WO2023113038A1 - オリゴヌクレオチドの製造方法 - Google Patents
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- 125000004933 β-carbolinyl group Chemical group C1(=NC=CC=2C3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 1
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- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
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Definitions
- the present invention relates to a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides, etc., which makes it possible to excise synthesized oligonucleotides even under mild conditions by using a phosphoramidite of a nucleoside having a specific structure.
- the solid-phase synthesis method using the phosphoramidite method is widely used for the chemical synthesis of oligonucleotides (nucleic acids) such as DNA and RNA.
- the nucleoside at the 3' end of the sequence must be supported on a solid support.
- the synthesized oligonucleotide sequence can be Regardless, the nucleoside at the 3' end of the oligonucleotide can optionally be introduced as the first nucleoside in the step of extending the oligonucleotide onto the universal linker, and regardless of the nucleoside at the 3' end, the oligonucleotide can have any sequence.
- Such universal linkers are widely used in solid-phase synthesis because they can effectively synthesize More specifically, a universal linker is preliminarily supported on a solid-phase carrier via a cleavable linker (spacer) such as a succinyl group, and an arbitrary 3'-terminal nucleoside is coupled, followed by synthesis by an automatic nucleic acid synthesizer.
- a cleavable linker spacer
- an arbitrary 3'-terminal nucleoside is coupled, followed by synthesis by an automatic nucleic acid synthesizer.
- the following steps are performed in the reaction column: (1) deprotection of the 5'-OH group of the protected nucleoside with an acid such as a trichloroacetic acid/dichloromethane solution; (2) a step of coupling a nucleoside phosphoramidite (also referred to as a “nucleic acid monomer”) to the deprotected 5′-OH group in the presence of an activating agent (tetrazole, etc.); (3) capping unreacted 5′-OH groups such as with acetic anhydride; and (4) oxidizing the phosphite such as with hydrous iodine, or 3-((N,N-dimethylaminomethylidene)amino )-3H-1,2,4-dithiazole-5-thione or the like to sulfurize the phosphite: An oligonucleotide extension reaction consisting of is performed.
- oligonucleotide (nucleic acid) having a desired sequence is synthesized by repeating the above synthesis cycle and advancing the extension reaction of the oligonucleotide from the 3' end to the 5' end. Finally, the cleavable linker is hydrolyzed with aqueous ammonia, methylamine solution, or the like, and the synthesized oligonucleotide (nucleic acid) is cleaved from the solid phase carrier and universal linker.
- nucleoside phosphoramidite nucleic acid monomer commonly used in the above conventional solid-phase phosphoramidite method has the following formula (A):
- B represents an optionally modified nucleobase.
- B is a group of nucleoside phosphoramidites represented by compounds represented by The feature here is that the hydroxyl group on the phosphorus atom is protected by a "cyanoethyl group”.
- the present inventors have also found that a linker having a simpler structure can be used as a universal linker in place of the linkers that are commonly used today.
- one embodiment of the present invention uses the following formula (I) as a nucleoside phosphoramidite for introducing a 3'-terminal nucleoside in solid-phase synthesis of an oligonucleotide using a universal linker:
- X is an optionally substituted alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group); optionally substituted cyclic group - oxy group, an optionally substituted alkyl group, represents an optionally substituted alkenyl group or an optionally substituted aryl group; Y represents a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group; Z 1 and Z 2 each independently represent an optionally substituted alkyl group, or Z 1 and Z 2 are bonded together to form an optionally substituted heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are bonded; R 1 is a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, or an optionally substituted represents an alkynyloxy group which may be R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl
- nucleotide derivative (I) A nucleotide derivative represented by (hereinafter also referred to as “nucleotide derivative (I)”) is first coupled to a universal linker, followed by an oligonucleotide elongation reaction to obtain formula (II):
- nucleotide derivative residue (II) An oligonucleotide having a nucleotide derivative represented by (hereinafter also referred to as "nucleotide derivative residue (II)" at the 3' end of the oligonucleotide sequence is obtained, and the obtained oligonucleotide is a solid phase support and A method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising cleaving from a universal linker.
- a step of supporting a nucleotide derivative represented by a solid phase support via a universal linker (2) A step of sequentially condensing nucleic acid monomers and extending nucleotides according to the target oligonucleotide sequence (here, as the nucleic acid monomer, one or more nucleotide derivatives represented by the above formula (I) may be used), (3) subjecting the obtained oligonucleotide having the desired sequence to a reaction for excision from the solid-phase support and the universal linker;
- a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising: [3] The cleavage reaction from the solid-phase carrier and the universal linker is performed on the solid-phase carrier on which the oligonucleotide is supported via the universal linker, 1) Contact with concentrated aqueous ammonia at room temperature to elevated temperature, 2) Contact
- Xa represents an optionally substituted (C 4 -C 5 )alkoxy group
- Y, Z 1 , Z 2 , R 1 to R 3 and Base are each defined as above.
- X 1 to X 4 each independently represent a hydrogen atom, a chain or cyclic substituent, and any two groups of X 1 to X 4 are at bondable positions optionally bonded to each other to form an optionally substituted ring with the carbon atom to which they are bonded; Y 1 and Y 2 represent a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group.
- a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides that enables excision of synthesized oligonucleotides (nucleic acids) even under mild conditions, and a novel nucleoside phosphor useful for carrying out the solid-phase synthesis method for oligonucleotides of the present invention.
- amidites and universal linkers of simple structure that are useful in carrying out solid phase synthesis methods for oligonucleotides of the invention.
- FIG. 1 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3a, CPG3e, CPG3g, CPG3b OMe and CPG3b LNA (conditions 1) to 3) in Example D1 below.
- FIG. 2 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3e-mix (Condition 1) and Condition 3) in Example D1 below.
- FIG. 3 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3e and CPG3g (Condition 4) in Example D1 described later.
- FIG. 1 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3a, CPG3e, CPG3g, CPG3b OMe and CPG3b LNA (conditions 1) to 3) in Example D1 below.
- FIG. 2 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from C
- FIG. 4 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3e and CPG3g (Condition 5) in Example D1 described later.
- FIG. 5 is an HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG1a and CPG1g/CPG2a and CPG2g in Example D2 below.
- the method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprises [1] An oligonucleotide synthesized by a nucleotide elongation reaction in a solid-phase oligonucleotide synthesis method, Formula (II) supported on a solid support via a universal linker:
- R Z represents O or S
- X is an optionally substituted alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group); optionally substituted cyclic group - oxy group, an optionally substituted alkyl group, represents an optionally substituted alkenyl group or an optionally substituted aryl group
- R 1 is a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, or a substituted represents an alkynyloxy group which may be
- R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group, an optionally substituted alkenyloxy group, or an optionally substituted
- a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising More specifically, [2] (1) Formula (I):
- Y represents a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group
- Z 1 and Z 2 each independently represent an optionally substituted alkyl group, or Z 1 and Z 2 are bonded together to form an optionally substituted heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are bonded
- X, R 1 to R 3 and Base are each defined as above.
- step (1) A step of supporting a nucleotide derivative represented by a solid phase carrier via a universal linker (hereinafter also referred to as "step (1)"), (2) A step of sequentially condensing nucleic acid monomers and extending nucleotides according to the target oligonucleotide sequence (here, as the nucleic acid monomer, one or more nucleotide derivatives represented by the above formula (I) may be used) (hereinafter also referred to as "step (2)”), (3) a step of subjecting the obtained oligonucleotide having the desired sequence to a cleavage reaction from the solid-phase carrier (hereinafter also referred to as "step (3)”); A method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising
- oligonucleotide having the desired sequence obtained in step (2) is "supported on a solid-phase carrier via a universal linker, formula (II)" in [1] above:
- step (1) A step of supporting a nucleotide derivative represented by a solid phase carrier via a universal linker (“step (1)”), and (2) sequentially condensing nucleic acid monomers according to the oligonucleotide sequence of interest.
- step (2) a step of elongating a nucleotide (here, one or more nucleotide derivatives represented by the above formula (I) may be used as the nucleic acid monomer) (“step (2)”); It can also be said to be a method for solid-phase synthesis of the oligonucleotide described in [1] above, which is obtained by the step comprising
- oligonucleotide means a chain compound in which nucleosides are linked by phosphodiester bonds, and includes DNA, RNA, and the like. Oligonucleotides (nucleic acids) may be either single-stranded or double-stranded, but are preferably single-stranded because efficient synthesis by an oligonucleotide (nucleic acid) synthesizer is possible.
- oligonucleotide (nucleic acid) includes only oligonucleotides containing purine bases such as adenine (A) and guanine (G) and pyrimidine bases such as thymine (T), cytosine (C) and uracil (U). Also included are modified oligonucleotides (nucleic acids) containing other modified heterocyclic bases.
