のために別取した。（ｎ＋０）の出発材料は、２０－ｎｔの長さであり、（ｎ＋５）の最終生成物は、２５－ｎｔの長さであった。
図１２Ａは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いた２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ、－ＵＴＰ、－ＣＴＰ、および－ＧＴＰ可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸の（ｎ＋１）の組み込みの変性ゲル電気泳動分析を示す。全ての伸長反応を同様に処置し、１ｍＭのヌクレオチドと共に１分間にわたり３７℃でインキュベートした。対照反応は、ヌクレオチドを除く全ての反応成分を含んだ。 図１２Ｂは、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰと－ＵＴＰ可逆性ターミネーターとの組み合わせを用いたバイナリー（ｎ＋２）合成の変性ゲル電気泳動分析を示す。以下の組み合わせを試験した：バルク溶液中で、最適化された酵素による伸長および脱ブロック反応条件を用いて、（ｎ＋２）Ａ－Ａ、（ｎ＋２）Ａ－Ｕ、（ｎ＋２）Ｕ－Ａ、および（ｎ＋２）Ｕ－Ｕ。（ｎ＋１）の反応または２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰおよび－ＵＴＰ可逆性ターミネーターを、比較のために示す。
図１３Ａは、「精製済」レーンの下に四角形付きの明るいバンドにより示されるとおり、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの発現および精製の変性ゲル電気泳動分析を示す。発現されたＮ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの予測される分子量は、約４５ｋＤａである。 図１３Ｂは、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸の組み込みを通してＮ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ活性の変性ゲル電気泳動分析を示す。反応に、漸増量のイニシエーターオリゴヌクレオチド（from 20pmol～1000pmol）を補充して、相対的変換速度をイニシエーターオリゴヌクレオチド材料の関数として、濃縮されたＮ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより行われたものとして、決定した。全反応容積は、１０μＬであり、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－Ｃｙ５フルオロフォアで標識されたポリ－ｒＵ－１５マーであった。反応を３７℃で３０秒間にわたりインキュベートした。対照反応は、可逆性ターミネーターヌクレオチドを例外として、全ての反応成分を含んだ（イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０ｐｍｏｌであった）。
図１４Ａは、酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド系のための固相支持系の開発を示す。５’－アミンイニシエーターオリゴヌクレオチドを、ビオチン－ＰＥＧ－ＮＨＳリンカーで標識し、これは、イニシエーターオリゴヌクレオチドが、マイクロプレートウェル、ビーズ、スライドグラスなどの容器中で、ストレプトアビジン表面アンカリングされることを可能にする。オリゴヌクレオチド標識の変性ゲル電気泳動分析を示し、品質管理のためにストレプトアビジン官能化ビーズを用いた。結合したオリゴヌクレオチドは、蛍光顕微鏡法を用いて可視化することができる内部Ｃｙ５色素を含んだ。 図１４Ｂは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いた固相ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の変性ゲル電気泳動分析を示す。（ｎ＋１）、（ｎ＋２）および（ｎ＋３）について１つずつ別々の反応容器中のビーズ上で合成を行った。合成された配列は、（ｎ＋３）の例においては＋ＡＣＵであった。伸長反応は３７℃で１分間にわたり、脱ブロック反応は５０℃で１０分間にわたり行った。伸長と脱ブロックとの間に、ビーズを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄した。
図１５Ａは、酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のための再使用可能な固相支持系の作製および使用のための例示的なスキームを表す。簡単に述べると、ビーズ、ウェルまたはスライドグラスなどの固体支持体を、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を好ましくは３’末端に含むイニシエーターオリゴヌクレオチドに結合した、適切なリンカーにより共有結合的に誘導体化する。固相酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成を行って、所望される生成物を生成し、次いで、エンドヌクレアーゼＶを、完全なオリゴヌクレオチド（イニシエーター＋生成物）と共にインキュベートさせた。このことにより、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を将来的な合成反応のために再利用されるように固体支持体上に無傷で残したまま、固体支持体からオリゴヌクレオチド生成物が切断されるであろう。所望される場合、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いて、リボイノシン（ｒＩ）を、このヌクレオベースの２’－Ｏ－アリルバージョンを用いて、アンカリングされたイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端に導入することができる。 図１５Ｂは、バルクにおける、およびアミン官能化シリカビーズの表面からの、デオキシイノシン（ｄＩ）を含むイニシエーターＲＮＡオリゴヌクレオチドのエンドヌクレアーゼＶ切断の変性ゲル電気泳動分析を示す。例示的なオリゴヌクレオチドイニシエーター配列、ならびに５’－アミンオリゴヌクレオチドをアミンシリカビーズの表面に共有結合によりアンカリングするために用いられた二重ＮＨＳ－ＰＥＧリンカーを示す。エンドヌクレアーゼＶ切断は、適切なバッファーを用いて、１時間にわたり３７℃で行い、すぐに変性ゲルに流した。 図１５Ｃは、新たな切断されていない固相支持体およびエンドヌクレアーゼＶにより切断された固相支持体上で、それぞれ、可逆性ターミネーター２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰおよびｒＮＴＰの混合物を用いた、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより制御された、およびこれにより制御されていない伸長の、変性ゲル電気泳動分析を示す。伸長反応に、１ｍＭのヌクレオチドまたはヌクレオチド混合物を補充し、１５分間にわたり３７℃でインキュベートした。エンドヌクレアーゼＶ切断の前に、ビーズを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄した。エンドヌクレアーゼＶ切断は、適切なバッファーを用いて、１時間にわたり３７℃で行い、すぐに変性ゲルに流した。 図１５Ｄは、共有結合したエンドヌクレアーゼＶ切断可能なイニシエーターオリゴヌクレオチドを２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸と共に用いた、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより制御された（ｎ＋２）生成物の合成の変性ゲル電気泳動分析を示す。伸長反応に、１ｍＭのヌクレオチドを補充し、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。脱ブロック反応は、５０℃で１０分間にわたり行った。ビーズを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄した。エンドヌクレアーゼＶ切断は、適切なバッファーを用いて、１時間にわたり３７℃で行い、すぐに変性ゲルに流した。（ｎ＋２）まで伸長され、エンドヌクレアーゼＶの存在下においてインキュベートしたが、アンカリングされたＣｙ５イニシエーターオリゴヌクレオチドを含まなかった対照反応は、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を含まなかった。このことは、オリゴヌクレオチドがエンドヌクレアーゼＶ切断の間には剥がれ落ちなかった（leech）ことを示すために用いられた。Ｃｙ５イニシエーターオリゴヌクレオチドを有するビーズは、各々の合成サイクルの後で目視により青色であり続ける。
図１６Ａは、イニシエーターオリゴヌクレオチドで誘導体化されたシリカまたは磁気ビーズなどの固相支持体を用いて、４×オリゴヌクレオチドを同時に大規模な反応スケールにおいて合成する能力を有する、プロトタイプの酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチドシンセサイザーを表す。シリンジバレルを、所望されるスケールの合成実行の要件に合致する十分な固体支持体で充填する。固相支持体のローディングの前に、シリンジバレルの底に充填剤を置き、その場で結合させる。この充填剤が、固相支持体をその場に保ちつつ、液体をシリンジバレルから除去することを可能にする。典型的な合成サイクルは、伸長反応、洗浄ステップ、脱ブロック反応、および次いで最終洗浄ステップからなる。このプロセスを、所望されるオリゴヌクレオチドが完成するまで繰り返す。最終生成物を固体支持体から切断するために、各々のシリンジバレルに化学または生物学的切断試薬を添加し、必要な場合にはあらかじめ決定された時間にわたりインキュベートし、溶離し、ろ過により回収する。固相支持体が再使用されるべき場合、例えばエンドヌクレアーゼＶが最終オリゴヌクレオチド生成物を切断するために用いられた場合、それをシリンジバレル中に残して、次の合成の実行のためにプライミングしてもよい。リアクターを加熱するために、シリンジバレルを取り除き、両端に栓をして、所望される時間量にわたりインキュベーター中に置いてもよい。あるいは、加熱したジャケットを、シリンジバレルの周りに置いてもよい。酵素に基づくＲＮＡオリゴヌクレオチド合成に対する主要な利点は、材料（酵素、ヌクレオチドなど）のリサイクルである。 図１６Ｂは、シリンジバレル中の液体を、廃棄回収またはリサイクル回収のいずれかに配向させるために制御することができる二重バルブ系を表す。リサイクルされた構成成分は、直接次のオリゴヌクレオチド合成のサイクルに適用しても、精製して、将来的な合成の実行のために貯蔵してもよい。類似のセットアップおよび合成リアクターを、商業レベルのオリゴヌクレオチド製造に適応するようにスケールアップさせてもよい。
図１７は、可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰの合成のための例示的なスキームを表す。出発材料ヌクレオシドは、天然の塩基（Ｕ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）および／または所望される修飾塩基のいずれかと交換してもよい。三リン酸はまた、アルファリン酸において、ホスホロチオエートと交換してもよい。
図１８Ａ～１８Ｄは、Ｈ３３６変異体が天然のヌクレオチドＧＴＰ－「Ｇ」およびＣＴＰ－「Ｃ」を組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。ブランク反応に、酵素およびヌクレオチドを除く全ての構成成分を補充した。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１８Ａ～１８Ｄは、Ｈ３３６変異体が天然のヌクレオチドＧＴＰ－「Ｇ」およびＣＴＰ－「Ｃ」を組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。ブランク反応に、酵素およびヌクレオチドを除く全ての構成成分を補充した。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１８Ａ～１８Ｄは、Ｈ３３６変異体が天然のヌクレオチドＧＴＰ－「Ｇ」およびＣＴＰ－「Ｃ」を組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。ブランク反応に、酵素およびヌクレオチドを除く全ての構成成分を補充した。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１８Ａ～１８Ｄは、Ｈ３３６変異体が天然のヌクレオチドＧＴＰ－「Ｇ」およびＣＴＰ－「Ｃ」を組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。ブランク反応に、酵素およびヌクレオチドを除く全ての構成成分を補充した。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。
図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ａ、１９Ｄは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＡＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ｂ、１９Ｅは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＵＴＰおよびＩＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ｃ、１９Ｆは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体について、ＣＴＰおよびＧＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ａ、１９Ｄは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＡＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ｂ、１９Ｅは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＵＴＰおよびＩＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。 図１９Ａ～１９Ｆは、野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を示す。図１９Ｃ、１９Ｆは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体について、ＣＴＰおよびＧＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。
図２０は、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、特に位置Ｈ３３６における、２’－メトキシ－アデノシン三リン酸（２’－Ｏ－Ｍｅ－ＡＴＰ）の制御されていない組み込みを示す；単変異体をここで、野生型（ＷＴ）と比較して示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
図２１は、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、特に位置Ｎ１７１における、２’－フルオロ－アデノシン三リン酸（２’－Ｆ－ＡＴＰ）の制御されていない組み込みを示す；単変異体をここで、変異体Ｈ３３６Ｒと比較して示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
図２２は、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、特に位置Ｎ１７１における、３’－メトキシ－アデノシン三リン酸（３’－Ｏ－Ｍｅ－ＡＴＰ）の制御された組み込み（キャッピング）を示す；単変異体をここで、変異体Ｈ３３６Ｒおよび野生型と比較して示す。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。注意：野生型試料は、陽性の組み込みを示すが、厳しい加ピロリン酸分解（pyrophosphorolysis）が起きる。陰性反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
図２３は、多様なS. pombe変異体による可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸（３’－（Ｏ－アリル）－ＡＴＰ）の制御された組み込みを示す。陰性反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
図２４は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ二重変異体Ｈ３３６Ｒ－Ｎ１７１Ａによる可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルカーボネートデオキシアデノシン三リン酸（３’－（Ｏ－アリルカーボネート）－ｄＡＴＰ）の制御された組み込みを示す。ゲルの画像は、様々なインプット量のイニシエーターオリゴヌクレオチド（２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ、５ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）を漸増量の精製酵素ストック（２μＬ、４μＬおよび６μＬ）と共に示す。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
図２５は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ単変異体Ｈ３３６Ｒによる、可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アジドメチルカーボネートデオキシチジミン三リン酸（３’－（Ｏ－アジドメチルカーボネート）－ｄＴＴＰ）の制御された組み込みについての反応較正を示す。反応を、多様な酵素ストック濃度およびヌクレオチド濃度により、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。文字「Ｅ」は、添加された精製酵素ストックの量をμＬにおいて示し、文字「Ｎ」は、伸長反応におけるヌクレオチドの最終濃度をｍＭにおいて示す。対照反応は、ヌクレオチドを例外として、全ての構成成分を含んだ。反応のインキュベーションの後で、試料を、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルにより、変性条件下において分析した。下のバンドは、伸長していない出発材料を示し、上のバンドは、正に伸長したオリゴヌクレオチドを示す。
図２６は、可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸３’－（Ｏ－アリル）－ＡＴＰ）による精製されたポリ（Ｕ）ポリメラーゼストックＨ３３６Ｒの反応較正評価を示す。ゲルは、イニシエーターオリゴヌクレオチドのインプットが漸増する場合の（ｎ＋１）伸長の応答を示す。反応に、１ｍＭの可逆性ターミネーターヌクレオチドおよび１ｕＬの精製酵素ストックを補充する。反応を、５分間にわたり３７℃でインキュベートした。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。これは、反応スケーラビリティの一例である。
図２７は、バルク溶液中の、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒを３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸（３’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ）を有する可逆性ターミネーターと共に用いた、制御された酵素による合成の実証を示す。ここに示されるのは、バルク溶液における（ｎ＋５）合成である。合成後、反応を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
図２８は、酵素による組み込みのための３’－可逆性ターミネーターヌクレオチドの例示的な構造を示す。３’ヒドロキシについての多様な保護基の例。ラベルされるとおり、これらは、酸化還元化学、光、フッ化物アニオンおよび触媒を通して、取り除くことができる。
図２９は、フラニル環が酸素を有する場合の３’保護基の選択を示す。２’は、結合、薬物動態学、薬力学、一般的な安定性およびプローブタグを促進する、天然のリボ、デオキシまたは多様な部分であってよい。
図３０は、架橋されていない、および架橋されたヌクレオシド三リン酸の両方について不可逆性（キャッピング）ターミネーターおよびエステラーゼ感受性ターミネーターである、さらなる３’－保護基の例を示す。架橋されていない場合において、２’－は、結合、薬物動態学、薬力学、一般的な安定性およびプローブタグを促進する、天然のリボ、デオキシまたは多様な部分であってよい。これらの３’－保護基を、アミノ酸、オリゴヌクレオチド、または合成されたオリゴヌクレオチドの３’末端のさらなる官能性を付与し得、任意の脱保護方法に対して感受性でない場合には最終的な不可逆性キャップとして用いることができる、大きな化学的ドメインなどの他の重要な部分により、さらに誘導体化することができる。
図３１は、ヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを示し、ここで、２’は、天然のＯＨ、または－Ｆ、－ＯＭｅ、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３もしくは標的オリゴの生物学的活性のために有益であるか、科学のより広範な影響に寄与することが証明されている他のものなどの、多様な修飾であってよい。
図３２は、ロックド（locked）ヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを示す。
図３３は、ヌクレオチド三リン酸のための３’アリルエーテルの調製のための例示的なスキームを示し、ここで、２’は、天然のＯＨ、またはＦ、ＯＭｅ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または標的オリゴの生物学的活性のために有益であるか、もしくは他の適用に寄与することが判明している他のものなどの多様な修飾であってよい。
図３４は、ロックドヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを示す。
ある態様の詳細な説明
本明細書において提供されるのは、酵素触媒を用いるＲＮＡオリゴヌクレオチドのデノボ合成のための方法である。例えば、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、ここで、ターミナルトランスフェラーゼ酵素（例えば、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）は、１つ以上のヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオチド上に組み込む。例えば、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを調製するための方法であって、ここで、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、ターミナルトランスフェラーゼを介して、１つ以上の修飾ヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオチド上に組み込む。
一側面において、本明細書において提供されるのは、方法であって、ここで、修飾ヌクレオチド（すなわち、２’－または３’－修飾可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチド）が組み込まれ、これは、ポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）の伸長されたイニシエーターオリゴヌクレオチドに対する結合アフィニティーを可逆的に変化させ、それにより（ｎ＋１）伸長されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成し、これは、脱保護されてさらに伸長されることができる。
別の側面において、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のための方法であって、ここで非加水分解性ヌクレオチドは、ポリメラーゼ（例えば、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）が加水分解性ヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオチド上に組み込む速度を制御するために用いられる。
別の側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において記載されるポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、野生型、または本明細書において記載される変異したポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）を用いて、２つのオリゴヌクレオチドをライゲーションして、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じる方法である。
加えて、これらの方法により生成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、逆転写（ＲＴ）を受けて、相補的ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を生じることができ、これは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼにより増幅可能である。また、本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される任意の方法により生成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＤＮＡオリゴヌクレオチドである。
また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用である修飾ヌクレオチド、ならびに本明細書において記載される方法において有用であるポリ（Ｎ）ポリメラーゼ酵素（例えば、変異体ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）である。
また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載されるポリ（Ｎ）ポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドを含む、組成物およびキットである。別の側面において、本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法を実施するための、反応混合物および系である。
ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成
本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、ここで、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ターミナルトランスフェラーゼ（例えば、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）を介して、１つ以上の修飾ヌクレオチドをイニシエーターオリゴヌクレオチド上に組み込む。ある態様において、本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｎ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、および１つ以上の修飾ヌクレオチドを組み合わせること；
を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。したがって、ある態様において、本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および１つ以上の修飾ヌクレオチドを組み合わせること；
を含む。
１つ以上の修飾ヌクレオチドがイニシエーターオリゴヌクレオチドに付加されたら、１つ以上のさらなるヌクレオチド（修飾されているかまたは修飾されていない）を、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するために、その後に付加することができる。したがって、ある態様において、方法は、さらに、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド）の３’末端に、１つ以上の天然のまたは修飾されたヌクレオチドを付加することを含む。ある態様において、１つ以上のさらなる修飾ヌクレオチドが付加される。ある態様において、方法は、
（ｄ）所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
をさらに含む。
ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ
本明細書において記載されるとおり、１つ以上のヌクレオチドを組み込む酵素は、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼである。本明細書において提供されるのは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、例えば変異体（すなわち変異した）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼであって、本明細書において記載される方法において有用であるものである。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ポリ（Ｃ）ポリメラーゼ、またはポリ（Ｇ）ポリメラーゼである。ＲＮＡポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼ、またはその変異体（すなわち変異したもの）、バリアントもしくはホモログであってよい。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、野生型ポリメラーゼである。ある態様において、ポリメラーゼは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼの変異体である。ある態様において、ポリメラーゼは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼのバリアントである。ある態様において、変異体またはバリアントは、野生型ポリメラーゼに対して約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリメラーゼは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼのホモログである。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの変異体である。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼのバリアントである。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼのホモログである。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ａ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ａ）ポリメラーゼは、野生型Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、野生型Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼの変異体である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼのバリアントである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼのホモログである。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体
