JP2017514465A - 核酸、特に長い核酸の合成方法、その方法の使用、および、その方法を実施するためのキット - Google Patents
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Abstract
Description
a)前記断片の末端へのXi個のヌクレオチド(Xは1〜5とすることができ、好ましくは1〜3である。iはサイクルの数である。)の酵素的付加段階であって、n+Xi個のヌクレオチドを含む断片を得ることを可能する、第1段階である、以下のステージを含む段階:
−伸長の過程で、第1の支持体に、n個のヌクレオチドを含む最初の核酸断片または核酸断片の第1の末端を付着させる第1の付着ステージ;
−前記核酸断片の第2の末端へのXi個のヌクレオチド(Xは1〜5とすることができ、好ましくは1〜3である。iはサイクルの数である。)の酵素的付加ステージの酵素的付加に必要な試薬を添加する添加ステージ;
−反応溶媒から好ましくない試薬を除去する任意の除去ステージ;
−前記第1の支持体から、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を分離する分離ステージ;
−n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を移動させる第1の移動ステージ;
b)n+Xi個のヌクレオチドを含む正しい配列を有する断片の精製段階であって、第2段階である、以下の連続したステージを含む段階:
−第2の支持体に、第1段階の間に付加したXi個のヌクレオチドを運ぶその末端によって、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を付着させる第2の付着ステージ;
−付加されていない断片および第2の支持体に付着していない断片の除去ステージ;
−前記第2の支持体から、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を分離する分離ステージ;
−反応溶媒から、好ましくない残留試薬を除去する任意の除去ステージ;
c)例えばPCRによる、n+Xi個のヌクレオチドを含む正しい配列を有する断片の増幅、好ましくは酵素的増幅の任意の段階であって、第3段階である、以下の連続したステージを含む段階:
−増幅に必要な試薬を添加する添加ステージ;
−n+Xi個のヌクレオチドを含む断片の増倍率Yiによる増倍ステージ(任意に、可能性のある方法を形成するサブステージから成る)(iはサイクルの数である。Yは1〜4×1010とすることができ、好ましくは1〜109である。);
−n+Xi個のヌクレオチドを含む断片の移動ステージ。
各サイクルは、水性溶媒等の酵素的付加と酵素的増幅に適合する反応溶媒中で実施され、さらに当該合成方法は、iの伸長サイクルの全ての終了時、増倍率Yfによる最終的な増幅ステージを含む。
好ましい実施態様では、増幅に使用されるヌクレオチドは天然型ヌクレオチドである。
本発明は、上記方法によって合成された核酸にも関する。これらの核酸のヌクレオチド配列は、伸長サイクルの実施の間、前記ヌクレオチドの重合の順序を定め、予め決定することができる。しかしながら、ランダムな配列を有する核酸の合成に本発明の方法を使用することが想定され得る。
本発明の構成要件である方法の自動化は、この方法を最適化することができる事前に適合させた任意の装置によって、特に伸長サイクルの持続時間を最小限にすることによって、付加、洗浄操作および流体の流れの正確さを最大化することによって、ならびに、これらのサイクルの様々なステージの間に使用される反応条件を最適化することによって、行うことができる。
本発明はまた、上記の方法を実施するための任意のキットに関し、以下を含むキットである:
−n個のヌクレオチドを含む核酸断片を含む反応媒体;
−ヌクレオチドの付加のための酵素試薬;
−前記酵素的付加試薬によって付加され得るヌクレオチドまたはヌクレオチドの組み合わせ;
−精製ステージのための洗浄および/または緩衝液;
−核酸を増幅するための酵素試薬と、酵素的増幅の試薬に使用できる天然型ヌクレオチドとを含む増幅反応媒体;
−使用説明書。
−合成プライマーとして使用される核酸断片;
−n個のヌクレオチドを含む核酸断片を付着させるための第1の支持体;
−付加された核酸断片を付着させるための第2の支持体;
−ヌクレオチドの付加のための酵素試薬および酵素的付加の試薬によって付加され得るヌクレオチドおよびヌクレオチドの組み合わせを含む付加反応媒体;
−付着、精製および分離ステージのための洗浄および/または緩衝液;
−核酸を増幅するための酵素試薬と、酵素的増幅の試薬に使用できる天然型ヌクレオチドとを含む増幅反応媒体;