- modified oligonucleotides (nucleic acids) include nucleosides linked by phosphorothioate bonds.
- sugar moiety of a nucleoside when modified, or when a crosslinked structure is formed between atoms constituting the sugar moiety (bridged nucleotide, BNA/LNA), it is also classified as "modified oligonucleotide (nucleic acid)". included.
- each group is as defined above.
- nucleic acid monomers are sequentially condensed (coupling) starting from the nucleotide derivative (I) according to the target oligonucleotide sequence. ) to extend the nucleotides and synthesize the desired oligonucleotide.
- each group of the nucleotide derivative (I) will be described below.
- halogen atom includes, for example, fluorine, chlorine, bromine, and iodine.
- alkyl group refers to a linear or branched saturated hydrocarbon group having 1 to 6 carbon atoms. is preferred.
- C 1-6 alkyl group includes, for example, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 1-ethylpropyl, hexyl, isohexyl, 1 , 1-dimethylbutyl, 2,2-dimethylbutyl, 3,3-dimethylbutyl and 2-ethylbutyl.
- alkenyl group refers to a hydrocarbon group having one or more straight or branched double bonds in the molecule. and those having 2 to 6 carbon atoms are preferred.
- C 2-6 alkenyl group includes, for example, ethenyl, 1-propenyl, 2-propenyl, 2-methyl-1-propenyl, 1-butenyl, 2-butenyl, 3-butenyl, 3-methyl-2- butenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 4-methyl-3-pentenyl, 1-hexenyl, 3-hexenyl and 5-hexenyl.
- alkynyl group refers to a straight or branched hydrocarbon group having one or more triple bonds in the molecule. No, those with 2 to 6 carbon atoms are preferred.
- C 2-6 alkynyl group includes, for example, ethynyl, 1-propynyl, 2-propynyl (propargyl), 1-butynyl, 2-butynyl, 3-butynyl, 1-pentynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl , 4-pentynyl, 1-hexynyl, 2-hexynyl, 3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl, 4-methyl-2-pentynyl.
- alkoxy group refers to a group having a structure in which the hydrogen atom of a hydroxy group is substituted with the above-mentioned "alkyl group", and carbon Numbers 1 to 6 are preferred.
- C 1-6 alkoxy group includes methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, sec-butoxy group, tert-butoxy group, n-pentyloxy group. , isopentyloxy group, sec-pentyloxy group, tert-pentyloxy group, hexyloxy group and the like.
- alkylthio group refers to a group having a structure in which the hydrogen atom of a thiol group is substituted with the above-mentioned "alkyl group", and carbon Numbers 1 to 6 are preferred.
- C 1-6 alkylthio group includes, for example, methylthio, ethylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, isobutylthio, sec-butylthio, tert-butylthio, pentylthio, isopentylthio, neopentylthio, 1-ethylpropyl thio, hexylthio, isohexylthio, 1,1-dimethylbutylthio, 2,2-dimethylbutylthio, 3,3-dimethylbutylthio, 2-ethylbutylthio;
- aryl group refers to an aromatic hydrocarbon ring group, preferably having 6 to 14 carbon atoms.
- C 6-14 aromatic hydrocarbon ring groups include phenyl, naphthyl and the like.
- cyclic group refers to a “hydrocarbon ring group” and a “heterocyclic group”.
- the "hydrocarbon ring group” includes, for example, an aromatic hydrocarbon ring group (preferably a C 6-14 aromatic hydrocarbon ring group having 6 to 14 carbon atoms), cycloalkyl (preferably C 3-10 cycloalkyl having 3 to 10 carbon atoms), cycloalkenyl (preferably C 3-10 cycloalkenyl having 3 to 10 carbon atoms).
- C 6-14 aromatic hydrocarbon ring group includes, for example, phenyl and naphthyl.
- C 3-10 cycloalkyl includes, for example, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl and cyclooctyl.
- C 3-10 cycloalkenyl includes, for example, cyclopropenyl, cyclobutenyl, cyclopentenyl, cyclohexenyl, cycloheptenyl and cyclooctenyl.
- the "heterocyclic group” includes, for example, (i) aromatic (ii) non-aromatic heterocyclic groups; and (iii) 7- to 10-membered heterocyclic bridged ring groups.
- aromatic heterocyclic group includes, for example, a ring-constituting atom selected from nitrogen, sulfur and oxygen atoms in addition to carbon atoms.
- aromatic heterocyclic group examples include thienyl, furyl, pyrrolyl, imidazolyl, pyrazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, oxazolyl, isoxazolyl, pyridyl, pyrazinyl, pyrimidinyl, pyridazinyl, 1,2,4-oxadiazolyl, 5- to 6-membered monocyclic aromatic heterocyclic groups such as , 3,4-oxadiazolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, 1,3,4-thiadiazolyl, triazolyl, tetrazolyl and triazinyl; Benzothiophenyl, benzofuranyl, benzimidazolyl, benzoxazolyl, benzisoxazolyl, benzothiazolyl, benzisothiazolyl, benzotriazolyl, imidazopyridinyl, thienopyri
- non-aromatic heterocyclic group includes, for example, a nitrogen atom, a sulfur atom and an oxygen atom in addition to carbon atoms as ring-constituting atoms.
- non-aromatic heterocyclic groups containing 1 to 4 heteroatoms selected from Preferable examples of the "non-aromatic heterocyclic group” include aziridinyl, oxiranyl, thiiranyl, azetidinyl, oxetanyl, thietanyl, tetrahydrothienyl, tetrahydrofuranyl, pyrrolinyl, pyrrolidinyl, imidazolinyl, imidazolidinyl, oxazolinyl, oxazolidinyl, pyrazolinyl, pyrazolidinyl, Thiazolinyl, thiazolidinyl, tetrahydroisothiazolyl, tetrahydrooxazolyl, tetrahydroisoxazolyl, piperidinyl, piperazinyl, tetrahydropyr
- preferred examples of the "7- to 10-membered heterocyclic bridged ring group” include quinuclidinyl and 7-azabicyclo[2.2.1]heptanyl.
- heterocyclic ring When Z 1 and Z 2 are bonded to each other to form an optionally substituted heterocyclic ring together with the nitrogen atom to which they are bonded, examples of the "heterocyclic ring" include The nitrogen-containing aromatic heterocycle and the nitrogen-containing non-aromatic heterocycle containing 1 to 4 nitrogen atoms and optionally containing 1 to 4 heteroatoms selected from a sulfur atom and an oxygen atom, respectively. ring.
- nitrogen-containing heteroaromatic ring examples include imidazole, pyrazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, 1,2,4-oxadiazole, 1,3,4-oxadiazole 5- to 6-membered monocyclic nitrogen-containing aromatic heterocycles such as azoles, 1,2,4-thiadiazoles, 1,3,4-thiadiazoles, triazoles, tetrazoles, triazines; benzimidazole, benzoxazole, benzisoxazole, benzothiazole, benzisothiazole, benzotriazole, imidazopyridine, thienopyridine, furopyridine, pyrrolopyridine, pyrazolopyridine, oxazolopyridine, thiazolopyridine, imidazopyrazine, imidazopyrimidine, thienopyrimidine , furopyrimidine,
- nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring examples include aziridine, pyrroline, pyrrolidine, imidazoline, imidazolidine, oxazoline, oxazolidine, pyrazoline, pyrazolidine, thiazoline, thiazolidine, tetrahydroisothiazole, tetrahydrooxazole. , tetrahydroisoxazole, piperidine, piperazine, tetrahydropyridine, dihydropyridine, tetrahydropyrimidine, tetrahydropyridazine, morpholine, thiomorpholine, etc.
- hydroxyl-protecting group represented by Y herein, those commonly used for protecting the 5'-hydroxyl group in oligonucleotide (nucleic acid) solid-phase synthesis can be used, and are not particularly limited to not. Examples include trityl-based protecting groups, silyl-based protecting groups, and acyl-based protecting groups.
- the "trityl-based protecting group” includes, for example, any substituent (e.g., a substituent selected from C 1-6 alkoxy group, C 1-6 alkyl group, halogen atom, etc.
- trityl group (Tr), a monomethoxytrityl group (e.g., a 4-methoxytrityl group ( MMTr)), dimethoxytrityl group (e.g., 4,4′-dimethoxytrityl group (DMTr)), 9-phenylxanthene-9-yl group (pixyl group), etc., preferably 4,4′-dimethoxy A trityl group (DMTr) can be mentioned.
- MMTr 4-methoxytrityl group
- DMTr dimethoxytrityl group
- DMTr 9-phenylxanthene-9-yl group
- pixyl group pixyl group
- silyl-based protecting group examples include a silyl group tri-substituted with an arbitrary substituent (for example, a substituent selected from a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkyl group, a phenyl group, etc. ).
