JP2001520501A

JP2001520501A - 保護ヌクレオチドを使用したホスホジエステル結合の酵素触媒鋳型非依存的製造のための組成物

Info

Publication number: JP2001520501A
Application number: JP50962796A
Authority: JP
Inventors: ハイアット，アンドリュー・シー; ローズ，フロイド
Original assignee: ハイアット，アンドリュー・シー; ローズ，フロイド
Priority date: 1994-09-02
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2001-10-30
Also published as: AU707806B2; WO1996007669A1; EP0781293A1; EP0781293A4; US5872244A; CA2197479A1; AU3545595A

Abstract

(57)【要約】遊離および非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオチドを含む開始基質を提供し；予定した配列の順序に従い選択されるヌクレオシド５'−トリホスフェートを、開始基質の３'−ヒドロキシル基に、モノヌクレオチドの５'−ホスフェートと開始基質の非保護３'−ヒドロキシル基との間の５'ないし３'ホスホジエステル結合を触媒できる触媒量の酵素を含む溶液中結合させることによる、予定した配列のポリヌクレオチドの合成をもたらす、所望のヌクレオチド間にホスホジエステル結合を段階的に製造する方法であって、モノヌクレオチドは保護３'−ヒドロキシル基を有し、保護モノヌクレオチドは開始基質に共有結合で結合し、更なる付加は３'−保護基で阻害される。図面は、鋳型非依存的ポリメラーゼおよびその３'位に保護基を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを異様下オリゴヌクレオチドの酵素的合成の図式である。モ固体支持体上に固定化したモノヌクレオチドを遊離ポリヌクレオチド鎖に付加する方法もまた記載される。

Description

【発明の詳細な説明】保護ヌクレオチドを使用したホスホジエステル結合の酵素触媒鋳型非依存的製造のための組成物関連出願本出願は、１９９４年９月１日出願の米国特許出願第０８／３００,４８４号の一部継続出願である。本出願はまた同時に続いて出願した、出願番号未付与の Lyon & Lyon番号２１３／２１８、２１４／０７５、２１４／０７６、２１４／０７７および２１４／１７７にも関連する。技術分野本発明は、鋳型非依存的酵素を使用したオリゴヌクレオチドおよび他の核酸ポリマーの合成に関する。発明の背景オリゴヌクレオチドは、現在、有機合成法を使用してin vitroで合成されている。これらの方法は、Adams et al.，J．Amer．Chem．Soc.，105:661(1983)およびFroehler et al.，Tetrahedron Lett.，24:3171(1983)に記載のホスホールアミデイト法およびドイツ公開第２６４４３２号に記載のホスホトリエステル法を含む。他の有機合成法は、Ｈ−ホスホネートがオリゴヌクレオチド製造に使用されているFroehler et al.，米国特許第５,２６４,５６６号に記載のものを含む。ホスホジエステル結合形成のホスホールアミデイト法およびオリゴヌクレオチド合成は、鋳型の使用なしに所望のヌクレオチドを結合させるために、多くの研究室で使用されている当分野の現在の状況を代表する。この方法において、結合反応は、固体支持体に結合したヌクレオシドにより開始する。固定ヌクレオシドの５'−ヒドロキシル基は、集合すべき鎖の第２ヌクレオシドと結合するために、遊離している。成長オリゴヌクレオチド鎖は、モノヌクレオチドとの反応に利用できる５'-ヒドロキシルを表出しているので、合成の方向を３'から５'と呼ぶ。成長オリゴヌクレオチド鎖に結合すべき各連続モノヌクレオチドは、支持体結合ヌクレオチドの５'−ヒドロキシ基と反応する３'−ホスホールアミデート部分を含み、５'から３'内部ヌクレオチドホスホジエステル結合を形成する。入来モノヌクレオチドの５'−ヒドロキシル基は、通常、トリチル基により保護されており、ヌクレオシドの制御下にない重合化を予防する。各入来ヌクレオシドを添加した後、保護５'−ヒドロキシル基を、３'−ホスホールアミデイト基および保護５'−ヒドロキシルを有する次の入来ヌクレオシドとの反応を可能にするために、脱保護する。これは、脱保護および次の入来ヌクレオチドの添加等に続く。各ヌクレオシド添加工程の間に、所望のヌクレオシドとのホスホジエステル結合に関与しない未反応鎖を化学的に“蓋”して、それらの更なる伸長を予防する。これは通常、化学的アシル化を含む。この方法および他の現在使用されている方法は、広く認められているが、大量の高価なモノマーを必要とし、製造するのに複雑な有機合成実行計画を必要とする。加えて、これらの方法は、ホスホールアミデイト法が各縮合反応後に酸化工程を必要とするため、複雑である。ホスホトリエステル法は、これらのオリゴヌクレオチドの更なる鎖伸長を防止するために、特定のサイクルで添加されたモノマーを有していないオリゴヌクレオチドの亜集団が別の反応で蓋されることを必要とする。ホスホジエステル結合形成の実質的にすべての化学法における他の欠点は、反応が有機溶媒中で、水の非存在下で行わなければならないことである。これらの有機溶媒の多くは有毒であるか、さもなくても危険である。化学合成の他の欠点は、各サイクルで、最高で９８％の効率であることである。言い換えれば、各ヌクレオチド添加以後、少なくとも２パーセントの成長オリゴヌクレオチド鎖が蓋され、収量の損失をもたらす。合成されるヌクレオチド鎖の全収量損失は、従って、配列に添加される各ヌクレオチドに伴い増加する。例えば、ヌクレオチド添加当たり９８％の収率と仮定して、７０モノヌクレオチドからなるポリヌクレオチドの合成は、ほとんど７５％近くまで、収量の損失が起こることが経験される。更に、対象のヌクレオチド鎖は、ポリヌクレオチドの反応混合物から単離することが必要であり、これらのほとんど７５％が長さで１から６９の範囲の蓋されたオリゴヌクレオチドからなる。このオリゴヌクレオチドの化学合成の固有の非効率性のために、効率的に製造できる長さのオリゴヌクレオチドは、５０核酸残基またはそれ以下を有するオリゴヌクレオチドに結局限定される。ホスホジエステル結合形成の効率を改善し、最終的に短鎖オリゴヌクレオチドを高い収率で、長鎖ポリヌクレオチドを許容可能な収率で製造できる方法が必要である。加えて、所望のポリヌクレオチド配列が容易に前存在配列に添加できるような、ベクターＤＮＡのような前存在ポリヌクレオチドと適合可能なポリヌクレオチド合成システムの必要性が存在する。ホスホルアミデート法は前存在ポリヌクレオチドへの“添加”合成と適合していない。しかしながら、酵素触媒ホスホジエステル結合形成は、反応を開始させるために、一本または二本鎖オリゴまたはポリヌクレオチドのいずれかに使用される水性環境で行うことができる。これらの反応条件はまた毒性および危険物質の使用を非常に減少させる。ホスホジエステル結合形成のホスホルアミデート法に固有の合成の３'から５' 配向は、酵素触媒されない。ホスホジエステル結合形成を触媒できる全ての既知の酵素は、成長ポリヌクレオチド鎖が常に次のヌクレオシドに結合できる３'− ヒドロキシルを表出するため、５'から３'配向で触媒として働く。ホスホジエステル結合の形成を触媒できる多くの酵素がある。このような酵素の一つのクラス、ポリメラーゼは、非常に鋳型依存的であり、それらは相補的ヌクレオチドを、二本鎖ポリヌクレオチドの成長鎖の３'ヒドロキシルに付加する。しかしながら、あるポリメラーゼは、鋳型非依存的であり、主に一本鎖ヌクレオチドポリマーの形成を触媒する。酵素の他のクラス、リガーゼは、鋳型非依存的であり、２個のポリヌクレオチドの間またはポリヌクレオチドとモノヌクレオチドの間にホスホジエステル結合を形成する。一個のヌクレオチドのＤＮＡフラグメントへの添加は、デオキシヌクレオチジルターミナルトランスフェラーゼ(TdTase)により触媒され、このことは以前にDe ngおよびWu，Meth．Enzymol.，100:96-116，1983に記載されている。これらの反応条件は、３'−ヒドロキシルの一時的保護を含まず、予定されたヌクレオチド配列を合成するためのホスホジエステル結合の配列製造に使用することが意図されていない。非保護３'−ヒドロキシルの存在は、反応生産物の非常に不均質な集団をもたらす。同様に、保護ヌクレオチドモノホスフェートまたはジホスフェートを使用したＲＮＡまたはＤＮＡの非常に短い断片の合成を触媒させる以前の試みは、所望のホスホジエステル結合形成が許容できない程に低い結果であったか、または許容可能な効率を達成するためには、過剰量の酵素を必要とした。これらの問題は、モノヌクレオチド積木の避けることができない不均質性または、極度に長いインキュベーション時間を要する、酵素の非常に高い転換数に主に起因している(例えば、HintonおよびGumport，Nucleic Acids Res.，7:453-464，1979；Kaufman et al.，Eur．J．Biochem.，24:4-11，1971参照)。これらの実験は５'−モノホスフェートおよびジホスフェートに限られていた。３'位で保護された５'−トリホスフェートを使用した触媒制御ＤＮＡ合成をなす試みはなかった。オリゴヌクレオチド鎖の遊離３'−ヒドロキシ基とモノヌクレオチドの５'−ホスフェートの間の一個のホスホジエステル結合の酵素触媒製造は、多重ホスホジエステル結合の製造、すなわち反復モノヌクレオチド添加を予防するために３' ーヒドロキシルの保護を必要とする。モノヌクレオチドの３'−ヒドロキシルの保護は、理想的には、連続反応を可能にするために、容易に除去できる一時的保護基を含む。Flugel et al.，Biochem．Biophys．Acta.，308:35-40，1973は３' −ヒドロキシル基を保護された、ヌクレオシドトリホスフェートは直接製造できないことを報告している。この３'保護トリホスフェートの欠如は、低エネルギーを利用するための予備処理、従って、更に非効率的３'保護モノホスフェートおよびジホスフェートを必要とする。３'保護トリホスフェートを製造する合成技術は、これらがポリヌクレオチド合成に導く段階的酵素触媒ホスホジエステル結合形成を可能にするため、非常に望まれている。鋳型非依存的ポリメラーゼを使用したオリゴヌクレオチドを合成する以前の試みは、非常に短いオリゴヌクレオチド製造において、極めて非効率的な結果であった。本発明は、鋳型非依存的ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの間のホスホジエステル結合の製造を可能にし、予め決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを製造する。この酵素触媒は、所望のヌクレオチド間のホスホジエステル結合の効率を、現在の化学結合の技術と比較して非常に改善でき、一本または二本鎖ＤＮＡの前存在配列のような他の生物学的分子および他のタイプの酵素の存在下で行うことができる。加えて、酵素触媒の固有の非常に高い特異性は、５'−ホスフェートと３'−ヒドロキシルの結合のみを可能にする。二つのモノヌクレオシド結合および種々の他の副反応は化学結合技術に固有であり、全く起こらない。本発明の更なる利点は、高いエネルギーのホスフェート結合を有する３'保護トリホスフェートの使用により得られる。酵素はこのトリホスフェートを、他のモノホスフェートおよびジホスフェートを使用した場合より、反応を非常に高い完了レベルまでするのに使用できる。加えて、トリホスフェートは、ジホスフェートより強く水和されておらず、トリホスフェートの触媒的加水分解を完了させる傾向にある。明らかに、保護モノヌクレオチドトリホスフェートの均質集団の利用能、および開始基質へ保護ヌクレオチドを効率的に結合できる酵素は、段階的ホスホジエステル結合形成からもたらされる、合成ポリヌクレオチドの非常に均質的な集団を形成する。発明の要約発明された数多くの方法によると、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの３'−ヒドロキシル基が効率的に保護および脱保護され、保護ヌクレオチドは、鋳型非依存的ポリメラーゼにより、所望の予め決定した配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの合成を可能にするホスホジエステル結合を製造するのに利用される。従って、本発明により、予定した配列のポリヌクレオチドの合成のための方法が提供され、その方法は：Ａ．非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオチドを含む開始基質を提供し、さらに、Ｂ．該開始基質の３'−ヒドロキシル基を、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護している除去可能な保護部分を有し、かつ該予定した配列の順序に従い選択されるヌクレオシド５'−トリホスフェートと、触媒量の酵素の存在下、酵素的条件で反応させ、それによって、該酵素に、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基と該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒させて、該ポリヌクレオチドを生成させる、段階を含む。本発明の他の態様において、本方法は、更に：（Ｃ）該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する保護部分を除去して、非保護３'−ヒドロキシル基を有する開始基質を生成させる工程を含む。他の態様において、工程（ｂ）および（ｃ）を、少なくとも一回繰り返して、追加ヌクレオチドを開始基質に加える。これは、除去可能な保護部分をその３' 位に有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを添加し、末端ヌクレオシドの３'位を脱保護し、次いでその３'位に除去可能な保護基を有する他のヌクレオシド５'ートリホスフェートを添加することにより行われる。工程（ｂ）および（ｃ）の反復は、予め決定した配列を有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを製造するためにも行うことができる。本発明は、デオキシヌクレオシド、ヌクレオチド、一本または二本鎖オリゴヌクレオチド、一本または二本ポリヌクレオチド、非ヌクレオシド分子に結合したオリゴヌクレオチド等である開始基質を意図している。本発明は、基質を固体支持体上に固定する態様を意図している。好ましい固体支持体は、セルロース、セファロース、制御孔ガラス、シリカ、フラクトシル、ポリスチレン、スチレンジビニルベンゼン、アガロースおよび架橋アガロース等を含む。本発明は、真核生物および原核生物を含む任意の源由来の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼのような鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼの使用を意図する。本発明の方法は、本方法で用いるヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する除去可能保護部分を利用する。好ましい除去可能保護部分は、１０分以下で除去でき、３'ヌクレオシドの３'位にヒドロキシル基を産生する。意図される除去可能保護基には、カルボニトリル、ホスフェート、カーボネート、カルバメート、エステル、エーテル、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルフェナート、スルフェートおよびスルフォンが含まれる。本発明の方法は、好ましくはＣｏ⁺⁺のような二価カチオンおよびジメチルアルシン酸、トイス[ヒドロキシメチル]アミノメタンおよび３−[ｍ−モルホリン]プロパンスルホン酸からなる群から選択された緩衝剤を含有する、生理緩衝液を含む脱保護溶液を使用して、除去可能保護部分の除去を意図する。本発明の他の態様は、脱保護溶液中に存在する酵素を利用し、除去可能保護部分を除去する。本発明は、また、除去可能保護部分をその３'位に有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを固体支持体に固定し、遊離開始基質と反応させる方法を意図する。固体支持体は、３'−ヒドロキシル基でヌクレオシド５'−トリホスフェートに結合し、それにより、３'位で除去可能保護部分として働く。ヌクレオシドの支持体への結合は一時的であり、それにより、次のヌクレオチド付加が起こり得るように、新規合成産物が支持体から遊離し、遊離および非修飾３'−ヒドロキシルが再生するのを可能にする。従って、本発明のある態様において、脱保護溶液はヌクレオシドの位置の除去可能保護部分を除去し、従って、成長ポリヌクレオチドを固体支持体から遊離する。本発明は、また、本発明の方法により提供される予定された配列を有するポリヌクレオチドを含む。本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、分子内遺伝子、ペプチドまたはタンパク質のクローニングおよび／または発現に適用される。