WO2021020562A1 - プライマー及びこれを用いた二本鎖ｄｎａの製造装置並びに二本鎖ｄｎａの製造方法 - Google Patents

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WO2021020562A1
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dna
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formula
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阿部　洋
奈保子 阿部
航介 中本
裕貴 村瀬
康明 木村
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国立研究開発法人科学技術振興機構
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a primer, a device for producing double-stranded DNA using the primer, and a method for producing double-stranded DNA.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a template DNA containing a target DNA sequence is used, and the template DNA is amplified by repeating heat denaturation and annealing for a plurality of cycles using a primer that binds complementarily to the template DNA.
  • the amplification product of the template DNA amplified by PCR has a blunt end as it is, and it is necessary to perform a process for binding (ligating) this with a host DNA such as a plasmid DNA.
  • a restriction enzyme that cleaves a specific sequence is used as such a treatment, but this method has a problem that it is not versatile because the DNA that can be bound depends on the sequence of the restriction enzyme cleavage site.
  • the 3'end and 5'end of the amplification product are used as adhesive ends (also called adhesive ends, protruding ends, etc.), and the host side also forms adhesive ends and ligates both to vector.
  • adhesive ends also called adhesive ends, protruding ends, etc.
  • the host side also forms adhesive ends and ligates both to vector.
  • the Gibson assembly method, the In-Fusion method, the SLiCE method and the like are known.
  • a homologous sequence of about 15 bp is provided at the end of a double-stranded DNA fragment, one strand in the double strand is digested with exonuclease activity to generate an adhesive terminal, and then the strand is ligated.
  • Taq DNA ligase is used for ligation in vitro
  • the In-Fusion method the repair system in Escherichia coli is used for ligation.
  • a method for preparing DNA having an adhesive end by a chemical method has been developed, and as a primer for PCR for that purpose, the one described in Patent Document 1 is known.
  • the base corresponding to the 3'end in the base sequence of the non-complementary DNA portion is modified with a protecting group.
  • This protecting group has a function of stopping the progress of DNA replication by DNA polymerase, and can be eliminated from the modified base by light irradiation treatment, alkali treatment, or the like.
  • a protecting group is introduced into the base of a primer by using a substituent introducing agent for introducing a protecting group (substituent) into a biomolecule.
  • Patent Document 1 the progress of DNA replication is stopped at the protecting group portion, but since the polymerase activity is inhibited by the protecting group at the base portion, the stopping efficiency is low, and as a result, a completely elongated product is produced. There was something. Further, for example, in DNA, there are four types of bases, adenine, guanine, cytosine, and thymine, but in Patent Document 1, a protecting group is introduced into the base, so it is necessary to introduce the protecting group by a method according to the type of base. Therefore, it took time and cost to manufacture the primer.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems. As a result, we developed a primer in which a degradable protecting group was introduced into the sugar portion of the nucleoside. Then, they found that double-stranded DNA having an adhesive end could be produced by decomposing the protecting group, and completed the present invention.
  • the present invention is a primer used for amplification of nucleic acid, which is characterized by having a structure represented by the following formula (1).
  • B indicates a base
  • R 1 indicates a degradable protecting group
  • R 2 indicates a hydrogen or hydroxyl group. * Means a bond of an adjacent nucleotide to a sugar.
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the following formula (2A).
  • a 1 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms and may have a branched chain having 1 to 20 carbon atoms. * Means a bond of phosphoric acid with oxygen (O). .
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the following formula (4A). (Here, R 3 represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.)
  • R 3 is a tert-butyl group or an adamantyl group. In particular, it is preferable that R 3 is a tert-butyl group.
  • R 1 is a 2-nitrobenzyl group represented by the following formula (3A).
  • R 1 is a reducing agent degradable protecting group represented by the following formula (2B).
  • a 2 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms and may have a branched chain having 1 to 20 carbon atoms. * Means a bond of phosphoric acid with oxygen (O). .
  • R 1 is a 4-nitrobenzyl group represented by the following formula (3B).
  • the present invention is an apparatus for producing double-stranded DNA for producing double-stranded DNA having an adhesive end using the primer described in any of the above, and is an antisense strand of template DNA serving as a template.
  • a forward primer having a structure represented by the above formula (1) and a part of the sequence of the sense strand of the template DNA, which is complementary to a part of the sequence of the above formula (1).
  • a reverse primer having the structure shown in (1), a forward-side extension strand in which the forward primer is extended by performing a polymerase chain reaction (PCR) for a plurality of cycles using the template DNA as a template, and a reverse-side extension strand in which the reverse primer is extended.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the deprotection means for deprotecting the R 1 is a double-stranded DNA manufacturing apparatus characterized by being provided.
  • the present invention is a method for producing double-stranded DNA for producing double-stranded DNA having an adhesive end using the primer described in any of the above, and the antisense strand of the template DNA as a template.
  • a forward primer having a structure represented by the above formula (1) and a part of the sequence of the sense strand of the template DNA, which is complementary to a part of the sequence of the above formula (1).
  • PCR polymerase chain reaction
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the formula (2A), and the deprotection step deprotects R 1 by light irradiation.
  • R 1 is a reducing agent degradable protecting group represented by the formula (2B), and the deprotection step deprotects R 1 with a reducing agent.
  • the primer has two or more consecutive structures represented by the formula (1) in the sequence.
  • the present invention it is possible to provide a primer that has high deprotection efficiency and can be manufactured at low cost. Further, according to the present invention, it is possible to provide an apparatus for producing double-stranded DNA having an adhesive end and a method for producing double-stranded DNA using such a primer.
  • Chain Extension Stop It is a figure which shows the stop of a chain extension reaction using an oligonucleotide containing a caged analog T * as a template. It is a figure which shows the agarose gel electrophoresis analysis of the PCR reaction. It is a schematic diagram of the ligation reaction of a PCR fragment. It is a figure which shows the experiment of making the adhesive end using the oligonucleotide containing T **.
  • Chain extension stop It is a figure which shows the stop of the chain extension reaction using the oligonucleotide containing caged analog (sequence TT, tBu type) as a template. It is a figure which shows the termination of a chain extension reaction using an oligonucleotide containing a caged analog (sequence TT, adamantane type) as a template.
  • Chain extension stop It is a figure which shows the stop of a chain extension reaction using an oligonucleotide containing a caged analog (sequences AA and TA, tBu type) as a template.
  • Chain extension stop It is a figure which shows the stop of a chain extension reaction using an oligonucleotide containing a caged analog (sequence CC and GC, tBu type) as a template.
  • the primer of the present invention is a primer used for amplification of nucleic acid and has a structure represented by the following formula (1).
  • B indicates a base
  • R 1 indicates a degradable protecting group
  • R 2 indicates a hydrogen or a hydroxyl group.
  • * Means a binding agent of an adjacent nucleotide to a sugar.
  • the bond on the 3'side of the formula (1) binds to the 5'carbon of the sugar of the adjacent nucleotide on the 3'side, and the bond on the 5'side is on the 5'side. It binds to the 3'carbon of the sugar of the adjacent nucleotide.
  • R 2 is a hydrogen
  • R 1 is a hydroxyl group.
  • B is a base, and specifically, in the case of a DNA primer, it is selected from adenine, guanine, cytosine, and thymine, and in the case of an RNA primer, it is selected from adenine, guanine, cytosine, and uracil.
  • the degradable protecting group of R 1 means a protecting group (substituent) that is decomposed by some treatment.
  • the treatment referred to here include light irradiation treatment, reduction treatment, alkali treatment, acid treatment, oxidation treatment, desilylation treatment, heat treatment, esterase treatment, phosphatase treatment and the like. Since the polymerase more strongly recognizes the negative charge of the phosphate group of nucleic acid, the phosphate group is masked with the protecting group as shown in the formula (1) rather than introducing the protecting group into the base as in Patent Document 1. It is presumed that the efficiency of polymerase termination can be further increased.
  • R 1 is a photodegradable protecting group represented by the following formula (2A).
  • a 1 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms, and may have a branched chain having 1 to 3 carbon atoms or a branched chain having 1 to 20 carbon atoms. * Indicates oxygen of phosphoric acid. It means a bond with (O).)
  • alkylene group having 1 to 20 carbon atoms examples include a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a tert-butyl group, a sec-butyl group, a cyclohexyl group, and an adamantyl group.
  • R 1 is preferably a photodegradable protecting group represented by the following formula (4A).
  • R 3 represents an alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • R 3 is preferably bulky, such as a tert-butyl group or an adamantyl group.
  • R 3 has 3 or more carbon atoms, preferably 4 or more, more preferably 7 or more, and particularly preferably 10 or more.
  • R 1 examples include a 2-nitrobenzyl group represented by the following formula (3A).
  • R 1 is a reducing agent degradable protecting group represented by the following formula (2B).
  • a 2 represents an alkylene group having 1 to 3 carbon atoms and may have a branched chain having 1 to 20 carbon atoms. * Means a bond of phosphoric acid with oxygen (O). .
  • Examples of the alkylene group having 1 to 20 carbon atoms include a methylene group, an ethylene group, a propylene group, a tert-butyl group, a sec-butyl group, a cyclohexyl group, and an adamantyl group.
  • R 1 examples include a 4-nitrobenzyl group represented by the following formula (3B).
  • degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by acid treatment include a trityl group.
  • degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by the oxidation treatment include an allyloxymethyl group, a dimethoxybenzyloxymethyl group, and a trimethoxybenzyloxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be desorbed from the modified base by the desilylation treatment include t-butyldimethoxysilyloxymethyl group and t-butyldiphenylsilyloxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be desorbed from the modified base by heat treatment include an isocyanate group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by esterase treatment include an acetoxymethyl group.
  • Examples of the degradable protecting group that can be eliminated from the modified base by phosphatase treatment include a methyl phosphate group.
  • the primer of the present invention is a single-stranded DNA or single-stranded RNA particularly preferably used in PCR, and is an oligonucleotide or polynucleotide having a structure represented by the above formula (1) in the molecule.
  • the number of base pairs of the primer can be appropriately set according to the sequence of the target DNA or the like, but is generally 20 base pairs or less for oligonucleotides and more than 20 base pairs for polynucleotides.
  • the upper limit of the number of base pairs of the polynucleotide is not particularly limited, but as a commonly used primer, for example, 40 base pairs or less is preferable.
  • the lower limit of the number of base pairs of the oligonucleotide is not particularly limited as long as it can be used as a primer, but for a commonly used primer, for example, 5 base pairs or more is preferable.
  • two or more of the structures represented by the above formula (1) are continuous rather than only one in the sequence.
  • the structure of the formula (1) is only one in the sequence, the formation of the adhesive end cannot be performed unless the replication of DNA by DNA polymerase is stopped at the structural part.
  • two or more structures of the formula (1) are continuous, DNA replication is stochastically more likely to be stopped, and the efficiency of adhesion end formation is increased.
  • the primer of the present invention synthesizes a modified nucleotide having the structure of the above formula (1) (hereinafter, may be referred to as a “nucleotide derivative”), and an unmodified nucleotide is added thereto by a phosphoramidite method or the like. It can be produced by linking by a solid phase synthesis method.
  • the primer synthesis method As an outline of the primer synthesis method, first, the 5'hydroxyl group of the nucleoside is protected, and N, N-bis (diisopropylamino) chlorophosphine is reacted with the 3'hydroxyl group. Next, nitrobenzyl alcohol is reacted to introduce a degradable protecting group. Then, phosphoramidite or the like is reacted, and unmodified nucleotides are ligated by a solid-phase synthesis method to synthesize a primer.
  • a specific method for producing the primers described in the examples will be described in detail.
  • deoxyribonucleoside thymidine in the following skim
  • DMTrCl 4,4'-dimethoxytrityl chloride
  • pyridine 4,4'-dimethoxytrityl chloride group is bonded to the 5'hydroxyl group of ribose
  • N, N-bis (diisopropylamino) chlorophosphine is added to triethylamine (TEA) and tetrahydrofuran (THF) to attach phosphoramidite to the 3'hydroxyl group of deoxyribose (Compound 25).
  • TAA triethylamine
  • THF tetrahydrofuran
  • 4-nitrobenzyl alcohol is added to the reaction mixture, and then 5- (methylthio) -1H-tetrazole is added to give compound 26.
  • a primer is synthesized by solid-phase synthesis of nucleotides so as to have a desired sequence by a conventional method.
  • the device for producing double-stranded DNA of the present invention is a device for having an adhesive end using the primer of the present invention.
  • the method for producing double-stranded DNA of the present invention is a method of using a template DNA containing a target DNA sequence and having an adhesive end using the primer of the present invention.
  • FIG. 1 description will be made with reference to FIG. In this embodiment, a primer having two consecutive structures of the formula (1) is used, but the same method / apparatus is used even when there is only one of the formula (1). can do.
  • the forward primer is complementary to a part of the sequence of the antisense strand of the template DNA and has a structure represented by the formula (1).
  • the reverse primer is complementary to a part of the sequence of the sense strand of the template DNA and has a structure represented by the formula (1).
  • the forward primer and the reverse primer are sequenced so as to sandwich the target DNA sequence to be amplified.
  • the position of the nucleotide having the degradable protecting group of the formula (1) in the primer is 3 of the nucleotide on the most 3'terminal side on the 3'depressed side in the target adhesion terminal sequence ((c) in the figure). 'Design so that the position is complementary to the position adjacent to the side.
  • the nucleotide located on the 3'side of the nucleotides of the structure of the formula (1) is set to the above position.
  • Other reagents include polymerases (such as Taq polymerase), buffers, and dNTPs used for PCR.
  • the sequence of the template DNA is amplified using a PCR device (amplification means) (amplification step).
  • the PCR device performs a polymerase chain reaction (PCR) for a plurality of cycles using the template DNA as a template to generate a forward-side extension strand in which the forward primer is extended and a reverse-side extension strand in which the reverse primer is extended.
  • PCR polymerase chain reaction
  • a double-stranded DNA ((b) in the figure) in which the 3'end is depressed is generated by annealing the extension strand on the reverse side.
  • PCR the sequence of template DNA is amplified by repeating heat denaturation, annealing, and elongation reaction. Although it depends on the PCR conditions, heat denaturation is performed at about 95 ° C. for 1 to 3 minutes, annealing is performed at Tm ⁇ 5 ° C. of the primer, and extension reaction is performed at 1 to 10 minutes.
  • the number of PCR cycles is not particularly limited, but is generally about 24 to 40 cycles.
  • the PCR amplification product contains double-stranded DNA with a depressed 3'end. This is because the degradable protecting group of the formula (1) inhibits the polymerase reaction and stops the reaction when the complementary strand is synthesized using the primer as a template.
  • the predetermined treatment is a treatment for deprotecting R 1, and examples thereof include the above-mentioned light irradiation treatment and reduction treatment.
  • Examples of the light irradiation treatment include a method of irradiating light having a wavelength of 300 to 400 nm for 1 to 30 minutes with a light source device (deprotecting means).
  • a method of treating with a reducing agent such as sodium dithionite (Na 2 S 2 O 4 ) at 70 to 80 ° C. for 1 to 30 minutes can be mentioned.
  • the degrading protecting group of the nucleoside of the primer formula (1) is deprotected, and double-stranded DNA having a 5'protruding end (3' depressed end) can be synthesized.
  • deprotection is performed using a device (deprotection device) that deprotects the degradable protecting group.
  • the adhesive end can be freely designed without using restriction enzymes or the like, DNA having a desired sequence can be freely linked.
  • the sequences of both the target DNA and the vector are designed, a common adhesive terminal is formed between them by deprotection treatment, and ligation is performed to prepare a recombinant DNA, which is cloned, a library is prepared, and a large amount is expressed. It can be used for system construction.
  • a genome build-up reaction can be performed in vitro by linking a plurality of genome sequences having adhesive ends.
  • the genome build-up reaction can be carried out in the cell by introducing the double-stranded DNA into the cell in the blunt-ended state and performing the deprotection treatment in the cell.
  • the present invention will be specifically described based on examples, but these do not limit the object of the present invention. Further, in the following examples, the “%” display is based on mass (mass percent) unless otherwise specified.
  • Chain extension stop caged analog T * (1) Synthesis of oligonucleotides containing a chain extension arrest caged analog T * The oligonucleotides containing a chain extension arrest caged analog T * (Table 1) are nucleic acid automatic synthesizers (NR-2A 7MX, Japan) based on the phosphoramidite method. Synthesized by Techno Service Co., Ltd.). The chain extension arrest caged analog T * amidite compound (Chemical Formula 13) was synthesized according to the previously reported reports (Wu, L. et al., Chem. Eur. J. 2014, 20, 12114-12122).
  • a commercially available amidite reagent 5'-Phosphate-ON Reagent (manufactured by ChemGenes) was used for phosphorylation of the 5'end.
  • the oligonucleotide after synthesis was deprotected according to a conventional method and then purified by reverse phase HPLC [System, LaChrom Elite manufactured by Hitachi High-Tech Science Co., Ltd .; Column, Hydrosphere C18 manufactured by YMC (250 ⁇ 10 mm ID); Eluent A.
  • the table below shows the oligonucleotide sequence containing the synthesized chain extension arrest caged analog T *. p indicates that the hydroxyl group at the 5'end is phosphorylated.
  • FIG. 2 is a diagram showing chromatograms after deprotection (a) and after purification (b) during the synthesis of oligonucleotide pAcGFP_Fw2.
  • the peak around 14.1 minutes shown in the chromatogram (a) before purification is the peak derived from the target product. This was separated and purified (b).
  • the reaction was heated in an Applied Biosystems 2720 thermal cycler at 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 30 seconds, and then at 72 ° C. for 10, 30 or 60 minutes.
  • 10 ⁇ L of 2 ⁇ formamide loading solution was added to 10 ⁇ L of the heated reaction solution, heated at 90 ° C. for 3 minutes, and then analyzed by 20% modified PAGE containing 7.5 M urea (FIG. 3).
  • the oligonucleotide chain contained in the gel after electrophoresis was detected by the ChemiDoc XRS + imaging system based on the fluorescence derived from the fluorescein group modified at the 5'end of the primer chain.
  • FIG. 3 is a diagram showing the termination of the chain extension reaction using an oligonucleotide containing a caged analog T * as a template.