本明細書において記載されるとおり、ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼの変異体（すなわち、変異したポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２から選択される１つ以上の位置において変異を含む、Schizosaccharomyces pombeポリ（Ｕ）（S. pombeのポリ（ｕ））ポリメラーゼである。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６変異（すなわち、ここで、位置３３６におけるアミノ酸Ｈが別のアミノ酸で置き換えられている）を含む、Schizosaccharomyces pombeポリ（Ｕ）（S. pombeのポリ（ｕ））ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択される１つのＨ３３６変異を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６Ｒ変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６Ｒ変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、１つの変異：Ｈ３３６Ｒを含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｎ１７１変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｎ１７１変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、１つのＮ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｎ１７１Ａ変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｎ１７１Ａ変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、１つの変異：Ｎ１７１Ａを含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｎ１７１Ｔ変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｎ１７１Ｔ変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、１つの変異：Ｎ１７１Ｔを含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｔ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｔ１７２変異は、唯一の変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、１つのＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６およびＮ１７１変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＮ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６およびＮ１７１変異は、ただ２つの変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択される１つのＨ３３６変異；ならびにＮ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択される１つのＮ１７１変異を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異は、ただ２つ変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、２つの変異：Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａを含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異は、ただ２つの変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、２つの変異：Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔを含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６およびＴ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６およびＴ１７２変異は、ただ２つの変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択される１つのＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む。ある態様において、Ｈ３３６変異は、Ｈ３３６Ｒである。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、S. pombeのポリ（ｕ）ポリメラーゼである。ある態様において、Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２変異は、ただ３つの変異である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、１つ以上の付加変異を含み、配列番号３に対して、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択される１つのＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択される１つのＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択される１つのＴ１７２変異を含む。ある態様において、Ｈ３３６変異は、Ｈ３３６Ｒである。ある態様において、Ｎ１７１変異は、Ｎ１７１ＡまたはＮ１７１Ｔである。
修飾ＲＮＡヌクレオチド
本明細書において記載されるとおり、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するために、１つ以上の修飾ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド中に組み込むことができる。修飾ヌクレオチドは、カスタムのＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドを調製するために、組み込むことができる。他の態様において、修飾ヌクレオチドは、その後のヌクレオチドの組み込みをブロックするために組み込むことができる（すなわち、本明細書において記載されるような「可逆性ターミネーター」の使用を介して）。本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において、ならびに他の適用（例えば、化学的オリゴヌクレオチド合成、治療的適用など）において有用である修飾ヌクレオチドである。
「修飾ヌクレオチド」は、１つ以上の非天然の修飾を含む、ヌクレオチドモノマー（例えば、リボース糖、リン酸基およびヌクレオベースを含む）である。ある態様において、例えば、修飾ヌクレオチドは、天然に存在するＲＮＡまたはＤＮＡヌクレオチド（すなわち、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ））の構造的等価物であるが、１つ以上の非天然の修飾を含む。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチドの等価物であって、ここで、１つ以上の位置が置換されているか、またはここで、１つ以上の置換基または基が、取り除かれているかもしくは置き換えられている。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、修飾糖、修飾塩基、修飾リン酸、またはこれらに任意の組み合わせを含む。「修飾ヌクレオチド」は、本明細書において記載される２’－および３’－可逆性ターミネーターヌクレオチドを含む。
以下の式は、ヌクレオチド上の可能な修飾部位を示すことを意図される。他の修飾は、企図される。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、以下の式：
Figure 2022504712000004
 のもの、またはその塩であって、式中：
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド塩基であり；および
ＲおよびＲ’は、独立して、水素または天然もしくは非天然の糖置換基である。
ある態様において、修飾ヌクレオチドは、以下の式：
Figure 2022504712000005
 のもの、またはその塩であって、式中：
Ｘは、ＯまたはＳであり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド塩基であり；および
ＲおよびＲ’は、独立して、水素または天然もしくは非天然の糖置換基である。
ある態様において、Ｙは、Ｏである。ある態様において、ＹはＳである。ある態様において、ＸはＯである。ある態様において、ＸはＳである。
ある態様において、修飾ヌクレオチドは、塩基修飾ヌクレオチドである。「塩基修飾」とは、Ｇ、Ｕ、ＡまたはＣ塩基が、置換されているかまたは修飾されている、あるいは、Ｇ、Ｕ、ＡまたはＣ塩基が、異なる基（例えば、ヒポキサンチン）により置き換えられているヌクレオチドを包含する。
修飾塩基の非限定的な例として、これらに限定されないが、５－メチルシトシン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン、５－アルキルウリジン、５－ハロウリジン、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン、プロピン、キューオシン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、４－アセチルチジン（acetyltidine）、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、３－メチルシチジン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、およびスレオニン誘導体が挙げられる。
他の非限定的な塩基の例として、これらに限定されないが、天然または非天然のピリミジンまたはプリンが挙げられ；これらに限定されないが、Ｎ１－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、８’－アジド－アデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－アデノシン、アミノアリル－アデノシン、５’－メチル－ウリジン、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５’－ヒドロキシ－メチル－ウリジン、２’－チオ－ウリジン、４’－チオ－ウリジン、ヒポキサンチン、キサンチン、５’－メチル－シチジン、５’－ヒドロキシ－メチル－シチジン、６’－チオ－グアニン、およびＮ７－メチル－グアニンが挙げられ得る。
ある態様において、塩基修飾ヌクレオチドは、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン－５’－三リン酸、Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸、８’－アジドアデノシン－５’－三リン酸、イノシン５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、６－チオグアノシン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、およびキサントシン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
ある態様において、修飾ヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドである。「糖修飾」ヌクレオチドとは、リボースもしくはデオキシリボース部分が置換されているか、またはリボースもしくはデオキシリボースが、異なる糖部分により置き換えられているヌクレオチドを包含する。ある態様において、リボースまたはデオキシリボースは、１’、２’、３’、４’および／または５’位において修飾されている（例えば置換されている）。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、２’位において修飾されている。いくつかの態様において、ヌクレオチドは、３’位において修飾されている。
ある態様において、糖の２’および／または３’位は、天然または非天然の「糖置換基」ＲまたはＲ’で置換されている。ある態様において、ＲおよびＲ’は、独立して、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールからなる群より選択される。
ある態様において、Ｒおよび／またはＲ’は、独立して、－ＯＲＰであって、ここで、ＲＰの各々の場合は、独立して、酸素保護基、任意置換アシルまたはアミノ酸である。ある態様において、Ｒおよび／またはＲ’は、生体共役のための反応性部分（例えば、クリックケミストリーのハンドル、例えば、アジドもしくはアルキン）、フルオロフォア、触媒性タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはレポートタグを含む。
いくつかの態様において、糖、例えばリボースの２’位は、ハロゲン、例えば、フッ素基；アルキル基、例えば、メチルまたはエチル基；メトキシ基；アミノ基；チオ基；アミノプロピル基；ジメチルアミノエチル；ジメチルアミノプロピル基；ジメチルアミノエチルオキシエチル基；アジド基；シリル基；環状アルキル基；またはＮ－メチルアセタミド基で修飾されていてもよい。
ある態様において、糖、例えばリボースの２’位は、ヒドロキシル（－ＯＨ）、水素（－Ｈ）、フルオロ（－Ｆ）、アミン（－ＮＨ３）、アジド（－Ｎ３）、チオール（－ＳＨ）、メトキシ（－ＯＣＨ３）、またはメトキシエタノール（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）で修飾されている。
ある態様において、２’位はまた、酸化還元活性、蛍光発生性または内因的に蛍光性の部分、天然および非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖またはオリゴ糖、機能的／リガンド結合性グリカン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーまたは大分子で置換されていてもよい。
いくつかの態様において、糖、例えばリボースの３’位は、ハロゲン、例えば、フッ素基；アルキル基、例えば、メチルまたはエチル基；メトキシ基；アミノ基；チオ基；アミノプロピル基；ジメチルアミノエチル；ジメチルアミノプロピル基；ジメチルアミノエチルオキシエチル基；アジド基；シリル基；環状アルキル基；またはＮ－メチルアセタミド基で修飾されていてもよい。
ある態様において、糖、例えばリボースの３’位は、ヒドロキシル（－ＯＨ）、水素（－Ｈ）、フルオロ（－Ｆ）、アミン（－ＮＨ３）、アジド（－Ｎ３）、チオール（－ＳＨ）、メトキシ（－ＯＣＨ３）、またはメトキシエタノール（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）で修飾される。
ある態様において、３’位はまた、酸化還元活性、蛍光発生性または内因的に蛍光性の部分、天然および非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖またはオリゴ糖、機能的／リガンド結合性グリカン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーまたは大分子で置換されていてもよい。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－位において修飾される。例えば、ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｆ、２’－Ｏ－アルキル、２’－アミノ、または２’－アジド修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、および２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチドである。ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸、および２’－Ｏ－メチルイノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－アミノ修飾ヌクレオチドである。ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、および２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－Ｏ－アジド修飾ヌクレオチドである。ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、および２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
ある態様において、修飾ヌクレオシド三リン酸は、不可逆性ターミネーター、別名キャッピングヌクレオチド、例えば、３’－Ｏ－メチル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－メチル－ｄＮＴＰ、３’－アジド－ｄＮＴＰ、３’－アジド－ＮＴＰ、３’－アミン－ｄＮＴＰ、３’－アミン－ＮＴＰ、などである。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、２’－修飾可逆性ターミネーターＲＮＡヌクレオチド（例えば、２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）である。２’－修飾可逆性ターミネーターヌクレオチドは、本明細書において記載される。ある態様において、２’－修飾可逆性ターミネーターヌクレオチドはまた、修飾塩基部分を含む。
ある態様において、糖修飾ヌクレオチドは、３’－修飾可逆性ターミネーターＲＮＡヌクレオチド（例えば、３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）である。３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、本明細書において記載される。ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドはまた、修飾塩基部分を含む。
糖への他の修飾は、企図される。これらの修飾として、これらに限定されないが、, 環の酸素を硫黄で置き換えることが挙げられる。ある態様において、２’－炭素と４’－炭素との間に架橋を導入する（例えば、環の立体構造を限定するために）。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドは、架橋されたヌクレオチド、例えば、ロックド核酸（locked nucleic acid：ＬＮＡ）；拘束エチルヌクレオチド（constrained ethyl nucleotide：ｃＥｔ）、またはエチレン架橋核酸（ethylene bridged nucleic acid：ＥＮＡ）ヌクレオチドである。
いくつかの態様において、ヌクレオチド、例えばヌクレオチドは、修飾されたリン酸基、例えばホスホロチオエートを含んでもよい。修飾されたリン酸基の非限定的な例として、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、アルキル、ヘテロ環式環、アミド、モルホリノ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、および他の既知のリン含有基が挙げられる。ある態様において、修飾は、三リン酸のアルファ（α）ホスフェートである。ある態様において、ヌクレオチドは、（α）チオホスフェートである。ある態様において、修飾は、三リン酸のベータ（β）および／またはガンマ（γ）チオホスフェートへのものである。
ある態様において、各々の反復組み込みイベントの成功を検証し、それによりいくつかの態様において実質的にエラーフリーなＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成するために、フルオロフォアにより修飾されたヌクレオチドを用いることができる。ある態様において、修飾ヌクレオチドは、フルオロフォアを含む。
修飾ヌクレオチドは、１つより多くの修飾を含んでもよい。例えば、修飾ヌクレオチドは、塩基修飾および糖修飾を含んでもよい。
可逆性ターミネーターによるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成
また本明細書において提供されるのは、可逆性ターミネーターヌクレオチドを用いてＮＡオリゴヌクレオチドを合成する方法である。「可逆性ターミネーターヌクレオチド」は、２’および／または３’－位において、取り除くことができる非天然の化学部分を含むヌクレオチドである。イニシエーターオリゴヌクレオチドへの可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加の後で、２’および／または３’－位の非天然の化学部分は、例えばポリメラーゼへのオリゴヌクレオチドの結合を妨害することにより、第２のヌクレオチドの組み込みをブロックする。非天然の化学部分２’および／または３’－位は、次いで取り除かれ、さらなるヌクレオチドの付加に対してオープンなまま残す。ある態様において、方法は、１回に１つのヌクレオチドの制御された付加を可能にし、これはまた、「（ｎ＋１）」付加としても言及される。ある態様において、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’および／または３’－ヒドロキシル基において保護されている（すなわち、“２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド」）。
本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｎ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、および可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み合わせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを、可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された位置（例えば、２’および／または３’位)において脱保護すること；ならびに
（ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと。
を含む。
ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み合わせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された２’および／または３’－Ｏ－位において脱保護すること；
（ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
を含む。
本明細書において記載されるとおり、２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドもまた、用いることができる。ある態様において、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み合わせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを、２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された２’－Ｏ－位において脱保護すること；
（ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
を含む。
本明細書において記載されるとおり、３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドもまた、用いることができる。本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み合わせること；
（ｄ）ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを、３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された３’－Ｏ－位において脱保護すること；
（ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
を含む。
本明細書において記載される任意のポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、上記の可逆性ターミネーターの方法において用いることができる。ある態様において、本明細書において記載される変異体ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み込むために用いられる。ある態様において、本明細書において記載される変異体ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、本明細書において記載される３’－可逆性ターミネーターヌクレオチドを組み込むために用いられる。
任意の特定の配列のＲＮＡオリゴヌクレオチドは、本明細書において記載される方法を用いて合成することができる。
可逆性ターミネーターＲＮＡヌクレオチド
本明細書において記載される方法のうちのいくつかは、可逆性ターミネーターＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用する。「可逆性ターミネーターヌクレオチド」とは、２’および／または３’－位において非天然の化学部分を含む修飾ヌクレオチドであって、取り除くことができるものである。ある態様において、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’－Ｏ－および／または３’－Ｏ－位において、酸素保護基により保護されている。また本明細書において提供されるのは、新たな可逆性ターミネーターヌクレオチド（例えば、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドおよび３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチド）である。
ある態様において、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’－Ｏ－位において、酸素保護基により保護されている（「２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド」）。ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ－位において酸素保護基により保護されている（「３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド」）。
例えば、ある態様において、可逆性ターミネーターヌクレオチド（すなわち、２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）は、以下の式：
Figure 2022504712000006
 のもの、またはその塩であって、式中：
ＲＰの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲＰは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲＰは、酸素保護基任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド（例えば、修飾された）塩基である。ヌクレオチドの他の部分は、上および本明細書において記載されるように修飾されていてもよい。
例えば、ある態様において、可逆性ターミネーターヌクレオチド（すなわち、２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）は、以下の式：
Figure 2022504712000007
 のもの、またはその塩であって、式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
ＲＰの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲＰは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲＰは、酸素保護基任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド（例えば、修飾された）塩基である。
ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチド（すなわち、３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）は、以下の式：
Figure 2022504712000008
 のもの、またはその塩であって、式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
ＲＰは、酸素保護基であり；
Ｒは、水素、または本明細書において記載される天然または非天然の糖置換基であり；および
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド（例えば、修飾された）塩基である。
任意に、ある態様において、連結基は、２’炭素を４’炭素に（例えば、基Ｒ’を通して）連結する。
ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドまたは架橋ヌクレオチドである。ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチド（すなわち、３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチド）は、以下の式：
Figure 2022504712000009
 のもの、またはその塩であって、式中：
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；
ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；
Ｒは、水素、または本明細書において記載される天然または非天然の糖置換基であり；および
「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、天然または非天然のヌクレオチド（例えば、修飾された）塩基である。
ある態様において、Ｙは、Ｏである。ある態様において、Ｙは、Ｓである。ある態様において、Ｘは、Ｏである。ある態様において、Ｘは、Ｓである。