本発明により、触媒量の鋳型非依存的酵素およびヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを有する組成物もまた意図される。図面の簡単な説明図１．鋳型非依存的ポリメラーゼおよびその３'位に除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'トリホスフェートを使用したオリゴヌクレオチドの酵素合成を示す図式を示す。図２．３'位に除去可能保護部分を有するヌクレオシドを示す図式を示す。図３．ポリヌクレオチドの酵素的合成を自動化するための装置を示す図式を示す。図４．ポリヌクレオチドの酵素的合成を自動化するための装置を示す図式を示す。発明の簡単な説明Ａ．定義ＤＮＡ：デオキシリボ核酸ＲＮＡ：リボ核酸ヌクレオチド：ホスフェート基、５−炭糖および窒素含有塩基を有する核酸のサブユニット。ＲＮＡにおいて、５−炭糖はリボースである。ＤＮＡにおいて、それは２−デオキシリボースである。本用語はまたこのようなサブユニットの類似体を含む。ヌクレオシド：ヌクレオジル単位を含み、それと交換可能に使用され、５−炭糖および窒素含有塩基を含む核酸のサブユニットを意味する。本用語は、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵをその塩基として含むヌクレオシジル単位だけでなく、プソイドイソシトシンおよびプソイドウラシルおよび他の修飾塩基(８−置換プリン類のような)のような自然に存在する塩基の類似体および修飾形も含む。ＲＮＡにおいて、５−炭糖はリボースである；ＤＮＡにおいて、それは２'−デオキシリボースである。用語ヌクレオシドは、２'−Ｏ−アルキルリボースのような修飾糖を含むものを含む、このようなサブユニットの他の類似体も含む。ポリヌクレオチド：一般に約５０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さのヌクレオチドマルチマー。これらは通常生物起源であるかまたは酵素的手段で得る。〔式中、ホスホジエステル基がヌクレオシジル間リン基結合として使用され、ヌクレオシジル単位を結合する〕。ヒドロカルビル：脂肪族(アルキル、アルケニルおよび飽和および不飽和結合の混合物であるアルキニル基を含む)、アリサイクリック(カルボサイクリック)、アリール(芳香族)またはこれらの組み合わせであり得る炭素および水素からなる有機ラジカル；および直鎖、分枝鎖または環状構造またはこれらの組み合わせを有する基およびハロゲン原子または窒素、酸素および硫黄のようなヘテロ原子および有機化合物およびラジカルで通常見られるそれらの官能基(アミノ、アルコキシ、アリールオキシ、ラクトン基等)で置換されている基を意味する。非ヌクレオシドモノマー単位：ヌクレオシドの塩基、糖および／またはリン骨格または他のヌクレオシジル間結合が他の化学的部分により置換されているモノマー単位。ポリペプチドおよびペプチド：アルファーアミノおよび付加残基のカルボキシル基の間のペプチド結合で他に接続した、アミノ酸残基の連続直線。タンパク質：他にポリペプチドとして結合している約５０アミノ酸残基以上の連続直線。遺伝子：リボゾームＲＮＡのような、それ自体構造ＲＮＡである、ＲＮＡ転写をコードする、またはポリペプチドをコードするＤＮＡのセグメント。ＤＮＡのセグメントはまた適当なプロモーター、停止配列および所望により他の制御的ＤＮＡ配列を伴う。構造遺伝子：構造ＲＮＡをコードし、適当なプロモーター、停止配列および所望により他の制御ＤＮＡを伴う遺伝子。プロモーター：遺伝子の発現制御エレメントを提供する、ＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列のグループを認識する部位であり、そこにＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合しその遺伝子のＲＮＡ合成(転写)が開始される。オリゴヌクレオチド：一般に約２から約５０ヌクレオシド長さのヌクレオシド間結合により結合したヌクレオシドの鎖。それらはヌクレオシドモノマーから化学合成し得るかまたは酵素的手段で産生し得る。用語オリゴヌクレオチドは、ヌクレオシドモノマーを結合するヌクレオシド間結合を有するヌクレオシドの鎖を意味し、従って、ヌクレオシド類似体、モノマー単位間の１個またはそれ以上のリン基が、ホルムアセタール結合、チオホルムアセタール結合、スルファメート結合またはカルバメート結合のような非リン結合で置換されているようなヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドを含む。糖およびリン分子の両方が置換または修飾されている、モホリノ基本類似体またはポリアミド基本類似体のようなヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーもまた含む。ヌクレオシドのベース、糖およびリン骨格が非ヌクレオシド部分で置換されているか、または非ヌクレオシド部分がヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマー中に挿入されているヌクレオシド／非ヌクレオシドポリマーも含む。従って、オリゴヌクレオチドは部分的にまたは完全にホスホノチオエート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミデートまたはホスホトリエステルオリゴヌクレオチド類似体のような中性ホスフェートエステルであり得る。除去可能保護部分：除去可能保護部分は、ヌクレオシドの３'位またはヌクレオシド類似体の同等な位置の酸素原子に結合した部分である。除去可能保護部分は、３'酸素が存在する場合、反応を防止し、３'酸素がその後化学的反応に参加できるように脱保護条件下で除去可能である。Ａ．方法一般に、本発明は、鋳型非依存的ポリメラーゼおよび一個のヌクレシドが成長オリゴヌクレオチドに結合するように、除去可能保護部分で３'位を保護されたヌクレオシドを使用した、予定された配列を有するオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの合成法を提供する。次の保護ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドに添加できるように、成長オリゴヌクレオチドの末端ヌクレオシドの３'位の保護部分を除去することにより、一個のヌクレオシドを成長鎖に添加する。次いで、本工程を、予定された配列を有するオリゴヌクレオチドが産生されるまで繰り返す。従って、本発明の本態様により、方法は： (ａ)非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを含む開始基質の提供： (ｂ)触媒量の酵素の存在下、酵素的条件下で、開始基質を、ヌクレオシド５'− トリホスフェートの３'位に除去可能保護部分を有し、予定された配列の順序に従い選択されたヌクレオシド５'−トリホスフェートと反応させ、ここで酵素は開始基質の非保護３'−ヒドロキシル基とヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートの間の５'から３'ホスホジエステル結合の形成を触媒し、ポリヌクレオチドを製造する：ことを含む。好ましい態様において、本発明の方法は、更に： (ｃ)ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する保護部分を除去し、非保護３'−ヒドロキシル基を有する開始基質を産生する：工程を含む。この付加工程は、反応性原子を末端ヌクレオシドの３'位に再生し、この原子が次のヌクレオシドと結合を形成するのに使用でき、従って−ヌクレオシド毎にオリゴヌクレオチトの長さを伸長する。本発明の方法は、上記工程(b)および(c)を少なくとも一度、オリゴヌクレオチドを製造するために繰り返す方法も含む。この工程は、多数回繰り返すことができ、選択した長さのオリゴヌクレオチドを産生する。この工程はまた、各特定のヌクレオシドが予定された配列を有するように、多数回繰り返すこともできる。１．開始基質本発明の開始基質は、遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを含有して製造される。当業者によく理解されているように、ヌクレオシド類アデノシン、シチジン、グアノシン、ウリジンおよびチミジンは、集合して、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを形成する。本発明の方法により、開始基質は、遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基を有する一個のヌクレオシドを含み得るか、またはオリゴーまたはポリヌクレオチドが遊離および非修飾３ '−ヒドロキシル基質を有する限り、前集合オリゴーまたはポリヌクレオチドが開始基質として提供され得る。当業者は、ヌクレオシドがその３'位に除去可能保護部分を有し、その部分は続いて脱保護工程を使用して除去され、開始基質が本発明に有用な遊離の非保護３'−ヒドロキシル基を有するような形で提供できることを理解しよう。本発明の開始基質は、頻繁に産生され、種々のクローニングおよび分子生物学技術に使用されるポリヌクレオチドの末端を含有する。これらの開始基質の例は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター、一本鎖または二本鎖フラグメント、一本鎖または二本鎖ＲＮＡフラグメントおよびＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドの末端を含む。好ましい態様において、開始基質は、オリゴーまたはポリヌクレオチドの全体または一部から成る。開始基質は、ヌクレオシドの３'−ヒドロキシルおよびモノヌクレオチドの５'−ホスフェートの間にホスホジエステル結合を酵素が産生させるようにできるヌクレオシドの配列であり得る。開始基質は、リボ核酸(ＲＮＡ)マタハデオキシリボ核酸(ＤＮＡ)の塩基全体または一部および一本鎖または多重鎖であり得る。加えて、開始基質は、酵素のホスホジエステル結合形成を可能にし得るか、能力を促進し得る、または反応成分および副産物の操作を容易にする自然発生または合成分子(非ヌクレオシド)の他のタイプを含むことができる。この例は、開始基質を固体支持体に結合させる既知の方法を提供するために働く、リンカー分子(Ｃ、Ｏ、ＮおよびＨからなる通常使用されるリンカー、例えばAffi−Gel(商標)１０：Ｒ−ＯＣＨ₂ＣＯＮＨ(ＣＨ₂)₂ＮＨＣＯ(ＣＨ₂)₂ＣＯＯＮ(ＣＨ₂)₂)である。ホスホジエステル結合の連続産生および即ちヌクレオチドの開始基体への付加は、完全に溶液中で行い得るかまたは開始基体は不溶性マトリックスに結合し得る。不溶性マトリックスへの結合は、次のヌクレオチドを結合するための基体を製造するための、基体の未反応試薬からの急速な分離を可能にする。この理由のため、基体は好ましくはホスホジエステル結合を製造する各反応中固体支持マトリックスに付着させる。固体支持体として使用するのに適当な不溶性マトリックスは、セルロース、セファロース(商標)、制御孔ガラス(ＣＰＧ)、ポリスチレン、シリカ、アガロース等を含む。本発明で使用するのに適当な試薬、緩衝液および溶媒は、固体支持マトリックスを通して流れることができ、その手段により、開始基体がこれらの物質と接触する。成長ヌクレオチド鎖は、固体支持体に、それを種々の試薬、緩衝液および溶媒が連続して流れるので、結合したままである。固体支持マトリックスは、好ましくは合成カラムの中であり、それに試薬、緩衝液および溶媒が提供される。開始基質の固体支持体への結合は共有結合であることができる。分子の不溶性マトリックスへの共有結合については多くの方法が記述されており、当業者によく理解されている。好ましい態様において、オリゴヌクレオチド鎖は、アルキルアミン誘導体化ポリスチレンまたはCPGに共有結合ホスホルアミデート結合で結合し得る。オリゴヌクレオチドの固体支持体への結合の多くの方法が記述されている。好適な結合方法の選択は、安定性、電荷相互作用、溶解性等に依存する。あるいは、開始基質の固体支持体への結合は、非共有相互作用によるものであることもできる。分子の不溶性マトリックスへの一時的結合については、多くの方法が記術されており、当業者によく理解されている。例えば、一個または多数のビオチン分子を含むオリゴヌクレオチド誘導体は、アビジン−アガロースまたはストレプトアビジン−アガロースに結合し得、非共有結合をオリゴヌクレオチドと不溶性アガロースマトリックスの間に形成する。一般に、ＤＮＡまたはＲＮＡを基本にした一本または二本鎖オリゴーおよびポリヌクレオチドは、固体支持体に共有または非共有で結合し得、種々の開始支持体を形成する。開始支持体を不溶性マトリックスに結合するのに使用した方法に関係なく、遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドは、常にホスホジエステル結合の酵素触媒製造のために利用可能である。２．鋳型非依存的酵素モノヌクレオチドを開始基質の遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基に添加する。これは、選択モノヌクレオチドの５'−ホスフェートを有する基質と、モノヌクレオチドの５'−ホスフェートとを、基質の３'−ヒドロキシルを共有結合するホスホジエステル結合を製造できる触媒量の酵素存在下に反応させることによりなされる。酵素は、鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼのような鋳型非依存的酵素である。鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼのような鋳型非依存的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの間のホスホジエステル結合を、活性のための相補的ヌクレオチド鎖の存在の必要なしに形成できる。従って、鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼのような鋳型非依存的酵素は、一本鎖核酸ポリマーの形成を、鋳型として働く相補的核酸鎖を必要とせず、触媒できる。鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼの例は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼは、ウシ胸腺およびリンパ球の他の源を含む種々の源から単離できる。特に好ましいポリメラーゼは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdTase、ＥＣ2.7.7.31)である。本発明で使用できる酵素は、当業者が容易に同定でき、好適なおよびよく理解された条件下で使用される。デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの酵素条件の例は、カリウムカコジレート緩衝液で維持した６.８のｐＨ、８mmol／lのＭｇＣｌ₂、１mmolのβ−メルカプトエタノール、０.３３mmol／lのＺｎＳＯ₄を含む。当業者は、これらの酵素条件を、酵素が所望の反応を触媒できる限り変え得ることを理解するであろう。３．除去可能保護部分を有するヌクレオシド本発明により、モノヌクレオチドは、開始基質の遊離３'−ヒドロキシルとモノヌクレオチドの５'−ホスフェート基の間に一個のホスホジエステル結合が形成されるように、その３'位が除去可能保護部分で保護されている。モノヌクレオチドの３'位を保護する除去可能保護部分は、多重ホスホジエステル結合の形成、即ち、多重ヌクレオチド付加を防止する。本発明は、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はヒドロカルビルである〕を有する、３'位を保護する除去可能保護部分を有する本発明のヌクレオシド５' ホスフェートを意図する。好ましい態様において、上記式のヌクレオシド５'− ホスフェートは、トリホスフェートであるＲ₂およびヒドロカルビルであるＲ₁を有する。本発明で使用するのに適当な３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオチドは、式１に対応する構造を有し、酵素によりホスホジエステル結合を形成するための完全ヌクレオチドの利用と矛盾しない構造を有する。Ｂはヌクレオチド塩基およびＲ₂は好適なモノ−、ジ−またはトリホスフェートを意味する。Ｒ₁は、エステル結合、構造ヌクレオチド３'−Ｏ−ＣＯ−Ｒ₁'を形成するＣＯＲ₁'であることができる。Ｒ₁'は、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合の製造のための酵素による分子の利用と矛盾しないアルキルまたはアリール基であることができる。エステルのヒドロキシルのための保護基としての化学はよく確立されている。ホルメート、ベンゾイルホルメート、アセテート、置換アセテート、プロピオネート、イソブチレート、レブリネート、クロトネート、ベンゾエート、ナフトエートおよび多くの他のエステルを含む除去可能保護部分は、詳述されている(Greene，T.W.，Protective Groups in Organic Chemistry ，John Wiley & Sons，New York，1981参照)。