  • A is the sequence of the oligonucleotide used.
  • B) to (e) show the results of denaturation PAGE analysis of the chain extension reaction using a commercially available thermostable polymerase, and
  • f) show the results of MALDI-TOF molecular weight analysis of the reaction using Pfu DNA polymerase as a template. ..
  • the lower panel shows the analysis result (control experiment) of the raw material (Primer).
  • the molecular weight analysis of the chain extension product shown in FIG. 3 (f) was performed as follows. An enzymatic reaction using 2T containing Pfu DNA polymerase as a template was prepared under the above conditions, and heated at 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 30 seconds, and then at 72 ° C. for 40 minutes. The reaction solution (50 ⁇ L) was extracted with an equal amount mixture of TE saturated phenol and chloroform, alcohol precipitated in the presence of ammonium acetate salt, and DNA was recovered. MALDI-TOF molecular weight analysis was performed using a mass spectrometer ultrafleXtreme (Bruker Daltonics).
  • FIG. 5 is a schematic diagram of the ligation reaction of PCR fragments.
  • the PCR fragments were ligated by the method shown in this figure.
  • the vector side fragment (5.3 kb) was prepared as follows (FIG. 4 (a)).
  • Reaction solution [0.5 ⁇ M pET21d_Fw2, 0.5 ⁇ M pET21d_Rev2, 0.8 ng / ⁇ L pET21d (Novagen), 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 10 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 mM 4 , 0.1% Triton® X-100, 0.1 mg / mL BSA, 0.2 mM dNTPs, 0.02 U / ⁇ L Pfu DNA polymerase] under the following heating conditions in Applied Biosystems MiniAmp Plus thermal cycler. [(95 ° C, 15 seconds ⁇ 50 ° C, 30 seconds ⁇ 72 ° C, 7.5 minutes) / cycle ⁇ 30 cycles].
  • the insert-side fragment (0.75 kb) was prepared as follows (FIG. 4 (b)).
  • Reaction solution [0.5 ⁇ M pAcGFP1_Fw2, 0.5 ⁇ M pAcGFP1_Rev2, 0.8 ng / ⁇ L pAcGFP1 (Takara), 20 mM Tris-HCl (pH 8.8 at 25 ° C), 10 mM KCl, 10 mM (NH 4 ) 2 SO 4 4 , 0.1% Triton® X-100, 0.1 mg / mL BSA, 0.2 mM dNTPs, 0.02 U / ⁇ L Pfu DNA polymerase] under the following heating conditions in Applied Biosystems MiniAmp Plus thermal cycler. [(95 ° C, 15 seconds ⁇ 55 ° C, 15 seconds ⁇ 72 ° C, 1 minute) / cycle ⁇ 30 cycles].
  • reaction solution 50 ⁇ L after the PCR reaction, add an equal volume mixture of TE saturated phenol (Nacalai Tesque) and chloroform (100 ⁇ L), mix vigorously, and centrifuge (14,000 ⁇ g, 3 minutes) to form an aqueous layer. Was separated. Similarly, the reaction solution was extracted with chloroform (100 ⁇ L), and then 5 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2) and 60 ⁇ L of isopropyl alcohol were added to the aqueous layer. After cooling at ⁇ 30 ° C. for 1 hour, the DNA was collected as pellets by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes).
  • the two reaction products were each reacted with the restriction enzyme DpnI (Toyobo) at 37 ° C. for 1 hour (0.8 U / ⁇ L DpnI in 33 mM Tris-acetylate (pH 7.9)). , 10 mM Mg (OAc) 2 , 66 mM KOAc, 0.5 mM DNA plasmid, reaction solution volume 20 ⁇ L). 80 ⁇ L of water was added to the reaction solution, an equal volume mixture of TE saturated phenol and chloroform (100 ⁇ L) was added, and the mixture was vigorously mixed and then centrifuged (14,000 ⁇ g, 3 minutes) to separate the aqueous layer.
  • DpnI Toyobo
  • the reaction solution was extracted with chloroform (100 ⁇ L), and then 10 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2) and 110 ⁇ L of isopropyl alcohol were added. After cooling at ⁇ 30 ° C. for 1 hour, the DNA was collected as pellets by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes). DNA pellets are dissolved in water and analyzed by agarose gel electrophoresis (0.8% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries) including GelRed (Wako Pure Chemical Industries)), and DNA size markers (Quick-Load Purple 1 kb Plus DNA) are analyzed. The concentration of the target DNA contained was calculated by comparing with the band intensity of Ladder, New England Biolabs [vector DNA fragment (5 ⁇ L), 13 ng / ⁇ L; insert DNA fragment (50 ⁇ L), 23 ng / ⁇ L].
  • PCR reaction solution was analyzed by agarose gel electrophoresis and found to contain 18 of the target ligation reaction products out of 20 clones (PCR primer, 5'TAATACGACTCA CTATAGGG 3', 5'GCTAGTATTTGCTCAGGCGG 3'; colony positive rate 90. %).
  • PCR primer 5'TAATACGACTCA CTATAGGG 3', 5'GCTAGTATTTGCTCAGGCGG 3'; colony positive rate 90. %).
  • PCR primer 5'TAATACGACTCA CTATAGGG 3', 5'GCTAGTATTTGCTCAGGCGG 3'; colony positive rate 90. %).
  • cells containing the ligation reaction product were liquid-cultured and plasmid DNA was extracted.
  • the sequence of the plasmid DNA obtained by the DNA sequencer ABI PRISM 3500xL Genetic Analyzer was analyzed using two types of primer sequences (5'GGTGATCGTGGCGATATAGG 3', 5'GCCAATCCGGATATAGTTCCCT 3'). As a result of analyzing the nucleotide sequences of 4 primer DNA-derived sites, 2 of these overlapping sites, and the range sandwiched between them, all 10 clones contained the sequence as designed, and mutations were observed. Was not done.
  • FIG. 4 is a diagram showing an agarose gel electrophoresis analysis of the PCR reaction. Line1, size marker; lane2, reaction solution is shown.
  • A Preparation of vector side fragment.
  • B Preparation of insert-side fragment.
  • the template used for the preparation of the 0.74 kb fragment is pAcGFP1 plasmid DNA, and the primer sequences are the following two.
  • the underlined portion T ( T ) indicates that the phosphoric acid portion contains a Me or tBu type modifying group.
  • p indicates that the 5'end is phosphorylated.
  • thermostable polymerase Using the commercially available thermostable polymerase described in the figure, PCR reaction was carried out according to the recommended conditions to prepare 1.0 kb fragment and 0.74 kb fragment, respectively. The progress of the reaction was confirmed by agarose gel electrophoresis (1.5% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) including GelRed (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). After the PCR reaction, 200 ⁇ L of an equal volume mixture of TE saturated phenol (Nacalai Tesque) and chloroform was added to 200 ⁇ L of the reaction solution, mixed vigorously, and then centrifuged (20,000 ⁇ g, 1 minute) to separate the aqueous layer.
  • TE saturated phenol Nacalai Tesque
  • reaction solution was extracted with 200 ⁇ L of chloroform, and then 20 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2) and 220 ⁇ L of isopropyl alcohol were added. After cooling at ⁇ 30 ° C. for 1 hour, DNA was recovered by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes).
  • the target DNA product was purified by agarose gel electrophoresis (1.5% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) including GelRed (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). DNA was extracted from the cut gel pieces using Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega).
  • the 1.0 kb fragment and 0.74 kb fragment prepared in this manner were ligated using Taq DNA ligase, and the efficiency was evaluated by agarose gel electrophoresis.
  • 365 nm light was applied to a DNA solution (5 ⁇ L; 24 nM 1.0 kb fragment, 24 nM 0.74 kb fragment, 1 mM Tris-HCl (pH 8.5)) at 4 mW / cm. Irradiation was performed at an intensity of 2 for 5 minutes.
  • Taq DNA ligase New England Biolabs
  • the composition of the reaction solution is as follows. 2.8 nM 1.0 kb fragment, 2.8 nM 0.74 kb fragment, 1.6 U / ⁇ L Taq DNA ligase, 20 mM Tris-HCl, 25 mM potassium acetate, 10 mM magnesium acetate, 1 mM NAD 1, 10 mM DTT, 0.1% Triton X-100, pH 7.6. Add 80 ⁇ L of water to the reaction solution to make the total volume about 100 ⁇ L, add 100 ⁇ L of an equal volume mixture of TE saturated phenol (Nacalai Tesque) and chloroform, mix vigorously, centrifuge (20,000 ⁇ g, 1 minute), and aqueous layer. Was separated.
  • reaction solution was extracted with 100 ⁇ L of chloroform, and then 10 ⁇ L of 3M NaOAc (pH 5.2), 110 ⁇ L of isopropyl alcohol, and 1 ⁇ L of 20 mg / mL glycogen were added. After cooling at ⁇ 30 ° C. for 15 minutes, DNA was recovered by centrifugation (20,000 ⁇ g, 20 minutes). The recovered DNA product was electrophoresed by agarose gel electrophoresis (1.5% Agarose S (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)). The gel after electrophoresis was stained with an aqueous GelRed solution to visualize the bands (BioRad ChemiDoc XRS + system).