- an arbitrary substituent for example, a substituent selected from a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkyl group, a phenyl group, etc.
- Specific examples include trimethylsilyl group, triethylsilyl group, isopropyldimethylsilyl group, tert-butyldimethylsilyl group, dimethylmethoxysilyl group, methyldimethoxysilyl group, tert-butyldiphenylsilyl group and the like, preferably , a trimethylsilyl group.
- acyl-based protective group examples include an acetyl group, a t-butoxycarbonyl group, a benzo
- the hydroxyl-protecting group that is eliminated by acid is preferably a trityl-based protecting group, such as a 4,4'-dimethoxytrityl group (DMTr), because deprotection by an acid is easy. is more preferred.
- DMTr 4,4'-dimethoxytrityl group
- the term “optionally substituted” means unsubstituted or substituted at a position substitutable with 1 to 3 substituents. In the case of 2 or 3 substitutions, each substituent may be the same or different. As used herein, the term “substituted” means a mode of being substituted at positions substitutable by 1 to 3 substituents. In the case of 2 or 3 substitutions, each substituent may be the same or different.
- Optionally substituted alkoxy group Optionally substituted cyclic group-oxy group
- Optionally substituted alkyl group Optionally substituted alkenyl group
- Substituted Substituents that may be possessed by each group of the nucleotide derivative (I) such as an optionally substituted alkynyl group and an optionally substituted aryl group include, for example, halogen atoms (e.g.
- an alkyl group eg, a C 1-6 alkyl group
- an alkoxy group eg, a C 1-6 alkoxy group
- alkoxy-alkoxy groups eg, C 1-6 alkoxy-C 1-6 alkoxy groups (eg, methoxy-methoxy, methoxy-ethoxy, ethoxy-ethoxy, etc.)
- an aralkyloxy group eg, a C 7-16 aralkyloxy group (eg, benzyloxy)
- Protected hydroxyl groups e.g., C 1-6 alkyl-carbonyloxy groups (e.g., acetoxy, propanoyloxy), C 6-14 aryl-carbonyloxy groups (e.g., benzoyloxy, 1-naphthoyloxy, 2-naphthoyloxy) yloxy), C 1-6 alkoxy-carbony
- aryl-carbamoyloxy groups e.g. methylcarbamoyloxy, ethylcarbamoyloxy, dimethylcarbamoyloxy, diethylcarbamoyloxy), C 6-14 aryl-carbamoyloxy groups (eg, phenylcarbamoyloxy, naphthylcarbamoyloxy), etc.); aryl groups (eg, C 6-14 aryl group); protected amino groups (e.g., acylamino groups (e.g., formylamino groups, C 1-10 alkyl-carbonylamino groups (e.g., acetylamino), C 2-6 alkenyl-carbonylamino groups (e.g., crotonoylamino), C 3-10 cyclo
- acylamino groups e.g., formylamino groups, C 1-10 alkyl-carbonylamino groups (e.g
- cyclopropylcarbamoylamino mono- or di-C 6-14 aryl-carbamoylamino group (e.g., phenylcarbamoylamino), mono- or di-C 7-16 aralkyl-carbamoylamino group, 5- to 14-membered aromatic heterocyclic carbamoylamino group (e.g., pyridyl carbamoylamino), thiocarbamoylamino group, mono- or di-C 1-6 alkyl-thiocarbamoylamino group (e.g.
- methylthiocarbamoylamino, N-ethyl-N-methylthiocarbamoylamino), mono- or di-C 2- 6 alkenyl-thiocarbamoylamino group e.g. diallylthiocarbamoylamino
- mono- or di-C 3-10 cycloalkyl-thiocarbamoylamino group e.g. cyclopropylthiocarbamoylamino, cyclohexylthiocarbamoylamino
- mono- or di-C 6-14 aryl-thiocarbamoylamino group e.g.
- phenylthiocarbamoylamino mono- or di-C 7-16 aralkyl-thiocarbamoylamino group (e.g. benzylthiocarbamoylamino, phenethylthiocarbamoylamino), 5- to 14-membered aromatic heterocyclic thiocarbamoylamino group (eg, pyridylthiocarbamoylamino); C 1-6 alkylamino group (eg, methylamino); N,N-di-C 1-6 alkylamino group (eg, , N,N-dimethylamino), C 3-10 cycloalkylamino group (eg, cyclopropylamino); C 6-14 arylamino group (eg, phenylamino), etc.),
- the protected amino group is more preferably an acylamino group, still more preferably a formylamino group or a C
- mono- or di-allylcarbamoyl mono- or di-C 3-10 cycloalkyl-carbamoyl group (e.g. cyclopropylcarbamoyl, cyclohexylcarbamoyl), mono- or di-C 6-14 aryl -carbamoyl group (e.g. phenylcarbamoyl), mono- or di-C 7-16 aralkyl-carbamoyl group, mono- or di-C 1-6 alkyl-carbonyl-carbamoyl group (e.g.
- the optionally substituted carbamoyl group is more preferably a carbamoyl group or a mono- or di-C 1-10 alkyl-carbamoyl group, still more preferably a carbamoyl group or a C 1-10 alkyl-carbamoyl group. ; etc.
- Optionally substituted alkoxy group "optionally substituted alkyl group”, “optionally substituted alkenyloxy group”, and “optionally substituted alkynyloxy group” of nucleotide derivative (I)
- group “alkoxy group” , “alkyl group”
- the sum of the carbon atoms of the constituent moieties other than -CONH- (or -NHCO-) is preferably 1-10.
- nucleobase is not particularly limited as long as it is used for synthesis of oligonucleotides (nucleic acids).
- groups, guanyl groups, and modified nucleobases thereof 8-bromoadenyl group, 8-bromoguanyl group, 5-bromocytosyl group, 5-iodocytosyl group, 5-bromouracil group, 5-iodouracil group, 5- fluorouracil group, 5-methylcytosyl group, 8-oxoguanyl group, hypoxanthinyl group and the like.
- nucleobase may be, for example, an adenyl group, a guanyl group and a cytosyl group, or an amino group of a modified nucleobase may be protected.
- Specific examples include benzoyl, 4-methoxybenzoyl, acetyl, propionyl, butyryl, isobutyryl, phenylacetyl, phenoxyacetyl, 4-tert-butylphenoxyacetyl, 4-isopropylphenoxyacetyl. etc. may be protected.
- X is as defined above, but preferably an optionally substituted C 1-6 alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group), an optionally substituted C 6-14 aryl-oxy group, an optionally substituted C 3-10 cycloalkyl-oxy group, an optionally substituted 3- to 14-membered non-aromatic heterocyclic-oxy group, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, an optionally substituted C 2-6 alkenyl group or an optionally substituted C 6-14 aryl group, More preferably a C 1-6 alkoxy group optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxy-C 1-6 alkoxy group and a C 7-16 alkoxy group; , a C 6-14 aryl-oxy group optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkyl group, a C cyanoethoxy group), an optionally substituted C 6-14 aryl-oxy group
- Y is as defined above, but preferably a hydrogen atom or an optionally substituted trityl-based protecting group, More preferably a trityl group, a monomethoxytrityl group (e.g., 4-methoxytrityl group), or a dimethoxytrityl group (e.g., 4,4'-dimethoxytrityl group); Most preferably It is a dimethoxytrityl group.
- Z 1 and Z 2 are each independently as defined above, but preferably an optionally substituted C 1-6 alkyl group, or Z 1 and Z 2 are bonded together to form an optionally substituted nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are attached; More preferably Z 1 and Z 2 are each independently a C 1-6 alkyl group, or Z 1 and Z 2 are joined together to form a 3- to 8-membered monocyclic nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are attached.
- R 1 is as defined above, but preferably a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, an optionally substituted C 1-6 alkoxy group, an optionally substituted C 2-6 alkenyloxy group or an optionally substituted C 2-6 alkynyloxy group, More preferably hydrogen atom, halogen atom, hydroxyl group, a C 1-6 alkyl group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a protected amino group and an optionally substituted carbamoyl group, a C 1-6 alkoxy group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a protected amino group and an optionally substituted carbamoyl group; a C alkenyloxy group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a
- R 2 is as defined above, but preferably a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, an optionally substituted C 1-6 alkoxy group, an optionally substituted C 2-6 alkenyloxy group or an optionally substituted C 2-6 alkynyloxy group, More preferably hydrogen atom, halogen atom, hydroxyl group, a C 1-6 alkyl group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a protected amino group and an optionally substituted carbamoyl group, a C 1-6 alkoxy group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a protected amino group and an optionally substituted carbamoyl group; a C alkenyloxy group optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a
- R 3 is as defined above, but preferably a hydrogen atom, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, an optionally substituted C 1-6 alkoxy group, or an optionally substituted C 1-6 alkylthio group, More preferably It is a hydrogen atom, a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, or a C 1-6 alkylthio group.