本明細書において記載されるとおり、「塩基」（本明細書においてまた「Ｂ」）は、任意の天然に存在するかまたは天然に存在しないヌクレオベースであってよい。天然に存在する塩基として、Ｇ、Ｕ、ＡおよびＣが挙げられる。非天然の（例えば、修飾された）塩基として、置換されているかまたは修飾されているＧ、Ｕ、ＡおよびＣのバリアントが挙げられる。修飾された塩基の非限定的な例として、これらに限定されないが、５－メチルシトシン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン、５－アルキルウリジン、５－ハロウリジン、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン、プロピン、キューオシン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、４－アセチルチジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、３－メチルシチジン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、およびスレオニン誘導体が挙げられる。
他の非限定的な塩基の例として、これらに限定されないが、天然または非天然のピリミジンまたはプリンが挙げられ；これらに限定されないが、Ｎ１－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、８’－アジド－アデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－アデノシン、アミノアリル－アデノシン、５’－メチル－ウリジン、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５’－ヒドロキシ－メチル－ウリジン、２’－チオ－ウリジン、４’－チオ－ウリジン、ヒポキサンチン、キサンチン、５’－メチル－シチジン、５’－ヒドロキシ－メチル－シチジン、６’－チオ－グアニン、およびＮ７－メチル－グアニンが挙げられ得る。
ある態様において、ヌクレオチド糖は、天然または非天然の「糖置換基」Ｒで置換されている。ある態様において、Ｒは、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールである。ある態様において、Ｒは、水素である。ある態様において、Ｒは、ハロゲンである。ある態様において、Ｒは、－ＣＮである。ある態様において、Ｒは、－ＮＯ２である。ある態様において、Ｒは、－Ｎ３である。ある態様において、Ｒは、任意置換アルキルである。ある態様において、Ｒは、任意置換アルケニルである。ある態様において、Ｒは、任意置換アルキニルである。ある態様において、Ｒは、任意置換アリールである。ある態様において、Ｒは、任意置換ヘテロアリール。ある態様において、Ｒは、任意置換カルボシクリルである。ある態様において、Ｒは、任意置換ヘテロシクリルである。ある態様において、Ｒは、任意置換アシルである。ある態様において、Ｒは、任意置換ヒドロキシルである。ある態様において、Ｒは、任意置換アミノである。ある態様において、Ｒは、任意置換チオールである。
ある態様において、Ｒは、－ＯＲＰであって、ここで、ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシルまたはアミノ酸である。
ある態様において、Ｒは、生体共役のための反応性部分（例えば、クリックケミストリーのハンドル、例えば、アジドもしくはアルキン）、フルオロフォア、触媒性タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはレポートタグを含む。
いくつかの態様において、Ｒは、ハロゲン、例えば、フッ素基；アルキル基、例えば、メチルまたはエチル基；メトキシ基；アミノ基；チオ基；アミノプロピル基；ジメチルアミノエチル；ジメチルアミノプロピル基；ジメチルアミノエチルオキシエチル基；アジド基；シリル基；環状アルキル基；またはＮ－メチルアセタミド基である。
ある態様において、Ｒは、ヒドロキシル（－ＯＨ）、水素（－Ｈ）、フルオロ（－Ｆ）、アミン
（－ＮＨ３）、アジド（－Ｎ３）、チオール（－ＳＨ）、メトキシ（－ＯＣＨ３）、またはメトキシエタノール（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）である。
ある態様において、Ｒは、酸化還元活性、蛍光発生性または内因的に蛍光性の部分、天然および非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖またはオリゴ糖、機能的／リガンド結合性グリカン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマーまたは大分子を含む。
本明細書において定義されるとおり、各々のＲＰは、独立して、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸である。ある態様において、ＲＰは、酸素保護基である。ある態様において、ＲＰは、任意置換アシルである。ある態様において、ＲＰは、アミノ酸である。ある態様において、ＲＰは、エステラーゼにより切断することができる酸素保護基、任意置換アシルまたはアミノ酸である。
ある態様において、可逆性ターミネーターヌクレオチドは、光化学的条件下において、脱保護することができる。したがって、可逆性ターミネーターＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ある態様において、２’－Ｏ－および／または３’－Ｏ－位において、感光性酸素保護基により保護されている。ある態様において、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’－Ｏ位において、感光性保護基により保護されている。ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ位において、感光性保護基により保護されている。
ある態様において、２’－または３’－Ｏ－保護基（例えば、ＲＰ）は、以下の式：
Figure 2022504712000010
 のうちの１つのものである。
ある態様において、２’－または３’－Ｏ－保護基（例えば、ＲＰ）は、以下の式：
Figure 2022504712000011
 のうちの１つのものである。
ある態様において、２’－または３’－Ｏ－保護基（例えば、ＲＰ）は、以下の式：
Figure 2022504712000012
 のうちの１つのものである。
ある態様において、２’－または３’－Ｏ－保護基（例えば、ＲＰ）は、以下の式：
Figure 2022504712000013
 のものである。
ある態様において、２’－または３’－Ｏ－保護基（例えば、ＲＰ）は、以下の式：
Figure 2022504712000014
 のアミノ酸である。
ある態様において、ＲＰの各々の場合は、独立して、アルキル、シリル、アリル、アジドメチル、ベンジル、クマリニル、またはカーボネートである。
ある態様において、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－シリル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－アジドメチル、２’－Ｏ－ベンジル、２’－Ｏ－クマリニル、または２’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである。ある態様において、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、２’－Ｏ－アリルオキシカルボニルおよび２’－Ｏ－（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）メチルオキシカルボニルから選択される２’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、２’－Ｏ－保護された可逆性ターミネーターは、２’－Ｏ－アリル－ＮＴＰまたは２’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰである。
ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ－アルキル、３’－Ｏ－シリル、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ベンジル、３’－Ｏ－クマリニル、または３’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである。ある態様において、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドは、３’－Ｏ－アリルオキシカルボニルおよび３’－Ｏ－（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）メチルオキシカルボニルから選択される３’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである。
ある態様において、３’－Ｏ－保護された可逆性ターミネーターは、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ｄＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ＮＴＰ、または３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ｄＮＴＰである。
ある態様において、３’－Ｏ－保護された可逆性ターミネーターは、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ、３’－（Ｏ－アリル－カーボネート）－ｄＮＴＰ（例えば、３’－（Ｏ－アリル－カーボネート）－ｄＡＴＰ、など）、３’－（Ｏ－アジドメチルカーボネート）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－アセテート）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－アシルアミノ酸）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－３－メチルクマリン）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－（４－メチルクマリンカーボネート）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－（２－ニトロベンジル）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－（２－ニトロベンジルカーボネート）－ｄＮＴＰ、３’－（Ｏ－ＴＭＳ）－ｄＮＴＰ、または３’－（Ｏ－Ｔｅｏｃ）－ｄＮＴＰである。
３’－保護ヌクレオチドの態様を含む可逆性ターミネーターヌクレオチドの他のある態様を、図２８～３４において示す。
本明細書において記載されるとおり、可逆性ターミネーターオリゴヌクレオチドは、酸素保護基（例えば、ＲＰ基）により保護されていてもよい。酸素保護基は、当該分野において周知であり、本明細書において参考として援用されるProtecting Groups in Organic Synthesis、T. W. GreeneおよびP. G. M. Wuts、第３版、John Wiley & Sons（1999年）において詳細に記載されるものを含む。例示的な酸素保護基として、これらに限定されないが、以下が挙げられる：メチル、メトキシルメチル（ＭＯＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、ｔ－ブチルチオメチル、（フェニルジメチルシリル）メトキシメチル（ＳＭＯＭ）、ベンジルオキシメチル（ＢＯＭ）、ｐ－メトキシベンジルオキシメチル（ＰＭＢＭ）、（４－メトキシフェノキシ）メチル（ｐ－ＡＯＭ）、グアヤコールメチル（ＧＵＭ）、ｔ－ブトキシメチル、４－ペンテニルオキシメチル（ＰＯＭ）、シロキシメチル、２－メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２，２，２－トリクロロエトキシメチル、ビス（２－クロロエトキシ）メチル、２－（トリメチルシリル）エトキシメチル（ＳＥＭＯＲ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、３－ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、１－メトキシシクロヘキシル、４－メトキシテトラヒドロピラニル（ＭＴＨＰ）、４－メトキシテトラヒドロチオピラニル、４－メトキシテトラヒドロチオピラニルＳ，Ｓ－ジオキシド、１－［（２－クロロ－４－メチル）フェニル］－４－メトキシピペリジン－４－イル（ＣＴＭＰ）、１，４－ジオキサン－２－イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、２，３，３ａ，４，５，６，７，７ａ－オクタヒドロ－７，８，８－トリメチル－４，７－メタノベンゾフラン－２－イル、１－エトキシエチル、１－（２－クロロエトキシ）エチル、１－メチル－１－メトキシエチル、１－メチル－１－ベンジルオキシエチル、１－メチル－１－ベンジルオキシ－２－フルオロエチル、２，２，２－トリクロロエチル、２－トリメチルシリルエチル、２－（フェニルセレニル）エチル、ｔ－ブチル、アリル、ｐ－クロロフェニル、ｐ－メトキシフェニル、２，４－ジニトロフェニル、ベンジル（Ｂｎ）、ｐ－メトキシベンジル、３，４－ジメトキシベンジル、ｏ－ニトロベンジル、ｐ－ニトロベンジル、ｐ－ハロベンジル、２，６－ジクロロベンジル、ｐ－シアノベンジル、ｐ－フェニルベンジル、２－ピコリル、４－ピコリル、３－メチル－２－ピコリルＮ－オキシド、ジフェニルメチル、ｐ，ｐ’－ジニトロベンズヒドリル、５－ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α－ナフチルジフェニルメチル、ｐ－メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ（ｐ－メトキシフェニル）フェニルメチル、トリ（ｐ－メトキシフェニル）メチル、４－（４’－ブロモフェナシルオキシフェニル）ジフェニルメチル、４，４’，４’’－トリス（４，５－ジクロロフタルイミドフェニル）メチル、４，４’，４’’－トリス（レブリノイルオキシフェニル）メチル、４，４’，４’’－トリス（ベンゾイルオキシフェニル）メチル、３－（イミダゾール－１－イル）ビス（４’，４’’－ジメトキシフェニル）メチル、１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－１’－ピレニルメチル、９－アントリル、９－（９－フェニル）キサンテニル、９－（９－フェニル－１０－オキソ）アントリル、１，３－ベンゾジチオラン－２－イル、ベンズイソチアゾリルＳ，Ｓ－ジオキシド、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、ジメチルイソプロピルシリル（ＩＰＤＭＳ）、ジエチルイソプロピルシリル（ＤＥＩＰＳ）、ジメチルテキシルシリル、ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリベンジルシリル、トリ－ｐ－キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル（ＤＰＭＳ）、ｔ－ブチルメトキシフェニルシリル（ＴＢＭＰＳ）、ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ－クロロフェノキシアセテート、３－フェニルプロピオネート、４－オキソペンタノエート（レブリネート）、４，４－（エチレンジチオ）ペンタノエート（レブリノイルジチオアセタール）、ピバロエート、アダマントエート、クロトネート、４－メトキシクロトネート、ベンゾエート、ｐ－フェニルベンゾエート、２，４，６－トリメチルベンゾエート（メシトエート（mesitoate））、メチルカーボネート、９－フルオレニルメチルカーボネート（Ｆｍｏｃ）、エチルカーボネート、２，２，２－トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２－（トリメチルシリル）エチルカーボネート（ＴＭＳＥＣ）、２－（フェニルスルホニル） エチルカーボネート（Ｐｓｅｃ）、２－（トリフェニルホスホニオ）エチルカーボネート（Ｐｅｏｃ）、イソブチルカーボネート、ビニルカーボネート、アリルカーボネート、ｔ－ブチルカーボネート（ＢＯＣまたはＢｏｃ）、ｐ－ニトロフェニルカーボネート、ベンジルカーボネート、ｐ－メトキシベンジルカーボネート、３，４－ジメトキシベンジルカーボネート、ｏ－ニトロベンジルカーボネート、ｐ－ニトロベンジルカーボネート、Ｓ－ベンジルチオカーボネート、４－エトキシ－１－ナフチルカーボネート、メチルジチオカーボネート、２－ヨードベンゾエート、４－アジドブチレート、４－ニトロ－４－メチルペンタノエート、ｏ－（ジブロモメチル）ベンゾエート、２－ホルミルベンゼンスルホネート、２－（メチルチオメトキシ）エチル、４－（メチルチオメトキシ）ブチレート、２－（メチルチオメトキシメチル）ベンゾエート、２，６－ジクロロ－４－メチルフェノキシアセテート、２，６－ジクロロ－４－（１，１，３，３－テトラメチルブチル）フェノキシアセテート、２，４－ビス（１，１－ジメチルプロピル）フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、イソブチレート、モノサクシネート、（Ｅ）－２－メチル－２－ブテノエート、ｏ－（メトキシアシル）ベンゾエート、α－ナフトエート、ナイトレート、アルキルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルホスホロジアミデート、アルキルＮ－フェニルカルバメート、ボレート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル２，４－ジニトロフェニルスルフェネート、スルフェート、メタンスルホネート（mesylate）、ベンジルスルホネート、およびトシレート（Ｔｓ）。ある態様において、酸素保護基は、シリルである。ある態様において、酸素保護基は、ｔ－ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、ｔ－ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリイソプロピルシリル（ＴＩＰＳ）、トリフェニルシリル（ＴＰＳ）、トリエチルシリル（ＴＥＳ）、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、トリイソプロピルシロキシメチル（ＴＯＭ）、アセチル （Ａｃ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、アリルカーボネート、２，２，２－トリクロロエチルカーボネート（Ｔｒｏｃ）、２－トリメチルシリルエチルカーボネート、メトキシメチル（ＭＯＭ）、１－エトキシエチル（ＥＥ）、２－メチルオキシ－２－プロピル（ＭＯＰ）、２，２，２－トリクロロエトキシエチル、２－メトキシエトキシメチル（ＭＥＭ）、２－トリメチルシリルエトキシメチル（ＳＥＭ）、メチルチオメチル（ＭＴＭ）、テトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）、テトラヒドロフラニル（ＴＨＦ）、ｐ－メトキシフェニル（ＰＭＰ）、トリフェニルメチル（Ｔｒ）、メトキシトリチル（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、アリル、ｐ－メトキシベンジル（ＰＭＢ）、ｔ－ブチル、ベンジル（Ｂｎ）、アリル、またはピバロイル（Ｐｉｖ）である。
ある態様において、３’－可逆性ターミネーターは、３’－Ｏ－アミノ酸（例えば、任意の標準的または非標準的アミノ酸を含む）である。ある態様において、アミノ酸は、エステラーゼを用いて取り除くことができる。
本明細書において一般的に定義されるとおり、Ｒ’’は、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールである。ある態様において、Ｒ’’は、水素である。ある態様において、Ｒ’’は、ハロゲンである。ある態様において、Ｒ’’は、－ＣＮである。ある態様において、Ｒ’’は、－ＮＯ２である。ある態様において、Ｒ’’は、－Ｎ３である。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アルキルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アルケニルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アルキニルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アリールである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換ヘテロアリールである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換カルボシクリルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換ヘテロシクリルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アシルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換ヒドロキシルである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換アミノである。ある態様において、Ｒ’’は、任意置換チオールである。
ある態様において、Ｒ’’は、生体共役のための反応性部分（例えば、クリックケミストリーのハンドル、例えば、アジドもしくはアルキン）、フルオロフォア、触媒性タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはレポートタグを含む。
本明細書において一般的に定義されるとおり、Ｒ’’’は、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、任意置換チオール、または酸素保護基である。ある態様において、Ｒ’’’は、水素である。ある態様において、Ｒ’’’は、ハロゲンである。ある態様において、Ｒ’’’は、－ＣＮである。ある態様において、Ｒ’’’は、－ＮＯ２である。ある態様において、Ｒ’’’は、－Ｎ３である。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アルキルである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アルケニルである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アルキニルである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アリールである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換ヘテロアリールである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換カルボシクリルである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換ヘテロシクリルである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アシルである。ある態様において、Ｒ’’’は、である。任意置換ヒドロキシル。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換アミノである。ある態様において、Ｒ’’’は、任意置換チオールである。
ある態様において、Ｒ’’’は、生体共役のための反応性部分（例えば、クリックケミストリーのハンドル、例えば、アジドもしくはアルキン）、フルオロフォア、触媒性タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはレポートタグを含む。
本明細書において一般的に定義されるとおり、ＲＮは、水素、任意置換アルキル、任意置換アシルまたは窒素保護基である。ある態様において、ＲＮは、水素である。ある態様において、ＲＮは、任意置換アルキルである。ある態様において、ＲＮは、任意置換アシルである。ある態様において、ＲＮは、窒素保護基である。
ある態様において、ＲＮは、生体共役のための反応性部分（例えば、クリックケミストリーのハンドル、例えば、アジドもしくはアルキン）、フルオロフォア、触媒性タンパク質、オリゴヌクレオチド、またはレポートタグを含む。
非加水分解性ＲＮＡヌクレオチドによるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成
また本明細書において提供されるのは、非加水分解性ヌクレオチドを使用するＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のための方法である。本明細書において記載されるとおり、ポリメラーゼが、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端においてヌクレオチド（すなわち、加水分解性ヌクレオチド）を組み込むことができる速度は、酵素の活性部位について競合する非加水分解性ヌクレオチドを導入することにより、制御することができる。非加水分解性ヌクレオチドが組み込まれないと、加水分解性ヌクレオチドの組み込みの速度は、加水分解性ヌクレオチドと非加水分解性ヌクレオチドとの比により、競合的阻害を通して、直接的に影響を受ける。最終的には、ヌクレオチドの組み込みの数は、反応混合物中の非加水分解性ヌクレオチドの濃度により決定される。ポリ（Ｎ）ポリメラーゼがターミナルトランスフェラーゼを介して１つ以上のヌクレオチドを組み込んだ後、反復ステップ中の１つ以上において、任意に異なるヌクレオチドを用いて、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られるまで、プロセスを繰り返すことができる。
本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｎ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの加水分解性ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の非加水分解性ヌクレオチドを組み合わせること、ここで、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼによる１つ以上のヌクレオチドの付加の速度を阻害するために十分である；
を含む。
本明細書において記載されるとおり、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼは、ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼである。本明細書において提供されるのは、鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
（ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの加水分解性ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の非加水分解性ヌクレオチドを組み合わせること、ここで、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１つ以上のヌクレオチドの付加の速度を阻害するために十分である；
を含む。
ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、１～１００個のヌクレオチドが組み込まれるものである。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、１～５０個のヌクレオチドが組み込まれるものである。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、１～２０個のヌクレオチドが組み込まれるものである。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、１００個未満、９０個未満、８０個未満、７０個未満、６０個未満、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満の加水分解性ヌクレオチドが組み込まれるものである
１つ以上のヌクレオチドがイニシエーターオリゴヌクレオチドに付加された後、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成するために、１つ以上のさらなるヌクレオチドを、その後に付加してもよい。したがって、ある態様において、方法は、さらに、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチド（すなわち、ステップ（ｃ）において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチド）の３’末端に、１つ以上の天然のまたは修飾されたヌクレオチドを付加することを含む。ある態様において、方法は、
（ｄ）所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと
をさらに含む。
非加水分解性ＲＮＡヌクレオチド
本明細書において提供される方法は、非加水分解性ヌクレオチドを使用する。「非加水分解性」ヌクレオチドとは、ＲＮＡポリメラーゼに結合することができるが、イニシエーターオリゴヌクレオチドへの（例えば、イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への）酵素により触媒される付加（すなわち、ターミナルトランスフェラーゼ反応）を受けることができないヌクレオチドである。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、リン酸－修飾ヌクレオチドである（すなわち、修飾された三リン酸基を含む）。また本明細書において提供されるのは、本明細書において記載される方法において有用な非加水分解性ヌクレオチドである。
例えば、ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、以下の式：
Figure 2022504712000015
 のもの、またはその塩であって、式中：
各々のＹは、独立して、－Ｏ－、－ＮＲＮ－、－Ｃ（ＲＣ）２－、または－Ｓ－であり；ただし、少なくとも１つのＹは、－Ｏ－ではなく；
ＲおよびＲ’は、独立して、本明細書において定義されるような水素または糖置換基であり；
「塩基」は、本明細書において定義されるような天然または非天然の（例えば、修飾された）ヌクレオチド塩基であり；
ＲＮは、水素、任意置換アルキルまたは窒素保護基であり；
ならびに、ＲＣの各々の場合は、独立して、水素、ハロゲン、または任意置換アルキルである。ある態様において、－ＮＲＮ－は、－ＮＨ－である。ある態様において、－Ｃ（ＲＣ）２－は、－ＣＨ２－である。
ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、修飾された三リン酸基を含む。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、ウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸、アデノシン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸、グアノシン－５’－［（α，β）－メチレノ］三リン酸、シチジン－５’－［（α，β）－メチレノ］三リン酸、アデノシン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸、グアノシン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸、およびウリジン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸からなる群より選択される。三リン酸基は、任意の他の修飾を含んでもよい。
ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、３’－修飾ヌクレオチドである。ある態様において、非加水分解性ヌクレオチドは、３’－Ｏ－メチルアデノシン-５’－三リン酸および３’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸からなる群より選択される。
非加水分解性ヌクレオチドは、上および本明細書において記載される任意の他のヌクレオチド修飾をさらに含んでもよい。
ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成反応
本明細書において記載されるターミナルトランスフェラーゼ反応（すなわち、本明細書において記載される方法のいずれかのステップ（ｃ））は、ポリメラーゼ酵素（例えば、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）の存在下において行われる。ある態様において、ステップ（ｃ）は、１つ以上のさらなる酵素の存在下において行われる。ある態様において、ステップ（ｃ）は、２つ以上の異なる酵素の存在下において行われる。酵素の混合物は、１つより多くの区別し得るポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、２つまたは３つの異なるポリ（Ｎ）ポリメラーゼ）を含んでもよい。ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ酵素の混合物は、野生型および変異体ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ（例えば、本明細書において提供される変異したポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）の両方を含んでもよい。
ある態様において、ステップ（ｃ）は、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼに加えて、１つ以上のさらなるホスファターゼの存在下において行われる。ある態様において、ステップ（ｃ）は、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼに加えて、酵母の無機ピロホスファターゼ（ＰＰＩ－アーゼ）の存在下において行われる。
ある態様において、ステップ（ｃ）におけるターミナルトランスフェラーゼ反応は、１つ以上のさらなる添加物の存在下において行われる。ある態様において、ステップ（ｃ）は、クラウディング剤（crowding agent）の存在下において行われる。ある態様において、クラウディング剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはフィコール（Ficoll）である。ある態様において、クラウディング剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ある態様において、ステップ（ｃ）は、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下において行われる。ある態様において、ステップ（ｃ）は、非加水分解性ヌクレオチドの存在下において行われる。
イニシエーターオリゴヌクレオチド
本明細書において記載される方法は、イニシエーターオリゴヌクレオチドを用いる。イニシエーターオリゴヌクレオチドは、任意の配列のものであってよく、任意の数のヌクレオチドの長さであってよい。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチド以下の長さである。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５～２０ヌクレオチド長である。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０ヌクレオチドより長い長さである。
ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ポリ－ｒＮオリゴヌクレオチドである。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ポリ－ｒＵ、ポリ－ｒＣ、ポリ－ｒＧ、またはポリ－ｒＡである。
イニシエーターオリゴヌクレオチドはまた、共有結合により固体支持体に連結されてもよい。ある態様において、オリゴヌクレオチドは、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が得られた後で、固体支持体から切断される。したがって、ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、切断可能なリンカーを通して共有結合により固体支持体に連結される。
イニシエーターオリゴヌクレオチドは、フルオロフォアなどの他の修飾を含んでもよい。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－フルオロフォアを含む。ある態様において、フルオロフォアは、Ｃｙ５またはＦＡＭである。イニシエーターオリゴヌクレオチドはまた、１つ以上のさらなる官能基または生体共役のためのハンドルを含んでもよい。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ビオチンにより官能化されている。
ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－リン酸（例えば、５’－一、二、または三リン酸）を含む。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－一リン酸を含む。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－二リン酸を含む。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－三リン酸を含む。
ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、５’－キャッピング基（すなわち、５’キャップ）を含む。
ある態様において、５’キャップは、モノ－ヌクレオチド（１－ｎｔ）、ジ－ヌクレオチド（２－ｎｔ）、トリ－ヌクレオチド（３－ｎｔ）、またはＮ－ヌクレオチド（すなわち、有用であるであろう任意のオリゴヌクレオチド長のもの）であってよい。５’キャップはまた、本明細書において記載されるものを含む、１つ以上の天然および非天然の（例えば修飾された）ヌクレオシド塩基の組み合わせを含んでもよい。
ある態様において、５’キャップは、グアニンキャップである。ある態様において、５’キャップは、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ）である。ある態様において、グアニンまたはｍ７Ｇキャップは、５’から５’三リン酸への連結を介してオリゴヌクレオチドに連結したグアニンヌクレオチドを含む。ある態様において、５’キャップは、オリゴヌクレオチドの５’末端の第１および／または第２の２リボース糖の２’ヒドロキシ基のメチル化を含む。
ある態様において、５’－キャップは、５’－トリメチルグアノシンキャップまたは５’－モノメチルリン酸キャップである。他の態様において、５’キャップは、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨまたは３’－デホスホ－共酵素Ａキャップである。
ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドの逆転写のためのプライマー部位を含む。ある態様において、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲ増幅のためのプライマー部位を含む。
ＲＮＡフラグメントを５’－三リン酸化オリゴヌクレオチドと一緒にスプライシングする
ある態様において、本明細書において提供される方法は、長いＲＮＡ（例えば、＞１００－ｎｔの長さの）分子を作製するための、鋳型に依存しないポリメラーゼによる、５’－三リン酸基を用いる、オリゴヌクレオチドフラグメントの一緒のスプライシング（すなわち、ライゲーション）に適用することができる
５’－三リン酸オリゴヌクレオチドは、イニシエーターオリゴヌクレオチドとして合成されたもの、または、制御された鋳型に依存しない酵素による合成（例えば、本明細書において記載される方法）の生成物として合成されたもののいずれであっても、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼまたはその変異したバリアント（例えば、本明細書において記載される変異したバリアント）などのポリメラーゼの基質であってよい。ある態様において、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼまたはその変異したバリアントは、大きな３’－修飾を受け入れる。いくつかの例において、３’－修飾は、単一のヌクレオシド三リン酸または保護基ではなく、一連の核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）である。
したがって、本明細書において提供されるのは、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）第１のオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、５’－三リン酸基を含む；
（ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを提供すること；（ｃ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
（ｄ）第２のオリゴヌクレオチドの３’末端への第１のオリゴヌクレオチドのライゲーションのために十分な条件下において、第１および第２のオリゴヌクレオチドならびにポリ（Ｕ）ポリメラーゼを組み合わせること；
を含む。
ある態様において、第２のオリゴヌクレオチドは、３’－ＯＨオリゴヌクレオチドである。
ある態様において、５’－三リン酸オリゴヌクレオチドは、アルファ（）－リン酸においてホスホロチオエートを含むように修飾される。
ある態様において、第１のオリゴヌクレオチド（例えば、５’－三リン酸化オリゴヌクレオチド）は、オリゴヌクレオチドのヌクレオベース、糖または骨格に対する１つ以上の修飾を含む。ある態様において、第２のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのヌクレオベース、糖または骨格に対する１つ以上の修飾を含む。
ＲＮＡオリゴヌクレオチドの逆転写および増幅
ある態様において、鋳型に依存しないライゲーションは、本明細書において記載されるようなクラウディング剤などの添加などの、ライゲーション活性を増強する反応条件において起こる。
本明細書において提供される方法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成のために適用することができる。本明細書において記載される方法を介して所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチドが得られた後、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ）を得るために、逆転写および／または増幅の１つ以上のさらなるステップを行うことができる。最後の結果は、制御された鋳型に依存しないＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法である。
したがって、ある態様において、本明細書において提供される方法は、さらに、
（ｆ）結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して、逆転写プライミング部位、プライマーおよび逆転写酵素を用いて逆転写を行い、相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成する；
ステップを含む。ある態様において、逆転写酵素は、高フィデリティー逆転写酵素である。
ある態様において、本明細書において提供される方法は、さらに、以下：
（ｇ）合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドからステップ（ｆ）における逆転写を介して生成された相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼにより増幅して、二本鎖ＤＮＡを生成すること；
ステップを含む。ある態様において、ＤＮＡポリメラーゼは、高フィデリティーＤＮＡポリメラーゼである。
例
導入
オリゴヌクレオチドベースの治療剤は、合理的に設計され個別化された医学のポストゲノム時代における新興のモダリティーである（Khvorova et al. 2017）。天然および／または非天然の修飾された核酸ビルディングブロックの短い配列からなることにより、オリゴヌクレオチド治療剤は、最大の効力をもって標的に影響を及ぼしつつ、最適な薬物動態学的プロフィールを保持するように、特異的に仕立てることができる（Deleavey et al. 2012）。このことは、主に、糖環、ヌクレオベースおよびリン酸骨格、ならびにオリゴヌクレオチドの全体的な三次元構造に対して注意深く選択される修飾を含み得るオリゴヌクレオチド治療剤の化学的および構造的な構築により定義される（Cummins et al. 1995、Eckstein 2014、Watts et al. 2008、Wilson et al. 2006）。核酸ビルディングブロックが組み立てられる化学組成および配列の両方が、オリゴヌクレオチド治療剤の包括的な特性を付与する；わずかな再配置または異なる化学部分は、その治療能力を潜在的に改善し得る（Khvorova et al. 2017、Koch et al. 2014、Bohr et al. 2017）。このことは、最適化のために主要な再設計が必要でありえる古典的な低分子治療剤に対する明確に重要な利点である。短い（＜５０－ｎｔ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）（Goyal et al. 2018, Uhlmann et al. 1990）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）（Dana et al. 2017）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（Rupaimoole et al. 2017）など、ならびにより長い（＞１００－ｎｔ）メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（Pardi et al. 2018）および長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）（Arun et al. 2018）などの成功したオリゴヌクレオチド治療剤のクラスの多様なアレイが存在する一方で、各々の間の統一的なテーマは、特にラージスケールにおけるそれらの生成が、現在の状態のオリゴヌクレオチド合成技術により大きく限定されることである（Ma et al. 2012）。
ホスホラミダイト化学を用いるＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成は、１９７０年代より科学研究の主流であった（Beaucage et al. 1992）。ホスホラミダイト化学は、４つの天然のヌクレオベースからなる短い複雑でないＤＮＡオリゴヌクレオチドの合成のためには、非常に信頼性が高く、安価である。しかし、超並列合成および自動化技術の到来は別として、ホスホラミダイトベースのオリゴヌクレオチド合成中心的な方法論に対しては、微量の、段階的（incremental）な改善しか存在していない（Beaucage et al. 1992、Kosuri et al. 2014）。このことは、ＲＮＡおよび重修飾オリゴヌクレオチドの化学合成について特に真実であり、これはなお非常に高価であり、低収量であり、しばしば、合成後に複数回の精製を必要とし、これが、認識可能な量の所望される生成物を単離するためのリード時間を大きく増大させる（Baronti et al. 2018）。さらに、ホスホラミダイト化学は、多くの現在のオリゴヌクレオチド治療剤にとって必要な化学修飾の大きなレパートリーに対しては特に貢献しない（Khvorova et al. 2017）。なぜならば、有機溶媒および厳しい条件が、例えば、オリゴヌクレオチドに対して送達またはリガンド結合の目的のためのユニークな特性を付与し得る不安定な部分のためにさらなる保護基を必要とすることにより、合成スキームを複雑化するからである（Baronti et al. 2018）。In vitro転写（ＩＶＴ）戦略は、これらの限定要因のうちのいくつかを回復させてきた；特に、現在のところホスホラミダイト化学によっては不可能である長鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチド（＞１２０－ｎｔ）の生成（Pardi et al. 2018, Milligan et al. 1987, Sahin et al. 2014）。しかし、ＩＶＴは、オリゴヌクレオチドの部位特異的標識を可能にせず、ユーザーに、適切な酵素触媒のためにＤＮＡ鋳型を用いることに加えて、特定の塩基をスワップアウト（swap out）することを要求する。残念ながら、高コストと難しい合成と多様な核酸ビルディングブロックに到達しにくいこととの組み合わせは、研究者が、消耗性疾患と戦うための画期的なオリゴヌクレオチド治療剤を開発することを妨害する。
オリゴヌクレオチド合成およびオリゴヌクレオチドベースの治療剤の開発の前述の限定要因に取り組むための１つの潜在的な解決法は、ホスホラミダイト化学の使用を完全に回避することである。現在、ヌクレオチジルトランスフェラーゼとして知られるあるクラスのポリメラーゼを利用することに、多大な関心が存在し、これは、オリゴヌクレオチドをデノボで合成するために、短いイニシエーター配列の３’末端へのヌクレオシド一リン酸の付加を触媒する（Perkel 2019, Pratt et al., 2008）。多くのヌクレオチジルトランスフェラーゼは、鋳型配列の使用を必要とせず、それらの反応は、水性条件下において行うことができ、ヌクレオベースの脱プリン、望ましくない挿入または欠失、および不可逆にキャッピングされた短縮生成物の蓄積を含む化学的なオリゴヌクレオチド合成の負の側面の多くを回避する。鋳型に依存しないデノボオリゴヌクレオチド合成を行うことができるいくつかの注目すべきヌクレオチジルトランスフェラーゼとして、これらに限定されないが、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）(Motea et al. 2010）、Ｃｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰｕＰ）（Munoz-Tello et al. 2012）、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰａＰ）（Balbo et al. 2007）、ポリ（Ｇ）ポリメラーゼ（ＰｇＰ）、ポリ（Ｃ）ポリメラーゼ（ＰｃＰ）、ＣＣＤ付加酵素（Cho et al. 2007）、ポリメラーゼミュー（μ）（Dominguez et al. 2000）、およびポリメラーゼシータ（Θ）（Thomas et al. 2019）が挙げられる。前述のヌクレオチジルトランスフェラーゼのうち、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのみが、酵素によるオリゴヌクレオチド合成首尾よい実証において用いられている（Palluk et al. 2019）。しかし、これまでのところ、ＤＮＡデータストレージにおける適用のみが可能である。なぜならば、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼは制御することが難しく、天然のデオキシヌクレオシド三リン酸に対して強力な優先性を有し、他のものと比較して特定のヌクレオベースとイニシエーターとの組み合わせに対して非常に偏っているからである（保存されたデータを検索するために合成後に計算により補正することができる性質）（Ceze et al. 2019、Anavy et al. 2019、Lee et al. 2019）。したがって、（１）可逆性のブロックされた修飾ヌクレオシド三リン酸により、成長中の配列を単一の塩基（ｎ＋１）で伸長させることができ、（２）治療的価値または他の価値をオリゴヌクレオチドに付与する修飾ヌクレオシド三リン酸のアレイを組み込むことができ、および（３）商業的に関連するアウトプットにスケールアップすることができる、酵素によるオリゴヌクレオチド合成のプラットフォームの開発が重要である。
制御された酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
酵素触媒を介する制御されたＲＮＡオリゴヌクレオチドのデノボ合成のためのいくつかの方法が開発されている。鋳型配列なしで、天然のおよび修飾されたリボヌクレオチド三リン酸（ｒＮＴＰ）を効率的に組み込む能力を有する、操作された、および野生型のポリメラーゼを、イニシエーターオリゴヌクレオチド配列の３’－ＯＨにヌクレオチドを繰り返し付加するために用いることができる。それらの付加は、単一または複数の組み込みイベントのいずれかを通したものであってよい。酵素官能性のために必要とされる生物学的に適合性の反応条件は、通常は化学合成に伴う分解に対するＲＮＡオリゴヌクレオチドの感受性を大きく低下させる。多くのＲＮＡオリゴヌクレオチドを並行して高いコスト効率で合成するために、これらの方法を、微小流体またはアレイベースのフォーマットに統合することができる。この方法により合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、低いエラー率で生成され得、下流の生化学的適用のために、生物学的に適合性であろう。
ＤＮＡ／ＲＮＡ志向型ポリメラーゼであるポリメラーゼμ、ならびにＲＮＡ志向型ポリメラーゼであるポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）およびポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、前述のＲＮＡ合成スキームに適合性であるポリメラーゼの３つの例である。しかし、ＣＣＡ付加酵素などの、鋳型配列を必要とすることなくイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端にヌクレオチドを付加する能力を有する任意の他のポリメラーゼまたは酵素を用いることができる。これは、制御されたデノボＲＮＡ合成のための類似の能力または増大した能力を示す、可能な機能的変異体を含む。
本発明のいくつかの可能な適用として、以下が挙げられる：（１）コスト効率的かつ高フィデリティーな１００－ｎｔより長いＲＮＡオリゴヌクレオチドのデノボ合成、（２）合成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドは、以下のような生物学的材料の安価かつ高品質なソースとして用いることができる：合成トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、自己折り畳みＲＮＡ構造、新規リボザイム、タンパク質結合複合体、ＲＮＡ治療剤、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ、およびＲＮＡシークエンシングプローブ（パッドロックプローブなど）、（３）逆転写による変換を介した有用でＰＣＲ増幅可能なＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは遺伝子配列の生成、および（４）ＲＮＡ合成様Ｐｏｌ（μ）（ＤＮＡ／ＲＮＡ志向型ポリメラーゼ）のために用いられる酵素は、さらに、生物学的に適合性の反応条件下におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドまたは遺伝子配列の制御された酵素による合成のための候補である。
妨害的反応条件によりｒＮＴＰ組み込みのスピードを制御する
ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は、所望される長さの生成物を最大限にする反応成分（天然のヌクレオチド組み込みの触媒速度を大きく妨害し、非加水分解性または不適合性のヌクレオチドの付加など）を選択することにより制御することができる（図１）。予め決定された組成および長さのイニシエーティング（initiating）ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドのヘテロまたはホモポリマー配列の３’末端に、天然のｒＮＴＰが付加される。イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０－ｎｔ未満であってよい。イニシエーティングオリゴヌクレオチドはまた、化学修飾、例えば、感光性であるもの、または酵素による合成の後で全長ＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物からの切断および分離を可能にする電気化学的特性を有するものなど、を含んでもよい。組み込みイベントの数は、また反応容器中に存在する非加水分解性または不適合性のヌクレオチドに対する、天然のヌクレオチドの濃度比に比例する。オリゴヌクレオチド合成の速度は、この比により競合的阻害を通して直接的に影響を受け、ここで、低濃度の非加水分解性または不適合性のヌクレオチドは、より高い反応速度においてより長いＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じ、高濃度の非加水分解性または不適合性のヌクレオチドは、より遅い反応速度において小さいＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じる。非加水分解性ヌクレオチドは、ヌクレオチドの酵素への結合アフィニティーに影響を及ぼさない三リン酸のα－、β－またはγ－リン酸への修飾を有するものを含む。不適合性ヌクレオチドは、２’および／または３’－部分への修飾を有するもの、または、ヌクレオチドの酵素への結合アフィニティーを著しく改変することなく非反応性をもたらすヌクレオチド塩基を有するものを含む。一態様において、この合成スキームは、微小流体のセットアップにおいて行うことができ、ここで、様々な天然のヌクレオチドを迅速に切り替えることができ、それにより、表面結合イニシエーターオリゴヌクレオチドに複数の塩基を組み込むことができる。
修飾されたｒＮＴＰ組み込みは、さらなる組み込みイベントを可逆的に妨げる
ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成はまた、伸長反応を１回のみの組み込みイベント（ｎ＋１）に限定するために、イニシエーターオリゴヌクレオチドに対するポリメラーゼの結合アフィニティーを一時的に改変する修飾ヌクレオチドを組み込むことにより、制御することができる（図２）。予め決定された組成および長さのイニシエーティングオリゴヌクレオチド配列の３’末端に修飾されたｒＮＴＰが付加される。イニシエーターオリゴヌクレオチドは、２０－ｎｔ未満であってよい。イニシエーティングオリゴヌクレオチドはまた、化学修飾、例えば、感光性であるもの、または酵素による合成の後で全長ＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物からの切断および分離を可能にする電気化学的特性を有するものなどを含んでもよい。単一の修飾ヌクレオチドの組み込みは、イニシエーティングオリゴヌクレオチドに対する酵素の結合アフィニティーを、酵素がもはや（ｎ＋１）を超えてさらなるヌクレオチドを組み込むことができなくなるように改変する。修飾ヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチドの２’－、３’－または２’－および３’－位において、非天然の化学的ドメインを有していてもよい（図２）。修飾されたｒＴＮＰが組み込まれた後、温和な脱保護反応を使用し、これは、天然の化学的ドメインを露出させるために、任意に生物学的に適合性の条件下において、修飾を取り除くように機能する。脱保護の後で、酵素は、オリゴヌクレオチドに対するアフィニティーを回復させ、配列（（ｎ＋１）＋１）の次の塩基に対応するさらなる修飾ヌクレオチドを組み込むことができる。修飾ヌクレオチド組み込み、脱保護および酵素結合アフィニティーの回復のプロセスを、所望されるＲＮＡオリゴヌクレオチド配列が生成されるまで反復的に行う。このスキームの要件は、ｎ＋１からの変換速度が非常に効率的であることであり、したがってステップは、酵素が確実にこの能力を有することに依拠するであろう。一態様において、首尾よい組み込みイベントは、フルオロフォアまたは組み込み後にフルオロフォアを接着するための反応性ドメインを含む修飾ヌクレオチドを選択することにより、任意にモニタリングすることができる。別の態様において、この合成スキームは、微小流体のセットアップにおいて行うことができ、これにより、未使用のヌクレオチドを洗い流し、伸長されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを伸長の次のラウンドのために準備するために用いることができる。
制御されたＲＮＡ合成のためのポリメラーゼ酵素
ファミリーＸポリメラーゼ
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ポリメラーゼミュー（Ｐｏｌμ）、ポリメラーゼベータ（Ｐｏｌβ）、およびポリメラーゼラムダ（Ｐｏｌλ）などのファミリーＸからのポリメラーゼは、制御された鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための候補である（Fowler and Suo 2006）。これらの高度に特化したポリメラーゼは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）ならびにＶ（Ｄ）Ｊ組み換えの間の抗体の産生およびＴ細胞受容体の多様性などの重要なＤＮＡ修復経路における主要な駆動力であることが示されている（Moon et al. 2007, 2014；Nick McElhinny and Ramsden 2004； Bertocci et al. 2006）。かかる生物学的プロセスにおけるファミリーＸポリメラーゼの関与は、鋳型依存的な様式において天然のヌクレオチドを組み込むことにおけるそれらの正確性に寄与しつつ、一方で、変異性が必要である場合には、鋳型に依存せず、ヌクレオチドをプライマー配列に無差別に追加する能力を維持する（(J. F. Ruiz et al. 2001；Dominguez et al. 2000；Motea and Berdis 2010）。
このユニークな能力は、タンパク質進化スキームを必要とすることなくファミリーＸポリメラーゼに付随して天然の柔軟性の大きな余白が存在するという点において、酵素によるＲＮＡの合成のために理想的である。ＴｄＴは、ＤＮＡヌクレオチドに加えて天然のヌクレオチドを組み込む能力を有することが、先に示されている（Roychoudhury 1972）。ファミリーＸポリメラーゼは、提案されたＲＮＡ合成スキームとの適合性がより高くなるように、さらに操作することができる。
ポリメラーゼミュー（Ｐｏｌμ）
Ｐｏｌμは、最適な反応条件下において、デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）およびｒＮＴＰの両方を、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッドオリゴヌクレオチド基質に効率的に組み込むことが示されている、ファミリーＸポリメラーゼである（Jose F. Ruiz et al. 2003；Agrawal et al. 2003）。酵素の一次構造、触媒ポケット、および多様な触媒的状態のいくつかの研究は、ｒＮＴＰ結合に関連するアミノ酸残基、およびそれらの組み込みの動態学を決定した（Moon et al. 2014；Jamsen et al. 2017；Moon et al. 2017）。興味深いことに、野生型Ｐｏｌμは、オリゴヌクレオチドプライマーまたはヌクレオチドの構造をゆがめることなく、ならびに正常な立体構造における活性部位の幾何学を保ちつつ、ｒＮＴＰを組み込む能力を有する；他のファミリーＸポリメラーゼが、任意の収容量または速度においてｒＮＴＰを収容する能力に大きく影響を及ぼし得る現象である（Moon et al. 2017）。加えて、Ｐｏｌμは、ＤＮＡ基質に対するその優先性において、他のファミリーＸポリメラーゼと比較して、より差別的でないことが言及されていることは、特筆すべきである（Moon et al. 2015）。