  • the reaction was heated in an Applied Biosystems 2720 thermal cycler at 95 ° C. for 1 minute, 55 ° C. for 30 seconds, and then at 72 ° C. for 30 minutes.
  • 10 ⁇ L of 2 ⁇ formamide loading solution was added to 10 ⁇ L of the heated reaction solution, heated at 90 ° C. for 3 minutes, and then analyzed by 20% modified PAGE containing 7.5 M urea (FIGS. 14 to 17).
  • the oligonucleotide chain contained in the gel after electrophoresis was detected by the ChemiDoc XRS + imaging system based on the fluorescence derived from the fluorescein group modified at the 5'end of the primer chain.

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Abstract

核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有するプライマーである。（ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）。また、式（１）で示される構造を有するフォワードプライマー及びリバースプライマーと、テンプレートＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを複数サイクル行って３'末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成するＰＣＲ装置と、Ｒ１を脱保護して３'末端が突出した接着末端を形成する光照射手段と、を備える二本鎖ＤＮＡの製造装置である。

Description

プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法
　本発明は、プライマー及びこれを用いた二本鎖ＤＮＡの製造装置並びに二本鎖ＤＮＡの製造方法に関する。
　分子生物学などの分野では、遺伝子組み換えや形質転換などを行うために、標的ＤＮＡをホストに組み込んだベクターが用いられている。一般に、標的ＤＮＡは、量が少ない場合はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅して使用される。ＰＣＲでは、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、これに相補的に結合するプライマーを用いて熱変性とアニーリングを複数サイクル繰り返すことでテンプレートＤＮＡを増幅している。
　ＰＣＲで増幅されたテンプレートＤＮＡの増幅産物は、そのままでは平滑末端であり、これをプラスミドＤＮＡなどのホストＤＮＡと結合（ライゲーション）させるための処理をする必要がある。一般に、そのような処理として、特定の配列を切断する制限酵素を使用するが、この方法では、結合できるＤＮＡが制限酵素の切断部位の配列に依存するため、汎用性に乏しいという問題がある。
　制限酵素を用いない方法として、増幅産物の３’末端及び５’末端を接着末端（粘着末端、突出末端などともいう）とし、ホスト側も同様に接着末端を形成して両者をライゲーションしてベクターを構築する技術がある。例えば、近年では、Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法、ＳＬｉＣＥ法などが知られている。これらの方法では、いずれも二本鎖ＤＮＡ断片末端に１５ｂｐ程度の相同配列を持たせ、二本鎖中の片側の鎖をエキソヌクレアーゼ活性で消化し、接着末端を生じさせたのちに連結する。なお、Ｇｉｂｓｏｎ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法ではｉｎ　ｖｉｔｒｏでＴａｑ　ＤＮＡ　ｌｉｇａｓｅを用いて連結し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法では大腸菌内の修復システムを利用して連結する。
　これらの方法では、酵素であるエキソヌクレアーゼを使用するため、コストがかかるほか、反応条件等によって部位特異性に劣ることがあり、定量的な接着末端形成が困難であるため、連結反応の効率が低いという問題があった。このため、酵素を使用しないシームレスクローニング法が求められていた。
　そこで、化学的手法により接着末端を有するＤＮＡを調製する方法が開発され、そのためのＰＣＲ用のプライマーとして、特許文献１に記載されたものが知られている。この文献のプライマーは、非相補ＤＮＡ部分の塩基配列中の３’末端に相当する塩基が保護基で修飾されている。この保護基は、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製の進行を停止させる機能を有しており、光照射処理やアルカリ処理などによって被修飾塩基から脱離しうる。また、本文献では、保護基（置換基）を生体分子に導入するための置換基導入剤を用いて塩基に保護基をプライマーの塩基に導入している。
国際公開第２００９／１１３７０９号（請求項１、請求項２など）
　特許文献１では、保護基の部分でＤＮＡ複製の進行が停止するが、塩基の部分で保護基によりポリメラーゼ活性を阻害するため、停止効率が低く、その結果、完全に伸長したものができてしまうことがあった。また、例えばＤＮＡでは塩基はアデニン、グアニン、シトシン、チミンの４種類あるが、特許文献１では塩基に保護基を導入しているため、塩基の種類に応じた方法で保護基を導入する必要があり、プライマーの製造に手間やコストがかかっていた。
　本発明の目的は、停止効率が高く、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することにある。また、本発明の他の目的は、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記問題を解決すべく鋭意研究を重ねた。その結果、ヌクレオシドの糖の部分に分解性保護基を導入したプライマーを開発した。そして、その保護基を分解することで接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを作製できることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマーである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
　この場合において、前記Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 （ここで、Ａ１は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
　さらにこの場合において、前記Ｒ１が下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 （ここで、Ｒ３は炭素数１～２０のアルキル基を示す。）
　上記の場合において、前記Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基又はアダマンチル基であることがより好ましい。特に、Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基であることが好適である。
　さらに、前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　あるいはまた、前記Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
　この場合において、前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することが好ましい。
　また、本発明は、上記のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、前記Ｒ１を脱保護する脱保護手段と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置である。
　さらに、本発明は、上記のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、前記Ｒ１を脱保護する脱保護工程と、を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法である。
　この場合において、前記Ｒ１が前記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
　あるいは、前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であり、脱保護工程は還元剤により前記Ｒ１を脱保護することが好ましい。
　また、前記プライマーは、前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することが好ましい。
　本発明によれば、脱保護効率が高く、かつ安価に製造することが可能なプライマーを提供することが可能となる。また、本発明によれば、このようなプライマーを用いた、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造装置及び二本鎖ＤＮＡの製造方法を提供することが可能となる。
接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置を示す模式図である。 オリゴヌクレオチドｐＡｃＧＦＰ＿Ｆｗ２合成時における、脱保護後（ａ）と精製後（ｂ）のクロマトグラムである。 鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。 ＰＣＲ反応のアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。 ＰＣＲ断片の連結反応の模式図である。 Ｔ＊＊を含むオリゴヌクレオチドを用いた接着末端の作成実験を示す図である。 Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を用いた１Ｔの脱保護反応の実験結果を示す図である。 Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を用いた２Ｔの脱保護反応の実験結果を示す図である。 リン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くした実験の概要を示す図である。 修飾オリゴヌクレオチドの熱サイクル条件における安定性試験の結果を示す図である。 修飾プライマーがＰＣＲ条件において安定（分解耐性）であることを示す実験の結果を示す図である。 ｔＢｕタイプ修飾プライマーの脱保護反応の逆相ＨＰＬＣ分析の実験結果を示す図である。 ＰＣＲ産物の試験管内での連結反応（Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼ）の実験悔過を示す図である。 鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＴＴ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。 鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＴＴ、アダマンチルタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。 鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＡＡ及びＴＡ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。 鎖伸長停止ケージドアナログ（配列ＣＣ及びＧＣ、ｔＢｕタイプ）を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。
１．プライマー
　以下、本発明のプライマーについて説明する。本発明のプライマーは、核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）。なお、結合手＊のうち、式（１）の３’側の結合手は、３’側において隣接するヌクレオチドの糖の５’炭素に結合し、５’側 の結合手は、５’側において隣接するヌクレオチドの糖の３’炭素に結合する。また、ＤＮＡプライマーの場合は、Ｒ２は水素、ＲＮＡプライマーの場合は、Ｒ１はヒドロキシル基である。
　Ｂは塩基であり、具体的には、ＤＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、チミンから選択され、ＲＮＡプライマーの場合はアデニン、グアニン、シトシン、ウラシルから選択される。
　Ｒ１の分解性保護基とは、何らかの処理により分解する保護基（置換基）を意味する。ここでいう処理としては、光照射処理、還元処理、アルカリ処理、酸処理、酸化処理、脱シリル化処理、熱処理、エステラーゼ処理、ホスファターゼ処理などを挙げることができる。ポリメラーゼは核酸のリン酸基の負電荷をより強く認識しているため、特許文献１のように塩基に保護基を導入するよりも、式（１）のようにリン酸基を保護基でマスクするほうが、ポリメラーゼの停止効率をより高めることができると推測される。
（１）光分解性保護基
　処理が光照射である場合、Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 （ここで、Ａ１は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～３の分岐鎖、あるいは炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
　炭素数１～２０のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などを挙げることができる。
　Ｒ１としては、下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 （ここで、Ｒ３は炭素数１～２０のアルキル基を示す。）