- R 2 and R 3 are bonded together to form the following formula (shown in the order -R 2 -R 3 -): -O-C(Ra) 2 -, -OC(Rb) 2 -C(Rc) 2 -, -OC(Rd) 2 -O-, -N(Re)-C(Rf) 2 - , -N(Rg)-CO-, -SC(Rh) 2 -, or -C(Ri) 2 -C(Rj) 2 - (In the above formula, Ra to Rj each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group.) To form a group represented by, more preferably, The following formulas (shown in the order -R 2 -R 3 -): -O-C(Ra) 2 -, -OC(Rb) 2 -C(Rc) 2 -, -OC(Rd) 2 -O-, -N(Re)-C(
- Base is a nucleobase that may be modified.
- nucleotide derivative (I) of the present invention when X is an optionally substituted (C 4 -C 5 )alkoxy group, the nucleotide derivative (I) is a novel compound.
- nucleotide derivative (I) of the present invention can be produced by appropriately applying the specific methods described in Examples/Production Examples below or methods known in the art. Moreover, when the nucleotide derivative (I) is commercially available, a commercial product may be used.
- nucleotide derivatives (I) are described below.
- X is an optionally substituted C 1-6 alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group); an optionally substituted C 6-14 aryl-oxy group, an optionally substituted C 3-10 cycloalkyl-oxy group, an optionally substituted 3- to 14-membered non-aromatic heterocyclic-oxy group, an optionally substituted C 1-6 alkyl group, an optionally substituted C 2-6 alkenyl group or an optionally substituted C 6-14 aryl group;
- Y is a hydrogen atom or an optionally substituted trityl-based protecting group;
- Z 1 and Z 2 are each independently an optionally substituted C 1-6 alkyl group, or Z 1 and Z 2 are bonded together to form an optionally substituted nitrogen-containing non-aromatic heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are bonded;
- R 1 is hydrogen atom, halogen atom, optionally protected
- X is C 1- optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkoxy group, a C 1-6 alkoxy-C 1-6 alkoxy group and a C 7-16 alkoxy group ; 6 alkoxy groups, a C 6-14 aryl-oxy group optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group and a protected hydroxyl group; a C 3-6 cycloalkyl-oxy group optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group and a protected hydroxyl group; a 5- or 6-membered non-aromatic heterocyclic-oxy group optionally substituted with 1 to 3 substituents selected from a C 1-6 alkyl group, a C 1-6 alkoxy group, and a protected hydroxyl group; a C 1-6 alkyl group optionally substituted
- X is a C 1-6 alkoxy group, a C 6-14 aryl-oxy group, a C 3-6 cycloalkyl-oxy group, 5- or 6-membered non-aromatic heterocyclic-oxy group, C 1-6 alkyl group, a C 2-6 alkenyl group or a C 6-14 aryl group (more preferably a C 1-6 alkoxy group, a phenyl-oxy group, or a C 1-6 alkyl group);
- R 1 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, C 1-6 alkyl group, C 1 optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a formylamino group, a C 1-10 alkyl-carbonylamino group, a carbamoyl group and a C 1-10 alkyl-carbamoyl group -6 alkoxy group, a C 2-6 alkenyloxy group, or a C 2-6 alkynyloxy group;
- R 2 is a hydrogen atom, a halogen atom, a hydroxyl group, C 1-6 alkyl group, C 1 optionally substituted with a group selected from a cyano group, a C 1-6 alkoxy group, a formylamin
- nucleotide derivative residues (II) those mentioned above for nucleotide derivative (I) are referred to.
- the nucleotide derivative (I) is supported on a solid phase carrier via a universal linker, more specifically, (Solid phase carrier (SM))-(Spacer (L))-(Universal linker (UL))-(Nucleotide derivative (I)) (hereinafter also referred to as “solid phase carrier linkage-nucleotide derivative (I)”) Nucleotide derivative (I) is linked to the solid support via covalent bond in the manner shown in .
- a spacer is not essential when the universal linker can be directly linked to the solid support.
- the (solid phase carrier (SM))-(spacer (L))-(universal linker (UL)) linkage is sometimes simply referred to as "solid phase carrier”.
- the "solid-phase carrier” (also referred to as "SM”) is not particularly limited as long as it is a carrier for solid-phase synthesis from which excess reagents can be easily removed by washing.
- examples include porous carriers, porous polymer carriers such as polystyrene-based porous carriers and acrylamide-based porous carriers, and the like, preferably polystyrene-based porous carriers and glass-based porous carriers.
- glass-based porous carrier refers to a porous carrier containing glass as a constituent component, and examples thereof include, but are not limited to, particle-shaped porous glass particles (CPG). More specifically, as the CPG, a CPG solid-phase carrier having a long-chain aminoalkyl spacer (LCAA-CPG solid-phase carrier) is preferably used. A CPG with pores of 20 to 400 nm, preferably 50 to 200 nm, and even more preferably 100 nm is used.
- CPG particle-shaped porous glass particles
- polystyrene-based porous carrier refers to a porous carrier mainly composed of a resin composed of structural units of styrene or derivatives thereof. Porous carriers are preferred.
- polystyrene-based porous carriers examples include porous carriers made of styrene-hydroxystyrene-divinylbenzene-based copolymer particles (see JP-A-2005-097545, JP-A-2005-325272 and JP-A-2006-342245), or Examples thereof include a porous carrier comprising a styrene-(meth)acrylonitrile-hydroxystyrene-divinylbenzene copolymer (see JP-A-2008-074979).
- acrylamide-based porous carrier refers to a porous carrier mainly composed of a resin composed of structural units of acrylamide or a derivative thereof.
- a porous carrier is preferred, and an acrylamide-based porous carrier having a hydroxyl group is preferred.
- the acrylamide-based porous carrier includes, for example, a porous carrier composed of an aromatic monovinyl compound-divinyl compound-(meth)acrylamide derivative-based copolymer.
- a porous carrier composed of an aromatic monovinyl compound-divinyl compound-(meth)acrylamide derivative-based copolymer.
- the support is an acrylamide-based solid-phase support, if the content of the structural unit derived from the (meth)acrylamide derivative monomer is too low, the effect of avoiding a decrease in the amount of nucleic acid synthesized and a decrease in synthesis purity is obtained. On the other hand, if it is too large, it is difficult to form porous resin beads. Therefore, it is preferably 0.3 to 4 mmol/g, more preferably 0.4 to 3.5 mmol/g, still more preferably 0.6 to 3 mmol/g.
- the solid phase carrier may be a solid phase carrier having a functional group capable of forming a covalent bond with a spacer (cleavable linker).
- a solid phase carrier having an amino group and/or a hydroxyl group is preferred.
- the bond between the solid support (SM) and spacer (L) is, for example, an amide bond or an ester bond.
- the content of the functional group in the solid-phase carrier is not particularly limited. If the content of the functional group is too high, the purity of the obtained oligonucleotide (nucleic acid) will be lowered. A person skilled in the art can appropriately select a suitable content.
- a “spacer” (also denoted as “L”) is a molecule that connects a universal linker and a solid-phase carrier via a covalent bond.
- the spacer is preferably cleavable so that the product can be efficiently cleaved from the solid-phase support in the final step of solid-phase synthesis, and is particularly hydrolyzable by an alkaline solution such as aqueous ammonia or methylamine solution. It is more preferable to have Any known spacer used in the art for solid phase synthesis of oligonucleotides can also be used in the practice of the present invention.
- Spacer is as defined above, but preferably has formula (III):
- the binding site indicates the binding site, respectively.
- ] is a divalent group represented by
- the structure of the spacer is an asymmetric structure, either the left or right binding site may bind to the nucleotide derivative (I) of the present invention.
- the "inert” of the “inert divalent group” indicates that it does not have a functional group that inhibits a solid-phase synthesis reaction such as a hydroxyl group, an amino group, a carboxyl group, a sulfanyl group, a sulfo group, or the like. .
- the "inert divalent group” La more preferably has a main chain of atoms selected from carbon atoms, oxygen atoms, sulfur atoms and nitrogen atoms (for example, 1 to 200, preferably 1 to 150 1 to 100, more preferably 1 to 50, still more preferably 1 to 10, and particularly preferably 1 to 5).
- La is preferably -CH 2 OC 6 H 4 OCH 2 -, -CH 2 CH 2 -, or -CH 2 CH 2 CH 2 -, more preferably -CH 2 OC 6 H 4 OCH 2 - or -CH 2 CH 2 -.