Ｐｏｌμ変異原性
一研究において、２つの主要関連ヒトＰｏｌμ点変異である（Ｇ１７４Ｓ）および（Ｒ１７５Ｈ）の発現は、ＮＨＥＪにおける効率およびフィデリティーが低下した酵素を生成した。これらの変異体は、ＤＮＡ修復プロセスをガイドする鋳型配列を有するにもかかわらず、無作為にヌクレオチドを組み込み、予測されるエラー率に対する著しい改変をもたらすことが言及された（Sastre-Moreno et al. 2017）。他のグループは、Ｎ末端ＢＲＣＴドメイン（これは、典型的には、他のＤＮＡ修復経路のコア因子と関連する）などのＰｏｌμの大きな割合を取り除くことにより、活性な酵素がもたらされることを示している（Moon et al. 2014）。これらの短縮型バリアントは、野生型の活性かつ非加水分解性のヌクレオチドに結合する能力を保持することが示されているが、修飾された、またはかさばるヌクレオチドを組み込むためのより大きな物理的空間を潜在的に有する。しかしながら、野生型Ｐｏｌμは、本来は鋳型依存的なポリメラーゼとして特徴づけられる；しかし、ヒト野生型Ｐｏｌμに対する点変異（Ｒ３８７Ｋ）は、鋳型に依存しない活性が著しく増大した酵素をもたらした（Andrade et al. 2009）。この点変異（Ｒ３８７Ｋ）は、鋳型に依存しないデノボＲＮＡオリゴヌクレオチド合成においてＰｏｌμを用いることの実現可能性にとって非常に重要であり、やはり、その柔軟性の大きな価値について繰り返し言及する。Ｐｏｌμは、現在唯一の既知のファミリーＸからのポリメラーゼであり、それを超えて、鋳型依存的活性および鋳型に依存しない活性の両方を示す（Dominguez et al. 2000; Juarez et al. 2006）。野生型または変異誘発されたＰｏｌμに加えて、長いＲＮＡオリゴヌクレオチドをデノボで合成するために潜在的に用いることができる他のポリメラーゼが存在する。
ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、および他のＲＮＡポリメラーゼ
リボヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡの３’－テイルは、２つの異なる文脈において重要である：（１）天然の生物学的または生化学的プロセス、ならびに（２）これらのプロセスをin vivoまたはin vitroで研究すること（Proudfoot 2011；Strauss et al. 2012）。後者について、いくつかのグループは、in vitroで、鋳型に依存しない様式において、ＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端を直接的に標識するために、Saccharomyces cerevisiaeおよびEscherichia coliのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（ＰＡＰ）、Schizosaccharomyces pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（ＰＵＰ）などの野生型ＲＮＡポリメラーゼを使用している（G. Martin and Keller 1998；Munoz-Tello, Gabus, and Thore 2012；Kwak and Wickens 2007；Winz et al. 2012）。最適条件下において、これらのファミリーの酵素、特にＰＡＰは、糖の２’－および３’－位、ならびにアデノシン塩基の８’－位における修飾を有する修飾リボヌクレオチドを受け入れることが示された（Winz et al. 2012）。全体的な組み込み効率は、修飾された位置、ヌクレオチド塩基、および試験された酵素の間で異なるが、一方、平均で１～３回のヌクレオチド組み込みイベントが行われ、生体直交型クリックケミストリーを介して色素と接着すべき３’－または内部のアジド官能基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じた（Winz et al. 2012）。
修飾ヌクレオチド組み込みの機構を研究することに加えて、他のグループは、ＰＡＰの基質結合および触媒についての生化学的及び構造的機構の両方を調べた（Georges Martin et al. 2004；Bard et al. 2000）。触媒ポケットにおける多くの残基の部位特異的変異誘発および定常状態速度論の網羅的分析を含んだこれらの研究を通して、組み込みは、他のヌクレオチド塩基と比較して、ＡＴＰに向かって大きく偏っていたことが明らかであった（Georges Martin et al. 2004）。しかし、別のグループは、細菌のＰＡＰに対する単一の点変異（Ｒ２１５Ａ）は、この偏りの完全な逆転をもたらし、ヌクレオチド塩基の全ての無作為な組み込みを可能にしたことを示した（Just et al. 2008）。この結果は、別の鋳型に依存しないＲＮＡポリメラーゼであるＣＣＡ付加酵素についても同様であった（Just et al. 2008；Xiong and Steitz 2004）。これらの研究は、ＰＡＰなどのＲＮＡポリメラーゼを、制御されたデノボでのＲＮＡオリゴヌクレオチドのためのスキームＩＩの実行において、非常に適合したものにする。野生型および変異したＲＮＡポリメラーゼのいずれも、温和な反応条件下において脱保護されるか、または改変されて、酵素結合アフィニティーを回復することができる、Ｕ、Ａ、ＧまたはＣ糖修飾ヌクレオチド塩基（２’－、３’－、または両方）を組み込むために、十分に柔軟であると考えられる。
結果：ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
１．精製されたヒトポリメラーゼμＲ３８７Ｋは、鋳型に依存しないターミナルトランスフェラーゼ活性を示す
材料と方法において記載されるとおりに、ヒトポリメラーゼμＲ３８７Ｋを、発現させ、精製した。ポリメラーゼμＲ３８７Ｋが最適に機能する反応条件が不明であったので、いくつかの反応パラメーターをはじめに評価した。インキュベーション温度３７℃および反応バッファー条件：１０ｍＭの酢酸マグネシウム、５０ｍＭの酢酸カリウム、および２０ｍＭのトリス－酢酸が、ｄＮＴＰ組み込みに関して十分な酵素活性を生じることを見出した。加えて、ポリメラーゼμ活性は、反応に一般的な二価の金属コファクター（Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋など）を補充した後で評価し、０．２５ｍＭの濃度におけるＭｎ２＋とＭｇ２＋との組み合わせが、約６５０ＲＦＵ／分における最も高いｓｓＤＮＡ生成の速度を生じ、一方、０．２５ｍＭのＣｏ２＋が、約１００ＲＦＵ／分における最も低い速度を生じることを見出した（図３Ａ）。次に、ポリメラーゼμＲ３８７Ｋが、類似の反応条件下において、ｒＮＴＰを組み込むことができるか否かを調べた。変性ゲル電気泳動は、ポリメラーゼμＲ３８７Ｋは、天然のｄＡＴＰ（図３Ｂ）およびｒＡＴＰの両方を組み込むことができることを示した（図３Ｃ）；しかし、２００μＭのｄＡＴＰと類似の応答をもたらすために、５ｍＭの濃度のｒＡＴＰが必要であった。これらの結果は、ポリメラーゼμＲ３８７Ｋは、他のポリメラーゼＸファミリーメンバーと同様のターミナルトランスフェラーゼ活性を示し、鋳型配列に依存せずに機能し、ｄＮＴＰおよびｒＮＴＰの両方を収容することができることを示す。したがって、確認されたＤＮＡ／ＲＮＡ志向型ポリメラーゼであるポリメラーゼμＲ３８７Ｋは、制御された酵素によるＲＮＡ合成のために有用である。
２．S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼは２’－修飾されたＡＴＰヌクレオチドおよび２’－ブロック可逆性ターミネーターを組み込む
いくつかの２’－修飾の組み込みについてのS. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Thermo 74225Z25KU）の効率を評価した。評価された修飾ヌクレオチドは、以下を含んだ：２’－Ｆ－ｒＡＴＰ（Trilink N-1007）、２’－アジド－ｒＡＴＰ（Trilink N-1045）、２’－アミノ－ｒＡＴＰ（Trilink N-1046）、および２’－Ｏ－メチルｒＡＴＰ（Trilink N-1015）。伸長反応に、０．５ｍＭのＭｎ２＋、２００ｐｍｏｌのイニシエーターＲＮＡオリゴヌクレオチド、２．５ｍＭの修飾ヌクレオチド、および９００単位の酵素を含む適切なバッファーを補充した。反応を、３７℃で６０分間にわたりインキュベートし、その後、変性ゲル電気泳動で分析した。ゲルによれば（図４Ａ）、これらの反応条件下において、S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼは、全ての２’－修飾ヌクレオチド（２’－アミノ－、２’－Ｏ－メチル－、２’－Ｆ－、および２’－アジド－ｒＡＴＰ）を組み込む。これらの結果は、S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼは、ヌクレオチド糖の２’－部分に対する異なる化学修飾に対して耐性であり、２’－可逆性ターミネーター化学と適合性であるであろうことを示す。同じ反応条件下において、可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸である２’－Ｏ－アリル－ｒＡＴＰを、S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼによる制御された組み込みについて試験した。結果として生じた変性ゲル（図４Ｂ）は、ある範囲のヌクレオシド三リン酸濃度（２５０μＭ～４０００μＭ）に対して、酵素およびヌクレオチド以外の全ての構成成分を含んだ陰性対照反応と比較して、正の（ｎ＋１）の組み込みを示した。このことは、S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼと、２’－Ｏ－アリルを有する可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸との組み合わせを、制御された酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のために用いることができることを示す。
３．S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、天然のヌクレオチドをユニバーサルに組み込む
天然のリボヌクレオチドを組み込むことについてのS. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（NEB M0337）の効率を評価した。動態学的分析のために、伸長反応に、適切なバッファー、１０ｐｍｏｌの標識されたイニシエーターＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’－Ｃｙ５－ポリｒＵ－１５マー）、１．０ｍＭの天然のヌクレオチド（ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰまたはＣＴＰのいずれか）、１×SYBR Green II for RNA（Thermo）、および２単位のポリ（Ｕ）ポリメラーゼを補充した。反応を、３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、リアルタイムでモニタリングした。次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、ＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍでイメージングした。ゲルから、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、対照と比較して、全ての天然のリボヌクレオチドを組み込む能力を有することが明らかである；しかし、起こるであろう伸長の数に関して、いくらかの偏りが存在した（図５Ａ）。これらの結果は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、これらのヌクレオチドによりほとんどまたは全く活性を示さないことが先に示されているｒＧＴＰおよびｒＣＴＰを例外として、先の研究と一致する（Munoz-Tello, Gabus, and Thore 2012；Lunde, Magler, and Meinhart 2012）。しかし、ゲル電気泳動およびＲＮＡ動態学的アッセイからの結果を用いて、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、ｒＧＴＰおよびｒＣＴＰにより活性を有することが確認された（図５Ｂ）。
４．S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、２’－修飾されたヌクレオチドを普遍的に組み込む
S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、４つ全ての天然のリボヌクレオチドを普遍的に組み込む能力を有するという知見から、この普遍性を、２’－修飾ヌクレオチドに拡大することができるか否かを決定するために研究した。同じ反応パラメーターを用いて、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを、２．５ｍＭの２’－Ｏ－メチル－ｒＡＴＰ、ｒＵＴＰ、ｒＣＴＰまたはｒＧＴＰと共に、３７℃で６０分間にわたりインキュベートした。次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、ＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍでイメージングした。ゲルは、S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、２’－修飾ヌクレオチドを普遍的に組み込むこと、およびイニシエーターオリゴヌクレオチドを＋１～２ヌクレオチドのみ、非常に高い効率で伸長することを示す（図６）。前と同様に、ヌクレオチドの選択において、いくらかの偏りが存在する；しかし、これは、６０分間のインキュベーションの後で全伸長生成物が非常に類似しているので、全体的には無視し得るものである。この結果は、制御されたＲＮＡ合成にとって非常に理想的であり、S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、以下の点においてユニークである：（１）他に現在知られている酵素で修飾ヌクレオチドを普遍的に組み込むことができるものが存在しない、および（２）伸長生成物は、わずか＋１～２ヌクレオチドである。S. cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼと同様に、S. pombeのＣｉｄ１ポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、ヌクレオチド糖の２’－部分に対する化学修飾に対して耐性であり、２’－可逆性ターミネーター化学と適合性であろう。
５．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、イニシエーターオリゴヌクレオチド配列組成および二次構造／ヘアピンにより最小限に影響を受ける
多くのターミナルトランスフェラーゼは、イニシエーターオリゴヌクレオチドの配列組成に対して極めて感受性であり、ここで、３’－ＯＨ末端における１つの異なる塩基が、ヌクレオチドが組み込まれる速度に大きく影響を及ぼし得る。したがって、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、４つ全ての天然のリボヌクレオチドについて、異なる組成を有する２つの５’－標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチドの存在下において伸長反応を行うことにより、この様式において影響を受けるか否かを調べた。１ｍＭのリボヌクレオチドおよび１０ｐｍｏｌの５’－標識イニシエーターオリゴヌクレオチドにより、反応を行った。次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、５’－Ｃｙ５－ポリｒＡ－１５マーについてはＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍ、ならびにＥＸ：４９５ｎｍおよびＥＭ：５２０ｎｍで、イメージングした。変性ゲル電気泳動により示されるとおり、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、イニシエーターオリゴヌクレオチド配列組成の偏りにより、最小限に影響を受けることを見出した（図７Ａ）。いずれのイニシエーターオリゴヌクレオチドも、普遍的なリボヌクレオチド組み込みを生じることが観察された；しかし、５’－Ｃｙ５－ポリｒＡ－１５マーは、３０分間のインキュベーションの後でより少ない出発生成物が存在したことから、わずかにより効率的であると考えられた。配列組成に加えて、強力な二次構造を有するイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いる、制御された酵素による伸長の効果を調べた。これを行うために、反応条件下において（Ｍｇ２＋、ヌクレオチド濃度、ＤＮＡ／ＲＮＡオリゴヌクレオチドなどを考慮する）強力なヘアピン構造を誘導するIDT Oligoanalyzer Tool（商標）を用いて、いくつかのオリゴヌクレオチドを作製した。各々のオリゴヌクレオチドは、３’末端に対するヘアピンの位置を例外として、配列において類似した。ヘアピンの位置は、以下を生成するように変更した：３’末端から１塩基（Ｈ１）、３’末端から５塩基（Ｈ５）、３’末端から１０塩基（Ｈ１０）、および３’末端から２０塩基。酵素による伸長の前に、オリゴヌクレオチドのヘアピンが正確に形成されることを保証するために、オリゴヌクレオチドを９５℃まで加熱し、次いでサーモサイクラーにおいて、適切な酵素反応バッファー中で、０．１℃／分の速度で１５℃までゆっくりと冷却した。冷却後、残りの反応成分をヘアピンイニシエーターオリゴヌクレオチドに加えて、可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰまたは－ＵＴＰのいずれかを用いて、５分間にわたり３７℃で伸長反応を行った。変性条件下における１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて、ヘアピンイニシエーターオリゴヌクレオチドの各々について伸長の効率を決定した。全体的に、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、強力な二次構造を有するヘアピンイニシエーターオリゴヌクレオチドを（ｎ＋１）まで伸長することができた；しかし、ヘアピンの後に１塩基しか存在しないＨ１オリゴヌクレオチドについてはいくらかの困難を有した。（図７Ｂ）－約１０％の伸長収率。難しい二次構造は、合成スキームにとって潜在的に問題となり得るが、高い反応温度またはポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体に加えて、ＤＭＳＯまたはベタインなどのさらなる反応成分を補助のために添加してもよい。しかしながら、これらの結果は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼのユニークな柔軟性をさらに強調する。
６．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ活性は無機ピロホスファターゼの添加により強調される
高いターミナルトランスフェラーゼ活性の結果は、ＤＮＡ－およびＲＮＡ志向型ポリメラーゼの既知の阻害剤である無機ピロリン酸の迅速な蓄積である。無機ピロリン酸の蓄積を軽減するために、反応を進行させつつピロリン酸を２つの単一のリン酸に切断するために、無機ピロホスファターゼ（ＰＰｉ－アーゼ）を使用することができる。したがって、ピロホスファターゼの補充がS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性を増強することができるか否かを決定するために研究した。反応を、３０分間にわたり３７℃で、１ｍＭの各々のリボヌクレオチド、１０ｐｍｏｌの５’－Ｃｙ５－ポリ－ｒＵ－１５マーのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および０．１単位の酵母無機ピロホスファターゼ（New England Biolabs M2403）と共にインキュベートした。次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、ＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍでイメージングした。無機ピロホスファターゼの補充は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼがＲＮＡを合成する速度を増強し、合成されたＲＮＡの最大の長さを増大させることを見出した（図８Ａ～８Ｃ）。最大の増強は、天然のリボヌクレオチドｒＵＴＰおよびｒＡＴＰについて観察され、一方、ｒＧＴＰおよびｒＣＴＰは、最小限に影響を受けた。この観察は、主に、長いＲＮＡ鎖を合成すること、したがってより多くの無機ピロリン酸の蓄積における、ｒＵＴＰおよびｒＡＴＰに対する野生型S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの優先性に起因する。ｒＧＴＰおよびｒＣＴＰは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによりなお組み込むことができるが、一方で、組み込みイベントの合計数は、より少なく、これは、より少ない無機ピロリン酸の蓄積をもたらす。しかしながら、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応への無機ピロホスファターゼの添加は有益であり、推奨される商業的に標準化された反応条件への改変を含む。
７．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ活性は、天然に、塩基修飾されたリボヌクレオチドを組み込むことができる
本明細書において提供されるの方法の一適用は、合成トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）またはリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）などの生物学的に活性な分子の合成である。しばしば、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを含むリボヌクレオチド塩基は、例えば最適な機能のためにin vivoで二次構造を誘導するように、天然に塩基修飾されている。加えて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドへの修飾塩基の組み込みは、それらの能力を大きく増強し、望ましくないヌクレアーゼ消化に対して保護することができる。したがって、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡにおいて最も一般的に見出される修飾リボヌクレオチド塩基の１つであるシュードウリジンを組み込む能力を有するか否かを決定するために研究した。反応を、３０分間にわたり３７℃で、２ｍＭ、１ｍＭ、または０．５ｍＭのｒＵＴＰまたはシュードウリジン（Trilink N-1019）、１０ｐｍｏｌの５’－Ｃｙ５－ポリ－ｒＵ－１５マーのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および０．１単位の酵母無機ピロホスファターゼと共にインキュベートした。次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、ＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍでイメージングした。S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、シュードウリジンを組み込む生得の能力を有し、約３０～４５－ｎｔの長さの塩基修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを生成することすることを見出した（図９Ａ）。結果として生じたポリ－シュードウリジンＲＮＡオリゴヌクレオチドは、未修飾のｒＵＴＰオリゴヌクレオチドよりも短かった；しかし、これは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼがかかるヌクレオチドを組み込むことができることを示す、初めて知られた例である。S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、他の塩基修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド塩基上の多様な位置においてメチル化または他の修飾を有するものなど）を組み込む能力を有する可能性が最も高いことは、これらの結果から明らかである。したがって、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを、４つ全ての天然の塩基に対する修飾を有する塩基修飾ヌクレオシド三リン酸のアレイと共にインキュベートした。これらは、これらに限定されないが、以下を含む：イノシン５’－三リン酸、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、８’－アジドアデノシン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン－５’－三リン酸、Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸、内因的に蛍光性のヌクレオチド、例えば３’／２’－Ｏ－（Ｎ－メチル－アントラニロイル）－三リン酸、およびリン酸修飾ヌクレオチド、例えばα－、β－、γ－チオ三リン酸。変性ゲル電気泳動は、試験された各々の塩基修飾リボヌクレオチドの、様々な数の組み込みイベントによる組み込みを明らかにした（図９Ｂ）。試験されたものなどの塩基修飾リボヌクレオチドは、これらを可逆性ターミネーターとして適合性にするために２’－ブロックされた基を用いて合成することができる。これらの結果は、それらの機能に依存して重度に塩基修飾され得るｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ、または特異的な二次構造を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドもしくは分解に対する耐性が増大したＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの、重要な生物学的分子のデノボ合成のための基礎を形成する。
８．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＲＮＡ合成は競合的阻害剤ヌクレオチドにより制御することができる
図１において例示されるとおり、ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の速度は、反応中に存在する加水分解性ヌクレオチドと非加水分解性ヌクレオチドとの比により、競合的阻害を介して直接的に影響を受ける。阻害剤は、酵素の活性部位を占有するが、組み込まれはせず、ＲＮＡ合成反応の速度を低下させ、結果として所与の反応時間内の組み込みイベントの数を低下させる。このことを実証するために、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼＲＮＡ合成反応を、漸増濃度の非加水分解性リボヌクレオチドウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸（Jena Biosciences）と共にインキュベートした。より高い濃度の非加水分解性リボヌクレオチドは、加水分解性ｒＵＴＰの組み込みの合計数を著しく限定することを見出した（図１０）。ＲＮＡ合成反応を、３０分間にわたり３７℃でインキュベートし、次いで、各々の伸長反応の２μＬを、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、Typhoon FLA 9500システムにおいて、ＥＸ：６４９ｎｍおよびＥＭ：６６６ｎｍで、イメージングした。０．８ｍＭより低い非加水分解性リボヌクレオチドウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸の濃度は、ＲＮＡ合成反応を制御することに対してほとんど影響を有しなかった；これは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼに対するウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸の結合アフィニティーの閾値に起因する可能性がある。他の非加水分解性リボヌクレオチドをこの様式において使用することができ、それらは、ウリジン塩基またはポリメラーゼS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである必要はない。
９．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼによるＲＮＡ合成は２’－Ｏ－ブロック可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸により制御することができる