　特に、Ｒ３は、ｔｅｒｔ－ブチル基やアダマンチル基のような嵩高いものが好ましい。後述する実施例で示すように、Ｒ３が嵩高いほど、修飾部位の化学的安定性と複製反応の阻害効果が高い。したがって、Ｒ３は炭素数が３以上であり、４以上であることが好ましく、７以上であることがより好ましく、１０以上であることが特に好ましい。実施例に記載の置換基（Ｒ３がメチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、アダマンチル基）では、化学的安定性の低い順に、メチル基＜ｔｅｒｔ－ブチル基＜アダマンチル基となる。
　Ｒ１としては、下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
（２）還元剤分解性保護基
　処理が還元処理の場合、Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることが好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
 （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
　炭素数１～２０のアルキレン基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、シクロヘキシル基、アダマンチル基などを挙げることができる。
　Ｒ１としては、下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
（３）その他の分解性保護基
　アルカリ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソブチリル基、ベンゾイル基、アセトキシメチル基などを挙げることができる。酸処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、トリチル基を挙げることができる。酸化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アリルオキシメチル基、ジメトキシベンジルオキシメチル基、トリメトキシベンジルオキシメチル基などを挙げることができる。脱シリル化処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、ｔ－ブチルジメトキシシリルオキシメチル基、ｔ－ブチルジフェニルシリルオキシメチル基などを挙げることができる。熱処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、イソシアネート基を挙げることができる。エステラーゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、アセトキシメチル基を挙げることができる。ホスファターゼ処理により被修飾塩基から脱離し得る分解性保護基としては、リン酸メチル基を挙げることができる。
　本発明のプライマーは、特にＰＣＲで好適に使用される一本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＲＮＡであり、上記式（１）で示される構造を分子内に有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドである。プライマーの塩基対の数は、標的ＤＮＡなどの配列等に応じて適宜設定することができるが、一般にオリゴヌクレオチドでは例えば２０塩基対以下、ポリヌクレオチドでは例えば２０塩基対超である。ポリヌクレオチドの塩基対の数の上限としては特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば４０塩基対以下が好ましい。また、オリゴヌクレオチドの塩基対の数の下限としては、プライマーとして使用できる長さであれば特に制限はないが、一般的に使用されるプライマーとしては例えば５塩基対以上が好ましい。
　プライマーにおいては、前記式（１）で示される構造が配列中に１つのみ存在するよりも、この構造が２つ以上連続することが好ましい。式（１）の構造が配列中に１つのみの場合は、その構造部分でＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡの複製が停止しなかった場合は接着末端の形成ができなくなる。しかしながら、式（１）の構造が２つ以上連続することで、ＤＮＡの複製が確率的により停止しやすくなり、接着末端形成の効率が高くなる。
２．プライマーの製造方法
　本発明のプライマーは、上記式（１）の構造を有する修飾ヌクレオチド（以下、「ヌクレオチド誘導体」ということがある）を合成し、これに非修飾のヌクレオチドをホスホロアミダイト法などの固相合成法で連結することで製造することができる。
　プライマーの合成方法の概要としては、まずヌクレオシドの５’ヒドロキシル基を保護し、３’ヒドロキシル基にＮ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを反応させる。次に、ニトロベンジルアルコールを反応させて分解性保護基を導入する。その後、ホスホロアミダイトなどを反応させ、固相合成法で非修飾のヌクレオチドを連結させてプライマーを合成する。以下、実施例に掲載したプライマーの具体的な製造方法について詳細に説明する。
（ａ）還元剤分解性保護基を有するヌクレオシド誘導体（※式（１）において、Ｒ１が式（２Ｂ）、Ｒ２が水素の化合物）及びプライマーの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　上記の合成スキ－ムに沿って説明する。以下で説明する合成スキ－ムにおいて、数字は化合物の番号を表す。まず、デオキシリボヌクレオシド（下記スキ－ムではチミジン）を出発物質として用意する。これに４，４’－ジメトキシトリチルクロリド（ＤＭＴｒＣｌ）、ピリジンを加え、リボースの５’ヒドロキシル基に４，４’－ジメトキシトリチルクロリド基を結合させる（化合物２４）。次に、Ｎ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィンを、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に添加し、デオキシリボースの３’ヒドロキシル基にホスホロアミダイトを結合させる（化合物２５）。次に、４－ニトロベンジルアルコールを反応混合物に加え、次いで５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾールを添加して化合物２６を得る。その後は常法により、所望の配列となるようにヌクレオチドを固相合成してプライマーを合成する。
３．接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置
　つぎに、接着末端を有する二本鎖ＤＮＡの製造方法及び製造装置について説明する。本発明の二本鎖ＤＮＡの製造装置は、本発明のプライマーを用いて接着末端を有するための装置である。また、本発明の二本鎖ＤＮＡの製造方法は、標的ＤＮＡ配列を含むテンプレートＤＮＡを使用し、本発明のプライマーを用いて接着末端を有する方法である。以下、図１を参照して説明する。なお、本実施形態では、プライマーにおいて、式（１）の構造が連続して２つ存在するものを使用しているが、式（１）が１つのみの場合も同様の方法・装置を使用することができる。
　まず、試薬としてフォワードプライマーとリバースプライマーを含むＰＣＲ増幅用プライマーセットを準備する（準備工程）。フォワードプライマーは、テンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。また、リバースプライマーは、テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ式（１）で示される構造を有する。
　図の（ａ）に示すように、フォワードプライマーとリバースプライマーは、増幅したい標的ＤＮＡ配列を挟むように配列を決定する。また、プライマーにおける式（１）の分解性保護基を有するヌクレオチドの位置は、目的とする接着末端の配列（図の（ｃ））において、３’陥没側における最も３’末端側のヌクレオチドの３’側に隣接する位置に相補的な位置となるように設計する。式（１）の構造が２つ以上連続している場合は、式（１）の構造のヌクレオチドのうち最も３’側に位置するヌクレオチドが上記の位置となるようにする。その他の試薬としては、ＰＣＲに使用するポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼなど）、バッファー、ｄＮＴＰなどである。
　次に、ＰＣＲ装置（増幅手段）を用いてテンプレートＤＮＡの配列を増幅する（増幅工程）。ＰＣＲ装置は、テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、フォワード側伸長鎖とリバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡ（図の（ｂ））を生成する。　
　ＰＣＲでは、熱変性、アニーリング、伸長反応を繰り返して、テンプレートＤＮＡの配列を増幅する。ＰＣＲの条件にもよるが、熱変性は約９５℃、１～３分間、アニーリングはプライマーのＴｍ±５℃、伸長反応は１～１０分間で行う。ＰＣＲのサイクル数は特に制限はないが、一般に２４～４０サイクル程度である。
　図のように、ＰＣＲ増幅産物には３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡが含まれる。これは、プライマーを鋳型として相補鎖が合成される際に、式（１）の分解性保護基がポリメラーゼ反応を阻害し、反応を停止させるためである。
　その後、図の（ｃ）に示すように、所定の処理によりＲ１を脱保護し、５’末端が突出した接着末端を形成する（脱保護工程）。所定の処理は、Ｒ１を脱保護するための処理であり、上記の光照射処理、還元処理などを挙げることができる。
　以下、脱保護メカニズムについて説明する。下記式に示すように、所定の処理を施すと、式（１）の分解性保護基Ｒ１がヌクレオチドのリン酸から脱離する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　光照射処理としては、例えば、光源装置（脱保護手段）により３００～４００ｎｍの波長の光を１～３０分間照射する方法を挙げることができる。また、還元処理としては、例えば、亜ジチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓ２Ｏ４）などの還元剤を用い、例えば７０～８０℃、１～３０分間処理する方法を挙げることができる。これにより、プライマーの式（１）のヌクレオシドの分解性保護基が脱保護され、５’突出末端（３’陥没末端）を有する二本鎖ＤＮＡを合成することができる。その他の処理についても同様に、分解性保護基を脱保護する装置（脱保護装置）を使用して脱保護を行う。
　本発明では、制限酵素などによらずに自由自在に接着末端を設計することができるため、所望の配列を有するＤＮＡを自由に連結することができる。例えば、標的ＤＮＡとベクターの両方の配列を設計し、脱保護処理により両者に共通の接着末端を形成させてライゲーションを行って組換えＤＮＡを調製し、これをクローニングやライブラリーの作成、大量発現系の構築などに使用することができる。また、接着末端を有する複数のゲノム配列を連結することで、試験管内でゲノムビルドアップ反応を行うことができる。あるいは、平滑末端の状態で細胞内に二本鎖ＤＮＡを導入し、細胞内で脱保護処理を行うことで、細胞内でゲノムビルドアップ反応を行うこともできる。
　以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、これらは本発明の目的を限定するものではない。また、以下の実施例において「％」表示は特に規定しない限り質量基準（質量パ－セント）である。
１．鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊
（１）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドの合成
　鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチド（表１）は、ホスホロアミダイト法に基づき核酸自動合成機（ＮＲ－２Ａ　７ＭＸ、日本テクノサービス社製）により合成した。鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊のアミダイト化合物（化１３）は、既報（Ｗｕ，Ｌ．ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４，２０，１２１１４－１２１２２）に従い合成した。５’末端のリン酸化には、市販のアミダイト試薬５’－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ＯＮ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ社製）を用いた。合成後のオリゴヌクレオチドは定法に従い脱保護したのち、逆相ＨＰＬＣにより精製した［システム，日立ハイテクサイエンス社製　ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ；　カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ　Ｉ．Ｄ．）；溶離液Ａ，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ　７．０）；溶離液Ｂ，アセトニトリル；グラジエント条件、０～６０％　溶離液Ｂ／２０分；溶離液量，３ｍＬ／分；波長２６０ｎｍの吸光度により検出］（図２）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　下記表に、合成した鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチド配列を示す。ｐは５’末端の水酸基がリン酸化されていることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　図２は、オリゴヌクレオチドｐＡｃＧＦＰ＿Ｆｗ２合成時における、脱保護後（ａ）と精製後（ｂ）のクロマトグラムを示す図である。精製前のクロマトグラム（ａ）に示す１４．１分付近のピークが目的物に由来するピークである。これを分取して精製した（ｂ）。
（２）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応