- the length of the spacer is not particularly limited, and can be appropriately set according to the chain length of the target oligonucleotide (nucleic acid) sequence.
- the "universal linker” (also referred to as "UL") is linked to the solid-phase carrier via a covalent bond or a spacer, and is used as a starting point for synthesizing the oligonucleotide of interest on the solid-phase carrier.
- UL is a linker.
- this universal linker regardless of the type of nucleoside at the 3' end of the target oligonucleotide, the 3' end nucleoside phosphoramidite can be reacted in the same process as in normal automated nucleic acid synthesis.
- the desired oligonucleotide can be obtained by excising it from the solid-phase carrier in the same manner as usual.
- the universal linker used in the present invention is not particularly limited, and may be the universal linker disclosed or cited in JP-A-2011-088843, or the universal linker disclosed in JP-A-2016-204316. you can Alternatively, it may be a commercially available universal support in which a universal linker is linked to a solid support. More specifically, for example, Unilinker (trade name) universal support for oligonucleotide synthesis from Chem Genes, Universal Syn Base (trade name) and Universal Q Syn Base (trade name) from Biosearch Technologies, and Glen Research's Universal supports I, II, and III, etc. are used.
- solid phase support-linked-nucleotide derivative (I) can be obtained by using the specific methods described in Examples/Production Examples below or methods known in the art as appropriate. can be applied and manufactured by those skilled in the art.
- a universal linker (UL) a group represented by HO-L- is reacted with the corresponding acid anhydride to introduce a spacer, in a solvent, in the presence of a condensing agent and a base, a solid support
- SM solid phase support
- L spacer
- UL universal linker
- the first (3′-terminal) nucleotide can be attached to a universal linker (UL) to produce a “solid support-linked-nucleotide derivative (I)”.
- a universal linker UL
- solid support-linked-nucleotide derivative I
- the commercial product may be used.
- step (2) nucleic acid monomers are sequentially condensed according to the oligonucleotide sequence of interest, starting from the nucleotide derivative (I) of "solid support-linked nucleotide derivative (I)" obtained in step (1). It is a step of extending the nucleotide by allowing the In addition, in “solid phase carrier linkage-nucleotide derivative (I)", the nucleotide derivative (I) specifically takes the form of "nucleotide derivative residue (II)".
- nucleic acid monomer is a nucleoside phosphoramidite appropriately selected according to the oligonucleotide sequence, and specific methods described in Examples/Production Examples below and methods known in the art can be applied as appropriate for production. Moreover, when the said "nucleic acid monomer” is marketed, you may use a commercial item. For example, formula (A) below:
- nucleic acid monomers A group of nucleoside phosphoramidites represented by compounds represented by Here, one or more "nucleotide derivatives (I)" of the present invention may be used as nucleic acid monomers.
- the nucleotide elongation reaction in step (2) consists of step A: deprotection step of the 5' hydroxy group of the nucleotide (including the case of the 3' terminal nucleotide derivative (I)) - step B: nucleic acid monomer (phosphoramidite )-Step C: The step of oxidizing/sulfurizing the nucleotide ligation site can be sequentially repeated one or more times depending on the desired nucleic acid sequence to obtain an oligonucleotide having the desired sequence.
- Each step A to C can be carried out by a person skilled in the art by appropriately applying specific methods described in Examples/Production Examples below or methods known in the art.
- Step (3) is a step of subjecting the obtained oligonucleotide having the desired sequence to a reaction for excision from the solid support.
- the cleavage reaction in this step can be carried out by those skilled in the art by appropriately applying specific methods described in Examples/Production Examples below or methods known in the art.
- the oligonucleotide-bound solid support is treated with ammonia, amines and/or a base to recover the oligonucleotide of the desired sequence.
- Ammonia includes concentrated aqueous ammonia.
- Amines include, for example, alkylamines (methylamine, ethylamine, isopropylamine, ethylenediamine, diethylamine, triethylamine, etc.).
- Bases include metal carbonates such as potassium carbonate.
- Ammonia, amines and/or bases can be used singly or in combination of two or more. Ammonia, amines, and/or bases are desirably used in combination with a solvent. Examples of solvents include water, alcohols (eg, methanol, ethanol, etc.), and the like. Two or more of these solvents may be mixed in an appropriate ratio and used.
- the step (3) is performed by flowing a solution of ammonia, amines, and/or a base into a column loaded with a solid-phase carrier to which oligonucleotides are bound so that the oligonucleotides are bound. It is carried out by bringing it into contact with a solid phase carrier that has
- the reaction temperature is appropriately selected according to the reaction conditions and is not particularly limited, but the reaction is usually carried out in the range of room temperature to heating.
- the reaction time is appropriately selected according to the reaction conditions and is not particularly limited, but is usually carried out within the range of 1 minute to 10 hours.
- the excision reaction in step (3) of the present invention is preferably performed on a solid-phase carrier on which an oligonucleotide is supported via a universal linker, 1) Contact with concentrated ammonia water at room temperature to under heating, 2) contacting a mixed solution of concentrated alkylamine aqueous solution/concentrated ammonia water at room temperature to heating; 3) Contacting an alcohol solution of potassium carbonate at room temperature to heating, or 4) Contacting a mixed solution of alkylamine/water or alkylamine/water/alcohol at room temperature to heating, performed by More preferably, an oligonucleotide is supported on a solid-phase carrier via a universal linker, 1) contact with 28% aqueous ammonia at room temperature; 2) contacting a 1:1 mixed solution (AMA solution) of 40% aqueous methylamine solution/28% aqueous ammonia at room temperature; 3) Contact with a methanol solution of 50 mM potassium carbonate at room temperature, or 4) Contact with a mixed solution of t
- nucleotide derivative (I) as the 3′-terminal nucleotide in oligonucleotide synthesis, efficient cleavage can be achieved not only under general cleavage conditions but also under mild conditions such as extremely basic conditions. It has the characteristic that the target oligonucleotide can be excised at the same time. This point will be specifically described in Examples below.
- X 1 to X 4 each independently represent a hydrogen atom, a chain or cyclic substituent, and any two groups of X 1 to X 4 are at bondable positions. optionally bonded to each other to form an optionally substituted ring with the carbon atom to which they are bonded; Y 1 and Y 2 represent a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group.
- a 1,2-diol derivative represented by hereinafter also referred to as "1,2-diol derivative (III)
- each group of the 1,2-diol derivative (III) is described below.
- Examples of the "chain-like or cyclic substituent” include the “alkyl group”, “alkenyl group”, “alkynyl group” and “alkoxy group” described above for the nucleotide derivative (I) as the “chain-like substituent”.
- the above-mentioned "cyclic group” can be mentioned as the "cyclic substituent”.
- each group may be substituted.
- a “heterocyclic ring” is mentioned as the ring in the "optionally substituted ring".
- heterocyclic ring includes, for example, an aromatic heterocyclic ring and a non-aromatic ring containing 1 to 4 hetero atoms selected from nitrogen atoms, sulfur atoms and oxygen atoms in addition to carbon atoms as ring-constituting atoms. Heterocycles are included.
- aromatic heterocyclic ring includes, for example, a 5- to 14-membered (preferably 5 to 10-membered, more preferably 5- to 6-membered) aromatic heterocycles.
- aromatic heterocycle examples include thiophene, furan, pyrrole, imidazole, pyrazole, thiazole, isothiazole, oxazole, isoxazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, 1,2,4-oxazide 5- to 6-membered monocyclic aromatic heterocycles such as azoles, 1,3,4-oxadiazoles, 1,2,4-thiadiazoles, 1,3,4-thiadiazoles, triazoles, tetrazoles and triazines.
- non-aromatic heterocyclic ring includes, for example, 3 to 14-membered heteroatoms (preferably 4- to 10-membered, more preferably 5- to 6-membered) non-aromatic heterocycles.
- the "non-aromatic heterocycle” include aziridine, oxirane, thiirane, azetidine, oxetane, thietane, tetrahydrothiophene, tetrahydrofuran, pyrroline, pyrrolidine, imidazoline, imidazolidine, oxazoline, oxazolidine, pyrazoline, pyrazolidine, thiazoline , thiazolidine, tetrahydroisothiazole, tetrahydrooxazole, tetrahydroisoxazole, piperidine, piperazine, tetrahydropyridine, dihydropyridine, dihydrothiopyran,
- hydroxyl-protecting group examples include the “hydroxyl-protecting group” described above for the nucleotide derivative (I).
- Preferred specific examples of each of the above groups and the substituents with which each group may be substituted include those described for the nucleotide derivative (I).
- each group of the 1,2-diol derivative (III) are as follows.