一般に、通常塩基の存在下、エステルは容易に除去され、ヒドロキシル基を再生し、従って除去可能保護部分として有用である。エステル除去可能保護部分は、ヌクレオチドと好適な酸無水物の反応により形成する。あるいは、カルボン酸を、カルボニルジイミダオールとの反応後、水の存在下ヌクレオチドの３'−ヒドロキシルとエステル化できる(Schager et al.,M eth．Enzymol.，126，682-712参照)。本発明は、また、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁は脂肪族または芳香族有機エステルである〕を有する、エステルである３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートを意図する。本発明は、また、以下の式：〔式中、Ｒはホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２,６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２, ６ージクロロ−４−(１,１,３,３−テトラメチルブチル)フェノキシアセテート、２,４−ビス(１,１−ジメチルプロピル)フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３−ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノサクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマニオエート、クロトネート、４−メトキシクロトネート、(Ｅ)−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−(ジブロモメチル)ベンゾエート、ｏ−(メトキシカルボニル)ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾェート、２,４,６−トリメチルベンゾエートおよびα−ナフトエートからなる群から選択される〕を有する、エステルである３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートを意図する。本発明は、また、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲはＨ、ＣＨ₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)_N(ここで、Ｎは１から１２の整数)、(ＣＨ₃)_X ₊₁ (ＣＨ)_X(ここで、Ｘは１から１２の整数)、(ＣＨ₃)_X+1(ＣＨ)_X(ＣＨ₂)_n(ここで、Ｘおよびｎは独立して１から１２の整数)、Ｃ_X(ＣＨ₃)_3X-(X-1)(ＣＨ₂)_n(ここで、Ｘおよびｎは独立して１から１２の整数)、および (ここで、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＣＨ₃、ＨまたはＮＯ₂である)からなる群から選択される〕を有する、エステルてある３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートを意図する。好ましい態様において、本発明のヌクレオシド５'−ホスフェートは、本明細書に記載の保護基またはそれらの基と同等であることができる、３'位を保護する除去可能保護部分を有するデオキシヌクレオシド５'−トリホスフェートである。別のタイプの除去可能保護部分は、構造ヌクレオチド−３'−ＯＲ'₁を形成するエーテル結合に使用する。この場合、Ｒ'₁はメチル、置換メチル、エチル、置換エチル、ブチル、アリル、シンナミル、ベンジル、置換ベンジル、アンスリルまたはシリルであることができる。除去可能保護部分としてエーテルを使用することに関連する化学は、当分野で既知である。多くのエーテルが記載され、ヒドロキシルおよび同様の化学基を一時的に保護するのに有用である。他の態様において、本発明のヌクレオシド５'ホスフェートは、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁は置換または非置換脂肪族基、芳香族基またはシリル基からなる群から選択される〕を有する、エステルである３'位を保護する除去可能保護部分を有する。他の態様において、本発明のヌクレオシド５'ホスフェートは、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はメチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、ｔ−ブトキシメチル、２−メトキシエトキシメチル、２,２,２−トリクロロエトキシメチル、ビス(２−クロロエトキシ)メチル、２−(トリメチルシリル)エトキシメチル、テトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニル、４ −メトキシテトラヒドロチオピラニル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニル、Ｓ,Ｓ−ジオキシド、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、１ −エトキシエチル、１−メチル−１−メトキシエチル、１−(イソプロポキシ)エチル、２,２,２−トリクロロエチル、２−(フェニルセレニル)エチル、ブチル、アリル、シンナミル、ｐ−クロロフェニル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ｏ−ニトロベンジル、ｐ−ニトロベンジル、ｐ−ハロベンジル、ｐ−シアノベンジル、３−メチル−２−ピコリルＮ−オキシド、ジフェニルメチル、５−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル、ｐ−(ｐ'−ブロモフェナシルオキシ)フェニルジフェニルメチル、９−アンスリル、９−(９−フェニル−１０−オキソ)アンスリル、ベンゾイソチアゾリルＳ,Ｓ−ジオキシド、トリメチルシシル、トリエチルシリル、イソプロピリジメチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリル、メチルジイソプロピルシリル、メチルジ−ｔ−ブチルシリル、トリベンジルシリル、トリ−ｐ−キシリルシリル、トリイソプロピルシリルおよびトリフェニルシリルからなる群から選択される〕を有する、エーテルである３'位を保護する除去可能保護部分を有する。好ましい態様において、本発明のヌクレオシド５'ホスフェートは、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はビス(２−クロロエトキシ)メチルエーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、トリ(ｐ−メトキシフェニル)メチルエーテル、ジ(ｐ−メトキシ)フェニルメチルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルからなる群から選択される〕を有する、エーテルである３'位を保護する除去可能保護部分を有する。より好ましい態様において、本発明のヌクレオシド５'ホスフェートは、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はＣＨ₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)_N(ここで、Ｎは１−１０の整数)、メチル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、トリメチルシリルおよびトリエチルシリルからなる群から選択される〕を有する、エーテルである３'位を保護する除去可能保護部分を有する。より好ましい態様において、本発明のヌクレオシド５'−ホスフェートは、ＣＨ(ＯＣ₂ Ｈ₅)ＣＨ₃であるＲ₁およびトリホスフェートであるＲ₂を有し、ヌクレオシド５' −ホスフェートはデオキシヌクレオシドである。ヒドロキシルの保護に有用な更なる既知の除去可能保護部分は、カルボニトリル、ホスフェート、カルボネート、カルバメート、ボレート、ニトレート、ホスホロアミデートおよびフェニルスルフェネートを含む。これらのヌクレオチドの化学的修飾の殆どが化学的反応により除去できる。ある修飾は、また、３'ヒオロキシルの再生をもたらす酵素的消化により除去し得る。これらはホスフェート、グリコシドおよびあるエステルを含む。他の態様において、本発明のヌクレオシド５'ホスフェートは、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はホスフェート、ホスホロアミデートおよびホスホロアミドからなる群から選択される〕を有する、３'位を保護する除去可能保護部分を有する。好ましい態様において、上記式のヌクレオシド５'ホスフェートはトリホスフェートであるＲ２およびホスフェートであるＲ１を有する。本発明のより好ましい態様は、以下の式：〔式中、Ｒ₂はトリホスフェート、ジホスフェートまたはモノホスフェート；およびＲ₁はホスフェート、トルイル酸エステルまたはエトキシエーテルからなる群から選択される〕を有する、３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートを意図する。本発明は、また、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの直接エステル化により製造されるエステルである、３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを意図する。好ましい態様において、ヌクレオシド５'−トリホスフェートは、ベンゾエートまたはアセテートであるエステルを３'位を保護する保護部分として有する。更に好ましい態様において、直接エステル化により製造されるヌクレオシド５'−トリホスフェートはデオキシヌクレオシドである。本発明は、また、エーテルをヌクレオシド５'−トリホスフェートに直接結合することにより産生したエーテルである、３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを意図する。特に好ましくは、エーテルを３'位に直接結合したデオキシヌクレオシド５'トリホスフェートである。３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオチドを開始基質の遊離および非修飾３'−ヒドロキシルとを結合せしめることは、前記ヌクレオチドと基質とを、この二つの間にホスホジエステル結合を形成できる酵素と共に反応[インキュベート]せしめることにより達成される。具体的に、本結合は、モノヌクレオチドと開始基質の３'−ヒドロキシルを結合させる。本反応は、溶液中で遊離して、または本発明の一つの態様において、開始基質を固体支持体上に固定化して行うことができる。特に好ましくは、除去可能保護部分および脱保護反応条件が、３'−末端ヌクレオシドの３'位にヒドロキシル基を製造するために、１０分以内に保護部分を除去し得ることである。他の好ましい除去可能保護部分および脱保護条件は、保護部分を、８、７、６、５、４、３、２または１分以内に除去可能にする。４．反応好ましい態様において、好ましい酵素はTdTaseであり、本酵素使用の具体例は下記の通りである。しかしながら、本発明は、ＤＮＡのTdTase触媒合成に限定されると見なすべきでなく、基質の３'ヒドロキシル基と除去可能保護部分を有するヌクレオシドの５'ホスフェートとの間の５'から３'ホスホジエステル結合の形成を触媒できる他の酵素の使用も本発明により意図される。当業者は、酵素反応条件が、起こるべき所望の触媒使用を可能にするために選択し、好適な条件下で行い得ることを理解するであろう。反応は、典型的には２５℃から４２℃の間で、適当な時間、典型的には約１分から約３０分の間で行う。除去可能保護部分が不安定な場合、非常に短い反応時間が有用であり得る。 TdTase触媒反応において、基質がその中で反応する溶液として働き得る酵素的条件は、約０.２０から約２００μＭの３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオチドおよび約０.２０から２００μＭの開始基質由来の遊離および非修飾３'−ヒドロキシルを含む。一つの具体的な好ましい緩衝液は、約１０から約５００ｍＭカリウムカコディレート緩衝液(６.５から７.５の間のｐＨ)および約０.０１から１０ｍＭの二価カチオン(例えば、ＣｏＣｌ₂またはＭｎＣｌ₂)を含む。他の緩衝液組成および成分は、本発明の具体的な所望の態様に好適であり得る。例えば、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの酵素的条件は、カリウムカコジレート緩衝液で維持された６.８のｐＨ、８mmol／lのＭｇＣｌ₂、１mmo l／lのβ−メルカプトエタノール、０.３３mmol／lのＺｎＳＯ₄を含む。当業者は、これらの酵素的条件が、酵素が所望の反応を触媒する限り、変化し得ることを理解するであろう。開始基質の３'ヒドロキシル基と添加されるヌクレオシドの５'ホスフェートの間との５'から３'ホスホジエステル結合の形成を触媒できる酵素は、触媒量存在する。酵素の触媒量は、典型的には開始基質の遊離３'ヒドロキシルおよびヌクレオシドの５'ホスフェートの間の１時間９９％より大きいホスホジエステルの形成を触媒すれば、充分である。好ましくは、酵素の触媒量および酵素的条件は、開始基質の遊離３'ヒドロキシルの９９％以上が１０分以内に反応するようなものである。他の好ましい態様において、酵素の触媒量および酵素的条件は、開始基質の遊離３'ヒドロキシルの９０％以上が５分以内、例えば４、３、２または１分で反応するようなものである。他の好ましい態様において、触媒量の酵素および酵素的条件は、開始基質の遊離３'ヒドロキシルの９９％以上が２分以内に反応するようなものである。 TdTase酵素は、緩衝液中に、約１から２００単位／μＬの濃度で存在する。Td Taseの１単位は１nmolのｄＡＴＰをｐ(ｄＴ)_6-12への転移を、３７℃で６０分で触媒する。TdTaseの商品は、ウシ胸腺TdTaseを含み、種々の供給者から入手可能である(例えば、Sigma Chemical Co.，St．Louis Mo.，Promega Corp.，Mad ison，WI．，Gibco-ＢＲＬ，Gaithersburg，ＭＤ)。ウシ胸腺TdTaseは、また、M odak，Biochemistry，17，3116-20(1978)およびBollum，Fed．Proc．Soc．Exp． Biol．Med．17，193(1958)記載の工程により製造し得る。遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基および３'−ヒドロキシル基を保護する除去可能保護部分を有するモノヌクレオチドを含む基質は、緩衝液中でTdTase存在下反応できるか、基質は、好ましくは固体支持体上、より好ましくは、その中を反応成分を含む緩衝溶液が流れる合成カラム中に固定化する。適当なインキュベーション時間後、酵素、未反応モノヌクレオチド、緩衝液および二価カチオンを開始基質から分離する。反応を遊離および可溶性基質の使用により行った場合、既知のサイズ排除クロマトグラフィーまたは、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない類似のタイプの分離技術により分離できる。固体支持体上に固定化した開始基質について、分離は支持体を水または好適な緩衝液で洗浄することにより達成される。本発明の一つの利点は、上記酵素反応後の開始基質の未反応ヒドロキシル基が、非常に低い、０.１％以下であり得ることである。これは、未反応ヒドロキシル基を蓋する必要性を減少させる。本発明のある態様において、合成サイクルの次工程の前に未反応基質を蓋する必要があり得る。これを達成するための好適な化学は、前述の保護方法から由来できるが、全連続サイクル中は永久に付着していなければならない。蓋の例は、遊離３'−ヒドロキシルの無水酢酸およびピリジンによるアセチル化であり、アセチル化(または他のエステル化)がモノヌクレオチドの保護基として使用されてない場合、適用できる。あるいは、蓋は、アセトニトリルおよびピリミジン中のｔ−ブチルジメチルクロロシランとの反応により達成でき、シリルエーテルを形成し、同様のエーテルがモノヌクレオチドの保護に使用されてない場合、適用可能である。好ましい態様において、これらの反応は、好適な蓋の条件を急速におよび効率良く提供するために、これらの反応は、主に固定化開始基質の修飾を意図する。適当なインキュベーション時間後、蓋薬剤を開始基質から除去する。反応を遊離および可溶性基質を使用して行った場合、既知のサイズ排除クロマトグラフィーまたは、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない類似のタイプの分離技術により分離できる。固体支持体上に固定化した開始基質について、分離は支持体を水または好適な緩衝液で洗浄することにより達成される。反応後、開始基質の３'位を保護する除去可能保護部分を除去または脱保護(保護基を外す)し、次のヌクレオチドの付加に利用可能な遊離および非修飾３'−ヒドロキシルを再生する。当業者は、これが化学的または酵素的方法のいずれかで達成され得ることを理解するであろう。例えば、エステル保護基は、前記のエステル保護基のＲ₁がエステラーゼの好適な基質である場合、エステラーゼを使用して除去し得る。