図２において例示されるとおり、ＲＮＡ合成は、２’－Ｏ－ブロック可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸を組み込むことにより制御することができ、これにより、合成は、単一の組み込みイベントの後で一時的に停止され、（ｎ＋１）のオリゴヌクレオチドを生じる。次いで、温和な脱保護スキームを使用して、ブロッキング基を取り除き、成長中のオリゴヌクレオチドを、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼなどの酵素のために認識可能な基質として再確立する。S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、可逆性ターミネーター２’－修飾ヌクレオシド三リン酸を組み込む能力を有するか否かを決定するために、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰを、ＲＮＡ合成反応において、３０分間にわたり最良の反応条件においてインキュベートした。結果として生じたＲＮＡ合成反応の分析は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、単一の２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰのみを組み込み、イニシエーターオリゴヌクレオチドを、対照反応と比較して１塩基伸長することを示した（図１１Ａ）。他の修飾ヌクレオシド三リン酸（例えば２’－、塩基など）は複数の伸長生成物をもたらすが、一方で、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰは１つの伸長生成物のみをもたらすことから、この結果は特に特筆すべきである。反応条件および構成成分化学量論のさらなる最適化は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、＞９９％の変換速度でイニシエーターオリゴヌクレオチド（＋０）を伸長生成物（＋１）に完全に変換するために０．５分以下を必要とするという決定をもたらした（図１１Ｂ）。インキュベーション時間ののさらなる増大は、ＲＮＡ合成反応に対して、何らの認識可能な効果を有しなかった。可逆性ターミネーター２’－修飾ヌクレオシド三リン酸２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰの脱ブロックおよびさらなる伸長は、精製された（ｎ＋１）オリゴヌクレオチドを、多様なｐＨにおけるトリス－ＨＣｌバッファー中のテトラクロロパラジウム酸（palladate）ナトリウム（Ｎａ２ＰｄＣｌ４）および３，３’，３’’－ホスファントリイルトリス（ベンゼンスルホン酸）三ナトリウム塩（ＴＰＰＴＳ）の混合物と共に、１０分間にわたり５０℃でインキュベートすることにより、示された。結果として生じる脱ブロックされたオリゴヌクレオチドを、次いで精製し、次いで、（ｎ＋２）生成物を得るために、１ｍＭの可逆性ターミネーター２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰを含む最適化されたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ反応条件により伸長させた。変性ゲル電気泳動分析は、脱ブロックバッファーの組成およびｐＨの最適化の後で、精製された（ｎ＋１）オリゴヌクレオチドが、高い効率で（ｎ＋２）生成物に変化されたことを示す（図１１Ｃ）。ｐＨ７．５、６．５、５．５、４．５でのトリス－ＨＣｌバッファー中で、２’－可逆性ターミネーター基の首尾よい脱ブロックが観察されたが、ｐＨ８．５ではそうではなかった。より低いｐＨのバッファーはＲＮＡの安定性を増強することは、当業者に公知であり、最小限のバッファーの組成は、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが、脱ブロック構成成分（Ｐｄ＆ＴＰＰＴＳ）によりアクセス可能であることを保証する。（ｎ＋２）生成物を示す高分解能変性ゲルを、図１１Ｄにおいて示す。加えて、５’－フルオロフォアの安定性および官能性は、脱ブロックのプロセス全体にわたり保持され、最小限のオリゴヌクレオチド分解が観察された。このことは、化学が生体適合性であることを示している。２’－Ｏ－アリル可逆性ターミネーター戦略が、より長いＲＮＡオリゴヌクレオチドフラグメントの合成に貢献したか否かを決定するために、（ｎ＋５）生成物に到達するために、バルク溶液中で最適化された反応条件および２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰを用いて、酵素による伸長および脱ブロックのプロセスを繰り返した。合成の間に、各々の伸長／脱ブロックイベント（また、合成サイクルとしても知られる）の小さなアリコートを、分析のために取り分けた。ゲル電気泳動分析は、２０－ｎｔのイニシエーターオリゴヌクレオチドから出発した２５－ｎｔのフラグメントの首尾よい合成を示した（図１１Ｅ）。各々の精製および脱ブロックステップの間に試料の損失（これは、ゲル上のシグナルの低下により示される）は起こらなかったことは、特筆すべきである。全体として、これらの結果は、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、図２において概説するような反復性の１塩基ごとの様式において、酵素によるＲＮＡ合成を行う生得の能力を有することを示す。他の可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸もまた、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより組み込まれることができる。これは２’－Ｏ－アジド－メチル－ＮＴＰを含むが、これに限定されない。
１０．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは４つ全ての天然のヌクレオベースを有する２’－可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸を効率的に組み込む
先に、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、４つの天然のＲＮＡヌクレオベース（Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ）を有する２’－修飾ヌクレオシド三リン酸（２’－メトキシ）を、比較的等しい効率で組み込む能力を有することを決定した（図６）。このことは、可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸についての場合であるか否かを決定するために、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ、－ＵＴＰ、－ＣＴＰ、および－ＧＴＰを合成した。最適化された条件を用いて、伸長反応を、サーモサイクラー中で、３７℃で１分間にわたり、１ｍＭの２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ、－ＵＴＰ、－ＣＴＰ、または－ＧＴＰ可逆性ターミネーターのいずれかと共にインキュベートした。反応を、次いで、１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを用いて分析し、これは、単一の（ｎ＋１）伸長イベントにより示されるとおり、２’－Ｏ－アリル可逆性ターミネーターの各々のヌクレオベースバージョンが、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより効率的に組み込まれることを明らかにした（図１２Ａ）。対照反応は、ヌクレオチドを除いて全ての反応成分を有した。この結果が多重ヌクレオベースＲＮＡオリゴヌクレオチド合成に貢献することをさらに証明するために、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰおよび－ＵＴＰの組み合わせを用いるバイナリー合成を行った。以下の組み合わせを試験した：バルク溶液中で、最適化された酵素による伸長および脱ブロック反応条件を用いて、（ｎ＋１）Ａ、（ｎ＋１）Ｕ、（ｎ＋２）Ａ－Ａ、（ｎ＋２）Ａ－Ｕ、（ｎ＋２）Ｕ－Ａ、および（ｎ＋２）Ｕ－Ｕ。結果として生じた材料を、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、これは、（ｎ＋０）の例を生じたブランク反応（ヌクレオチドを除く全ての構成成分）と比較して、単一の（ｎ＋１）の試験条件については正の組み込み、ならびに二重（ｎ＋２）の試験条件については正の組み込みおよび脱ブロックを示した（図１２Ｂ）。
１１．活性なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、ラージスケールでの生成および精製のためのＮ末端Ｈｉｓ６－タグと共に細菌において発現させることができる
S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（UniProtKB－O13833）についての一次配列を、酵素のＮ末端にアミノ酸「ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＳＧＬＶＰＲＧＳＨ」付加することにより修飾した。これらのアミノ酸は、適切なリンカーを有するＮ末端Ｈｉｓ６タグをコードする。材料および方法のセクションにおいて概略されるプロトコルを用いて、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを発現させ、精製し、小さい容積に濃縮した。変性ゲル電気泳動は、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、正しく発現され、細菌ライセートから単離されたことを示した。Ｎ末端Ｈｉｓ６－タグにより、予測されるS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの分子量は、約４５ｋＤａであり、これは、ゲル上に対応する強力なバンドが存在する（図１３Ａ）。精製され、濃縮された、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼの活性を決定するために、伸長反応に、１ｍＭの２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターヌクレオチドを補充し、漸増量のイニシエーターオリゴヌクレオチドを、発現された酵素と共にインキュベートした。Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いて、約１００ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチドを、＞９９％の変換率で、（＋１）の生成物に変換することができることが決定された（図１３Ｂ）。１００ｐｍｏｌより多くを補充された反応は、より高い変換率のために、さらなる最適化を必要とする場合がある。これらの結果は、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを、非常に低いコストのために容易に発現させることができ、ＲＮＡ合成のための酵素の適切な量を生じるようにスケールアップすることができることを示す。さらに、精製され、濃縮された、Ｎ末端でＨｉｓ６タグ付けされたS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、大量のＲＮＡオリゴヌクレオチド材料を変換することができ、それにより、所望されるＲＮＡ配列の大きな収量を得るための、繰り返しの合成反応の必要性を軽減することができる。S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが発現され、精製された細菌ライセートから持ち越し汚染されたＲＮａｓｅは、観察されなかった。
１２．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼを用いる制御されたＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は固相表面上で行うことができる。
制御されたＲＮＡオリゴヌクレオチド合成は、バルク溶液を用いて容易に行うことができる；しかし、各々の合成サイクル中の伸長および脱ブロックのステップの後で、成長中のオリゴヌクレオチドは、妨害性の構成成分を取り除くために精製しなければならない。複数回の精製は、近代的な方法により効率的な回収率を有しているとはいえ、数回の合成サイクルの後で、最終的に大きな試料の損失をもたらす。したがって、オリゴヌクレオチド合成を、官能化されたビーズ、ウェル、スライドグラスなどの固相支持体上で行うことは、より長いオリゴヌクレオチドフラグメント、および大きな産業的に妥当な量の材料の合成のために、著しくより貢献する。S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、表面にアンカリングされたオリゴヌクレオチドを伸長する能力を評価するために、５’－アミン基および内部Ｃｙ５色素を有するイニシエーターオリゴヌクレオチドを、５’－ビオチン－ＰＥＧ－ＮＨＳリンカー（EZ-Link #A35389 Thermo）を付着させるために初めに用いた。１５％のＴＢＥ－ウレアゲルによる分析を介して、標識反応の効率は＞９０％であることを決定した（かさばるＰＥＧ基の付加は、オリゴヌクレオチドが、非標識オリゴヌクレオチドと比較して異なって流れるようにする）（図１４Ａ）。ストレプトアビジン感応化磁気ビーズ（Spherotech #SVM-20-10）を用いて、さらなる品質管理を行い、ここで、内部Ｃｙ５色素により標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチドの正の非共有結合性アンカリングが起こったことが観察され、これは、蛍光顕微鏡法により決定された（図１４Ａ）。３サイクルの酵素によるオリゴヌクレオチド合成を、次いで、最適化された伸長および脱ブロック反応条件を用いて、アンカリングされたイニシエーターオリゴヌクレオチドおよび２’－Ｏ－アリル可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸を用いて行った。（ｎ＋３）生成物を合成し、ここで、サイクル１は「Ａ」を付加し、サイクル２は「Ｃ」を付加し、次いでサイクル３は「Ｕ」を付加した。合成後、ビーズを、サーモサイクラー中で、５０℃で１０分間にわたり、水中９０％のホルムアミドの溶液と共にインキュベートすることにより、ストレプトアビジンビーズの表面からアンカリングされたオリゴヌクレオチドを取り除いた。回収した材料を、精製し、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析し、これは、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより触媒されたもののような、複数のヌクレオベースによる高度に効率的なオリゴヌクレオチド合成を示した（図１４Ｂ）。バルク合成に対して固相合成についての主な利点は、伸長および脱ブロック反応を繰り返し、いずれの反応も精製により完全に完了されることを確実にすることができることである。このことは、伸長反応の間のピロリン酸の生成をモニタリングすること、色素標識されたヌクレオシド三リン酸を用いる場合には固体支持体の蛍光を測定すること、または脱ブロック反応の比色モニターを用いることにより、可視化または測定することができる。
１３．S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより媒介される制御された酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成のために、共有結合性リンカーを有する再使用可能な固相支持体を用いることができる
制御された酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の全体的なコストに対する主要な寄与因子は、オリゴヌクレオチドイニシエーター配列である。バルク合成の先の例において、オリゴヌクレオチドイニシエーター配列は、消費され、典型的には再使用不可能である。加えて、所望される場合であっても、最終生成物からオリゴヌクレオチドイニシエーター配列を取り除くことは困難である。この問題を解決するために、最終オリゴヌクレオチド生成物から望ましくないイニシエーター配列を取り除くために、エンドヌクレアーゼＶによる一本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡまたはそれらの組み合わせにおけるリボイノシン（ｒＩ）および／またはデオキシイノシン（ｄＩ）の部位特異的切断を用いることができる。エンドヌクレアーゼＶは、リボイノシン（ｒＩ）およびデオキシイノシン（ｄＩ）について高度に特異的であり、オリゴヌクレオチドイニシエーター配列中の他の塩基を破壊しない。バルク溶液合成と比較長いＲＮＡオリゴヌクレオチド合成および産業的に妥当な合成スケールにより貢献する固相オリゴヌクレオチド合成についてのこの概念を拡大して、繰り返しの、潜在的に無制限の合成の実行のために、ビーズ、ウェル、スライドグラスなどの再使用可能なセットを生成することができる。このプロセスの簡単な概略を、図１５Ａにおいて示す。第１に、固体支持体は、好ましくは３’末端においてリボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を含むイニシエーターオリゴヌクレオチドに結合した適切なリンカー（長いＰＥＧ鎖など）で、共有結合的に誘導体化する。固相酵素によるＲＮＡオリゴヌクレオチド合成を行って、所望される生成物を生成し、次いで、エンドヌクレアーゼＶを、完全なオリゴヌクレオチド（イニシエーター＋生成物）と共にインキュベートさせた。このことにより、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を将来的な合成反応のために再利用されるように固体支持体上に無傷で残したまま、固体支持体からオリゴヌクレオチド生成物が切断されるであろう。エンドヌクレアーゼＶは、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）の下流で２つの塩基を切断し、したがって、合成されるべき所望されるオリゴヌクレオチドを設計する場合に、これを考慮することが重要である。最終生成物はまた、５’－リン酸化されており、これは、ホスファターゼを用いて容易に取り除くことができ、または、他の分子生物学もしくはシークエンシングの適用のために用いることができる。いくつかの場合において、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼは、このヌクレオベースの２’－Ｏ－アリルバージョンを用いてアンカリングされたイニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端にリボイノシン（ｒＩ）を導入するために用いることができる。
このスキームが意図されたとおりに働くか否かを決定するために、５’－アミン基、およびエンドヌクレアーゼＶ消化の下で２つの同等のサイズのフラグメントを生じるであろうデオキシイノシン（ｄＩ）により、イニシエーターオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドの５’－アミンおよびシリカビーズ上のアミンと反応するであろう二重－ＮＨＳ－ＰＥＧ９リンカーを導入することにより、イニシエーターオリゴヌクレオチドを、アミン官能化シリカビーズの表面上にアンカリングした。誘導体化されたビーズを、エンドヌクレアーゼＶ（材料および方法のセクションにおいて記載されるとおりに発現および精製される）と共に、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。加えて、比較のためにバルク相において同じ消化反応を行った。固相およびバルクの両方の消化反応について、対照試料を、エンドヌクレアーゼＶを含まない反応であった場所に置いた。１時間のインキュベーションの後で、消化反応を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。ゲルを、室温で１５分間にわたり振盪しながら１×SYBR GelStar核酸ステインで染色した。エンドヌクレアーゼＶが、バルクおよび固相の両方の反応において、意図されたとおりに働き、消化フラグメントを生成することが観察された（図１５Ｂ）。バルク対照反応について、全長の、未消化のフラグメントが観察される。固相の対照消化反応については識別可能なフラグメントは観察されず、このことは、オリゴヌクレオチドがシリカビーズの表面上で完全なままであることを示唆する。この結果は、共有結合したオリゴヌクレオチドが表面から剥がれ落ちないことを検証するので、さらに重要である。
記載される固体支持体系が酵素による合成のために機能的であること、および、イニシエーターオリゴヌクレオチドが、エンドヌクレアーゼＶ消化の後で表面上に完全なまま残っているデオキシイノシンヌクレオベースを介して、再使用可能であることを実証するために、消化されたイニシエーターオリゴヌクレオチドを保有する洗浄したシリカビーズを、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼおよび天然のｒＮＴＰ（制御されない伸長）、ならびに２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーター（制御される伸長）と共に、最適化された反応条件を用いてインキュベートした。比較のために、新たにアンカリングされた、未消化のイニシエーターオリゴヌクレオチドを有するビーズを、同様に伸長させた。次いで、全てのビーズを、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄し、エンドヌクレアーゼＶの存在下において、１時間にわたり３７℃でインキュベートした。次いで、伸長および表面からの切断の効率を、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを変性条件下において用いて分析し、室温で１５分間にわたり振盪しながら1×SYBR GelStar核酸ステインにより染色した。ゲルは、再使用された、および新たに誘導体化されたビーズの両方について、全ての条件下において、正の伸長および切断を示した（図１５Ｃ）。バイアビリティーについての最終的な証明として、共有結合したエンドヌクレアーゼＶ切断可能なイニシエーターオリゴヌクレオチドを、２’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ可逆性ターミネーターヌクレオシド三リン酸と共に用いて、S. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼにより、制御された（ｎ＋２）生成物の合成を行った。伸長反応に１ｍＭのヌクレオチドを補充し、３７℃で１５分間にわたりインキュベートした。脱ブロック反応は、５０℃で１０分間にわたり行った。ビーズを１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ６．５）で洗浄した。エンドヌクレアーゼＶ切断は、適切なバッファーを用いて、１時間にわたり３７℃で行い、すぐに変性ゲルに流した。対照反応は、（ｎ＋２）まで伸長され、エンドヌクレアーゼＶの存在下においてインキュベートしたが、リボイノシン（ｒＩ）またはデオキシイノシン（ｄＩ）を有しないアンカリングされたＣｙ５イニシエーターオリゴヌクレオチドを含んだ。これを、オリゴヌクレオチドがエンドヌクレアーゼＶ切断の間に剥がれ落ちなかった（leech）ことを証明するために用いた。Ｃｙ５イニシエーターオリゴヌクレオチドを有するビーズは、各々の合成サイクルの後で、目視により青色のままであった。
１４．３’－ブロック可逆性ターミネーターヌクレオチドの開発およびオリゴヌクレオチド合成における使用
ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの酵素による合成のための新たなヌクレオシド三リン酸を開発した。ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド治療剤を含む多様な適用において用いることができる。ヌクレオシド三リン酸を、糖環の３’－位においてブロッキング基により可逆的に終結させ、これは、成長中のオリゴヌクレオチドに（ｎ＋１）の伸長のみを与える；伸長反応は、さらなる伸長が起こり得る３’－位において遊離のヒドロキシル基（－ＯＨ）を生成しない。ブロッキング基は、温和な生体適合性の脱保護剤により取り除くことができる。この戦略は、２’位または塩基において実質的なブロッキングを与え、ここで、成長中のオリゴヌクレオチドが、化学的にブロックされるのではなく、むしろ立体的にブロックされる（これらはまた、「実質的ターミネーター（virtual terminator）」としても知られる）。
いくつかの例において、３’－ブロッキング戦略は、ブロッキングする化学的ドメインを収容する適合性の酵素（例えば、本明細書において記載される変異誘発したポリ（Ｕ）ポリメラーゼ）を必要とする。下に列記されるとおり、３’－ブロッキング戦略のために用いることができる多数の化学的ドメインが存在する。いくつかの例として、これらに限定されないが、３’－Ｏ－アリル三リン酸（３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ）および３’－Ｏ－アジドメチル三リン酸（３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰ）が挙げられる。
新たな３’－で可逆的に終結したヌクレオシド三リン酸は、オリゴヌクレオチド全体に治療上のまたは他の機能的価値を与える複数の修飾を含むことの利点を有していてもよい。ヌクレオシド三リン酸は、３’－可逆性終結基に加えて、単一または複数の修飾を有していてもよい。さらなる保護基なしで、オリゴヌクレオチド中に部位特異的に修飾を導入してもよい。これらのヌクレオシド三リン酸は、それらの組み込みのために適合性の酵素を必要とし、これは、用いられる各々の修飾ヌクレオチドについてユニークな配列または変異体コドンのセットを保持していてもよい。修飾は、化学的ハンドル、リガンド結合ドメイン、オリゴヌクレオチドヌクレアーゼ耐性を与える方法、立体化学的に純粋な（stereopure）チオホスホネートオリゴヌクレオチド、所望されるオリゴヌクレオチド二次構造を形成するための傾向を与える方法、または望ましくないオリゴヌクレオチド二次構造を形成することに対して耐性を与える方法などとして現れる。これは、以下を含む：
ｉ． フラノース環の２’－ドメインに対する修飾、これは、ヒドロキシル（－ＯＨ）、水素（－Ｈ）、フルオロ（－Ｆ）、アミン（－ＮＨ３）、アジド（－Ｎ３）、チオール（－ＳＨ）、メトキシ（－ＯＣＨ３）、メトキシエタノール（－ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、酸化還元活性、蛍光発生性または内因的に蛍光の部分、天然および非天然のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、単糖またはオリゴ糖、機能的／リガンド結合性グリカン、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの大きい／かさばる基を含んでもよいが、これらに限定されない；
ｉｉ． 三リン酸のアルファ（α）リン酸に対する修飾、ここで、立体化学的に純粋なオリゴヌクレオチドを生成するために、チオホスホネートのＲまたはＳのいずれかの異性体がオリゴヌクレオチド中に部位特異的に導入される；
ｉｉｉ． 三リン酸のベータ（β）およびガンマ（γ）リン酸に対する修飾：ここで、いずれか、および／または両方の修飾が、酵素によるオリゴヌクレオチド合成スキームに価値を与える；例えば、ピロリン酸生成の結果としての望ましくない加ピロリン酸分解を予防または限定するため；
ｉｖ． フラノース環への修飾、これは、環の酸素を硫黄で置き換えること、または２’－酸素と４’－炭素との間に環の立体構造を限定する架橋を導入することであってよいが、これらに限定されない；
ｖ． ヌクレオベースに対する修飾、ここで、塩基は、天然または非天然のピリミジンまたはプリンであり、Ｎ１－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、８’－アジド－アデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－アデノシン、アミノアリル－アデノシン、５’－メチル－ウリジン、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５’－ヒドロキシ－メチル－ウリジン、２’－チオ－ウリジン、４’－チオ－ウリジン、ヒポキサンチン、キサンチン、５’－メチル－シチジン、５’－ヒドロキシ－メチル－シチジン、６’－チオ－グアニン、およびＮ７－メチル－グアニンを含んでもよいが、これらに限定されない。
合成の完了時に、オリゴヌクレオチドは、さらなる機能的または治療的価値を与え得る最後の３’－ブロックヌクレオシド三リン酸により不可逆的にキャッピングされてもよい。これはまた、適合性の酵素（例えば、変異したポリ（Ｕ）ポリメラーゼ酵素)の使用を必要としてもよく、本明細書において記載される修飾基であってもよい。加えて、フラノース環についての３’－および２’－の両方のドメインは、同じまたは異なる基により、不可逆的にブロックしてもよい。
モノ－ヌクレオシド三リン酸に加えて、ジ－ヌクレオシド三リン酸、トリ－ヌクレオシド三リン酸、およびＮ－ヌクレオシド三リン酸（ここで、Ｎ＝長さがＮの三リン酸化オリゴヌクレオチド）は、適合性の酵素触媒を用いて、効果的にオリゴヌクレオチドリガーゼを作製し、組み込みのための基質として用いることができる。
いくつかの場合において、新たなヌクレオシド三リン酸の付加は、切断可能なハンドルを導入し得、これは、合成後のプロセッシングおよび精製のための化学的または生物学的手段により作用を受けることができる。例えば、ヒポキサンチン（イノシン）基を有するオリゴヌクレオチドは、エンドヌクレアーゼＶにより、部位特異的に切断することができる。このことは、オリゴヌクレオチドの固相合成のために特に有用であり、ここで、結合したオリゴヌクレオチドイニシエーターを、無制限に再利用することができる。
野生型および変異したポリ（Ｎ）ポリメラーゼによる、酵素によるオリゴヌクレオチド合成
Ｈ３３６変異体が、天然のヌクレオチドＧＴＰ－「Ｇ」およびＣＴＰ－「Ｃ」を組み込む能力のゲル電気泳動分析を、図１８Ａ～１８Ｄにおいて示す。ブランク反応に、酵素およびヌクレオチドを除く全ての構成成分を補充した。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。
野生型ポリ（Ｕ）ポリメラーゼと比較した、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒが天然およびアナログのヌクレオチドのアレイを組み込む能力のゲル電気泳動分析を、図１９Ａ～１９Ｆにおいて示す。図１９Ａ、１９Ｄは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＡＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。図１９Ｂ、１９Ｅは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体についての、ＵＴＰおよびＩＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。図１９Ｃ、１９Ｆは、それぞれ野生型およびＨ３３６Ｒ変異体について、ＣＴＰおよびＧＴＰベースのヌクレオチドについての伸長結果を表す。全ての反応を、１ｍＭのヌクレオチド、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、および１μｇの酵素と共に、３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲルを、伸長反応分析のために用いた。
特に位置Ｈ３３６における、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、２’－メトキシ－アデノシン三リン酸（２’－Ｏ－Ｍｅ－ＡＴＰ）の制御されていない組み込みを、図２０において示す；単変異体をここで、野生型（ＷＴ）と比較して示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
特に位置Ｎ１７１における、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、２’－フルオロ－アデノシン三リン酸（２’－Ｆ－ＡＴＰ）の制御されていない組み込みを、図２１において示す；単変異体をここで、変異体Ｈ３３６Ｒと比較して示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
特に位置Ｎ１７１における、多様なS. pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体による、３’－メトキシ－アデノシン三リン酸（３’－Ｏ－Ｍｅ－ＡＴＰ）の制御された組み込み（キャッピング）を、図２２において示す；単変異体をここで、変異体Ｈ３３６Ｒおよび野生型と比較して示す。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。注意：野生型試料は、陽性の組み込みを示すが、厳しい加ピロリン酸分解が起きる。陰性反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
多様なS. pombe変異体による、可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸（３’－（Ｏ－アリル）－ＡＴＰ）の制御された組み込みを、図２３において示す。陰性反応は、酵素を除く全ての反応成分を含んだ。試料を変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ二重変異体Ｈ３３６Ｒ－Ｎ１７１Ａによる、可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルカーボネートデオキシアデノシン三リン酸（３’－（Ｏ－アリルカーボネート）－ｄＡＴＰ）の制御された組み込みを、図２４において示す。ゲルの画像は、様々なインプット量のイニシエーターオリゴヌクレオチド（２ｐｍｏｌ／ｒｘｎ、５ｐｍｏｌ／ｒｘｎおよび１０ｐｍｏｌ／ｒｘｎ）を漸増量の精製酵素ストック（２μＬ、４μＬおよび６μＬ）と共に示す。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。