- X 1 to X 4 are each independently a hydrogen atom, or Any two groups of X 1 to X 4 (preferably two groups present on adjacent carbon atoms) are bonded to each other at bondable positions and are substituted together with the carbon atoms to which they are bonded.
- Y 1 is a hydrogen atom or a trityl-based protecting group (more preferably a 4,4'-dimethoxytrityl group);
- Y2 is a hydrogen atom.
- Another preferred embodiment of the invention includes the following.
- [1-A] An oligonucleotide synthesized by a nucleotide elongation reaction in a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides and supported on a solid-phase support via a universal linker, formula (II):
- R Z represents O or S
- X is an optionally substituted alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group); optionally substituted cyclic group - oxy group, an optionally substituted alkyl group, represents an optionally substituted alkenyl group or an optionally substituted aryl group
- R 1 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted alkoxy group
- R2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted alkoxy group
- R3 represents a hydrogen atom, an optionally substituted an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted alkoxy group, or an optionally substituted alkyl
- a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising: [2-A] (1) Formula (I):
- X is an optionally substituted alkoxy group (excluding a cyanoethoxy group), an optionally substituted cyclic group-oxy group, an optionally substituted alkyl group, represents an optionally substituted alkenyl group or an optionally substituted aryl group;
- Y represents a hydrogen atom or a hydroxyl-protecting group;
- Z 1 and Z 2 each independently represent an optionally substituted alkyl group, or Z 1 and Z 2 are bonded together to form an optionally substituted heterocyclic ring with the nitrogen atom to which they are bonded;
- R 1 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted alkoxy group;
- R2 represents a hydrogen atom, a halogen atom, an optionally protected hydroxyl group, an optionally substituted alkyl group, or an optionally substituted alkoxy group, and
- R3 represents a hydrogen atom,
- a step of supporting a nucleotide derivative represented by a solid phase support via a universal linker (2) A step of sequentially condensing nucleic acid monomers and elongating nucleotides according to the target oligonucleotide sequence (here, as the nucleic acid monomer, one or two or more nucleotide derivatives represented by the above formula (I) may be used), (3) subjecting the obtained oligonucleotide having the desired sequence to a reaction for excision from the solid phase support and the universal linker;
- a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides comprising: [3-A] The cleavage reaction from the solid-phase support and the universal linker is performed on the solid-phase support on which the oligonucleotide is supported via the universal linker, 1) Contact with concentrated aqueous ammonia at room temperature to elevated temperature, 2) Contact with a mixed solution of concentrated alkylamine aqueous solution/concentrated ammonia water at room temperature to
- nucleotide derivative 3a Commercially available products (purchased from Glen Research) were used for the nucleotide derivative 3a, compound 3g, and nucleotide derivative 3h. 2. Nucleotide derivatives 3b-3f were synthesized by the following method.
- Preparation A1 Synthesis of Compound 2 Synthesized according to the reported literature (Bioconjugate Chem., 2008, 19, 1696-1706). Diisopropylethylamine (2.40 mL, 13.2 mmol) was added to a solution of commercially available compound 1 (3.00 g, 5.51 mmol) in anhydrous dichloromethane (20 mL) under an argon stream. Bis(diisopropylamino)chlorophosphine (1.56 g, 6.61 mmol) was added at 0° C. and stirred at room temperature for 1.5 hours.
- Example A1 Synthesis of Nucleotide Derivative 3b Synthesized according to the reported literature (Bioorg. Med. Chem. Lett., 2015, 25, 3610-3615.). Diisopropylethylamine (40.5 ⁇ L, 0.232 mmol) and ethanol (13.5 ⁇ L, 0.232 mmol) were added to a solution of compound 2 (150 mg, 0.194 mmol) in anhydrous acetonitrile (2 mL) under an argon stream. Ethylthiotetrazole (30.2 mg, 0.232 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour.
- Example A2 Synthesis of Nucleotide Derivative 3c Under an argon stream, diisopropylethylamine (40.5 ⁇ L, 0.232 mmol) and isopropanol (17.9 ⁇ L, 0 .232 mmol) was added. Ethylthiotetrazole (30.2 mg, 0.232 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours. The mixture was diluted with ethyl acetate, the organic layer was washed twice with water and once with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
- Example A3 Synthesis of Nucleotide Derivative 3d Under an argon stream, diisopropylethylamine (40.5 ⁇ L, 0.232 mmol) and 2-methylpropanol (21. 5 ⁇ L, 0.232 mmol) was added. Ethylthiotetrazole (30.2 mg, 0.232 mmol) was added and stirred at room temperature for 1 hour. The mixture was diluted with ethyl acetate, the organic layer was washed twice with water and once with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
- Example A4 Synthesis of Nucleotide Derivative 3e Under an argon stream, diisopropylethylamine (54.1 ⁇ L, 0.310 mmol) and 2,2-dimethyl-1 were added to a solution of compound 2 (200 mg, 0.258 mmol) in anhydrous acetonitrile (2 mL). -propanol (27.3 mg, 0.310 mmol) was added. Ethylthiotetrazole (40.4 mg, 0.310 mmol) was added and stirred at room temperature for 2 hours.
- Example A5 Synthesis of Nucleotide Derivative 3f Synthesized according to the reported literature (J. Org. Chem., 1995, 60, 925-930.). Diisopropylethylamine (270 ⁇ L, 1.55 mmol) and phenol (70.0 mg, 0.774 mmol) were added to a solution of compound 2 (500 mg, 0.645 mmol) in anhydrous acetonitrile (6 mL) under an argon stream. Ethylthiotetrazole (101 mg, 0.774 mmol) was added and stirred at room temperature for 3 hours.
- reaction mixture was quenched by adding a 5% aqueous sodium hydrogencarbonate solution and diluted with ethyl acetate.
- the organic layer was washed twice with water and once with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
- Example A6 Synthesis of Nucleotide Derivative 3b OMe Under an argon stream, a solution of compound 5 (600 mg, 0.759 mmol) in anhydrous acetonitrile (5 mL) was added with diisopropylethylamine (0.16 mL, 0.911 mmol) and ethanol (53 ⁇ L, 0.759 mmol). 911 mmol) was added. Ethylthiotetrazole (119 mg, 0.911 mmol) was added and stirred at room temperature for 2.5 hours.
- Example A7 Synthesis of Nucleotide Derivative 3b LNA
- diisopropylethylamine 28.6 ⁇ L, 0.164 mmol
- ethanol 9.6 ⁇ L, 0.164 mmol
- Ethylthiotetrazole (21.3 mg, 0.164 mmol) was added and stirred at room temperature for 4 hours. After diluting with ethyl acetate, the organic layer was washed twice with water and once with saturated brine, dried over sodium sulfate, and the solvent was distilled off under reduced pressure.
- DMTr 4,4′-dimethoxytrityl group
- CPG is controlled pore glass
- HBTU 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1, 3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate is shown respectively.
- Example B1 Preparation of CPG1 Solid-phase carrier lcaa-CPG (Amino-SynBase TM CPG1000/110 (LCAA), manufactured by Biosearch Technologies) (200 mg, amino group content: 11.2 ⁇ mol) was added to anhydrous acetonitrile (1 mL) under an argon stream. ) suspension, diisopropylethylamine (3.80 ⁇ L, 22.4 ⁇ mol), HBTU (4.25 mg, 11.2 ⁇ mol) and synthesized according to the literature (Bioorganic & Med. Chem., 1997, 5, 2235-2243.) Compound 8 (5.20 mg, 11.2 ⁇ mol) was added.
- Example B2 Preparation of CPG2
- CPG2 was solid-phased using compound 9 (5.36 mg, 11.2 ⁇ mol) synthesized according to the literature (Nucleic Acids Res., 1987, 15, 3113-3129.).
- a carrier was synthesized.
- the amount of compound 9 carried by CPG2 was quantified by DMTr assay and found to be 33 ⁇ 0.9 mol/g.
- DMTr assay method by treating the solid phase support with a deblocking solution (3 w/v% trichloroacetic acid in dichloromethane) and measuring the amount of deprotected DMTr (dimethoxytrityl) groups by absorbance measurement (504 nm). , a method for indirectly quantifying the amount supported.
- Oligonucleotide Oligonucleotides were synthesized using GeneDesign nS-8II Oligonucleotides Synthesizer (manufactured by GeneDesign) according to the usual phosphoramidite method. The synthesis scale was 0.2 ⁇ mol, and the trityl OFF condition was used.
- Commercial T phosphoramidites (same as compound 3g), commercial Ac C phosphoramidites, commercial Pac A phosphoramidites, and commercial iPrPac G phosphoramidites were prepared as 0.1 M anhydrous acetonitrile solutions. It was prepared and used.