そうでなければ、エステル結合は、保護３'−ヒドロキシル基を好適な濃度の塩基と充分な時間接触させることにより達成される塩基加水分解により開裂し得る。エステル保護基の開裂はよく研究され、エステルを開裂するが、蓋に使用した結合(例えば、エーテル)は開裂しない好適な反応条件は容易に同定できる。本発明は、ある除去可能保護部分、デオキシヌクレオチドトリホスフェートの芳香族３'−Ｏエステルが二価カチオンを含む通常使用される緩衝液で不安定であるという予期しない発見を含む。この不安定性は、緩衝液および二価カチオンの両方が存在するときに生じ得るもので、緩衝液単独またはカチオン単独の存在ではもたらされない。エステル保護基を不安定にする緩衝液は、ジメチルアルシン酸(カコジル酸)、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、酢酸ナトリウムおよびリン酸ナトリウムを含む。エステル保護基を不安定にする二価カチオンは、コバルト、マンガンおよびマグネシウムイオンを含む。デオキシヌクレオチドトリホスフェートのトルイル酸エステルは、１ｍＭＣｏＣｌ₂、１００μＭカリウムカコジレート、ｐＨ６.８の混合物中で不安定である。エーテル、カルボネート、ニトレートおよび他の保護基のような除去可能保護部分を除去する条件はよく研究され、多くはポリヌクレオチド鎖の無傷さと矛盾しない。ホスフェート保護基のような保護部分の除去は、ヒドロキシルがホスファターゼでの酵素消化により再生される。保護基が糖部分である場合の保護部分の除去について、ヒドロキシルの再生はグリコシダーゼを使用した酵素的加水分解により達成できる。除去または脱保護反応を溶液中で行う場合、脱保護試薬を単に溶液に添加する。反応を固体支持体上に固定化した開始基質で行う場合、ヒドロキシル基再生工程は、固体支持体を脱保護試薬で洗浄することにより行う。合成カラムが固体支持体を含有して使用される場合、ヒドロキシル基再生工程は、カラムを好適な試薬で洗浄して行う。除去のための適当な時間後、開始基質(付加ヌクレオチドを受容したものおよび蓋されたものの両方を含む)を再び他の反応成分から分離する。反応を可溶性基質を使用して行った場合、既知のサイズ排除クロマトグラフィーまたは、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない類似のタイプの分離技術により分離できる。固体支持体上に固定化した開始基質について、分離は支持体を水または好適な緩衝液で洗浄することにより達成される。認められるように、その３'位に除去可能保護部分を有するヌクレオチドと開始基質の間の酵素触媒ホスホジエステル結合形成、開始基質の反応成分からの分離、未反応開始基質の蓋、再び反応成分からの開始基質の分離、３'−ヒドロキシル基再生のための除去可能保護部分の除去および再び開示基質の反応成分からの除去は、所望の目的ポリヌクレオチド鎖が完全に合成されるまで、必要により繰り返す。新規合成ポリヌクレオチド鎖の固体支持体および／または開始基質からの開裂は、化学的または酵素的反応のいずれかで達成できる。化学的反応の場合、(遊離および非修飾３'−ヒドロキシル基を含む)開始基質末端ヌクレオチドが、７位の塩基がメチル化されたデオキシグアノシン：支持体−ｄＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−Ｍｅ⁷−Ｇ−目的ポリヌクレオチド(配列番号１）である場合、水中、９０℃での１Ｍピペリジンとの反応が、この位置の鎖を開裂し、所望のポリヌクレオチドのみを溶液中に産生する。この方法は、予め決定した配列のみを有するポリヌクレオチド鎖を産生でき、固定化鎖(開裂を行うための)または開始基質を除去するための溶液合成のいずれかで行うことができる。あるいは、ｄＧ^7meは開始基質または目的ポリヌクレオチド内の、開裂が望ましい、任意の座に位置できる。ポリヌクレオチド鎖の修飾塩基特異的開裂の他の例は、文献で広範囲に記載されている(AmbroseおよびPless，Meth．Enzymol .，I Vol 152:522-538参照)。ポリヌクレオチド鎖の酵素的除去は、特異的制限エンドヌクレアーゼとの反応により達成し得る。例えば、開始基質ヌクレオチドが以下の構造：支持体−ｄＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＡ−３'−ＯＨ(配列番号２) を有し、目的ポリヌクレオチドがＧで開始する場合、得られる新規合成鎖は、支持体からPst１制限酵素との反応により開裂できる。この方法は、新規合成鎖に更に別のPst１制限部位がなく、一つが好適なオリゴヌクレオチドとPst１部位でアニールし、酵素により認識される二本鎖形にする(例えば、以下の構造：３'− ｄＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＣＧＴＣ−５'(配列番号３)とのオリゴヌクレオチドのアニーリング)と推測する。目的ポリヌクレオチドの所望の最初のヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの最終的な配列に依存して、所望の配列のみの開裂を達成するために広範囲の制限酵素から選択できる。この方法は、予め決定した配列のみを有するポリヌクレオチド鎖を産生でき、固定化鎖(開裂を行うための)または開始基質を除去するための溶液合成のいずれかで行うことができる。あるいは、好適な制限エンドヌクレアーゼ認識配列を、開始基質または目的ポリヌクレオチド内の、開裂が望ましい、任意の座に位置できる。組み合わせた開始基質および目的のポリヌクレオチドは、固体支持体から化学的方法により開裂できる。どのように開裂を行うかは開始基質の性質およびどのように固体支持体に結合しているかに依存する。トリチル基のような共有置換活性化結合は、支持体を好適なプロトン酸で洗浄することにより開裂できる。多くの他の開裂方法が記載されている。アビジン−ビオチン結合のような非共有結合の場合、組み合わせ基質および目的のポリヌクレオチドの遊離は、８Ｍグアニジン−ＨＣｌ、ｐＨ１.５とのインキュベーションにより行う。完全合成を可溶性開始基質を使用して行った場合、目的のポリヌクレオチドを含む開始基質は種々の蓋されたオリゴ−およびポリヌクレオチドから、ポリアルキルアミドゲル電気泳動のようなクロマトグラフ技術により分離できる。同様に、開始基質を目的ポリヌクレオチドから化学的または酵素的手段(例えば、前記のようなピペリジンとの反応または制限酵素消化により)により開裂した場合、既知のクロマトグラフィーが目的のポリヌクレオチドの精製に使用できる。合成を固体支持体上に固定化した開始基質を使用して行った場合、固体支持体からの開裂は化学的または酵素的手段のいずれかで達成でき、組み合わせ開始基質と目的ポリヌクレオチドまたは目的のポリヌクレオチド単独を回収する。いずれの場合も、目的ポリヌクレオチドは蓋されたオリゴ−およびポリヌクレオチドで汚染されており、目的ポリヌクレオチドからポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離できる。目的ポリヌクレオチドの合成および回収の別の方法は、ヌクレオチドの固定化を含む。この場合、ヌクレオチドを固体支持体に結合するリンカーにより、３' −ヒドロキシルを保護する。リンカーのヌクレオチドへの結合は、エステルまたは他の前記保護基方法のいずれかであることができる。種々の官能基(例えば、アミン、アミド、ビオチン、アビジン等)を含む固体支持体は一般に入手可能であり、ヌクレオチドリンカーの具体的要求に合わすことができる。例えば、ビオチン分子を含むヌクレオチドリンカーは、アガロースに結合したアビジン官能基を使用してアガロースに結合できる。固定化ヌクレオチドを使用して、TdTase反応は遊離開始基質を溶液中で固定化ヌクレオチドに含有させ、それにより酵素反応に参加する開始基質のみが固定化される。TdTase反応に参加しない開始基質は、好適な緩衝液で固体支持体をすすぐことにより容易に除去される。開始基質の３'ヒドロキシルの再生は、前記と同様の技術で達成される。再生および開裂工程に続き、開始基質を固体支持体から洗い流し、遊離ヌクレオチドを含む再生／開裂溶液から、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換またはアフィニティー・クロマトグラフィーのような既知の方法で分離する。次いで、固体支持体粒子の新しい集団に含まれる次の固定化ヌクレオチドを、開始基質および好適な緩衝液を混合し、TdTase結合反応を繰り返す。開始基質よりむしろヌクレオチドの固定化のため、目的ポリヌクレオチドが未反応開始基質から全サイクルで分離されるため、蓋をする反応は不要である。同様に、開裂反応がすべての目的ポリヌクレオチド鎖の遊離をしない場合、固体支持体に結合し続けるこれらのポリヌクレオチドは連続TdTase反応前に除去される。種々の新規合成ヌクレオチド鎖が、二本鎖形の長いポリヌクレオチド配列を形成するために、続いてポリメラーゼ／リガーゼタイプの反応により合わされることは予期される。例えば、新規合成ポリヌクレオチドＡおよびＢは以下に記載の構造を有する：〔式中、ｐ(ｄＮ)は予定された、ＡまたはＢポリヌクレオチドに独自の目的のポリヌクレオチエド配列〕。ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントおよびＴ４ＤＮＡリガーゼならびに好適な緩衝液およびヌクレオチドの存在下、二本鎖ポリヌクレオチドは、目的ポリヌクレオチドが違いに“縫われて”おり、長い二本鎖ポリヌクレオチドＣ：を形成する。この反応は、ポリヌクレオチドの一つがまた固体支持体に結合しているか、または両方のポリヌクレオチドが溶液中に前記の技術により遊離している場合に行うことができる。Ｂ．ポリヌクレオチド本発明は、本発明の方法を使用して製造されるオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを意図する。これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、合成が完了した場合に、予定された配列を有するポリヌクレオチドが合成されるように、開始基質に添加する個々のヌクレオチトの選択された順序により産生される、予定されたヌクレオチド配列を有する。あるいは、ポリヌクレオチドの無作為の組み合わせが、個々の結合反応中または多くの個々の結合反応中に全４種の保護ヌクレオチドの挿入によりまた製造される。好ましい態様において、本発明の方法により製造されるポリヌクレオチドは、５ヌクレオチド長さより大きい。本発明の方法により製造されるポリヌクレオチドは、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００および２００ヌクレオチドより大きいヌクレオチド数を含み得る。本発明の方法により製造されるポリヌクレオチドの長さは、５、１５、１６、２５、２６または他の具体的長さの中間の整数のような前記ヌクレオチド長さの中間の長さであり得る。本発明により産生されるポリヌクレオチドの長さは、本発明の処理の効率によってのみ限定される。本発明の方法により製造されるポリヌクレオチドは、種々の生物学的および分子生物学的用途を有するヌクレオチド配列を含むことができる。当業者は、予め決定した配列を有する長いポリヌクレオチドの用途を理解するてあろう。例えば、現在の分子生物学て通常行われている多くの操作が、高価でない、予め決定した配列を有する長いポリヌクレオチドの利用性により非常に単純化され得る。本発明の方法により産生されたポリヌクレオチドを使用して単純化される分子生物学的工程および操作は、インビトロおよびインビボ両方の種々の核酸のクローニングおよび発現を含む。本発明の方法を使用して産生されたポリヌクレオチドを使用して単純化される技術および操作の例は、BergerおよびKimmel編集Meth ods in Enzymology，Vol．152；Maniatis et al.，Molecular Cloning a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，1990；Ausubel et al編集、 Current Protocols in Molecular Biology，John Haley and Sons，New York，1 987参照。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、核酸への制限部位の挿入に、プロモーターのような生物活性を有する種々のヌクレオチド配列の挿入におよび読み取り枠の調節に使用できる。本発明により製造されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを使用した多くの適用の可能は、当業者が理解するように非常に大きい。本発明により製造されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、適用が長いオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを必要とする場合、特に有用である。Ｃ．組成物本発明は、また、鋳型非依存的酵素およびヌクレオシド５'トリホスフェートの３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートを含む組成物を、および更に本発明の開始基質を含む好ましい組成物もまた意図する。本発明は、本発明の開始基質に存在する９９％の未保護３'ヒドロキシル基とその３'位に除去可能保護基を有するヌクレオシド５'トリホスフェートとの間の５'から３'ホスホジエステル結合の形成を１０分以内に触媒できる量の鋳型非依存的酵素を有する組成物を意図する。他の組成物は、同じ反応を同じ程度２分以内に行うことができる量の酵素を含むことを意図される。本発明により意図される組成物は、存在する鋳型非依存的ポリヌクレオチド酵素が鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼである組成物を含む。好ましい鋳型非依存的ポリヌクレオチドポリメラーゼは、TdTaseおよび同様の活性の酵素を含む。本発明の組成物は、ヌクレオシドの３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシドを含む。特に好ましくは、ヌクレオシドの３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートである。種々の有用な除去可能保護部分が本明細書に記載されている。好ましい組成物において、３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシドは、１ナノモルから１００mモルの範囲の濃度で存在する。他の好ましい組成物において、ヌクレオシドは１マイクロモルから１ミリモルの濃度で存在する。他の好ましい態様において、その３'位を保護する除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェートは、組成物に存在するＫｍの１０倍の濃度で存在する。Ｄ．自動処理および装置本発明は、本明細書に記載の方法の自動処理および装置および容器を意図する。例えば、本発明工程の種々の緩衝液試薬溶液は、正しい配列の物質の正確な量を測定するためにマイクロプロセッサープログタムで制御されたペリスタポンプまたは類似の装置に結合した固定可能管を使用して固体マトリックスに固定された開始基質を含む合成カラムに提供できる。用いる装置に関係無く、本発明の方法は所望のヌクレオシドの間に、高い効率で一個のホスホジエステル結合を製造でき、高い収率で長い鎖のポリヌクレオチドを効率良く製造するのに使用できることは認められよう。このような自動処理の一つの例は、図３に示すガラスの孔フリット(porous fr it)１３またはプラスチック容器１５である。不溶性マトリックス１１は、セルロース、SEPHAROSE(商標)またはＣＰＧのような固体支持体を含み、それにヌクレチド、ヌクレオシドまたはポリヌクレオチドが末端ヌクレオチドの５'位で共有結合するかまたは、遊離３'位ヒドロキシル基を有するオリゴ−またはポリヌクレオチドまたはヌクレオシドが５'−ヒドロキシル基を経由して共有結合する。マトリックス１１はそれ自体、孔フリット１３の共有組成であり得るかまたは別のものであり得る。合成サイクルに含まれる種々の溶液を、貯蔵容器２１、２３、２５、２７、２８および２９に貯蔵する。溶液を溶液１５にポンプ３１、３３、３５、３７、３８、３９および４０に結合した管４１、４３、４７、４８、４９および５０を通って挿入される。貯蔵溶液の組成は、混合物の種々の組成の安定性に依存する。単純自動処理は、下記のような多くの種々の試薬の組み合わせである：貯蔵容器２１、２３、２５および２７は、約１０から約５００ｍＭのナトリウムカコディレート(ｐＨ７.０、２５℃で)、約０.１から約１.０ｍＭのジチオステイトールの濃度を有する緩衝液４５１、５３、５５および５７をそれぞれ含む。各緩衝液はまた、ホスホジエステル結合形成に好適な約０.１０から約２００単位／μＬの酵素(例えば、TdTase)を含む。貯蔵容器２１の緩衝溶液５１は、また、約０.２０から約２００μＭの保護された３'−ヒドロキシル基を有するデオキシアデノシン５'−トリホスフェートを含む。それぞれ、貯蔵容器１２、２５および２７の緩衝溶液５３、５５および５７は、それぞれ同様の濃度の、また保護３'−ヒドロキシル基を有するデオキシシトシン５'−トリホスフェート、デオキシグアノシン５'−トリホスフェートおよびチミジン５'−トリホスフェートを含む。