可逆性ターミネーター３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸３’－（Ｏ－アリル）－ＡＴＰ）による精製されたポリ（Ｕ）ポリメラーゼストックＨ３３６Ｒの反応較正評価を、図２６において示す。ゲルは、イニシエーターオリゴヌクレオチドのインプットが漸増する場合の、（ｎ＋１）伸長の応答を示す。反応に、１ｍＭの可逆性ターミネーターヌクレオチドおよび１μＬの精製酵素ストックを補充する。反応を５分間にわたり３７℃でインキュベートした。上のバンドは、（ｎ＋１）生成物を示す。ブランク反応は、酵素を除く全ての構成成分を含む。試料を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルで分析した。これは、反応スケーラビリティの一例である。
バルク溶液中で、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ変異体Ｈ３３６Ｒを、３’－Ｏ－アリルアデノシン三リン酸（３’－Ｏ－アリル－ＡＴＰ）および可逆性ターミネーターと共に用いた、制御された酵素による合成の実証を、図２７において示す。ここで示されるのは、バルク溶液中での（ｎ＋５）合成である。合成後、反応を、変性条件下において、１５％のＴＢＥ－ウレアゲルを用いて分析した。
３’－可逆性ターミネーター構造および合成
酵素による組み込みのための３’－可逆性ターミネーターヌクレオチドの例示的な構造を、図２８において示す。３’ヒドロキシについての多様な保護基の例。ラベルされるとおり、これらは、酸化還元化学、光、フッ化物アニオンおよび触媒を通して、取り除くことができる。
フラニル環が酸素を有する場合の３’保護基の選択を、図２９および３０において示す。２’は、結合、薬物動態学、薬力学、一般的な安定性およびプローブタグを促進する、天然のリボ、デオキシまたは多様な部分であってよい。
ヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを、図３１において示し、ここで、２’は、天然のＯＨもしくは－Ｆ、－ＯＭｅ、－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３または標的オリゴの生物学的活性のために有益であるか、科学のより広範な影響に寄与することが証明されている他のものなどの、多様な修飾であってよい。
ロックドヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを、図３２において示す。
ヌクレオチド三リン酸のための３’アリルエーテルの調製のための例示的なスキームを、図３３において示し、ここで、２’は、天然のＯＨ、もしくはＦ、ＯＭｅ、ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、または標的オリゴの生物学的活性のために有益であるか、科学のより広範な影響に寄与することが証明されている他のものなどの、多様な修飾であってよい。
ロックドヌクレオチド三リン酸のための３’アジドメチルエーテルの調製のための例示的なスキームを、図３４において示す。
配列
ヒトポリメラーゼミューＲ３８７Ｋ（配列番号１）
MLPKRRRARVGSPSGDAASSTPPSTRFPGVAIYLVEPRMGRSRRAFLTGL
ARSKGFRVLDACSSEATHVVMEETSAEEAVSWQERRMAAAPPGCTPPALL
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GLPHFGEHSSRVVQELLEHGVCEEVERVRRSERYQTMKLFTQIFGVGVKT
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Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼ（配列番号２）
MSSQKVFGITGPVSTVGATAAENKLNDSLIQELKKEGSFETEQETANRVQ
VLKILQELAQRFVYEVSKKKNMSDGMARDAGGKIFTYGSYRLGVHGPGSD
IDTLVVVPKHVTREDFFTVFDSLLRERKELDEIAPVPDAFVPIIKIKFSG
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CSAVILNRFFIILSEWNWPQPVILKPIEDGPLQVRVWNPKIYAQDRSHRM
PVITPAYPSMCATHNITESTKKVILQEFVRGVQITNDIFSNKKSWANLFE
KNDFFFRYKFYLEITAYTRGSDEQHLKWSGLVESKVRLLVMKLEVLAGIK
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DHKVFNLALRFVKGYDLPDEVFDENEKRPSKKSKRKNLDARHETVKRSKS
DAASGDNINGTTAAVDVN
Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ（配列番号３）
MNISSAQFIPGVHTVEEIEAEIHKNLHISKSCSYQKVPNSHKEFTKFCYE
VYNEIKISDKEFKEKRAALDTLRLCLKRISPDAELVAFGSLESGLALKNS
DMDLCVLMDSRVQSDTIALQFYEELIAEGFEGKFLQRARIPIIKLTSDTK
NGFGASFQCDIGFNNRLAIHNTLLLSSYTKLDARLKPMVLLVKHWAKRKQ
INSPYFGTLSSYGYVLMVLYYLIHVIKPPVFPNLLLSPLKQEKIVDGFDV
GFDDKLEDIPPSQNYSSLGSLLHGFFRFYAYKFEPREKVVTFRRPDGYLT
KQEKGWTSATEHTGSADQIIKDRYILAIEDPFEISHNVGRTVSSSGLYRI
RGEFMAASRLLNSRSYPIPYDSLFEEAPIPPRRQKKTDEQSNKKLLNETD
GDNSE
材料および方法
酵素の発現および精製
カスタム最適化アルゴリズムを用いて、目的の野生型または変異体酵素の一次配列をE. coliでの発現のために最適化し、ｐＥＴ－２８－ｃ－（＋）Ｈｉｓタグ発現ベクター（EMD Millipore 69866-3）中へのギブソン・アセンブリのための２０－ｎｔのオーバーラップ配列を有するgBlocks（登録商標）（IDT）として注文した。IDTからのフォワードおよびリバースプライマーを用いて、Phusion High Fidelity（ＨＦ）ポリメラーゼ（NEB M05030）により、gBlocks（登録商標）をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲのサーモサイクリングは、以下のとおり行った：９８℃での３０秒間にわたる初期変性、９８℃での１０秒間にわたる変性、６８℃での１０秒間にわたるアニーリングおよび７２℃での６０秒間にわたる伸長を１８サイクル、その後、５分間の７２℃での最後の伸長。QIAquick ＰＣＲ精製キット（Qiagen 28106）を用いて、ＰＣＲ反応物を精製し、濃縮した。
環状ＤＮＡを、ベクター５００ｎｇあたり４０ＵのＮＤｅＩ（NEB R0111）により３７℃で９０分間にわたり消化することにより、gBlocks（登録商標）挿入のためのｐＥＴ－２８－ｃ－（＋）発現ベクターを調製した。２％アガロースゲル電気泳動により、直鎖状ＤＮＡに対応するバンドを含むアガロースを、バッファーＱＧ（Qiagen 19063）中で５５℃で１０００ＲＰＭで２時間にわたり回転させながらインキュベートすることにより、直鎖状ＤＮＡを未消化の材料から分離し、抽出した。結果として生じた混合物を、QIAquick ＰＣＲ精製キットにより、浄化し、濃縮した。ＰＣＲで増幅されたインサートとベクター配列とを、１：３の比で、０．１ｐｍｏｌの合計材料で組み合わせ、Gibson Assembly Master Mix（NEB E5510S）により、５０℃で１時間にわたりアセンブリした。T7 ExpressケミカルコンピテントE. coli（NEB C2566I）を、製造者の指示に従って完全にアセンブリしたプラスミドにより形質転換し、ＬＢ－カナマイシンプレート（５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン）上で陽性の形質転換体について選択した。
細菌のコロニーをシークエンシングし（Genewiz、Ｔ７－フォワードプライマー、Ｔ７ Ｔｅｒｍ－リバースプライマー）、完全な一致を有するものを、液体ＬＢ－カナマイシン培地（５０μｇ／ｍＬカナマイシン）中で一晩増殖させ、フレッシュな液体ＬＢ－カナマイシン中で１：４００に希釈し、１ｍＭのＩＰＴＧ（Sigma I6758）で約ＯＤ６００＝０．８において誘導した。誘導した液体培養物を、１５℃で一晩、２５０ＲＰＭで振盪しながらインキュベートした。次いで、培養物を３５００×ｇで１０分間にわたりペレット化し、次いで、HisTalonレジンキットを製造者の指示に従って用いてＨｉｓ－タグを精製した（Clontech 635654）。溶離させた酵素試料を、次いで、１５－ｍＬのフィルターカラム（Millipore）を適切なＭＷＣＯにおいて用いて、５０００×Ｇでの１５分間にわたる４℃での遠心分離により、最適な２×タンパク質保存バッファーにバッファー交換した。このプロセスを２回繰り返した。３回目のスピンにおいて、タンパク質をより小さな容積に濃縮するために、試料を３０分間にわたりスピンした。
Reducing Agent Compatible MicroBCAキット（Thermo 23252）を用いて全体的なタンパク質濃度を決定するために、および、１６％のトリス－Ｇｌｙ変性ゲル（Thermo XP00165）を１０－２５０ｋＤａタンパク質ラダー（Thermo 26619）と共に用いて、Ｈｉｓ－タグ精製されたタンパク質のサイズを決定するために、２つの小さなアリコートを取り分けた。ゲル電気泳動の後で、ゲルを、クマシーオレンジ蛍光（Coomassie Orange Fluor：Thermo C33250）で２０分間にわたり室温で温和な撹拌下において染色し、GelDoc Image Station（Biorad）を用いて可視化した。残りの濃縮されたタンパク質のストックを、無菌グリセロールで１：２に希釈し、－２０℃で保存した。
ＲＮＡ合成を改善するための標的タンパク質の部位特異的変異誘発
合理的設計による、またはエラープローンＰＣＲなどのハイスループット法による、ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成スキームにおける改善のために、単一または複数のアミノ酸を変異誘発することができる。MiniPrepキット（Qiagen 27104）を用いて、ＬＢ－カナマイシン培地中で３７℃で一晩培養された、配列が検証された液体の細菌培養物から、標的タンパク質を担持するプラスミドを収集し、精製した。オリゴヌクレオチドプライマーは、IDTからオーダーされ、タンパク質発現プラスミドをＰＣＲ増幅しつつ、予め決定された位置においてプラスミドに同時に変異誘発し、直鎖化されたＤＮＡを生じるように設計された。Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit（NEB E0554S）からの試薬を用いて、Q5 Hot Start High-Fidelity 2×Master Mixを用いて、以下のサーモサイクリング条件により、タンパク質発現プラスミドをＰＣＲ増幅した：９８℃での３０秒間にわたる初期変性、９８℃での１０秒間にわたる変性、６８℃での１０秒間にわたるアニーリングおよび７２℃での１２０秒間にわたる伸長を２５サイクル、その後、２分間の７２℃での最終伸長。結果として生じるＰＣＲ増幅反応のうちの１μＬを、次いで、キットの酵素反応カクテルで処置し、タンパク質発現プラスミドを再環化させつつ、反応混合物中に残る未置換のプラスミド配列を消化した。細菌の形質転換および配列の検証の後で、完全な配列の一致を有するコロニーを用いて、先に概説される方法により、部位特異的変異体タンパク質を発現させ、分析した。結果として生じた精製された変異誘発されたタンパク質を、濃縮し、先に言及されるとおり適切な２×保存バッファーにバッファー交換し、無菌グリセロールで１：２に希釈し、－２０℃で保存した。
天然のｒＮＴＰによる初期活性スクリーニング
発現されたターミナルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質を、総ＲＮＡ濃度に関してＲＮＡ生成の速度、および天然のｒＮＴＰとのインキュベーションの後でタンパク質により生成されたＲＮＡの長さ／分布を決定することにより、スクリーニングした。ＲＮＡ生成の速度を測定するために、１０ｐｍｏｌの短鎖５’－Ｃｙ５標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチド（１５－２０－ｎｔ）、１００μＭのｒＮＴＰ、０．２５ｍＭの二価のカチオンコファクター（Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋、またはこれらの組み合わせなど）、１×反応バッファー、１×SYBR Dye（GelStar（Lonza 50535）、Qubit ssDNA Dye（Thermo Q10212）、またはSYBR Green II RNAゲルステイン（Thermo S7564）、および１μＬの精製酵素からなる１０μＬのバルク伸長反応を、プレートリーダーにおいて（ＥＸ：５９８ｎｍ、ＥＭ：５２２ｎｍ）３０分間にわたり３７℃でモニタリングし、１分毎に三つ組（Ｎ＝３）においてシグナル読み値を取得した。カスタムのＲスクリプトを用いて、時間の関数としてプロットされた平均ＲＦＵのの最良近似曲線（best fit curve）の傾きから、ＲＮＡ生成の速度、およびその後に酵素初期活性（Ｖｏ）を決定した。これらの反応において生成されたＲＮＡの長さを、１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲル（Thermo EC6885）を製造者のプロトコルに従って用いて、生成物を１００－ｎｔのｓｓＤＮＡラダー（Simplex Biosciences）と比較することにより決定した。約８μＬの初期活性スクリーン反応容積を、ゲルにロードし、別段に特定されない限り、１８５Ｖで６０分間にわたり流した。次いで、ゲルを、１×GelStar核酸ステインまたはSYBR Green II RNAゲルステインの溶液で、１５分間にわたり温和に撹拌しながら染色した。結果として生じたゲルを、次いで、Typhoon FLA 9500システム（GE Healthcare Life Sciences）において、SYBR Goldについてのイメージングパラメーターを用いてイメージングした。ＦＡＭ、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの５’－フルオロフォアで標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いた伸長反応について、ゲルは、染色せず、適切なパラメーターを用いて直接イメージングした。
酵素活性アッセイ－天然およびアナログのヌクレオチドによる制御されていない伸長
制御されていない伸長反応は、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、１ｍＭの天然またはアナログのヌクレオチド、１×ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ反応バッファー（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９、２５℃）、および１μｇの精製酵素からなった。天然およびアナログのヌクレオチドは、市販のソースから購入するか、インハウスでカスタム合成した。反応を、３７℃で３０分間にわたりインキュベートし、すぐに、１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲル（Thermo EC6885）を製造者の指示に従って用いて、ゲル電気泳動により分析した。これらの反応において生成されたオリゴヌクレオチドの長さを、生成物を１００－ｎｔのｓｓＤＮＡラダー（Simplex Biosciences）と比較することにより決定した。次いで、ゲルを、１×GelStar核酸ステインまたはSYBR Green II RNAゲルステインの溶液で、１５分間にわたり温和に撹拌しながら染色した。結果として生じたゲルを、次いで、Typhoon FLA 9500システム（GE Healthcare Life Sciences）において、SYBR Goldについてのイメージングパラメーターを用いてイメージングした。ＦＡＭ、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの５’－フルオロフォアで標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いた伸長反応について、ゲルは、染色せず、適切なパラメーターを用いて直接イメージングした。
酵素活性アッセイ－天然およびアナログの可逆性ターミネーターヌクレオチドによる制御された伸長
制御された伸長反応は、５ｐｍｏｌのイニシエーターオリゴヌクレオチド、１ｍＭのブロッキングされた可逆性ターミネーターヌクレオチド、１×ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ反応バッファー（１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９、２５℃）、および１μｇの精製酵素からなった。反応を３７℃で１分間にわたりインキュベートし、すぐに、１５％のＴＢＥ－ウレア変性ゲル（Thermo EC6885）を製造者の指示に従って用いて、ゲル電気泳動により分析した。（Ｎ＋１）のイベントの成功を、ヌクレオチドまたは酵素が補充されなかったブランク伸長反応を流すことにより決定した。次いで、ゲルを、１×GelStar核酸ステインまたはSYBR Green II RNAゲルステインの溶液で、１５分間にわたり温和に撹拌しながら染色した。結果として生じたゲルを、次いで、Typhoon FLA 9500システム（GE Healthcare Life Sciences）において、SYBR Goldについてのイメージングパラメーターを用いてイメージングした。ＦＡＭ、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの５’－フルオロフォアで標識されたイニシエーターオリゴヌクレオチドを用いた伸長反応について、ゲルは、染色せず、適切なパラメーターを用いて直接イメージングした。
酵素活性アッセイ－表面における制御されていない、または制御された伸長反応
制御されていない、および制御された伸長反応は、いずれも表面結合イニシエーターオリゴヌクレオチドを用いて行うことができる。表面結合イニシエーターオリゴヌクレオチドは、IDTから、５’－アミンＣ６スペーサー基および内部Ｃｙ５フルオロフォアと共に得た。このオリゴヌクレオチドを、次いで、EZ Link NHS-PEG12-ビオチンキット（Thermo A35389）を製造者の指示に従って用いてビオチン化およびＰＥＧ化し、次いで、Oligonucleotide Clean and Concentrator スピンカラムキット（Zymo D4060）を用いて浄化して濃縮した。誘導体化されたイニシエーターオリゴヌクレオチドを、次いで、オリゴヌクレオチドを２×結合および洗浄バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）２５℃）と共に、プレートのウェル中で温和に撹拌しながら（３００ＲＰＭ）１時間にわたりインキュベートすることにより、ストレプトアビジンコートされたＰＣＲプレート（BioTez, Germany）の表面に結合させた。ウェルを、次いで吸引して、次いで１×結合および洗浄バッファーで１回洗浄した。先に記載されるとおり伸長反応カクテルを作り、表面結合オリゴヌクレオチドと共に、予め決定された時間（制御されていないものについては３０分、および制御されたものについては１分）にわたり、９００ＲＰＭで振盪しながら３７℃でインキュベートした。ウェルを、次いで１×結合および洗浄バッファーを用いて再び洗浄した。伸長されたオリゴヌクレオチドを表面から取り除くために、ウェルを、剥離溶液（９５％ホルムアミド、１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）２５℃）と共に、６５℃で５分間にわたりインキュベートした。剥離溶液中に懸濁されたオリゴヌクレオチドを、次いで、オリゴヌクレオチドスピンカラムを用いて浄化して精製し、６μＬのｄｉＨ２０中に溶出させた。表面伸長反応を、次いで、先に記載されるとおり、ゲル電気泳動を用いて分析した。

参考文献
Figure 2022504712000016
Figure 2022504712000017
Figure 2022504712000018
Figure 2022504712000019
Figure 2022504712000020
均等物および範囲
請求の範囲において、「a」、「an」および「the」などの冠詞は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、１つまたは１つより多くを意味し得る。群の１つ以上のメンバーの間に「or」を含む請求項または説明は、文脈から逆であることが示されるか、または別段に明らかでない限り、当該群のメンバーの１つ、１つより多く、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する場合に、満たされるとみなされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。本発明は、群のメンバーのうちの１つより多くまたは全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、これにおいて使用されるか、またはこれに別段に関連する態様を含む。
さらに、本発明は、列記される請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の限定要因、要素、条項および説明的用語が、別の請求項中に導入される、全てのバリエーション、組み合わせおよび順列を包含する。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つ以上の限定要因を含むように改変することができる。要素がリストとして、例えばマーカッシュ群の形式において提示される場合、要素の各々のサブグループもまた開示され、任意の要素を、群から取り除くことができる。一般的に、本発明、または本発明の側面が、特定の要素および／または特徴を含むものとして言及される場合、本発明のある態様または本発明の側面は、かかる要素および／または特徴からなるか、またはこれらから本質的になることが、理解されるべきである。平易さのために、これらの態様は、本明細書において、文章によっては具体的には記載されていない。
また、用語「含むこと（comprising）」および「含むこと（containing）」は、オープンであることを意図され、さらなる要素またはステップの包含を許容することに注意する。範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、別段に示されるかまたは文脈および当業者の理解から別段に明らかでない限り、範囲として表現された値は、本発明の異なる態様における記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が明らかに別段に示さない限り、当該範囲の単位の１０分の１まで、仮定し得る。
本願は、多様な発行された特許、公開された特許出願、学術雑誌の記事、および他の刊行物を引用し、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。援用される参考文献のうちのいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が支配すべきである。加えて、本発明の任意の特定の態様であって、先行技術に該当するものは、請求項のうちの任意の１つ以上から明示的に除外される。かかる態様は、当業者に公知であるとみなされるので、それらは、除外が本明細書において明示的に記載されない場合においてすら、除外することができる。本発明の任意の特定の態様は、任意の請求項から、任意の理由のために、先行技術の存在に関係するか否かにかかわらず、除外することができる。
当業者は、慣用的な実験のみを用いて、本明細書において記載される特定の態様に対する多くの均等物を認識するか、またはこれらを確認することができるであろう。本明細書において記載される本態様の範囲は、上の説明に限定することを意図されず、むしろ、添付される請求の範囲において記載される。当業者は、以下の請求の範囲において定義されるような本開示の精神または範囲から逸脱することなく、この記載に対して多様な変更および改変を行うことができることを理解するであろう。

Claims (122)

  1. 鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
    （ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
    （ｂ）ポリ（Ｎ）ポリメラーゼを提供すること；
    （ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの修飾ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｎ）ポリメラーゼ、および１つ以上の修飾ヌクレオチドを組み合わせること；
    を含む、前記方法。
  2. （ｄ）所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
    をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、１つ以上の天然のまたは修飾されたヌクレオチドを、結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドの３’末端に付加することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. ポリ（Ｎ）ポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ポリ（Ｃ）ポリメラーゼ、またはポリ（Ｇ）ポリメラーゼ；またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. ポリ（Ｎ）ポリメラーゼが、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. ポリ（Ａ）ポリメラーゼが、野生型Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項５に記載の方法。
  7. ポリ（Ａ）ポリメラーゼが、野生型Saccharomyces cerevisiaeのポリ（Ａ）ポリメラーゼである、請求項５に記載の方法。
  8. ポリ（Ｎ）ポリメラーゼが、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  9. ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体、またはそれらのホモログである、請求項８に記載の方法。
  10. ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、請求項８に記載の方法。
  11. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、塩基修飾ヌクレオチドである、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 塩基修飾ヌクレオチドが、５－メチルシトシン、ピリジン－４－オン、ピリジン－２－オン、フェニル、シュードウラシル、３－メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５－アルキルシチジン、５－アルキルウリジン、５－ハロウリジン、６－アザピリミジン、６－アルキルピリミジン、プロピン、キューオシン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、４－アセチルチジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、β－Ｄ－ガラクトシルキューオシン、１－メチルアデノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、３－メチルシチジン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メチルカルボニルメチルウリジン、５－メチルオキシウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、β－Ｄ－マンノシルキューオシン、ウリジン－５－オキシ酢酸、２－チオシチジン、Ｎ１－メチル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、８’－アジド－アデニン、Ｎ，Ｎ－ジメチル－アデノシン、アミノアリル－アデノシン、５’－メチル－ウリジン、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５’－ヒドロキシ－メチル－ウリジン、２’－チオ－ウリジン、４’－チオ－ウリジン、ヒポキサンチン、キサンチン、５’－メチル－シチジン、５’－ヒドロキシ－メチル－シチジン、６’－チオ－グアニン、およびＮ７－メチル－グアニン、スレオニン誘導体、ピリミジン誘導体、およびプリン誘導体からなる群より選択される修飾塩基を含む、請求項１１に記載の方法。
  13. 塩基修飾ヌクレオチドが、Ｎ１－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチルアデノシン－５’－三リン酸、Ｎ６－メチル－２－アミノアデノシン－５’－三リン酸、５－メチルウリジン－５’－三リン酸、Ｎ１－メチルシュードウリジン－５’－三リン酸、シュードウリジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルウリジン－５’－三リン酸、５－メチルシチジン－５’－三リン酸、５－ヒドロキシメチルシチジン－５’－三リン酸、Ｎ７－メチルグアノシン－三リン酸、８’－アジドアデノシン－５’－三リン酸、イノシン５’－三リン酸、２－チオウリジン－５’－三リン酸、６－チオグアノシン－５’－三リン酸、４－チオウリジン－５’－三リン酸、およびキサントシン－５’－三リン酸からなる群より選択される、請求項１１に記載の方法。
  14. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、糖修飾ヌクレオチドである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－位において修飾される、請求項１４に記載の方法。
  16. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－Ｆ、２’－Ｏ－アルキル、２’－アミノ、または２’－アジド修飾ヌクレオチドである、請求項１４に記載の方法。
  17. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－フルオロ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸、および２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸からなる群より選択される２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
  18. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルシチジン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルグアノシン－５’－三リン酸、２’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸、および２’－Ｏ－メチルイノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