　Ｑ５（登録商標）　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，　Ｄｅｅｐ　Ｖｅｎｔ（登録商標）　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，　Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ（５’　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ　３’），１μＭ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表１），０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．０２　ｕｎｉｔｓ／μＬ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ　２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０，３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図３）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
　図３は、鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした鎖伸長反応の停止を示す図である。（ａ）は用いたオリゴヌクレオチドの配列。（ｂ）～（ｅ）は市販の耐熱性ポリメラーゼを用いた鎖伸長反応の変性ＰＡＧＥ解析結果、（ｆ）はＰｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用い、２Ｔを鋳型にした反応のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量解析結果を示す。下パネルは原料（Ｐｒｉｍｅｒ）の解析結果（コントロール実験）を示す。
　図３（ｆ）に示した鎖伸長産物の分子量解析は次のとおり行った。前述の条件にてＰｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む２Ｔを鋳型にした酵素反応を作成し、９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で４０分間加熱した。反応液（５０μＬ）をＴＥ飽和フェノールとクロロホルムの等量混合液で抽出し、酢酸アンモニウム塩存在下アルコール沈殿し、ＤＮＡを回収した。質量分析計ｕｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ（Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用い、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ分子量解析を行った。
（３）鎖伸長停止による接着末端形成を利用したクローニング反応
　図５はＰＣＲ断片の連結反応の模式図である。この図に示す方法でＰＣＲ断片の連結を行った。まず、ベクター側断片（５．３ｋｂ）は以下のようにして調製した（図４（ａ））。反応液［０．５μＭ　ｐＥＴ２１ｄ＿Ｆｗ２，　０．５μＭ　ｐＥＴ２１ｄ＿Ｒｅｖ２，　０．８ｎｇ／μＬ　ｐＥＴ２１ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ），２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８　ａｔ　２５℃），１０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００，　０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ，０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．０２Ｕ／μＬ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］をアプライドバイオシステムズ　ＭｉｎｉＡｍｐ　Ｐｌｕｓサーマルサイクラーにて以下の加熱条件に付した［（９５℃，１５秒→５０℃，３０秒→７２℃，７．５分間）／サイクル×３０サイクル］。
　インサート側断片（０．７５ｋｂ）は以下のようにして調製した（図４（ｂ））。反応液［０．５μＭ　ｐＡｃＧＦＰ１＿Ｆｗ２，　０．５μＭ　ｐＡｃＧＦＰ１＿Ｒｅｖ２，　０．８ｎｇ／μＬ　ｐＡｃＧＦＰ１（Ｔａｋａｒａ），　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．８　ａｔ　２５℃），１０ｍＭ　ＫＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，　２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）　Ｘ－１００，　０．１ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡ，　０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，　０．０２Ｕ／μＬ　Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ］をアプライドバイオシステムズ　ＭｉｎｉＡｍｐ　Ｐｌｕｓサーマルサイクラーにて以下の加熱条件に付した［（９５℃，１５秒→５５℃，１５秒→７２℃，１分間）／サイクル×３０サイクル］。
　ＰＣＲ反応後の反応液（５０μＬ）にそれぞれＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液（１００μＬ）を加え、激しく混和したのち遠心（１４，０００×ｇ，３分間）し，水層を分離した。同様にクロロホルム（１００μＬ）で反応液を抽出したのち、水層に３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）５μＬとイソプロピルアルコール６０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）し、ＤＮＡをペレットとして回収した。ＰＣＲ反応の鋳型プラスミドＤＮＡを分解するため、２種の反応産物をそれぞれ制限酵素ＤｐｎＩ（Ｔｏｙｏｂｏ）と３７℃で１時間反応させた（０．８Ｕ／μＬ　ＤｐｎＩ　ｉｎ　３３ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡｃ）２，　６６ｍＭ　ＫＯＡｃ，０．５ｍＭ　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，反応液量２０μＬ）。反応液に水８０μＬを添加し、ＴＥ飽和フェノールとクロロホルムの等量混合液（１００μＬ）を加え、激しく混和したのち遠心（１４，０００×ｇ，３分間）し、水層を分離した。同様にクロロホルム（１００μＬ）で反応液を抽出したのち、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコール１１０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）し、ＤＮＡをペレットとして回収した。ＤＮＡペレットを水に溶解しアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む０．８％　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓ（和光純薬工業））により分析し、ＤＮＡサイズマーカー（Ｑｕｉｃｋ－Ｌｏａｄ　Ｐｕｒｐｌｅ　１　ｋｂ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）のバンド強度と比較することで含まれる目的ＤＮＡの濃度を算出した［ベクターＤＮＡ断片（５μＬ）、１３ｎｇ／μＬ；インサートＤＮＡ断片（５０μＬ），２３ｎｇ／μＬ］。
　べクターＤＮＡ断片（２６．５ｎｇ）とインサート断片（２６．５ｎｇ）の混合液５μＬを９６穴マルチウェルプレートのウェルに加え、光照射装置ＭＡＸ－３０５（朝日分光）により波長３６５ｎｍの光を約４ｍＷ／ｃｍ２で１０分間照射した。同溶液を大腸菌コンピテントセル溶液２５μＬ（ＮＥＢ　５－ａｌｐｈａ　Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｈｉｇｈ　Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に添加し形質転換した。これをアンピシリンナトリウム（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天培地に塗布し３７℃で一晩培養した。生じたコロニー４７６個から２０個を選択しコロニーＰＣＲを行い、ベクターへの目的インサートの挿入の有無を判別した。ＰＣＲ反応液をアガロースゲル電気泳動により解析し、２０クローンのうち目的連結反応産物は１８個含まれることが分かった（ＰＣＲプライマー，　５’　ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ　ＣＴＡＴＡＧＧＧ　３’，　５’　ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ　３’；コロニー陽性率９０％）。連結反応産物１０クローンについて、これを含む菌体を液体培養し、プラスミドＤＮＡを抽出した。２種のプライマー配列（５’　ＧＧＴＧＡＴＧＴＣＧＧＣＧＡＴＡＴＡＧＧ　３’，　５’　ＧＣＣＡＡＴＣＣＧＧＡＴＡＴＡＧＴＴＣＣＴ　３’）を用い、ＤＮＡシーケンサーＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　３５００ｘＬ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒにより得られたプラスミドＤＮＡの配列を解析した。４か所のプライマーＤＮＡ由来部位、これらのうちの２か所のオーバーラップ部位、及びこれらに挟まれた範囲の塩基配列を解析した結果、１０クローンすべてで設計どおりの配列を含み、変異は観察されなかった。
　図４は、ＰＣＲ反応のアガロースゲル電気泳動分析を示す図である。Ｌａｎｅ１，サイズマーカー；ｌａｎｅ２，反応液を示す。（ａ）ベクター側断片の調製。（ｂ）インサート側断片の調製である。
２．還元条件で脱保護されるアナログ（Ｔ＊＊）
（１）還元条件で脱保護されるアナログ（Ｔ＊＊）の合成
　以下に還元条件で脱保護されるアナログ（還元脱保護アナログ）の合成スキームを示す。以下、この合成スキームに従って、還元脱保護アナログの合成手順を説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　３－Ｏ－［２－（４－ニトロベンジルオキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル］－５－Ｏ－（４，４’－ジメトキシトリチル）－２－デオキシ－チミジン（化合物２６）の合成
　ＴＨＦ（７ｍＬ）中の化合物２４（０．５０ｇ、１．３２ｍｍｏｌ）及びＥｔ３Ｎ（２００μＬ、１．４５ｍｍｏｌ）の混合物に、室温でＮ，Ｎ－ビス（ジイソプロピルアミノ）クロロホスフィン（０．３９ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応が完了するまで、生じた混合物を室温で２５分間撹拌した（化合物２５）。次の工程を精製せずに続けた。４－ニトロベンジルアルコール（０．２２ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を反応混合物に加え、次いで５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．１７ｇ、１．４５ｍｍｏｌ）を加えた。反応は室温で２０分後に完了した。反応混合物をＥｔＯＡｃで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ、及びブラインで洗浄した。蒸発後、混合物を中性フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン中２％トリエチルアミン／ＥｔＯＡｃ＝２：１～１：１）で精製して化合物２６（０．４６ｇ、０．５６ｍｍｏｌ、４２％）を得た。
（２）オリゴヌクレオチドの合成
　合成した切断アナログＴ＊＊のアミダイトは終濃度５０　ｍＭのアセトニトリル溶液とし、ホスホロアミダイト法に基づきＤＮＡ合成機を用いてＤＮＡオリゴマーを合成した。脱保護は定法に従って行い、逆相ＨＰＬＣ　［日立ハイテクサイエンス社製　ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により精製し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ（Ｂｒｕｋｅｒ）を用いて構造を確認した。合成したＤＮＡの配列を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
（３）プライマー伸長実験
　Ｑ５　Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社から購入した。Ｐｆｕ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅはプロメガ社から購入した。酵素反応の反応液［１μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ　（５’　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ　３’），１μＭ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ（０Ｔ，１Ｔ又は２Ｔ，表２），０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．０２ｕｎｉｔｓ／μＬ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で１０、３０又は６０分間加熱した。加熱後の反応液９μＬに２×ホルムアミドローディング溶液９μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図６）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。
（４）Ｔ＊＊を１つ含むオリゴヌクレオチド（１Ｔ）の脱保護反応
　オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊ＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製　ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８　（２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図７）。
（５）Ｔ＊＊を２つ含むオリゴヌクレオチド（２Ｔ）の脱保護反応
　オリゴヌクレオチド（５’－ＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴ＊＊Ｔ＊＊ＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴ－３’，１０μＭ）を２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ４を終濃度１０ｍＭとなるように加え、室温で３０分間静置した。その後、脱保護反応の進行を逆相ＨＰＬＣ［日立ハイテクサイエンス社製　ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ；カラム，ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×１０ｍｍ）］により解析した（図８）。
３．リン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くした実験
　以下、ＰＣＲ停止プライマーにおいてリン酸修飾基中の置換基Ｒをより嵩高くしたとき、修飾部位の化学的安定性及び複製反応阻害効果を評価した。図９は、この実験の概要を示す図である。
（１）アミダイト試薬　（ｄＴ，Ｒ＝Ｍｅ，ｔＢｕ，ａｄａｍａｎｔｙｌ）の合成
　置換基Ｒをより嵩高くし、複製反応阻害効果、化学的安定性向上を目指した。
（１－１）メチル型ｄＴホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
 参照）Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．２０１４，２０，１２１１４－１２１２２
　５’－ＤＭＴｒ－チミジン（３４３ｍｇ，０．６３ｍｇ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（３００ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（５３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１．７ｍＬ）中、アルゴン下、０℃で添加し、室温で４時間撹拌した。この混合物をシリカゲルカラム（３％ＴＥＡを含むＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＥｔ＝３／１）に直接アプライして粗生成物を得た。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（３％ＴＥＡを含むＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝３／１）で精製し、Ｍｅアナログアミダイト（３０９ｍｇ、５８％）を得た。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ　１４８．８，１４７．８，１４７．７；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．８６３．３３９２［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ　８６３．３４１５。
（１－２）アダマンチル型ｄＴホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
 　ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）中の５’－ＤＭＴｒ－チミジン（２５８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）の溶液にＤＩＰＥＡ（１０７μＬ，０．６１ｍｍｏｌ）とビス（ジイソプロピルアミノ）－Ｃｌ－ホスフィン（１６３ｍｇ，０．６１ｍｍｏｌ）をアルゴン下、０℃で加え、室温で２時間撹拌した。次いで、上記反応混合物に２－ニトロ－α－アダマンチルベンジルアルコール（１５０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）と１Ｈ－テトラゾール（５０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間撹拌した。反応混合物に１Ｈ－テトラゾール（５０ｍｇ，０．７１ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間撹拌した。Ｈ２Ｏを加えた後、反応混合物をＡｃＯＥｔで抽出し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、蒸発させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（０．５％　ＴＥＡを含むＨｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝１／１）で粗生成物を精製し、Ａｄアナログアミダイト（１６９ｍｇ、３７％）を得た。
　３１Ｐ－ＮＭＲ（１５９ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ　１５３．１，１５１．９，１５０．２，１４８．１；ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９８３．４３３１［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ　９８３．４３３６。
（１－３）ｔＢｕ置換アナログの４種類の塩基（Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｔ）のアミダイト試薬合成スキーム（まとめ）
　以下に、４種類の塩基を用いた場合におけるアミダイト試薬の合成スキームの概要を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
（１－４）Ｐａｃ－ｄＡホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
 　５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＡ（２．０ｇ，２．９ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．６ｇ，５．８ｍｍｏｌ）と５（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（１．０ｇ，８．７ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ）中でアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００　ｍＬ）、食塩水（２００　ｍＬ）で洗浄した。硫酸ナトリウム上で有機相を乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１、１％　ＴＥＡ含有）で精製し、ｔ－Ｂｕ　ｄＴアナログアミダイト（１．１ｇ、３７％）を得た。
　ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０４８．４３５０［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ　１０４８．４４３７。
（１－５）ｄＴホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＡ（１．５ｇ，２．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．４ｇ，５．５ｍｍｏｌ）と５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．６４ｇ，５．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中にアルゴン下、０℃で添加し、室温で７時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１、１％　ＴＥＡを含む）で精製し、ｔ－Ｂｕ　ｄＡアナログアミダイト（２．０ｇ、８１％）を得た。
　ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．９０５．２２６７［Ｍ＋Ｎａ］＋、ｆｏｕｎｄ　９０５．３９７８。
（１－６）Ｐａｃ－ｄＧホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 　５’－ＤＭＴｒ－Ｐａｃ－ｄＧ（２．０ｇ，２．８ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．５ｇ，５．７ｍｍｏｌ）と５－（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．９９ｇ，８．５ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（７．５ｍＬ）中でアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝２／１で１％　ＴＥＡを含む、ＡｃＯＥｔ／ＭｅＯＨ＝４０／１）で精製し、ｔ－Ｂｕ　ｄＧアナログアミダイト（１．２ｇ，４１％）を得た。
　ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ　（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１１４３．５６７８［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ　１１４３．５８６７。
（１－７）Ａｃ－ｄＣホスホロアミダイトの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 　５’－ＤＭＴｒ－Ａｃ－ｄＣ（１．８ｇ，３．２ｍｍｏｌ）の懸濁液に光保護アミダイト試薬（２．８ｇ，６．３ｍｍｏｌ）と５（メチルチオ）－１Ｈ－テトラゾール（０．７３ｍｇ，６．３ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（８．０ｍＬ）中にアルゴン下、０℃で加え、室温で６時間撹拌した。溶液をＡｃＯＥｔ（２００ｍＬ）に注ぎ、水（２００ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水（２００ｍＬ）、食塩水（２００ｍＬ）で洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（Ｈｅｘ／ＡｃＯＥｔ＝１／１、１％　ＴＥＡ含有）で精製し、ｔ－Ｂｕ　ｄＣアナログアミダイト（２．１ｇ、７４％）を得た。
　ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳ（ｍ／ｚ）ｃａｌｃｄ．１０１１．５３５５　［Ｍ＋ＴＥＡ］＋、ｆｏｕｎｄ　１０１１．５５０３。
（２）修飾オリゴヌクレオチドの熱サイクル条件（ＰＣＲ条件）における安定性（分解耐性）試験
（反応条件）
　１０μＭ　ｏｌｉｇｏ（Ｍｅ１Ｔ　ｏｒ　ｔＢｕ１Ｔ）　ｉｎ　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ　ＫＣｌ，２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８．本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１分→５０℃，３０秒→７２℃，３分）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
（分析条件）
　システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ
　カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
　移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，　ｐＨ７．０）
　　　　　Ｂ液，アセトニトリル
　（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ））
　移動相流量；１ｍＬ／分
　検出波長；２６０ｎｍ
（結果）
　オリゴヌクレオチドＭｅ１Ｔを熱サイクルに付した後には、約５０％の基質において修飾基の脱離が見られた（図１０の（ｄ）：観察されたピークが修飾を含まない同配列オリゴヌクレオチドの溶出時間と一致することを確認した）。それに対し、ｔＢｕ１Ｔの場合は熱サイクルに付しても保護基の脱離は観察されなかった（図１０の（ｅ））。したがって、Ｍｅ，ｔＢｕタイプ修飾の安定性を比較した結果、後者の優位性が示された。
（３）修飾プライマーがＰＣＲ条件において安定（分解耐性）であることを示す実験（ｔＢｕアナログ導入数１，２，３の比較）
（反応条件）
　１０μＭ　ｏｌｉｇｏ（ｔＢｕ１Ｔ，ｔＢｕ２Ｔ　ｏｒ　ｔＢｕ３Ｔ）　ｉｎ　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，１０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍＭ　ＫＣｌ，２ｍＭ　ＭｇＳＯ４，ｐＨ８．８。本組成の溶液を熱サイクル条件［（９５℃，１ｍｉｎ→５０℃，３０ｓｅｃ→７２℃，３ｍｉｎ）×３０ｃｙｃｌｅｓ］に付したのち、逆相ＨＰＬＣにて分析した。
（分析条件）
　システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ
　カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
　移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
　　　　　Ｂ液，アセトニトリル
　（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ））
　移動相流量；１ｍＬ／分
　検出波長；２６０ｎｍ
（結果）
　図１１に示すように、修飾の導入数を２個、３個に増加させても本条件では保護基の脱離は見られなかった。
（４）ｔＢｕタイプ修飾プライマーの脱保護反応の逆相ＨＰＬＣ分析
（脱保護反応条件）