貯蔵容器２８の緩衝溶液５８は、前述の４つのヌクレオシドの保護３'位ヒドロキシル基の脱保護に好適な試薬を含む。貯蔵容器２９の貯蔵溶液５９はまた好適な、０.１ＭナトリウムカコディレートのようなｐＨ７.０の中和緩衝液を含む。貯蔵容器６０の貯蔵溶液３０は前述のように固体支持体から最終生産物を遊離するのに好適な酵素溶液または化学的試薬を含む。種々の溶液は管に導かれ、マトリックスに供給される。緩衝溶液５１、５３、５５および５７のそれぞれの貯蔵溶液２１、２３、３５および２７への容器１５からの再循環は、管６１、６３、６５または６７により達成できる。好適な管への液体の分配は、液体を容器１５から動かす分配器により達成できる。マルチポートストップコックおよびフラクションコレクターのような分配器は当業者に既知である。液体の、分配器から下流の管(例えば、６１、６３、６５、６７、６９、７３)を経由しての移動は、必要に応じた追加ポンプ(例えば、ポンプ８３、８５、８７、８９、９１、９３)により達成できる。少なくとも一つのマイクロプロセッサーが、予定された配列を有するヌクレオチド鎖を形成するためにヌクレオチドの連続付加および再循環のためにペリスタポンプおよび分配器を制御する。好ましい処理において、マトリックス１１に結合した開始基質は、最初に５１、５３、５５または５７の一つの溶液に充分な時間さらされ、ヌクレオチドの開始基質への添加を可能にする。この溶液を次いで好適な容器(２１、２３、２５または２７)に再循環する。緩衝溶液５１、５３、５５および５７に含まれるTdTaseおよび５'−ヌクレオシドトリホスフェートの量は、予め決定した量の目的ヌクレオチド鎖の合成に十分である。例えば、１,０００塩基対(約３３０,０００ＭＷおよび約３３０μg) からなる１nmolのヌクレオチド鎖の自動合成のために、各緩衝溶液は過剰の各５ '−ヌクレオシドトリホスフェート(約５００nmol)および過剰のTdTase(約１００から約１,０００単位)を含む。TdTaseおよび５'−ヌクレオシドトリホスフェートを含む緩衝溶液の小さいフラクションだけが、ヌクレオチド添加の各サイクルに使用される。マトリックス１１を次に溶液５８に充分な時間さらし、成長オリゴまたはポリヌクレオチド鎖から除去可能保護基を除去する。この溶液は再循環されないが、ポンプ９１を使用して分配器７１により管６８に分配される。次いで、マトリックス１１を短く溶液５９にさらし、脱保護試薬を洗い流す。次の酵素／ヌクレオチド溶液、５１、５３、５５または５７のいずれかを次いでマトリックス１１に添加し、サイクルを続ける。最後に、所望のオリゴ−またはポリヌクレオチドが合成された後、目的ポリヌクレオチドの固体支持体からの分離は、前記のような制限エンドヌクレアーゼ溶液または固体支持体からの化学的開裂を起こす溶液である溶液６０の制御添加により起こる。マイクロプロセッサーは分配器７１およびポンプ９３に指示し、最終産物を管７３を経由して移動し、最終の後処理のために回収される。マイクロプロセッサーの種々の反応の制御の例として、開始基質のオリゴヌクレオチドＡＣＧＴの合成は、下記に示すコマンドの配列を含む。コマンドの長さおよび間は、任意の具体的な反応または更に処理するための液体の移動を可能にする。マイクロプロセッサーコマンド指示の結果１．ポンプ３１オン溶液５１を容器１５に添加２．ポンプ３１ポフヌクレオチド添加反応進行中３．分配器７１オン、管６１を経由した反応溶液のポンプ８３オン再循環４．分配器７１オフ、溶液５８の容器１５への添加；ポンプ８１オフ脱保護反応開始５．ポンプ３８オフ脱保護反応進行中６．分配器７１オン、管６９を経由した脱保護溶液のポンプ９１オン廃棄７．ポンプ３９オン中和／洗浄容器チャンバー８．分配器７１オフ、溶液５３の容器１５への添加ポンプ６９オフ、ポンプ３３オンこのサイクルは所望の配列が合成されるまで他のヌクレオチドで繰り返す。最終産物の回収が望ましい場合、マイクロプロセッサーは上記工程７の後に以下のコマンドを与える。１．ポンプ４０オン溶液６０の容器１５への添加２．ポンプ４０オフ開始基質の開裂反応進行中３．分配器７１オン、合成ＤＮＡを管７３を経由したポンプ９３オン回収別の方法は、目的のヌクレオチドを非反応基質ポリヌクレオチドから各サイクルで分離するため、固定化ヌクレオチドトリホスフェートの使用を予期する。固定化ヌクレオチドを使用した自動処理は、固定化基質ポリヌクレオチドを含む処理と全く異なる。トリホスフェートとポリヌクレオチドの結合反応後、溶出液は未反応ポリヌクレオチド、反応緩衝液およびTdTase酵素を含む。目的ポリヌクレオチドは固体支持体に結合する。酵素をその貯蔵庫に戻すために、汚染ポリヌクレオチドを最初にヒドロキシルアパタイトを含むカラム、例えば同様な酵素が通過するポリヌクレオチド吸着媒体を溶液を通して除去する。このカラムは各サイクルで製造される予測される汚染ポリヌクレオチドの全てを吸着する能力を有する。脱保護工程後、目的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドトリホスフェート(３' −ヒドロキシルの)および脱保護緩衝液(例えば、ＮａＯＨまたはホスファターゼ )の溶液中に含まれる。これら２つの汚染物は、サイズ排除クロマトグラフィー( 例えば、SEPHAROSE(商標)CL-6B)または多くの小分子をオリゴおよびポリヌクレオチドから分離する通常使用される技術で除去できる。この例は、目的ポリヌクレオチドの、開始基質がオリゴｄＴを含むことのみを要求するオリゴｄＡ−セルロースカラム(３'−５')へのアニーリングによる吸着である。Ａ−Ｔアニーリングは、目的ポリヌクレオチドの溶出がＨ₂Ｏとのインキュベーションにより達成できるため、自動処理に好ましい態様である。目的ヌクレオチドのアニーリングは、単に開裂反応の、充分な量のＨＣｌ添加によるまたは脱保護緩衝液中の好適な量のＮａＣｌ(〜０.１−０.５Ｍ)の含有による中和のみを必要とする。本発明の固定化ヌクレオチドトリホスフェートを含む自動処理は、図４に示す。処理は、限定はされないが前述の方法により、固体支持体に固定化したヌクレオチドトリホスフェートを使用し、貯蔵容器１２１、１２３、１２５および１２７中の貯蔵溶液１５１、１５３、１５５、１５７を含む。貯蔵溶液は鎖状ヌクレオチド、好適な緩衝液および充分な量の酵素を含み、所望の量の予定された配列の合成を行う。固定化物質は、種々の管を必要に応じて移動する液体動態特性を有する。これらの特性を有する基質(例えば、ゲルおよび粘性懸濁液)は、当業者に既知である。反応容器１１５は反応室１１１およびストップコック１１３を含む。ストップコック１１４は３つのＡ、Ｂ、Ｃの位置を有する。位置Ａは、種々の成分が妨げられることなく通過するのに充分な直径の穴を管に配列する。位置Ｂは約２０塩基の長さのデオキシアデノシン(ｄＡ)のオリゴヌクレオチドが共有結合する孔フリットを配列する。オリゴｄＡの量は、上記のように開始基質に結合したオリゴｄＴの全量をアニールるすのに十分である。位置Ｂにおいて、溶液のみが通過でき、固定化物質(例えば、溶液１５１、１５３、１５５および１５７に含まれるもの)は通過できない。位置Ｃは全ての流れを止める。反応室１１１はチドの長さのオリゴｄＴを含む。貯蔵容器１２１、１２３、１２５、１２７、１２８および１２９は、ペリスタ管または他の類似の物質により反応容器１１５に結合し、貯蔵容器への試薬の輸送を行う。更に、容器１１５は、管１８７、１８９、１９１または１９３を経由して、１３０、１３２、１３４または１３６に結合した吸着媒体(例えば、ヒドロキシアパタイト)を通過した後、管１８３または管１８５または貯蔵溶液に再循環するように流れを分ける管１８１に結合する。管１８３は容器１１５にフィートバックする；管１８５は廃棄容器に供給する。管を通った溶液の移動は、液体、ゲルまたは粘性懸濁液を管を通して所望の目的地に運ぶためにポンプ１３１、１３３、１３５、１３７、１３８、１３９、１６３１３３、１３５、１３７、１３８、１３９、１６３(例えば、ペリスタポンプ) により容易になる。合成のための自動処理は、少なくとも一つのマイクロプロセッサーで制御される溶液の下記の流動およびストップコック位置を含む。マイクロプロセッサーはポンプ、分配器およびストップコック位置を制御する：１）ストップコック１１３、位置Ｃ(遮断)；廃棄位置のストップコック１７１ (管１８５)；鎖状ヌクレオチド、緩衝液(溶液１５１、１５３、１５５または１５７)を基質オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド(溶液１６１)と合わせ、鎖状オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを形成する。２）ストップコック１１３、位置Ｂ(オリゴ−ｄＡフリット)；再循環位置(管１８７、１８９、１９１または１９３)の分配器１７１；未反応ポリヌクレオチドが容器１３０、１３２、１３４または１３６に吸着される；酵素、緩衝液および再循環。３）ストップコック１１３、位置Ｂ(オリゴ−ｄＡフリット)；開裂緩衝溶液( 溶液１５８)を固定化ポリヌクレオチドに添加し、オリゴ−ｄＡフリットにアニールした遊離ポリヌクレオチドを産生する；遊離モノヌクレオチド廃棄。４）ストップコック１１３、位置Ｂ(オリゴ−ｄＡフリット)；再循環位置(管１８３)のストップコック１７１；水(溶液１５９)を室およびフリット内を通し、アニルポリヌクレオチドをフリットから遊離させ、ポリヌクレオチドを反応室に戻す。遊離ポリヌクレオチドは、管１８３に工程５中、残る。５）ストップコック１１３、位置Ａ(完全に開放)；廃棄位置(管１８５)のストップコック１７１；固定化基質は、ポリヌクレオチドが反応室に戻る前に廃棄される。６）最終産物を、位置Ａのストップコック１１３を伴う管１８５を通して回収する。これらの分離技術が効果的であるには、開始オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質は、少なくとも約２０ヌクレオチドを含有すべきであることは認められよう。開始オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの組成は、連続精製工程および、開始オリゴ−またはポリヌクレオチドから目的オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを最後に開裂できる任意のものであることができる。目的ポリヌクレオチドの開始オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドからの最後の分離を可能にするヌクレオチド修飾の例は、ｄＡ、ｄＣまたはｄＧの主要アミンのビオチニル化である。更に、７−メチルグアノシンを３'−末端に含む開始オリゴヌクレオチド基質は、開裂部位を、最後に目的ポリヌクレオチドを回収するために、前記のように提供する。従って、用いる装置に関係無く、本発明の方法は、サイクル当たり未反応配列の数を著しく減少させて、効率的に高い収率でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを産生する。これは、更なる実験のための目的ヌクレオチド鎖の最後の単離を非常に単純化する。一度単離すれば、ヌクレオチド鎖は、他のポリヌクレオチドと“鎖状”であり得、上記のように二本鎖ＤＮＡを形成するか、または組換えＤＮＡ末端使用適用においてポリメラーゼ連鎖反応のような既知の手段で増幅し得る。Ｅ．キット本発明はまた本発明方法を行うためのキットも意図する。典型的に、キットは本合成工程と共に方法を行うための挿入を行うのに必要な全溶液および基質を含む。本発明方法を行うための典型的キットは、本発明の開始基質、３'位を保護する除去可能保護部分を有する本発明の種々のヌクレオシド５'トリホスフェート、開始基質の非保護３'ヒドロキシル基と保護５'−トリホスフェートとの間に５'から３'ホスホジエステル結合の形成を触媒できる本発明の酵素を含む。所望によりキットに含まれてもよい更なる組成および溶液は、種々の必要な反応溶液および反応緩衝液、検定を行う反応容器、脱保護化学試薬、本発明の溶液または酵素である。本合成を行うキットはまた固体支持体に結合した開始基質も含み得る。キットは、所望のオリゴヌクレオチドの最初のヌクレオシドが好適な開始基質の選択により選択できるように、種々の固体支持体に結合した開始基質を含み得る。本工程を行うための他のキットにおいて、予め選択されたヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを有する開始基質が、その５'にこの予め選択された配列を含むオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを産生可能にするために提供される。このタイプの開始基質を有するキットは、例えば、そのヌクレオチド配列に存在する制限エンドヌクレアーゼ開裂を有するオリゴヌクレオチドの容易な合成を提供する。本発明により意図される他のキットは、またはこれらの開始基質を使用して産生されるオリゴヌクレオチドを、容易に他の分子に結合する、独特な生理活性を有するまたは他の独特な特性のような有用な特性を有するようにする、種々の誘導体化ヌクレオチド、ヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド分子を有する開始基質を含む。他のキットは、二本鎖オリゴヌクレオチドのような本発明の開始基質を含む。本発明は、また、その３'位に除去可能保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートおよびヌクレオシド類似体を産生するためのキットも意図する。これらのキットは、使用者に本発明の実施に有用なヌクレオシド５'トリホスフェートおよび相同物の製造を可能にする。本発明はまた、本発明の方法と組み合わせた他の分子生物学的工程を行うための付加成分を含むキットも意図する。例えば、本発明の成分は、合成途上にあるまたは十分合成された目的ポリヌクレオチドの増幅に所望の修飾をなすために、タンパク質または酵素を発現するためのベクターおよび付随細胞系を含むキットに存在し得る。下記の実施例は、更に本発明を例示説明するものであり、その範囲を限定すると解釈されるものではない。特に指示しないかぎり、材料は、Promega社、Fishe r社、Aldrich社、Sigma社、Pharmacia社、Gibco-BRL社、Bio-Rad社、およびNew England Biolabs社から入手した。部およびパーセンテージは全て、その他であることを明記しない限り、重量によるものであり、温度は全て、セ氏温度である。実施例実施例１．保護ヌクレオチドの合成Ａ．３'ヒドロキシルのカルボン酸との反応による保護ヌクレオチドの合成ｉ．トルイル酸。無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１Ｍトルイル酸（パラまたはオルソ異性体のいずれか）１００μLを、窒素雰囲気下、無水ＤＭＦ中１Ｍカルボニルジイミダゾール１００μLと混合した。イミダゾリドの形成は、３０秒間室温で進行させた。この混合物に水中５０mMデオキシヌクレオシド５'−トリホスフェート溶液１００μLを加えた。トルオイル−ｄＮＴＰエステルの形成は、１２時間室温で進行した。トリホスフェート（３'−ヒドロキシ未反応トリホスフェートおよび３'−トルオイルトリホスフェートの両方を含む）をアセトン９容量の存在下で沈殿させることにより他の反応成分から分離した。不溶性ヌクレオシドトリホスフェートを可溶性成分の遠心分離および除去により回収した。次いでヌクレオシドを水１００μLに再溶解させ、トルオイルエステルを、まず容量２：２：３の割合のイソプロパノール、ブタノールおよび水で、次いで、水単独で前洗浄し、乾燥させておいたワットマン３ＭＭセルロース紙でのクロマトグラフィーにより出発物質ヌクレオチドから分離した。上昇クロマトグラフィーにより分離を達成するための溶媒は、イソプロパノール、ブタノール、および水を、これもまた容量２：２：３の割合で含有した。分離した様々な成分の検出は、２５４nmでの紫外線吸収によって行った。ｄＮＴＰ−３'−Ｏ−トルエートを紙から切り取り、水で溶出した。真空下で濃縮乾固後、ヌクレオチドエステルを最終濃度〜０.１−１mMまで水に再溶解させた。この物質を質量分光分析にかけて、構造を確認した。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰのトルオイルエステルの予想質量数は、それぞれ６０８、５８４、６２４、および５９９である。それぞれの場合で、これらの質量数が観察された。これらの質量数は、非保護デオキシヌクレオシドトリホスフェートから得られたスペクトルでは観察されなかった。関連実験において、様々なエステルをカルボン酸から形成させて、３'位の芳香族または脂肪族保護基を得ている。 ii．安息香酸およびジメチル安息香酸。安息香酸ならびに２,６−および３,５ −ジメチル安息香酸異性体を、続く酵素反応の全体速度に対するメチル基の位置効果を評価するために上記したのと同一の方法でヌクレオチドトリホスフェートへとエステル化した。 iii．４−ニトロ安息香酸。同一の方法を用いて３'−ヒドロキシルへとエステル化した。 iv．２−ナフトエ酸。同一の方法を用いて３'−ヒドロキシルへとエステル化した。ｖ．イソ吉草酸。同一の方法を用いて３'−ヒドロキシルへとエステル化した。