  19. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、および２’－アミノ－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される２’－Ｏ－アミノ修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
  20. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－アジド－２’－デオキシシチジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン－５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン－５’－三リン酸、および２’－アジド－２’－デオキシグアノシン－５’－三リン酸からなる群より選択される２’－Ｏ－アジド修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載の方法。
  21. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、修飾された三リン酸を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、架橋ヌクレオチドまたはロックドヌクレオチドである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 糖修飾ヌクレオチドが、２’－修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドである、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 糖修飾ヌクレオチドが、３’修飾された可逆性ターミネーターヌクレオチドである、請求項１３～２２のいずれか一項に記載の方法。
  25. 鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
    （ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
    （ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
    （ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、ならびに２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドを、組み合わせること；
    （ｄ）ステップ（ｃ）において２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドの保護された２’および／または３’－Ｏ－位において形成されたＲＮＡオリゴヌクレオチドを脱保護すること；
    （ｅ）任意に、所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
    を含む、前記方法。
  26. 可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ位において酸素保護基により保護された２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
  27. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ位において感光性保護基により保護されている、請求項２６に記載の方法。
  28. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ－アルキル、２’－Ｏ－シリル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｏ－アジドメチル、２’－Ｏ－ベンジル、２’－Ｏ－クマリニル、または２’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ－アリルオキシカルボニルおよび２’－Ｏ－（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）メチルオキシカルボニルから選択される２’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、請求項２８に記載の方法。
  30. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、２’－Ｏ－アリル－ＮＴＰまたは２’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰｄである、請求項２５または２６に記載の方法。
  31. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、修飾塩基部分を含む、請求項２５～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. ２’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、１つ以上のさらなる修飾を含む、請求項２５～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ位において酸素保護基により保護された３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
  34. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ位において感光性保護基により保護されている、請求項３３に記載の方法。
  35. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ－アルキル、３’－Ｏ－シリル、３’－Ｏ－アリル、３’－Ｏ－アジドメチル、３’－Ｏ－ベンジル、３’－Ｏ－クマリニル、または３’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、請求項３２または３４に記載の方法。
  36. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ－アリルオキシカルボニルおよび３’－Ｏ－（２－オキソ－２Ｈ－クロメン－４－イル）メチルオキシカルボニルから選択される３’－Ｏ－カーボネート修飾ヌクレオチドである、請求項３５に記載の方法。
  37. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ｄＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ＮＴＰ、または３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ｄＮＴＰである、請求項２５または３３に記載の方法。
  38. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、修飾塩基部分を含む、請求項３１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、１つ以上のさらなる修飾を含む、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. ２’および／または３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、以下の式：
    Figure 2022504712000021
     式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲＰは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；
    のもの、またはその塩である、請求項２５に記載の方法。
  41. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、以下の式：
    Figure 2022504712000022
     式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；
    Ｒは、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールであり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；
    のもの、またはその塩である、請求項３３に記載の方法。
  42. ３’－Ｏ－保護可逆性ターミネーターヌクレオチドが、以下の式：
    Figure 2022504712000023
     式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である
    のもの、またはその塩である、請求項３３に記載の方法。
  43. 鋳型に依存しないＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって、以下：
    （ａ）イニシエーターオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、イニシエーターオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡである；
    （ｂ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
    （ｃ）イニシエーターオリゴヌクレオチドの３’末端への少なくとも１つの加水分解性ヌクレオチドの付加のために十分な条件下において、イニシエーターオリゴヌクレオチド、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、１つ以上のヌクレオチド、および１つ以上の非加水分解性ヌクレオチドを組み合わせること、ここで、非加水分解性ヌクレオチドの濃度は、ポリ（Ｕ）ポリメラーゼによる１つ以上のヌクレオチドの付加の速度を阻害するために十分である；
    を含む、前記方法。
  44. （ｄ）所望されるＲＮＡ配列が得られるまで、ステップ（ａ）～（ｃ）を繰り返すこと；
    をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 非加水分解性ヌクレオチドが、修飾された三リン酸基を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
  46. 非加水分解性ヌクレオチドが、ウリジン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸、アデノシン－５’－［（α，β）－イミド］三リン酸、グアノシン－５’－［（α，β）－メチレノ］三リン酸、シチジン－５’－［（α，β）－メチレノ］三リン酸、アデノシン－５’－［（β，γ）－メチレノ］三リン酸、アデノシン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸、グアノシン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸、およびウリジン－５’－［（β，γ）－イミド］三リン酸からなる群より選択される、請求項４３～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 非加水分解性ヌクレオチドが、３’－修飾ヌクレオチドである、請求項４３または４４に記載の方法。
  48. 非加水分解性ヌクレオチドが、３’－Ｏ－メチルアデノシン－５’－三リン酸および３’－Ｏ－メチルウリジン－５’－三リン酸からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
  49. １～１００個のヌクレオチドが組み込まれる、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. １～５０個のヌクレオチドが組み込まれる、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  51. １～２０個のヌクレオチドが組み込まれる、請求項４３～４８のいずれか一項に記載の方法。
  52. ＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成のための方法であって以下：
    （ａ）第１のオリゴヌクレオチドを提供すること、ここで、第１のオリゴヌクレオチドは、５’－三リン酸基を含む；
    （ｂ）第２のオリゴヌクレオチドを提供すること；
    （ｃ）ポリ（Ｕ）ポリメラーゼを提供すること；
    （ｄ）第２のオリゴヌクレオチドの３’末端への第１のオリゴヌクレオチドのライゲーションのために十分な条件下において、第１および第２のオリゴヌクレオチドならびにポリ（Ｕ）ポリメラーゼを組み合わせること；
    を含む、前記方法。
  53. ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼ、またはそれらの変異体である、請求項２５～５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、野生型Schizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、請求項２５～５２のいずれか一項に記載の方法。
  55. 以下のステップ：
    （ｆ）結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドに対して、逆転写プライミング部位、プライマーおよび逆転写酵素を用いて逆転写を行い、それにより相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡを生成すること；
    をさらに含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。
  56. 以下のステップ：
    （ｇ）ステップ（ｆ）において生成された相補的一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドまたはｃＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼで増幅し、それにより二本鎖ＤＮＡを生成すること；
    をさらに含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ステップ（ｃ）が、クラウディング剤の存在下において行われる、請求項１～５６のいずれか一項に記載の方法。
  58. クラウディング剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項５７に記載の方法。
  59. ステップ（ｃ）が、１つ以上のさらなる酵素の存在下において行われる、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法。
  60. ステップ（ｃ）が、さらなるポリ（Ｎ）ポリメラーゼの存在下において行われる、請求項５９に記載の方法。
  61. ステップ（ｃ）が、酵母の無機ピロホスファターゼ（ＰＰＩ－アーゼ）の存在下において行われる、請求項５９に記載の方法。
  62. ステップ（ｃ）が、ＲＮａｓｅ阻害剤の存在下において行われる、請求項１～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. ステップ（ｃ）が、非加水分解性ヌクレオチドの存在下において行われる、請求項１～６２のいずれか一項に記載の方法。
  64. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、共有結合により固体支持体に連結される、請求項１～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、切断可能なリンカーを通して共有結合により固体支持体に連結される、請求項６４に記載の方法。
  66. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、５～２０ヌクレオチド長である、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、ポリ－ｒＵ、ポリ－ｒＣ、ポリ－ｒＧ、またはポリ－ｒＡである、請求項６６に記載の方法。
  68. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、フルオロフォアまたは生体共役のためのハンドルを含む、請求項１～６７のいずれか一項に記載の方法。
  69. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、逆転写のためのプライマー部位またはＰＣＲのためのプライマーを含む、請求項１～６８のいずれか一項に記載の方法。
  70. イニシエーターオリゴヌクレオチドが、５’キャップを含む、請求項１～６９のいずれか一項に記載の方法。
  71. 結果として生じるＲＮＡオリゴヌクレオチドを単離するステップをさらに含む、請求項１～７０のいずれか一項に記載の方法。
  72. ポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、請求項８～７１のいずれか一項に記載の方法。
  73. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異を含む、請求項７２に記載の方法。
  74. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ｒ変異を含む、請求項７３に記載の方法。
  75. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ｒ変異を含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異を含む、請求項７２～７５のいずれか一項に記載の方法。
  77. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｎ１７１Ａ変異を含む、請求項７６に記載の方法。
  78. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｎ１７１Ａ変異を含む、請求項７７に記載の方法。
  79. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６およびＮ１７１変異を含む、請求項７２～７８のいずれか一項に記載の方法。
  80. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異を含む、請求項７９に記載の方法。
  81. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異を含む、請求項８０に記載の方法。
  82. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異を含む、請求項７９に記載の方法。
  83. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異を含む、請求項８０に記載の方法。
  84. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項７２～８３のいずれか一項に記載の方法。
  85. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項８４に記載の方法。
  86. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６およびＴ１７２変異を含む、請求項７２～８５のいずれか一項に記載の方法。
  87. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項８６に記載の方法。
  88. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項８７に記載の方法。
  89. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２変異を含む、請求項７２～８８のいずれか一項に記載の方法。
  90. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項８５に記載の方法。
  91. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と実質的に同一であり、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項７９に記載の方法。
  92. 請求項１～５２のいずれか一項に記載の方法により調製される、ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
  93. 以下の式：
    Figure 2022504712000024
     式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰの各々の場合は、水素、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であるか、または２個のＲＰは、介在する原子と一緒になって連結されて、任意置換ヘテロシクリルを形成する；ただし、少なくとも１つのＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；
    の化合物、またはその塩。
  94. 以下の式：
    Figure 2022504712000025
     式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；
    Ｒは、水素、ハロゲン、－ＣＮ、－ＮＯ２、－Ｎ３、任意置換アルキル、任意置換アルケニル、任意置換アルキニル、任意置換アリール、任意置換ヘテロアリール、任意置換カルボシクリル、任意置換ヘテロシクリル、任意置換アシル、任意置換ヒドロキシル、任意置換アミノ、または任意置換チオールであり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；
    の化合物、またはその塩。
  95. 以下の式：
    Figure 2022504712000026
    式中：
    Ｙは、ＯまたはＳであり；
    Ｘは、ＯまたはＳであり；
    ＲＰは、酸素保護基、任意置換アシル、またはアミノ酸であり；および
    「塩基」は、天然または非天然のヌクレオチド塩基である；
    の化合物、またはその塩。
  96. ＲＰが、酸素保護基である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の化合物。
  97. ＲＰが、アミノ酸である、請求項９３～９５のいずれか一項に記載の化合物。
  98. ＲＰが、アリル、アジドメチル、アリルカーボネート、またはアジドメチルカーボネートである、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の化合物。
  99. 化合物が、３’－Ｏ－アリル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチル－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ＮＴＰ、３’－Ｏ－アリルカーボネート－ｄＮＴＰ、３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ＮＴＰ、または３’－Ｏ－アジドメチルカーボネート－ｄＮＴＰである、請求項９３～９６のいずれか一項に記載の化合物。
  100. 化合物が、２’－Ｏ－アリル－ＮＴＰまたは２’－Ｏ－アジド－メチル－ＮＴＰである、請求項９３に記載の化合物。
  101. 化合物が、図２８～３４において列挙される式のうちのいずれか１つのものである、請求項９３～１００のいずれか一項に記載の化合物。
  102. Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２から選択される１つ以上の位置において変異を含む、変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼである、ポリメラーゼ。
  103. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異を含む、請求項１０２に記載のポリメラーゼ。
  104. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ｒ変異を含む、請求項１０３に記載のポリメラーゼ。
  105. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ｒ変異を含む、請求項１０４に記載のポリメラーゼ。
  106. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異を含む、請求項１０２～１０５のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
  107. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｎ１７１Ａ変異を含む、請求項１０６に記載のポリメラーゼ。
  108. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｎ１７１Ａ変異を含む、請求項１０７に記載のポリメラーゼ。
  109. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６およびＮ１７１変異を含む、請求項１０２～１０８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
  110. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異を含む、請求項１０９に記載のポリメラーゼ。
  111. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ａ変異を含む、請求項１１０に記載のポリメラーゼ。
  112. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異を含む、請求項１０９に記載のポリメラーゼ。
  113. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６ＲおよびＮ１７１Ｔ変異を含む、請求項１１２に記載のポリメラーゼ。
  114. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１０２～１１３のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
  115. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｔ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１１４に記載のポリメラーゼ。
  116. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６およびＴ１７２変異を含む、請求項１０２～１１５のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
  117. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１１６に記載のポリメラーゼ。
  118. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１１７に記載のポリメラーゼ。
  119. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６、Ｎ１７１およびＴ１７２変異を含む、請求項１０２～１１８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
  120. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１１９に記載のポリメラーゼ。
  121. 変異したSchizosaccharomyces pombeのポリ（Ｕ）ポリメラーゼが、配列番号３と同一であるが、Ｈ３３６Ａ、Ｈ３３６Ｃ、Ｈ３３６Ｄ、Ｈ３３６Ｅ、Ｈ３３６Ｆ、Ｈ３３６Ｇ、Ｈ３３６Ｉ、Ｈ３３６Ｋ、Ｈ３３６Ｌ、Ｈ３３６Ｍ、Ｈ３３６Ｔ、Ｈ３３６Ｖ、Ｈ３３６Ｗ、Ｈ３３６Ｙ、Ｈ３３６Ｎ、Ｈ３３６Ｐ、Ｈ３３６Ｑ、Ｈ３３６Ｒ、Ｈ３３６ＳおよびＨ３３６Ｗからなる群より選択されるＨ３３６変異；Ｎ１７１Ｅ、Ｎ１７１Ｌ、Ｎ１７１Ｑ、Ｎ１７１Ｓ、Ｎ１７１Ｍ、Ｎ１７１Ｄ、Ｎ１７１Ｇ、Ｎ１７１Ｃ、Ｎ１７１Ａ、Ｎ１７１Ｗ、Ｎ１７１Ｔ、Ｎ１７１Ｉ、Ｎ１７１Ｖ、Ｎ１７１Ｐ、Ｎ１７１Ｒ、Ｎ１７１Ｈ、およびＮ１７１Ｋからなる群より選択されるＮ１７１変異；ならびにＴ１７２Ｅ、Ｔ１７２Ｌ、Ｔ１７２Ｑ、Ｔ１７２Ｓ、Ｔ１７２Ｍ、Ｔ１７２Ｄ、Ｔ１７２Ｇ、Ｔ１７２Ｃ、Ｔ１７２Ａ、Ｔ１７２Ｗ、Ｔ１７２Ｔ、Ｔ１７２Ｉ、Ｔ１７２Ｖ、Ｔ１７２Ｐ、Ｔ１７２Ｒ、Ｔ１７２ＨおよびＴ１７２Ｋからなる群より選択されるＴ１７２変異を含む、請求項１２０に記載のポリメラーゼ。
  122. 請求項９３～１０１のいずれか一項に記載の化合物および／または請求項１０２～１２２のいずれか一項に記載のポリメラーゼを含む、キット。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3129393A1 (en) * 2019-02-12 2020-08-20 Dna Script Efficient product cleavage in template-free enzymatic synthesis of polynucleotides.
KR20220052937A (ko) * 2019-07-30 2022-04-28 디엔에이 스크립트 폴리(a) 및 폴리(u) 중합효소를 사용한 폴리뉴클레오타이드의 주형-부재 효소적 합성
US20230313255A1 (en) 2020-07-15 2023-10-05 Dna Script Massively Parallel Enzymatic Synthesis of Polynucleotides
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CN116732020A (zh) * 2022-03-02 2023-09-12 中国科学院分子细胞科学卓越创新中心 提高rna分子的胞内翻译效率和/或稳定性的方法
WO2023183569A1 (en) * 2022-03-25 2023-09-28 Molecular Assemblies, Inc. Methods and apparatus for synthesizing nucleic acids

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2290068A3 (en) * 2004-05-28 2012-01-04 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving microRNA
WO2011038241A1 (en) * 2009-09-25 2011-03-31 President And Fellows Of Harvard College Nucleic acid amplification and sequencing by synthesis with fluorogenic nucleotides
EP2551354A1 (en) * 2011-07-25 2013-01-30 Universität Heidelberg Functionalization of RNA oligonucleotides
US10683536B2 (en) * 2013-04-02 2020-06-16 Molecular Assemblies, Inc. Reusable initiators for synthesizing nucleic acids

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