- CE is a 2-cyanoethyl group
- T is a thyminyl group
- U is a uracil group
- C Ac is an N-acetylcytosyl group
- a Pac is an N- Phenoxyacetyladenyl group
- G iPrPac represent N-(4-isopropylphenoxyacetyl)guanyl group respectively (where thyminyl group, uracil group, cytosyl group, adenyl group and guanyl group are thymine monovalent group, uracil monovalent groups, cytosine monovalent groups, adenine monovalent groups, and guanine monovalent groups, respectively).
- T, C Ac , A Pac , and G iPrPac are described as nucleic acid monomers constituting an oligonucleotide sequence, they mean deoxyribonucleotides in which each said nucleic acid base is bound to deoxy-D-ribose.
- U when U is described as a nucleic acid monomer constituting an oligonucleotide sequence, it means a ribonucleotide in which the nucleic acid base is bound to D-ribose.
- Example C1 Synthesis of CPG3a-h, CPG3bOMe , CPG3bLNA , and CPG3e-mix
- Commercially available CPG3 Universal Support manufactured by Glen Research
- Example C2 Synthesis of CPG1a and g/CPG2a and g Below is an outline of the synthetic scheme and the structures of the synthesized oligonucleotides.
- CPG1a and g Using CPG1 synthesized according to Example B1 as a solid-phase carrier, T-10mer oligonucleotides (CPG1a and CPG1g) introduced with nucleotide derivative 3a or compound 3g at the 3' end were synthesized by an automatic DNA synthesizer.
- CPG2a and g Using CPG2 synthesized according to Example B2 as a solid phase carrier, T-10mer oligonucleotides (CPG2a and CPG2g) were synthesized in the same manner as for CPG1a.
- Example D1 Cleavage from CPG3a-h, CPG3b OMe , CPG3b LNA and CPG3e-mix An overview of oligonucleotide excision is provided below.
- T 10 is the T-10mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 1); T 10 -adduct is an oligonucleotide in a state in which a universal linker is not cleaved and bound to a T-10mer oligonucleotide; T 9 UOMe is a T-9mer- UOMe oligonucleotide (SEQ ID NO: 2); T 9 U OMe -adduct is an oligonucleotide in a state in which a universal linker is not cleaved and bound to a T-9mer-U OMe oligonucleotide; T 9 T LNA is a T-9mer-T LNA oligonucleotide (SEQ ID NO: 3), and mix-12mer is a 12-mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 1); T 10 -adduct is an oligonucleotide in a state in which a universal linker is not
- HPLC charts showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3a, CPG3e, CPG3g, CPG3b OMe and CPG3b LNA are shown in FIG.
- An HPLC chart showing the results of excision of oligonucleotides from CPG3e-mix is shown in FIG.
- a table (Table 2) summarizing the production ratios of the target oligonucleotide (T 10 ) released and the oligonucleotide (T 10 -adduct) produced as a by-product during the excision of each CPG3a-h.
- T 10 -adduct was identified by comparison with the description in the literature (Tetrahedron, 2021, 92, 132261.).
- target oligonucleotides T 9 UOMe and T 9 T LNA
- byproduct oligonucleotides T 9 UOMe -adduct and T 9 T LNA - Tables (Tables 3 and 4) summarizing the production ratios of adduct
- a phosphoramidite (compound 3g) having a cyanoethoxy group as a protective group for the phosphate moiety has been widely used.
- the nucleotide derivative (I) of the present invention (nucleotide derivative 3a to 3f and 3h)
- the production of T10 oligonucleotides is remarkably increased, and it was confirmed that oligonucleotides can be released from the solid-phase carrier under mild base conditions. rice field. This excellent effect was also confirmed when OMe and LNA with modified sugar moieties were used.
- Example D2 Excision from CPG1a and CPG1g/CPG2a and CPG2g A summary of oligonucleotide excision is given below.
- HPLC charts showing the results of excision of oligonucleotides from CPG1a and CPG1g/CPG2a and CPG2g are shown in FIG.
- T 10 target oligonucleotide
- T 10 -adduct byproduct oligonucleotide
- Nucleotide derivative (I) of the present invention which is a phosphoramidite with more stable substituents is used, even when using an ethylene glycol resin (CPG1) having the same "1,2-diol structure" as the universal support with a simpler structure as the solid-phase support, the oligonucleotide can be cleaved out quickly enough. It became clear that it is possible. Thus, the fact that a 1,2-diol derivative having a simple structure can be used as a universal linker is also one of the features of the method for producing an oligonucleotide of the present invention.
- CPG1 ethylene glycol resin
- Compound 15 was synthesized according to the procedure of known literature (Nucleosides and Nucleotides, 1992, 11, 1263-1273.).
- Compound 17 was synthesized according to the procedure of known literature (J. Med. Chem. 2008, 51, 4957-4967.).
- Compound 21 was synthesized according to the procedure of known literature (Tetrahedron. 2021, 72, 153066.).
- T phosphoramidite (same as compound 3g) and a commercially available MOE-T amidite (12 g of a nucleotide derivative represented by the following formula, manufactured by Hongene) were prepared as 0.15 mol/L anhydrous acetonitrile solutions. Using.
- PS1 Commercially available PS1 (Cytiva Primer Support 5G Unylinker 350) was used as a solid-phase carrier, and an automatic DNA synthesizer was used.
- PS1 Commercially available PS1 (Cytiva Primer Support 5G Unilinker 350) was used as a solid-phase carrier, and the above nucleotide derivative 20c was synthesized by an automated DNA synthesizer.
- PS1 Commercially available PS1 (Cytiva Primer Support 5G Unilinker 350) was used as a solid-phase carrier, and the above nucleotide derivative 25c was synthesized by an automatic DNA synthesizer.
- Ph is a phenyl group
- Me is a methyl group
- iPr is an isopropyl group
- Ac is an acetyl group
- CE is a 2-cyanoethyl group.
- T represents a thyminyl group
- U represents a uracil group (here, a thyminyl group and a uracil group represent a thymine monovalent group and a uracil monovalent group, respectively).
- T when described as a nucleic acid monomer constituting an oligonucleotide sequence, it means a deoxyribonucleotide in which the nucleic acid base is bound to deoxy-D-ribose.
- U when described as a nucleic acid monomer constituting an oligonucleotide sequence, it means a ribonucleotide in which the nucleic acid base is bound to D-ribose.
- a phosphoramidite compound: MOE-T amidite commercial product, nucleotide derivative 12 g
- nucleotide derivative 12c and 12e the nucleotide derivative of the present invention
- the production of TnA oligonucleotides is increased at each stage, and the excellent effect that oligonucleotides can be released from the solid-phase support under mild basic conditions is This was also confirmed when using MOE modified at the 2' site of the sugar moiety.
- the oligonucleotide is shown with a universal linker attached to the oligonucleotide without being cut off.
- phosphoramidites compounds: corresponding to nucleotide derivatives 14g, 16g, 20g, and 25g
- a cyanoethoxy group as a phosphate protecting group
- the nucleotide derivative (I) of the present invention nucleotide derivative 14c, 16c, 20c, and 25c
- TnB to E oligonucleotides are produced more at each stage, and oligonucleotides can be released from the solid-phase support under mild basic conditions. This excellent effect was confirmed even when using nucleotides modified with various functional groups at the 2' site of the sugar moiety.
- the present invention relates to a method for solid-phase synthesis of oligonucleotides, etc., which makes it possible to excise synthesized oligonucleotides even under mild conditions by using a phosphoramidite of a nucleoside having a specific structure, which requires oligonucleotide synthesis. It is useful in the technical field (for example, the field of research and development of nucleic acid medicine).