個々の安定性要件によって変わるが、操作方法は、ヌクレオチドトリホスフェートの３'−ヒドロキシルのエステル化および保護のため、ほとんどのカルボン酸の利用に容易に適応可能である。Ｂ．３'−ヒドロキシルとエーテルとの反応による保護ヌクレオチドの合成デオキシヌクレオシドトリホスフェート２.５mgをパラートルエンスルホン酸５.２mgを含有する無水ＤＭＳＯ１００μLに溶解させた。溶液を０℃まで冷却し、次いで、エチルビニルエーテル２００μLを加えて、３分間反応させた。その後、１Ｍトリス−Cl、ｐＨ９.０の２００μLを勢い良く撹拌しながら加え、その結果２液相が形成した。エーテル相を廃棄し、水性相に、１０容量の無水エタノールを加えて、ヌクレオチドを沈殿させた。−２０℃で１０分間インキュベーション後、ヌクレオチドペレットを遠心分離により得、これを０.２５Ｍ NaClに再溶解させ、次いで、１０容量のエタノールを加えた。最終沈殿ヌクレオチドペレットを水１００μLに溶解し、クロマトグラフィー用のワットマン３ＭＭ紙にかけて、ヌクレオチドエーテルを未反応のヌクレオチドから分離した。上昇クロマトグラフィーを上記のとおり、イソプロパノール、ブタノール、および水の容量２：２：３の割合の溶媒を用いて実施した。ヌクレオチドエーテルは、保護基がエトキシエチル部分である場合、１.２５のＲ_f（未反応ヌクレオチドと比較）で移動する。これを紙から切り取り、水で溶出して、精製誘導体を得た。Ｃ．３'−ヒドロキシルのリン酸化による保護ヌクレオチドの合成ｉ．化学合成。デオキシヌクレオシドトリホスフェート２.０mgを無水ＤＭＳＯ６０μL、オルソリン酸２μL、トリエチルアミン６μLに溶解させた。反応を開始するために、トリクロロアセトニトリル６μLを加え、混合物を３７℃で３０分間インキュベーションした。反応物を室温まで冷まし、５Ｍ NaCl ５μLを加え、次いで、アセトン１.４mlを加えた。ヌクレオチドの沈殿を１０分間−２０℃で進行させ、ヌクレオチドを遠心分離により回収し、０.２５Ｍ NaCl １００μLに再溶解し、無水エタノール１.４mlの添加により沈殿させた。最終ヌクレオチドを遠心分離により回収し、水１００μLに溶解させ、ワットマン３ＭＭ紙にかけた。ヌクレオチドテトラホスフェート（５'−トリホスフェート、３'−モノホスフェート）の分離は、容量２：２：３の割合のイソプロパノール、ブタノール、および水での上昇クロマトグラフィーにより実施した。ヌクレオチドテトラホスフェートは、０.９０のＲ_f（未反応ヌクレオチドと比較）で移動する。別法として、同じリン酸化反応成分（リン酸、テイチルアミン、およびデオキシヌクレオチド）をホルムアミドに溶解させ、反応を７０℃で進行させてもよい。その他のクロマトグラフィー溶媒には、１−プロパノール、濃アンモニア、水（５５：２０：２５）があり、その場合、３mm紙でのテトラホスフェートのＲｆは、未反応トリホスフェートと比較しておよそ０.８である。 ii．酵素的合成。デオキシヌクレオシド３'−モノホスフェート（Sigma）をポリヌクレオチドキナーゼを用いて５'位でリン酸化した。反応は、５０mMトリス −Cl（ｐＨ９.０）、１０mMMgCl₂、１.５mMスペルミン、５mMジチオトレイトール、３mM３'−ｄＮＭＰ、３０mMＡＴＰ、および２０単位のポリヌクレオチドキナーゼ（SigmaまたはPharmacia）からなる最終容量２００μLの溶液中、酵素の本来の３'ホスファターゼ活性を最小にするためにｐＨ９.０で、室温で１６時間行った。リン酸化は、Affi-Gel６０１（Bio-Rad）でのクロマトグラフィーによりＡＴＰを除去後、クロマトグラフィー（ワットマン３ＭＭ紙）で監視した。ヌクレオシド５'−モノホスフェート３'−モノホスフェートを更に、５０mMトリス−Cl（ｐＨ７.４）、１０mMMgCl₂、１.５mMスペルミン、５mMジチオトレイトール、３０mMＡＴＰ、４mMホスホエノールピルビン酸、１０mMKCl、１５０μg ／mlピルビン酸キナーゼ（Sigma）および１００μg／mlヌクレオシドモノホスフェートキナーゼ（Boehringer Mannheim）を含有する溶液中、ヌクレオシドモノホスフェートキナーゼおよびピルビン酸キナーゼを用いて５'位でリン酸化した。反応は、室温で３０分（ｄＡの場合）ないし４時間（ｄＴ、ｄＣ、ｄＧの場合）続けた。デオキシヌクレオチドを再度、Affi-Gel６０１でのクロマトグラフィーによりＡＴＰから分離し、真空下で濃縮乾固させ、水２００μLに溶解させた。テトラホスフェートの他のヌクレオチドからの精製は、上記ペーパークロマトグラフィーにより実施した。Ｄ．アガロースビーズにつなげたベンゾイル化ヌクレオチドの合成１０mM水酸化ナトリウム、９０％ＤＭＦ、ｐＨ１０中、１Ｍｐ−アミノ安息香酸１００μLを塩基性ＤＭＦ中１ＭＮ−スクシンイミジル３−(２−ピリジルチオ)プロピオネート１０μLと混合した。スクシンイミジルのアミンへの結合は、４時間室温で進行させた。反応を監視し、結合した生成物を、溶媒としてクロロホルムとメタノールの混合物を用いるシリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより精製した。結合生成物を含有するシリカゲルをＤＭＦで抽出し、濾過し、無水ＤＭＦ中、等容量（〜１００μL）の１Ｍカルボニルジイミダゾールに加え、その後直ちに５０mMデオキシヌクレオシドトリホスフェート１００μLを加えた。生成物、即ち、アミドおよびジスルフィド結合を含有するつなぎ鎖（tether）にエステル結合により結合させたｄＮＴＰを、窒素雰囲気下、２−メルカプトエタノールで処理し、スルフヒドリルにさらし、続いて、１０容量の無水エタノールから精製した。次いで、精製物を窒素雰囲気下、５０mMリン酸ナトリウム、ｐＨ６中、有機水銀架橋アガロースであるAffi-Gel（登録商標）５０１０.２mlとともに、室温で１時間インキュベーションして、メルカプチド共有結合を形成させた。Ｅ．別法を用いる、除去可能な３'保護部分を有するヌクレオシドの製造エステルおよびエーテルトリホスフェート製造の別法は、既に３位にエステルまたはエーテル保護基を含有しているヌクレオシドの化学的リン酸化を伴う。イソバレロイルエステル。窒素雰囲気下で無水Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた１Ｍイソ吉草酸１００μLを無水ＤＭＦ中１Ｍカルボニルジイミダゾール１００μLと混合する。イミダゾリドの形成は、３０秒間室温で進行させる。この混合物に、同じく無水ＤＭＦに溶解させた５'−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジン（ＤＭＴチミジン；Sigma Chemical Co.）１００μLを加える。３'ヒドロキシルの位置でのイソバレロイルエステルの形成は、室温で１２時間続ける。５'−ＤＭＴ３'−イソバレレートチミジンを薄層クロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより精製し、真空下で溶媒から回収した。５'保護基を除去するために、化合物を、塩化メチレン１ml中、室温で撹拌しながら、微細粉末状の無水臭化亜鉛５等量と反応させる。反応は、ＴＬＣで監視して、ＤＭＴ基の特異的除去に最適な時間を測定する。次いで、ＴＬＣまたはＨＰＬＣ精製の後、チミジンの５ '−ＯＨ３'−イソバレロイルエステルを回収する。これらの操作は、一般に、４種のヌクレオシドすべてに適用可能である。５'ヒドロキシルをリン酸化するために、エステルをトリエチルホスフェート０.５mlに溶解または再懸濁させる。０.４mmol塩化ホスホリル（POCl₃）を加え、反応を室温で１−１４時間進行させる。５'−モノホスフェート−３'Ｏ−イソバレロイルエステルの精製は、直線勾配の炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７ −８）で溶出させるＤＥＡＥセファデックスＡ−２５でのクロマトグラフィーにより実施する。モノホスフェートは、およそ０.２−０.３Ｍの緩衝液濃度で溶出される。精製したモノホスフェートエステル（０.１mmol）をDowex−５０ＷＸ−８カチオン交換樹脂のピリジニウム形態を用いて、そのピリジニウム塩に変換する。トリブチルアミン（０.２mmol）の添加によりトリブチルアンモニウム塩を製造し、生成物を、無水ピリジンおよびＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドの添加および蒸発濃縮により乾燥させる。Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ml）中、無水トリブチルアンモニウム塩の溶液に、１,１−カルボニルビス（イミダゾール）（０.５mmol）を加える。イミダゾリドの形成は、ＴＬＣクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣにより監視することができる。反応が完了したら、メタノール３５μ Lを加えて、残りのカルボニルビス（イミダゾール）と反応させ、その溶液を室温で５分間維持する。次いで、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ml）中、トリブチルアンモニウムピロホスフェート（０.５mmol）を撹拌しながら滴下添加する。混合物を室温で数時間維持し、次いで、蒸発乾固する。トリホスフェートを上記のクロマトグラフィーにより単離し、およそ０.４−０.５Ｍ炭酸トリエチルアンモニム緩衝液で溶出させる。これらのリン酸化操作法は、一般に、４種のヌクレオシド全てに適用可能である。個々の安定性要件によって変わるが、上記操作法は、３'保護ヌクレオチドトリホスフェートを製造するための３'−ヒドロキシルのエステル化および保護、続く、５'ヒドロキシルの化学的リン酸化のため、ほとんどのカルボン酸の利用に容易に適応可能である。これらのカルボン酸には、下記のものがあるが、これらに限定されない：ギ酸、ベンゾイルギ酸、クロロ酢酸、フルオロ酢酸、メトキシ酢酸、フェノキシ酢酸、クロロフェノキシ酢酸、フェニル酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ吉草酸、コハク酸、ペンタン酸、ピバル酸、アダマンタンカルボン酸、クロトン酸、ブテン酸、置換安息香酸（例えば、ニトロ安息香酸、メチル安息香酸、クロロ安息香酸、フェニル安息香酸）、ナフトエ酸。当業者には理解されるように、ヒドロキシル基を一時的に保護する目的でエステルを作る方法は多数ある。更に、１つのヒドロキシル基（例えば、ヌクレオシドの５'ヒドロキシル）を一時的に保護してもう１つのヒドロキシル基（例えば、ヌクレオシドの３'ヒドロキシル）にエステルを導入する方法も多数ある。シリルエーテル。チミジン１mmolを室温でＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド１ml に溶解する。この溶液に、イミダゾール２０mmolおよびtert−ブチルジメチルシリルクロリド（ｔ−ＢＤＭＳ）１０mmolを加える。反応は、両方のヒドロキシル基がシリル化されるまで室温で進行させる。ジシリル化ヌクレオシドをＴＬＣまたはＨＰＬＣにより回収し、溶媒を真空下で除去する。次いで、５'シリル保護基を８０％酢酸中でインキュベーションすることにより、選択的に除去する。反応は、ＴＬＣにより監視して、５'保護基の除去に最適な時間を測定する。得られた３'シリル化ヌクレオシドをＴＬＣまたはＨＰＬＣにより精製し、５'位でのリン酸化を上記操作法により実施して、ヌクレオチドトリホスフェート３'−ｔ−ＢＤＭＳエーテルを得る。これらの操作法は、一般に、４種のヌクレオシド全てに適用可能である。メトキシメチルエーテル。ＤＭＴ−チミジン１mmolをジイソプロピルエチルアミンに溶解し、クロロメチルメチルエーテル（Aldrich Chemical Co.）４mmolと０℃で１時間反応させ、続いて、室温まで暖めて、更に８時間反応させる。チミジン５'−ＤＭＴ３'−メトキシメチルエーテルをＴＬＣまたはＨＰＬＣにより精製し、真空下で溶媒から回収する。５'保護基を除去するために、化合物を塩化メチレン１ml中で５等量の微粉末状無水臭化亜鉛と室温で撹拌しながら反応させる。反応は、ＴＬＣにより監視して、ＤＭＴ基の特異的除去に最適な時間を測定する。次いで、ＴＬＣまたはＨＰＬＣ精製後、チミジンの５'−ＯＨ３'−メトキシメチルエーテルを回収する。５ '位でのリン酸化を上記操作法により達成し、ヌクレオチドトリホスフェート３' −メトキシメチルエーテルを得る。これらの操作法は、一般に、４種のヌクレオシド全てに適用可能である。当業者には理解されるように、ヒドロキシル基を一時的に保護する目的でエーテルを作る方法は多数ある。更に、１つのヒドロキシル基（例えば、ヌクレオシドの５'ヒドロキシル）を一時的に保護してもう１つのヒドロキシル基（例えば、ヌクレオシドの３'ヒドロキシル）にエーテルを導入する方法も多数ある。ヌクレオシド３'ヒドロキシル基の保護に有用なエーテルには、下記のものがあるが、これらに限定されない：メチルエーテル、置換メチル（例えば、ベンジルオキシメチル、メトキシエトキシメチル、トリメチルシリルエトキシメチル）エーテル、ピラニルエーテル、フラニルエーテル、置換エチル（例えば、エトキシエチル、メトキシエチル、メチルメトキシエチル）エーテル、ブチルエーテル、アリルエーテル、シンナミルエーテル、ベンジルエーテル、および置換ベンジル（例えば、メトキシベンジル、ハロベンジル、ニトロベンジル）エーテル、アントリルエーテル、およびシリルエーテル。実施例２．保護ヌクレオチドから３'ヒドロキシルの再生Ａ．ヌクレオチド３'−Ｏエステルの脱保護。エステル保護基を１mMCoCl₂および１００mMカコジル酸カリウム、ｐＨ６.８中でインキュベーションすることにより、ｄＮＴＰの３'−ヒドロキシルから除去した。３７℃で１５分インキュベーション後、エステルのヒドロキシルへの変換をセルロースおよびペーパークロマトグラフィーにより評価し、ほとんど定量的であることが分かった。これらの脱保護条件は、４種のヌクレオチドそれぞれについて等しく有効であった。更なる評価により、不安定性は、緩衝液および二価カチオンの両方に起因することが明らかになった。通常使用されるその他のＴｄＴアーゼカップリング反応緩衝液におけるトルオイルエステルの不安定性を調査した。（１mMCoCl₂の存在下）様々な緩衝液に起因する相対的な不安定性度は、カコジレート＞トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン＞酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウムであることが分かった。（カコジレート緩衝液中）カチオンに起因する不安定性は、Co⁺⁺＞Mn⁺⁺＞Mg⁺⁺であることが分かった。エステルの分解は、最初、約３分のインキュベーション後に観察できた。緩衝液単独、またはカチオン単独でのインキュベーションでは、観察可能な分解はなんら生じなかった。これらのデオキシヌクレオチドエステルもまた、他の多くの種類のエステルに共通して、塩基性条件、例えば、１０−１００mM NaOH中のインキュベーション、に敏感であった。ｄＮＴＰのその他のエステル（イソバレロイルエステル、ジメチルベンゾイルエステル、ナプトイルエステル、およびニトロベンゾイルエステル）もまた、緩衝化二価カチオン中で相対的に不安定であった。一般に、これらの結果は、ｄＮＴＰのエステルの予想外の特性を明らかにするものであり、これらのエステルをカップリング反応後、伸長ポリヌクレオチド鎖から迅速除去する好便かつ良好な方法を提供する。これらの脱保護条件は、サイクル毎にＤＮＡを変性させることなく、予め存在する二本鎖ＤＮＡ上での目的ポリヌクレオチドの合成を可能にするのに充分に緩やかである。開始基質として二本鎖ポリヌクレオチドを用いるこの“アッド−オン（add-on）”合成の能力は、下記実施例５に示している。Ｂ．ヌクレオチド３'−Ｏエーテルの脱保護。ヌクレオシドトリホスフェートの３'エトキシエチルエーテルは、緩衝液を含有するコバルト中で安定であったが、５％酢酸中室温でインキュベーションするか、または０.５Ｎ HCl／ＴＨＦ中０℃でインキュベーションすることによって容易に除去できた。Ｃ．ヌクレオチド３'−ホスフェートの脱保護。３'−ホスフェートは、５０mM 酢酸ナトリウム、ｐＨ５.５、１０mMMgCl₂、および２０単位のヌクレアーゼＰ１、即ち、モノヌクレオチドの３'位からホスフェートを特異的に除去する酵素、を含有する溶液中でのヌクレオチドのインキュベーションにより特異的に除去した。反応は、３７℃で９０分間進行させた。この酵素は、ホスホジエステラーゼでもあるから、開始基質に結合させた保護ヌクレオチドの場合は適切でない。その場合、代替ホスファターゼとして、下記のものを使用できる。実施例３．保護デオキシヌクレオチジルトリホスフェートを用いる、酵素触媒化ホスホジエステル結合の有効性重合化酵素、ＴｄＴアーゼが開始ポリヌクレオチド基質と３'−Ｏ−保護デオキシヌクレオチジルトリホスフェートとの間のホスホジエステル結合の創製を触媒する能力は、トランスフェラーゼ／リガーゼアッセイを用いて測定した。このアッセイでは、ヌクレオチドが鎖状ベクターなどの開始基質ＤＮＡに転移することにより、ベクターが環状形態に戻る能力を阻害するものである。その後、各反応における環状ベクターＤＮＡの相対量を細菌の形質転換により測定できる。１００μMデオキシヌクレオチド３'エトキシエチルエーテル、または３'ホスフェートを１mMCoCl₂、０.１mM ＤＴＴ、カコジル酸カリウム、ｐＨ６.