−使用説明書。
−第1および/または第2の付着支持体への核酸断片の付着に好ましい緩衝液媒体;および/または
−第1および/または第2の付着支持体からの核酸断片の分離に好ましい緩衝液媒体。
合成方法の特定のステージの間、核酸断片を固定するための付着支持体を用いた本発明の好ましい態様の例示的な実施態様の説明を、図面を参照して以下に記載する。図1〜7は、方法の様々なステージを図式的に表す:
図1:開始断片の固定化;
図2:固定された断片へのヌクレオチドの付加;
図3:洗浄ステージと、付加された核酸断片の分離;
図4:付加された核酸断片の第2の支持体への固定;
図5:付加された核酸断片の脱保護;
図6:増幅ステージ;
図7:前のサイクルからの付加された断片を使用する新しいサイクルの開始;
そして、図8は、酵素的付加段階と、正しい配列の断片の精製段階を実施するための「反応装置」の可能性のある配置図を示す。
そして、合成の終了前または新しい伸長サイクルi+1の実施前には、その後の精製ステージは必要ではない。
これにより合成された核酸は、最後の増幅ステージの後、第2の反応装置の出口17で回収される。
Claims (17)
- 核酸、特に長い核酸の合成方法であって、n個(nは3〜1012)のヌクレオチド(またはn個のヌクレオチドの配列)を含む最初の断片である核酸断片の伸長のサイクルを少なくとも1つ含み、各サイクルが以下のように分割され:
a)前記断片の末端へのXi個のヌクレオチド(Xは1〜5とすることができ、好ましくは1〜3である。iはサイクルの数である。)の酵素的付加段階であって、n+Xi個のヌクレオチドを含む断片を得ることを可能する、第1段階である、以下のステージを含む段階:
−伸長の過程で、第1の支持体に、n個のヌクレオチドを含む最初の核酸断片または核酸断片の第1の末端を付着させる第1の付着ステージ;
−前記核酸断片の第2の末端へのXi個のヌクレオチド(Xは1〜5とすることができ、好ましくは1〜3である。iはサイクルの数である。)の酵素的付加ステージの酵素的付加に必要な試薬を添加する添加ステージ;
−反応溶媒から好ましくない試薬を除去する任意の除去ステージ;
−前記第1の支持体から、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を分離する分離ステージ;
−n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を移動させる第1の移動ステージ;
b)n+Xi個のヌクレオチドを含む正しい配列を有する断片の精製段階であって、第2段階である、以下の連続したステージを含む段階:
−第2の支持体に、第1段階の間に付加したXi個のヌクレオチドを運ぶその末端によって、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を付着させる第2の付着ステージ;
−付加されていない断片および第2の支持体に付着していない断片の除去ステージ;
−前記第2の支持体から、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を分離する分離ステージ;
−反応溶媒から、好ましくない残留試薬を除去する任意の除去ステージ;
c)例えばPCRによる、n+Xi個のヌクレオチドを含む正しい配列を有する断片の増幅、好ましくは酵素的増幅の任意の段階であって、第3段階である、以下の連続したステージを含む段階:
−増幅に必要な試薬を添加する添加ステージ;
−n+Xi個のヌクレオチドを含む断片の増倍率Yiによる増倍ステージ(任意に、可能性のある方法を形成するサブステージから成る)(iはサイクルの数である。Yは1〜4×1010とすることができ、好ましくは1〜109である。);
−n+Xi個のヌクレオチドを含む断片の移動ステージ;
各サイクルが、水性溶媒等の酵素的付加と酵素的増幅に適合する反応溶媒中で実施され、さらに当該合成方法が、iの伸長サイクルの全ての終了時、増倍率Yfによる最終的な増幅ステージを含む方法。 - n+Xi個のヌクレオチドを含む正しい配列の断片の精製段階が、付加されなかった断片および/または他の好ましくない残留試薬の除去を含む請求項1に記載の方法。
- 増幅段階が、正しい配列の断片であるn+Xi個のヌクレオチドを含む配列を有する断片の選択的な増幅であり、誤った配列断片(特に付加されなかった断片)である他の断片の増倍率の10倍を超えて大きい、好ましくは100倍を超えて大きい増倍率によって、反応溶媒中で正しい配列を有する断片を増倍する請求項1または2に記載の方法。