　光照射（図１２の（ｂ））；１０μＭ　ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　溶液に対し３６５ｎｍ光（４ｍＷ／ｃｍ２）を１０分間照射
　還元反応（図１２の（ｃ））；５μＭ　ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ　Ｎａ２Ｓ２Ｏ４，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）
　溶液を２５℃で３０分間インキュベート
（分析条件）
　システム；日立ハイテクサイエンス社製ＬａＣｈｒｏｍ　Ｅｌｉｔｅ
　カラム；ＹＭＣ社製Ｈｙｄｒｏｓｐｈｅｒｅ　Ｃ１８（２５０×４．６ｍｍ）
　移動相；Ａ液，５％アセトニトリルを含む５０ｍＭ　ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ（ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０）
　　　　　Ｂ液，アセトニトリル
　（Ｂ液含量を２０分かけて０％から６０％へと増加させた（ｌｉｎｅａｒ　ｇｒａｄｉｅｎｔ））
　移動相流量；１ｍＬ／分
　検出波長；２６０ｎｍ
　以下の還元条件でも同様に脱保護が可能であることを確認済みである。
　・１０μＭ　ｏｌｉｇｏ，１０ｍＭ　Ｂ２（ＯＨ）４，５０ｍＭ　ＮａＯＨ，３０％　ＥｔＯＨ／ｗａｔｅｒ；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
　・１０μＭ　ｏｌｉｇｏ，１．５ｍＭ　ＴｉＣｌ３，２０ｍＭ　ｃｉｔｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）；２５℃，２ｈｏｕｒｓ
　図１２に示すように、３６５ｎｍ光照射、及び亜ジチオン酸ナトリウムによる還元反応の両者で定量的な反応進行を確認した。
（５）ＰＣＲ産物の試験管内での連結反応（Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼ）
　図１３中に記載の熱耐性ポリメラーゼを使用し、ＰＣＲ反応により二本鎖ＤＮＡ断片を調製した。１．０ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＥＴ２１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
　下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
　Ｆｗ（２１－ｎｔ），５’　ＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＴＴＡＡＴＧＧ　３’
　Ｒｅｖ（３８－ｎｔ），５’　ｐＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＣＴＡＧＡＧ　３’
　０．７４ｋｂ断片の調製に用いた鋳型はｐＡｃＧＦＰ１プラスミドＤＮＡ、プライマー配列は以下の２本である。
　下線部Ｔ（Ｔ）はリン酸部にＭｅ、ｔＢｕ型修飾基を含むことを示す。ｐは５’末端がリン酸化されていることを示す。
　Ｆｗ（３５－ｎｔ），５’　ｐＡＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＣＣ　３’
　Ｒｅｖ（３４－ｎｔ），５’　ＧＣＡＡＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＣＡＴ　３’
　図中に記載の市販の耐熱性ポリメラーゼを使用し、推奨条件に従いＰＣＲ反応を実施し、１．０ｋｂ断片及び０．７４ｋｂ断片をそれぞれ調製した。反応の進行はアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む１．５％　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓ（和光純薬工業））にて確認した。ＰＣＲ反応後、反応液２００μＬにＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液２００μＬを加え、激しく混和したのち遠心（２０，０００×ｇ，１分間）、水層を分離した。同様にクロロホルム２００μＬで反応液を抽出したのち，３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）２０μＬとイソプロピルアルコール２２０μＬを加えた。－３０℃で１時間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）することでＤＮＡを回収した。目的とするＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動（ＧｅｌＲｅｄ（和光純薬工業）を含む１．５％　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓ（和光純薬工業））により精製した。切り出したゲル片からＷｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ）を用いてＤＮＡを抽出した。
　このようにして調製した１．０ｋｂ断片と０．７４ｋｂ断片をＴａｑ　ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その効率をアガロースゲル電気泳動で評価した。最初にリン酸部の保護基を除去するために、ＤＮＡ溶液（５μＬ；２４ｎＭ　１．０ｋｂ断片，２４ｎＭ　０．７４ｋｂ断片，１ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５））に３６５－ｎｍ光を４ｍＷ／ｃｍ２の強度で５分間照射した。次いで、この２つのＤＮＡ断片を含む溶液にＴａｑ　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を加え、３７℃で２時間インキュベートした。反応液組成は以下のとおりである。２．８ｎＭ　１．０ｋｂ断片，２．８ｎＭ　０．７４ｋｂ断片，１．６Ｕ／μＬ　Ｔａｑ　ＤＮＡリガーゼ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，２５ｍＭ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ，１０ｍＭ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ，１ｍＭ　ＮＡＤ　１，　１０ｍＭ　ＤＴＴ，　０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００，ｐＨ７．６．反応液に水８０μＬを加え、全量を約１００μＬとし、ＴＥ飽和フェノール（ナカライテスク）とクロロホルムの等量混合液１００μＬを加え、激しく混和したのち遠心（２０，０００×ｇ，１分間）、水層を分離した。同様にクロロホルム１００μＬで反応液を抽出したのち、３Ｍ　ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．２）１０μＬとイソプロピルアルコール１１０μＬ，２０ｍｇ／ｍＬ　グリコーゲン　１μＬを加えた。－３０℃で１５分間冷却した後、遠心（２０，０００×ｇ，２０分間）することでＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡ産物をアガロースゲル電気泳動（１．５％　Ａｇａｒｏｓｅ　Ｓ（和光純薬工業））により泳動した。泳動後のゲルをＧｅｌＲｅｄ水溶液で染色し、バンドを可視化した（ＢｉｏＲａｄ　ＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋システム）。
　図に示すように、Ｍｅ，ｔＢｕプライマーの比較を行い、後者でより高い連結効率が得られることを確認した。
（６）鎖伸長停止ケージドアナログを含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応
　上記「（２）鎖伸長停止ケージドアナログＴ＊を含むオリゴヌクレオチドを鋳型にした複製反応」と同様に、複製反応の実験を行った。
　酵素反応の反応液［１μＭ　Ｐｒｉｍｅｒ（５’　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ－ＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣ　３’），１μＭ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ（各図に配列及び構造記載），０．２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ，０．０２　ｕｎｉｔｓ／μＬ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを含む］は各酵素に添付の緩衝液を用い、推奨条件に従い作成した。反応液をアプライドバイオシステムズ　２７２０サーマルサイクラーにて９５℃で１分、５５℃で３０秒、次いで７２℃で３０分間加熱した。加熱後の反応液１０μＬに２×ホルムアミドローディング溶液１０μＬを加え、９０℃で３分間加熱した後、７．５Ｍ尿素を含む２０％変性ＰＡＧＥにより解析した（図１４～図１７）。泳動後のゲルに含まれるオリゴヌクレオチド鎖をプライマー鎖の５’末に修飾したフルオレセイン基由来の蛍光に基づきＣｈｅｍｉＤｏｃ　ＸＲＳ＋イメージングシステムにて検出した。

Claims (13)

  1. 　核酸の増幅に使用されるプライマーであって、下記式（１）で示される構造を有することを特徴とするプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （ここで、Ｂは塩基を示し、Ｒ１は分解性保護基を示し、Ｒ２は水素又はヒドロキシル基を示す。＊は隣接するヌクレオチドの糖との結合手を意味する。）
  2. 　前記Ｒ１が下記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （ここで、Ａ１は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
  3. 　前記Ｒ１が下記式（４Ａ）で示される光分解性保護基であることを特徴とする請求項２に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （ここで、Ｒ３は炭素数１～２０のアルキル基を示す。）
  4. 　前記Ｒ３がｔｅｒｔ－ブチル基又はアダマンチル基であることを特徴とする請求項３に記載のプライマー。
  5. 　前記Ｒ１が下記式（３Ａ）で示される２－ニトロベンジル基であることを特徴とする請求項２に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  6. 　前記Ｒ１が下記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であることを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     （ここで、Ａ２は炭素数１～３のアルキレン基を示し、炭素数１～２０の分岐鎖を有していてもよい。＊はリン酸の酸素（Ｏ）との結合手を意味する。）
  7. 　前記Ｒ１が下記式（３Ｂ）で示される４－ニトロベンジル基であることを特徴とする請求項６に記載のプライマー。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  8. 　前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することを特徴とする請求項１に記載のプライマー。
  9. 　請求項１～８のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造装置であって、
    　鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、
    　前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、
    　前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅手段と、
    　前記Ｒ１を脱保護する脱保護手段と、
    　を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造装置。
  10. 　請求項１～８のいずれかに記載したプライマーを用いて接着末端を有する二本鎖ＤＮＡを製造するための二本鎖ＤＮＡの製造方法であって、
    　鋳型となるテンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するフォワードプライマーと、前記テンプレートＤＮＡのセンス鎖の一部の配列と相補的であり、かつ前記式（１）で示される構造を有するリバースプライマーと、を準備する準備工程と、
    　前記テンプレートＤＮＡを鋳型としてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を複数サイクル行い、前記フォワードプライマーが伸長したフォワード側伸長鎖と、前記リバースプライマーが伸長したリバース側伸長鎖とを生成し、前記フォワード側伸長鎖と前記リバース側伸長鎖とをアニーリングして３’末端が陥没した二本鎖ＤＮＡを生成する増幅工程と、
    　前記Ｒ１を脱保護する脱保護工程と、
    　を備えることを特徴とする二本鎖ＤＮＡの製造方法。
  11. 　前記Ｒ１が前記式（２Ａ）で示される光分解性保護基であり、脱保護工程は光照射により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
  12. 　前記Ｒ１が前記式（２Ｂ）で示される還元剤分解性保護基であり、脱保護工程は還元剤により前記Ｒ１を脱保護することを特徴とする請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
  13. 　前記プライマーは、前記式（１）で示される構造が配列中に２つ以上連続することを特徴とする請求項１０に記載の二本鎖ＤＮＡの製造方法。
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WO2024185697A1 (ja) * 2023-03-03 2024-09-12 国立大学法人東海国立大学機構 ポリヌクレオチド連結産物の製造方法

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