８、およびＴｄＴアーゼ（Promega）４０単位の存在下、総容量２５μlでPst １−消化Pu c８ベクターＤＮＡ（１μg）と共にインキュベーションした。３'エステルの場合、CoCl₂の代わりにMnCl₂を用い、カコジレート緩衝液の代わりにトリス−Cl を用いた以外は同一の反応を実施した。反応は３７℃で１５分間進行させ、その時点で、１００mMNa₂ＥＤＴＡ、０.１％ドデシル硫酸ナトリウムの添加により、反応を止めた。Puc８ＤＮＡを水性の充填セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂによるクロマトグラフィーにより他の反応成分から分離し、その後、リガーゼ反応に使用した。連結反応は、Puc８ＤＮＡ、１mMNa₂ＡＴＰ、５０mMトリス−Cl、ｐＨ８.０、１mMMgCl₂、１００μg／mlウシ血清アルブミン、および１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（New England Biolabs）から構成した。連結反応は、１６℃で１時間進行させた。Puc８ＤＮＡを再度、セファロース（登録商標）ＣＬ６Ｂクロマトグラフィーにより回収した。ＴｄＴアーゼによるPuc８ＤＮＡへのヌクレオチドの添加による連結反応の阻害を細菌の形質転換アッセイにより定量した。コンピテントなE.coli ＪＭ１０９細菌（Promega）を、形質転換コンピテント細胞の場合の使用説明書に従い、P uc８ＤＮＡ１００ngと共にインキュベーションした。要約すると、これは、混合物の１分間４２℃での熱ショック、ＬＢブロス中３７℃で１時間の細菌のインキュベーション、および５０μg／mlアンピシリンを含有するＬＢ寒天ペトリ皿での細菌の一晩生育を必要とした。次いで、各形質転換由来のコロニーを計数した。ＴｄＴアーゼ反応ベクター再連結トランス中のｄＮＴＰ基質形成コロニーなし（陽性対照） Pst1−Puc8 yes 1,381 なし(バック〃 no 325 グラウンド) ジデオキシ-ＡＴＰ〃 yes 342 dATP３'-Ｏトルエート〃 yes 316 dATP３'-Ｏエーテル〃 yes 330 dATP３'-ホスフェート〃 yes 340 dATP-３'ＯＨ〃 yes 636 結果は、保護ヌクレオチドがホスホジエステル結合創製のためにＴｄＴアーゼにより利用されることを表している。保護ヌクレオチドのベクターＤＮＡへの共有結合は、ベクターが再連結するのを遮断する。非保護ヌクレオチド（dATP３' −ＯＨ)の場合、酵素は、主に、一部のベクターが非修飾のまま残っているベクター分子の集団にホモポリマー尾部を加えるものであり得る。バックグラウンド値を越えるコロニー数により測定したＴｄＴアーゼ触媒化転移の有効性は、保護ヌクレオチドとジデオキシヌクレオチドとを比較したところ、同等であった。１０００コロニー以上を生産した対照と比較したバックグラウンド値以上の形質転換コロニーがないことは、開始基質３'ヒドロキシルの≧９９.９％に対する保護モノヌクレオチドのＴｄＴアーゼ触媒化転移を示す。実施例４．保護ヌクレオチドによるホスホジエステル結合形成の阻害保護モノヌクレオチドのベクターＤＮＡへの結合は、保護基を３'−ヒドロキシルにつける限りは、その後のビオチン標識化ヌクレオチドの結合を妨げるものである。このベクタービオチニル化の阻害は、アガロースゲル電気泳動後、ブロッティングアッセイにより容易に定量できる。適切な制限酵素で消化したベクターＤＮＡ（Puc８またはｐ Bluescriptのいずれか）を、最終容量２５μlで、適切な緩衝液中２５単位のＴｄＴアーゼ（Prome gaまたはＢＲＬ)の存在下、およそ１００μM保護ヌクレオチドと様々な時間で反応させた。次いで、反応混合物に３００μMビオチニル化ｄＵＴＰ（Sigmaまたは Boehringer）１μlを加え、反応を１−３分間進行させ、その時点で、１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０mMNa₂ＥＤＴＡ、１μlの添加により反応を止めた。混合物を７５℃で１分間加熱し、次いで、アガロースゲルで電気泳動して、ＤＮＡを可視化した。関連アッセイでは、ビオチニル化ヌクレオチドの添加前にベクターＤＮＡを他の反応成分から精製した。精製は、セファロースＣＬ−６Ｂでの遠心クロマトグラフィーにより実施した。この工程は、低分子量阻害因子がＴｄＴアーゼの活性を遅らせる可能性を回避するために含めた。ＤＮＡへのビオチンの組み込みは、標準色素反応操作法を用いて測定した。まず、ＤＮＡをニトロセルロース紙にブロットした。次いで、ＤＮＡが付着しているニトロセルロース紙を乾燥オーブンで３０分間８０℃まで加熱し、５０mMトリス−Cl、ｐＨ８.１、１５０mMNaCl、０.１％トリトン−Ｘ−１００（ＴＢＳＴ）、および１０％（w/v）カーネーション脱脂粉乳、即ち、最終色素反応のコントラストを増強する目的の溶液、で再度湿らせた。乳溶液中で１時間インキュベーション後、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼ（Fisher Scientific#0 B5000-ALPH）およそ１μg／mlを含有するＴＢＳＴの新鮮溶液を紙に添加した。ストレプトアビジンのビオチンへの結合は、室温で１時間続けた。次いで、紙を新たなＴＢＳＴ２５mlに１０分間移し、過剰のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを洗浄除去した。この洗浄工程を４回繰り返した。次いで、紙を１００mMトリス−Cl、ｐＨ９.５、１５０mMNaCl、５mMMgCl₂、３００μg／mlニトロテトラゾリウムブルー、および１５０μg/mlブロモクロロインドリルホスフェートの１０mlに移し、発色団ブロモクロロインドールの酵素的放出により、結合したストレプトアビジンホスファターゼの量を可視化した。様々な保護基を用いる阻害アッセイの結果は、下記にまとめる。３'保護基(％) ビオチニル化時間(分) 反応時間(分) 阻害パラートルオイル０.５−５０.５−５＞５０％ベンゾイル〃〃〃イソバレロイル〃〃〃ジメチルベンゾイル〃〃〃エトキシエチル〃〃〃ホスフェート〃〃〃実施例５．保護ｄＮＴＰを用いるＤＮＡ合成：Puc８ベクターにおける新たな制限部位の合成保護ｄＮＴＰのＴｄＴアーゼ触媒化添加によりベクターＤＮＡ上へ直接、所望のＤＮＡ配列が合成されることを立証するために、Pst１−消化Puc８ＤＮＡにおいてベクター中に新たな制限部位を導入するための連鎖反応を実施した。Pst１ Puc ８ＤＮＡの末端の配列は：５'Ｇ------------------ＣＴＧＣＡ３'（配列番号６）Puc８３'ＡＣＧＴＣ------------------Ｇ５' （配列番号６）であり、ここで、点線は、ベクターのアニール化相補鎖を示す。連鎖カップリングおよび切断反応は、下記のようにｄＮＴＰのトルオイルエステルを用いて実施した：第１カップリング反応 − １００mMカコジル酸カリウム、ｐＨ６.８、１mMC oCl₂、０.１mMＤＴＴ、０.１mg／mlＢＳＡ、１００μM ｄＴＴＰ−３'−Ｏ−トルエート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止反応 −１μl １００mMNa₂ＥＤＴＡ、１μl １０％ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃、２分。ＤＮＡ回収 − 水中０.５ml充填セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂによる遠心分離。エステル切断反応 − １００mMカコジル酸カルウム、ｐＨ６.８、１mMCoCl₂ 、０.１mMＤＴＴ、０.１mg／mlＢＳＡ、３７℃、３０分。第２カップリング反応 − １００μＭｄＧＴＰ−３'Ｏ−トルエート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返す第３カップリング反応 − １００μＭｄＣＴＰ−３'Ｏ−トルエート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返す第４カップリング反応 − １００μＭｄＡＴＰ−３'Ｏ−トルエート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返すＤＮＡの最終回収 − 水中０.５ml充填セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂによる遠心分離。同様に一連の反応を、若干修飾を加えたｄＮＴＰの３'−ホスフェートを用いて実施した。第１カップリング反応 − １００mMカコジル酸カリウム、ｐＨ６.８、１mM CoCl₂、０.１mMＤＴＴ、０.１mg／mlＢＳＡ、１００μMｄＴＴＰ−３'−ホスフェート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止反応 −１μl １００mMNa₂ＥＤＴＡ、１μl １０％ドデシル硫酸ナトリウム、６５℃、２分。ＤＮＡ回収 − 水中０.５ml充填セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂによる遠心分離。ホスフェート切断反応 − ０.１mトリスHCl、ｐＨ９.０、１mNaCl、１０mMM gCl₂、および２０単位のアルカリホスファターゼ、３７℃、３０分。第２カップリング反応 − １００μＭｄＧＴＰ−３'−ホスフェート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返す第３カップリング反応 − １００μＭｄＣＴＰ−３'−ホスフェート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返す第４カップリング反応 − １００μＭｄＡＴＰ−３'−ホスフェート、４０単位ＴｄＴアーゼ（Promega）、３７℃、２分。停止、回収および切断を繰り返すＤＮＡの最終回収 − 水中０.５ml充填セファロース（登録商標）ＣＬ−６Ｂによる遠心分離。修飾したベクターＤＮＡは、下記の新たなＤＮＡ配列を有するものとした：５'Ｇ------------ＣＴＧＣＡＴＧＣＡ３'(配列番号７)Puc８３'ＡＣＧＴＡＣＧＴＣ------------Ｇ５' （配列番号７）このベクター中の新たな配列の存在を実証するために、修飾Pst１−Puc８を前記のようにして、１６℃で１８時間再連結させた。得られた再環状化またはコンカテマー化プラスミドは、Puc８ポリリンカー中に下記の新たな構造：５'---------ＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧ-----------３'（配列番号８）３'---------ＧＡＣＧＴＡＣＧＴＣ-----------３'（配列番号８）ここで、下線部分は、Sph１制限酵素の認識配列である、を有し、これは、前にはベクター中に存在しなかった。再連結したベクターを、ＣＬ−６Ｂスパンカラムに通し、Sph１制限酵素緩衝液および１０単位のSph１（New England Biolabs）中でインキュベーションした。アガロースゲル電気泳動により、元のPuc８ＤＮＡがSph１認識配列をなんら含有せず、ＴｄＴアーゼ反応後に再回収したＤＮＡが所望の配列を含有したことを明らかにした。保護基の重要性を立証するために、合成反応において非保護ヌクレオチドトリホスフェートを用いて同一プロトコールを引き続いて行った。最終の再連結生成物は、検出可能なSph１配列をなんら含有しなかった。上記実施例および好ましい実施態様の説明は、請求の範囲に定めた本発明を限定するものとしてではなく、例示説明するものとみるべきである。容易に評価されるとおり、上記の特徴の多くの変化および組合せが、請求の範囲に記載の本発明から逸脱することなく、利用できる。このような修飾は全て、下記請求の範囲内にあるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ローズ，フロイドアメリカ合衆国92017カリフォルニア州デル・マル、ビア・デ・ラ・バジェ117番

Claims

【特許請求の範囲】１．予定した配列のポリヌクレオチドを合成する方法であって：（ａ）非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオチドを含む開始基質を提供し、さらに、（ｂ）該開始基質の３'−ヒドロキシル基を、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護している除去可能な保護部分を有し、かつ該予定した配列の順序に従い選択されるヌクレオシド５'−トリホスフェートと、触媒量の酵素の存在下、酵素的条件で反応させ、それによって、該酵素に、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基と該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒させて、該ポリヌクレオチドを生成させる、各工程を含んでなる方法。２．（Ｃ）該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する保護部分を除去して、非保護３'−ヒドロキシル基を有する開始基質を生成させる、工程を更に含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。３．工程（ｂ）および（ｃ）を少なくとも１度繰り返す工程を更に含んでなる、請求の範囲第２項記載の方法。４．工程（ｂ）および（ｃ）を予定した配列を有するポリヌクレオチドが得られるまで繰り返す工程を更に含んでなる、請求の範囲第２項記載の方法。５．該開始基質が、リボヌクレオシド、デオキシヌクレオシド、ヌクレオチド、および一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドからなる群から選択される、請求の範囲第１項記載の方法。６．該開始基質がオリゴヌクレオチド配列を含む、請求の範囲第１項記載の方法。７．該オリゴヌクレオチド配列が非ヌクレオシド分子に結合している、請求の範囲第６項記載の方法。８．該開始基質が固体支持体に固定化されている、請求の範囲第６項記載の方法。９．該固体支持体が、セルロース、セファロース、制御孔ガラス、シリカ、フラクトシル、ポリスチレン、スチレンジビニルベンゼン、アガロース、および架橋アガロースからなる群から選択される、請求の範囲第８項記載の方法。 10．該酵素が鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼである、請求の範囲第１項記載の方法。 11．該鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼが末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、請求の範囲第１０項記載の方法。 12．該除去可能な保護部分を、３'末端ヌクレオシドの３'位でヒドロキシル基を生成させるために１０分未満で除去する、請求の範囲第１項記載の方法。 13．該除去可能な保護部分を、３'末端ヌクレオシドの３'位でヒドロキシル基を生成させるために２分未満で除去する、請求の範囲第１項記載の方法。 14．該除去可能な保護部分が、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カルボネート、カルバメート、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェート、スルホンからなる群から選択され、ここで、該除去可能な保護部分は、該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'炭素に結合している、請求の範囲第１項記載の方法。 15．該除去可能な保護部分がエステル、リン含有部分、およびエーテルからなる群から選択される、請求の範囲第１４項記載の方法。 16．該エステルがトルオイルエステル、イソバレロイルエステル、ベンゾイルエステル、４−ニトロベンゾイルエステル、２,６ジメチルベンゾイルエステル、３,５ジメチルベンゾイルエステル、およびジメチルベンゾイルエステルからなる群から選択される、請求の範囲第１５項記載の方法。 17．該エーテルがビス(２−クロロエトキシ)メチルエーテル、４−メトキシテトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドラフラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、トリ(ｐ−メトキシフェニル)メチルエーテル、ジ(ｐ−メトキシ) フェニルメチルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルからなる群から選択される、請求の範囲第１５項記載の方法。 18．該リン含有部分が、ホスフェート、ホスホルアミデート、およびホスホルアミドからなる群から選択される、請求の範囲第１５項記載の方法。 19．該除去可能な保護部分を有する該ヌクレオシド５'−トリホスフェートを脱保護溶液で処理し、それによって該除去可能な部分を除去する工程を更に含んでなる、請求の範囲第１項記載の方法。 20．該脱保護溶液が二価カチオンを含む、請求の範囲第１９項記載の方法。 21．該二価カチオンがCo⁺⁺である、請求の範囲第19項記載の方法。 22．