- 第1の支持体および第2の支持体が、異なる性質の付着表面を示し、前記第1および第2の支持体が好ましくは異なっている請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の支持体が、非共有的に、少なくとも3つのヌクレオチドを含む核酸鎖が固定される表面を示し、これらの鎖の前記ヌクレオチドが、最初の断片の第1の末端に存在するヌクレオチドと相補的であり、それらの各塩基の間の水素結合によって、断片の前記第1の末端を固定する請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1および第2の支持体が、ガラスのシート、ポリマー材のシート、または、ビーズの形状であり、好ましくは、これらの支持体のどちらかが、有利には第2の支持体が磁気特性を示す請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- X個のヌクレオチドの付加が、マトリックス鎖の存在なしで、修飾された核酸の重合が可能な酵素の手段による酵素的ルートによって実施される請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素が、テロメラーゼファミリー、トランスリージョン(translesion 損傷乗り越え)酵素ファミリー、鋳型非依存性RNAポリメラーゼファミリーまたはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼファミリーの酵素から選択される請求項7に記載の方法。
- 断片に付加したヌクレオチド(単数または複数)の自由末端には、同じ断片へのX個のヌクレオチドの複数の付加を阻止するために、保護化学基が含まれる請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 第2の支持体をタンパク質などの分子で覆い、これらの分子と前記保護化学基の間の非共有結合を可能にし、したがって、第2の付着ステージの間、付加された断片の固定を可能にする請求項9に記載の方法。
- 前記第2の支持体からn+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片を分離するステージが、pHまたは温度の変更などの反応溶媒の条件の変更によって、または、前記第2の支持体が磁気支持体のとき電磁波放射作用の下で、実施される請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 第1の付着ステージが、開始核酸断片または伸長の過程における核酸断片の5’末端の付着に相当し、第2の付着ステージが、n+Xi個のヌクレオチドを含む前記断片の3’末端の付着に相当する請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素的付加が、5’から3’方向に実施される請求項12に記載の方法。
- 遺伝子、核酸の合成配列またはDNAもしくはRNAの生産のための、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法の使用。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、以下を含むキット:
−n個のヌクレオチドを含む核酸断片を含む反応媒体;
−ヌクレオチドの付加のための酵素試薬;
−前記酵素的付加試薬によって付加され得るヌクレオチドまたはヌクレオチドの組み合わせ;
−精製段階のための洗浄(13、14)および/または緩衝液;
−核酸を増幅するための酵素試薬と、酵素的増幅の試薬に使用できる天然型ヌクレオチドとを含む増幅反応媒体;
−使用説明書。 - 請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、以下を含むキット:
−合成プライマーとして使用される核酸断片;
−n個のヌクレオチドを含む核酸断片を付着させるための第1の支持体(1);
−付加された核酸断片を付着させるための第2の支持体(2);
−ヌクレオチドの付加のための酵素試薬および酵素的付加の試薬によって付加され得るヌクレオチドおよびヌクレオチドの組み合わせを含む付加反応媒体;
−付着、精製および分離ステージのための洗浄(13、14)および/または緩衝液;
−核酸を増幅するための酵素試薬と、酵素的増幅の試薬に使用できる天然型ヌクレオチドとを含む増幅反応媒体;
−使用説明書。 - さらに以下を含む請求項16に記載のキット:
−第1および/または第2の付着支持体への核酸断片の付着に好ましい緩衝液媒体;および/または
−第1および/または第2の付着支持体からの核酸断片の分離に好ましい緩衝液媒体。
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