該脱保護溶液が、ジメチルアルシン酸、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン、および３−[ｍ−モルホリン]プロピアノスルホン酸からなる群から選択される緩衝液を含む、請求の範囲第１９項記載の方法。 23．該脱保護溶液が該除去可能な保護部分を除去する能力がある酵素を含む、請求の範囲第１９項記載の方法。 24．該処理が１０分未満で生じる、請求の範囲第１９項記載の方法。 25．該処理が２分未満で生じる、請求の範囲第１９項記載の方法。 26．該除去可能な保護部分が固体支持体に結合されている、請求の範囲第１項記載の方法。 27．該ポリヌクレオチドを該固体支持体から切断する工程を更に含んでなる、請求の範囲第２６項記載の方法。 28．該切断により３'−ヒドロキシル基をその３'末端で有するポリヌクレオチドを生成する、請求の範囲第２７項記載の方法。 29．該固体支持体に結合した該除去可能な保護部分が、エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カルボネート、カルバメート、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスルフェネート、スルフェート、スルホンおよびアミノ酸からなる群から選択され、ここで、該除去可能な保護部分が、該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位に結合しており、また該固体支持体にも結合している、請求の範囲第２６項記載の方法。 30．請求の範囲第１項ないし２９項に記載の方法を用いて生成した、予定した配列を有するポリヌクレオチド。 31．請求の範囲第１項ないし２９項に記載の方法を用いて生成した５つ以上のヌクレオチドからなる、予定した配列を有するポリヌクレオチド。 32．（ａ）触媒量の鋳型非依存性酵素；および、（ｂ）ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する除去可能な保護部分を有する該ヌクレオシド５'−トリホスフェート、からなる組成物。 33．非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを含んでなる開始基質を更に含む、請求の範囲第３２項記載の組成物。 34．該触媒量の酵素が、１０分以内で、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基の９９パーセントと該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒するものである、請求の範囲第３３項記載の組成物。 35．該触媒量の酵素が、２分以内で、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基の９９パーセントと該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒するものである、請求の範囲第３３項記載の組成物。 36．該開始基質の濃度が、１nmolと１００mmolの間である、請求の範囲第３３項記載の組成物。 37．該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの濃度が、１０μmolから１mmolである、請求の範囲第３２項記載の組成物。 38．該ヌクレオシド５'−トリホスフェートが、該酵素のKmの１０倍の濃度で存在する、請求の範囲第３２項記載の組成物。 39．（ａ）触媒量の鋳型非依存性酵素；および、（ｂ）ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'位を保護する除去可能な保護部分を有する該ヌクレオシド５'−トリホスフェート、からなる、組成物。 40．非保護３'−ヒドロキシル基を有するヌクレオシドを含んでなる開始基質を更に含む、請求の範囲第３９項記載の組成物。 41．該触媒量の酵素が、１０分以内で、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基の９９パーセントと該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒するものである、請求の範囲第４０項記載の組成物。 42．該触媒量の酵素が、２分以内で、該開始基質の該非保護３'−ヒドロキシル基の９９パーセントと該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの５'−ホスフェートとの間の５'ないし３'ホスホジエステル結合の形成を触媒するものである、請求の範囲第４０項記載の組成物。 43．該開始基質の濃度が、１nmolと１００mmolの間である、請求の範囲第４０項記載の組成物。 44．該ヌクレオシド５'−トリホスフェートの濃度が、１０μmolから１mmolである、請求の範囲第３９項記載の組成物。 45．該ヌクレオシド５'−トリホスフェートが、該酵素のKmの１０倍の濃度で存在する、請求の範囲第３９項記載の組成物。 46．ヒドロカルビルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有し、該除去可能な保護部分が、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'炭素に結合している、ヌクレオシド５'−ホスフェート。 47．エステル、エーテル、カルボニトリル、ホスフェート、カルボネート、カルバメート、ボレート、ニトレート、糖、ホスホルアミデート、フェニルスフェネート、スルフェート、スルホンからなる群から選択される３'位を保護する除去可能な保護部分を有し、該除去可能な保護部分が、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'炭素に結合している、ヌクレオシド５'−ホスフェート。 48．エステル、エーテルおよびホスフェートからなる群から選択される３'位を保護する除去可能な保護部分を有し、該除去可能な保護部分が、ヌクレオシド５'−トリホスフェートの３'炭素に結合している、ヌクレオシド５'−ホスフェート。 49．該ヌクレオシドは、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）からなる群から選択される塩基を含有する、請求の範囲第４６項ないし４８項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 50．該ヌクレオシド５'−ホスフェートがヌクレオシド５'−トリホスフェートである、請求の範囲第４６項ないし４９項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 51．該除去可能な保護部分が酵素的に除去可能なものである、請求の範囲第４６項ないし５０項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 52．該除去可能な保護部分が１０分未満で除去される、請求の範囲第５１項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 53．該除去可能な保護部分が固体支持体に結合している、請求の範囲第４６項ないし５２項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 54．エーテルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１は置換または非置換の、脂肪族基、芳香族基、またはシリル基からなる群から選択されるエーテルである、を有するヌクレオシド５'ホスフェート。 55．エーテルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はメチルエーテル、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｔ−ブトキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、２,２,２−トリクロロエトキシメチルエーテル、ビス(２−クロロエトキシ)メチルエーテル、２−(トリメチルシリル)エトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、３−ブロモテトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロチオピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、４−メトキシテトラヒドロチオピラニルエーテル、Ｓ,Ｓ−ジオキシドエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、テトラヒドロチオフラニルエーテル、Ｉ−エトキシエチルエーテル、Ｉ−メチル−１−メトキシエチルエーテル、Ｉ−(イソプロポキシ)エチルエーテル、２,２,２−トリクロロエチルエーテル、２−(フェニルセレニル) エチルエーテル、ブチルエーテル、アリルエーテル、シンナミルエーテル、ｐ− クロロフェニルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、３−メチル−２−ピコリルエーテル、Ｎ−オキシドエーテル、ジフェニルメチルエーテル、５−ジベンゾスベリルエーテル、トリフェニルメチルエーテル、α−ナフチルジフェニルメチルエーテル、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチルエーテル、ｐ−(ｐ'−ブロモフェンアシルオキシ)フェニルジフェニルメチルエーテル、９−アントリルエーテル、９−( ９−フェニル−１０−オキソ)アントリルエーテル、ベンズイソチアゾリルエーテル、Ｓ,Ｓ−ジオキシドエーテル、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、イソプロピルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、(トリフェニルメチル)ジメチルシリルエーテル、メチルジイソプロピルシリルエーテル、メチルジ−ｔ−ブチルシリルエーテル、トリベンジルシリルエーテル、トリ−ｐ−キシリルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、およびトリフェニルシリルエーテルからなる群から選択されるエーテルである、を有するヌクレオシド５'ホスフェート。 56．エーテルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はビス(２−クロロエトキシ)メチルエーテル、４−メトキシテトラヒドロピラニルエーテル、テトラヒドロフラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、トリ(ｐ−メトキシフェニル)メチルエーテル、ジ(ｐ−メトキシ)フェニルメチルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテルからなる群から選択される、を有するヌクレオシド５'ホスフェート。 57．エーテルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はＣＨ₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)_N、ただしＮは１から１０の整数である、メチル、メトキシメチル、メトキシエトキシメチル、トリメチルシリル、およびトリエチルシリルである、を有するヌクレオシド５'ホスフェート。 58．Ｒ１がＣＨ(ＯＣ₂Ｈ₅)ＣＨ₃であり、Ｒ２がトリホスフェートであって、かつデオキシヌクレオシドである、請求の範囲第５４項ないし５７項記載のヌクレオシド５'ホスフェート。 59．３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はエトキシエチルエーテルである、を有するヌクレオシド５'ホスフェート。 60．ヌクレオシド５'−トリホスフェートにエーテルを直接結合させることにより生成されるエーテルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェート。 61．該ヌクレオシドがデオキシヌクレオシドである、請求の範囲第６０項記載のヌクレオシド５'−トリホスフェート。 62．３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はホスフェート、ホスホルアミデート、およびホスホルアミドからなる群から選択される、を有するヌクレオシド５'−ホスフェート。 63．Ｒ２がトリホスフェートであり、Ｒ１がホスフェートである、請求の範囲第６２項記載のヌクレオシド５'ホスフェート。 64．該除去可能な保護部分が酵素により除去可能である、請求の範囲第６２項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 65．該除去可能な保護部分が２ないし１０分以内で生ずる反応により除去可能である、請求の範囲第６２項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 66．該除去可能な保護部分が固体支持体に結合している、請求の範囲第６２項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 67．３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１は脂肪族または芳香族有機エステルである、を有するヌクレオシド５'−ホスフェート。 68．エステルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートであって、下式：式中、Ｒはホルメート、ベンゾイルホルメート、クロロアセテート、ジクロロアセテート、トリクロロアセテート、トリフルオロアセテート、メトキシアセテート、トリフェニルメトキシアセテート、フェノキシアセテート、ｐ−クロロフェノキシアセテート、２,６−ジクロロ−４−メチルフェノキシアセテート、２,６ −ジクロロ−４−(１,１,３,３−テトラメチルブチル)フェノキシアセテート、２,４−ビス(１,１−ジメチルプロピル)フェノキシアセテート、クロロジフェニルアセテート、ｐ−Ｐ−フェニルアセテート、３−フェニルプロピオネート、３ −ベンゾイルプロピオネート、イソブチレート、モノスクシノエート、４−オキソペンタノエート、ピバロエート、アダマニオエート、ｏ−(ソロトネート、４ −メトキシクロトネート、（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノエート、ｏ−(ジブロモメチル)ベンゾエート、ｏ−(メトキシカルボニル)ベンゾエート、ｐ−フェニルベンゾエート、２,４,６−トリメチルベンゾエート、およびα−ナフトエートからなる群から選択される、を有するヌクレオシド５'−ホスフェート。 69．エステルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェートであって、下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒは、Ｈ、ＣＨ₃、ＣＨ₃(ＣＨ₂)_N、ただしＮは１から１２の整数である、( ＣＨ₃)_x+1(ＣＨ)_x、ただしｘは１から１２の整数である、(ＣＨ₃)_x+1(ＣＨ)_x(ＣＨ₂)_n、ただしｘおよびｎは独立して１から１２の整数である、Ｃ_x(ＣＨ₃)_3x-(x _-1) (ＣＨ₂)_n、ただしｘおよびｎは独立して１から１２の整数である、およびただし、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６はＣＨ₃、ＨまたはＮＯ₂である、である、からなる群から選択される、を有するヌクレオシド５'−ホスフェート。 70．Ｒ２がトリホスフェートであって、デオキシヌクレオシドである、請求の範囲第６７項ないし６９項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 71．下式：式中、Ｒ２はトリホスフェート、ジホスフェート、またはモノホスフェートであり、Ｒ１はトルイル酸エステルである、を有する、３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−ホスフェート。 72．ヌクレオシド５'−トリホスフェートを直接エステル化することにより生成される、エステルである３'位を保護する除去可能な保護部分を有するヌクレオシド５'−トリホスフェート。 73．該エステルがベンゾエートまたはアセテートである、請求の範囲第７２項記載のヌクレオシド５'−トリホスフェート。 74．該ヌクレオシドがデオキシヌクレオシドである、請求の範囲第７２項または８項記載のヌクレオシド５'−トリホスフェート。 75．該除去可能な保護部分が酵素により除去可能である、請求の範囲第６７項ないし７４項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 76．該除去可能な保護部分が２ないし１０分以内で生ずる反応により除去可能である、請求の範囲第６７項ないし７４項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。 77．該除去可能な保護部分が固体支持体に結合している、請求の範囲第６７項ないし７４項記載のヌクレオシド５'−ホスフェート。