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Abstract
Description
この場合、合成されるオリゴヌクレオチドの3'末端になるヌクレオシドに応じて、当該ヌクレオシドを予め担持させた固相担体を調製して、その後のヌクレオチド伸長反応を行う方法があるが、合成されるオリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオシドを予め担持させた固相担体をその都度調製することは煩雑となる。これに対して、任意のヌクレオシドとのカップリングが可能なユニバーサルリンカー(例えば、特許文献1、特許文献2を参照)を担持させた固相担体を利用すれば、合成されるオリゴヌクレオチドの配列に関係なく、オリゴヌクレオチドをユニバーサルリンカー上に伸長させるステップにおける第一のヌクレオシドとして、オリゴヌクレオチドの3’末端のヌクレオシドを任意に導入でき、3’末端のヌクレオシドに拘わらず、任意の配列を有するオリゴヌクレオチドを効果的に合成できるため、かかるユニバーサルリンカーが固相合成において汎用されている。
より具体的には、ユニバーサルリンカーをスクシニル基等の開裂性リンカー(スペーサー)を介して固相担体に予め担持させ、任意の3’末端のヌクレオシドをカップリングさせ、以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程:
(1)トリクロロ酢酸/ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの5'-OH基の脱保護を行う工程;
(2)ヌクレオシドホスホロアミダイト(「核酸モノマー」とも表記する)を活性化剤(テトラゾール等)の存在下、脱保護した5'-OH基ヘのカップリングを行う工程;
(3)無水酢酸などにより未反応の5'-OH基をキャッピングする工程;および
(4)含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程、または3-((N,N-ジメチルアミノメチリデン)アミノ)-3H-1,2,4-ジチアゾール-5-チオン等によりホスファイトを硫化する工程:
からなるオリゴヌクレオチド伸長反応が行われる。
以上の合成サイクルを繰り返し、3'末端から5'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持ったオリゴヌクレオチド(核酸)が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成したオリゴヌクレオチド(核酸)が、固相担体およびユニバーサルリンカーから切り出される。
で表される化合物により代表される一群のヌクレオシドホスホロアミダイトである。ここでは、リン原子上の水酸基が「シアノエチル基」により保護されている点が、特徴である。
さらに、本発明の固相オリゴヌクレオチド(核酸)合成方法においては、ユニバーサルリンカーとして、現在汎用されているリンカーに代えてよりシンプルな構造を有するリンカーをも用いることができることを併せて見出した。
置換されていてもよい環状基-オキシ基、
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
Yは、水素原子または水酸基の保護基を示し;
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル基を示すか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい複素環を形成する;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し、および
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。]
で表されるヌクレオチド誘導体(以下、「ヌクレオチド誘導体(I)」とも表記する)を、最初にユニバーサルリンカーにカップリングさせて、これに続くオリゴヌクレオチドの伸長反応を行い、式(II):
**は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合位置を示し;
RZは、OまたはSを示し;
X、R1~R3、およびBaseは、前記と同義である。)
で表されるヌクレオチド誘導体(以下、「ヌクレオチド誘導体残基(II)」とも表記する)を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドを得て、得られたオリゴヌクレオチドを固相担体およびユニバーサルリンカーから切り出すことを含む、オリゴヌクレオチドの固相合成方法である。
[1]オリゴヌクレオチドの固相合成方法におけるヌクレオチド伸長反応により合成されたオリゴヌクレオチドであって、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持された、式(II):
**は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合位置を示し;
RZは、OまたはSを示し;
X、R1~R3、およびBaseは、前記と同義である。)
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドを、
固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[2](1)式(I):
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させる工程、
(2)目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程(ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の上記式(I)で表されるヌクレオチド誘導体を用いてもよい)、
(3)得られた目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[3]固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)濃アンモニア水を室温下~加温下で接触させること、
2)濃アルキルアミン水溶液/濃アンモニア水の混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
3)炭酸カリウムのアルコール溶液を室温下~加温下で接触させること、または、
4)アルキルアミン/水またはアルキルアミン/水/アルコールの混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
により行われる、上記[1]または[2]に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[4]固相担体からの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)28%アンモニア水を室温下で接触させること、
2)40%メチルアミン水溶液/28%アンモニア水の1:1の混合溶液(AMA溶液)を室温下で接触させること、
3)50mM炭酸カリウムのメタノール溶液を室温下で接触させること、または、
4)t-ブチルアミン/水またはt-ブチルアミン/水/メタノールの混合溶液を加温下で接触させること、
により行われる、上記[3]に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
Y、Z1、Z2、R1~R3およびBaseは、それぞれ前記と同義である。)
で表されるヌクレオチド誘導体。
Y1およびY2は、水素原子または水酸基の保護基を示す。)
で表される1,2-ジオール誘導体の、オリゴヌクレオチド固相合成用ユニバーサルリンカーとしての使用。
[1]オリゴヌクレオチドの固相合成方法におけるヌクレオチド伸長反応により合成されたオリゴヌクレオチドであって、
ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持された、式(II):
**は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合位置を示し;
RZは、OまたはSを示し;
Xは、置換されていてもよいアルコキシ基(但し、シアノエトキシ基を除く)、
置換されていてもよい環状基-オキシ基、
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し、および
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。)
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドを、
固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法である。
より具体的には、
[2](1)式(I):
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル基を示すか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい複素環を形成する;
X、R1~R3、およびBaseは、それぞれ前記と同義である。)
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させる工程(以下、「工程(1)」とも表記する)、
(2)目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程(ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の上記式(I)で表されるヌクレオチド誘導体を用いてもよい)(以下、「工程(2)」とも表記する)、
(3)得られた目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体からの切り出し反応に付す工程(以下、「工程(3)」とも表記する)、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法である。
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチド」に該当するから、上記[2]は、
[2-1]ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持された、式(II):
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドが、
(1)式(I):
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させる工程(「工程(1)」)、および
(2)目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程(ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の上記式(I)で表されるヌクレオチド誘導体を用いてもよい)(「工程(2)」)、
を含む工程により得られたものである、上記[1]に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法ということもできる。
上記の通り、本発明においては、式(I):
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させた後、当該ヌクレオチド誘導体(I)を起点として、目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合(カップリング)させることによりヌクレオチドを伸長させて、目的とするオリゴヌクレオチドを合成する点が特徴となる。
以下、ヌクレオチド誘導体(I)の各基について説明する。
本明細書中、「複素環基」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる1ないし4個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、(i)芳香族複素環基、(ii)非芳香族複素環基および(iii)7ないし10員複素架橋環基が挙げられる。
該「芳香族複素環基」の好適な例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、1,2,4-オキサジアゾリル、1,3,4-オキサジアゾリル、1,2,4-チアジアゾリル、1,3,4-チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニルなどの5ないし6員単環式芳香族複素環基;
ベンゾチオフェニル、ベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾトリアゾリル、イミダゾピリジニル、チエノピリジニル、フロピリジニル、ピロロピリジニル、ピラゾロピリジニル、オキサゾロピリジニル、チアゾロピリジニル、イミダゾピラジニル、イミダゾピリミジニル、チエノピリミジニル、フロピリミジニル、ピロロピリミジニル、ピラゾロピリミジニル、オキサゾロピリミジニル、チアゾロピリミジニル、ピラゾロトリアジニル、ナフト[2,3-b]チエニル、フェノキサチイニル、インドリル、イソインドリル、1H-インダゾリル、プリニル、イソキノリル、キノリル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、カルバゾリル、β-カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニルなどの8ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)芳香族複素環基が挙げられる。
該「非芳香族複素環基」の好適な例としては、アジリジニル、オキシラニル、チイラニル、アゼチジニル、オキセタニル、チエタニル、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロフラニル、ピロリニル、ピロリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロイソチアゾリル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイソオキサゾリル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピリジニル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロピリダジニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、モルホリニル、チオモルホリニル、アゼパニル、ジアゼパニル、アゼピニル、オキセパニル、アゾカニル、ジアゾカニルなどの3ないし8員単環式非芳香族複素環基;
ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロベンゾチアゾリル、ジヒドロベンゾイソチアゾリル、ジヒドロナフト[2,3-b]チエニル、テトラヒドロイソキノリル、テトラヒドロキノリル、4H-キノリジニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロチエノ[2,3-c]ピリジニル、テトラヒドロベンゾアゼピニル、テトラヒドロキノキサリニル、テトラヒドロフェナントリジニル、ヘキサヒドロフェノチアジニル、ヘキサヒドロフェノキサジニル、テトラヒドロフタラジニル、テトラヒドロナフチリジニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロシンノリニル、テトラヒドロカルバゾリル、テトラヒドロ-β-カルボリニル、テトラヒドロアクリジニル、テトラヒドロフェナジニル、テトラヒドロチオキサンテニル、オクタヒドロイソキノリルなどの9ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)非芳香族複素環基が挙げられる。
ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール、ベンゾチアゾール、ベンゾイソチアゾール、ベンゾトリアゾール、イミダゾピリジン、チエノピリジン、フロピリジン、ピロロピリジン、ピラゾロピリジン、オキサゾロピリジン、チアゾロピリジン、イミダゾピラジン、イミダゾピリミジン、チエノピリミジン、フロピリミジン、ピロロピリミジン、ピラゾロピリミジン、オキサゾロピリミジン、チアゾロピリミジン、ピラゾロピリミジン、ピラゾロトリアジン、インド-ル、イソインドール、1H-インダゾール、プリン、イソキノリン、キノリンなどの8ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)窒素含有芳香族複素環が挙げられる。
ジヒドロベンゾイミダゾール、ジヒドロベンゾオキサゾール、ジヒドロベンゾチアゾール、ジヒドロベンゾイソチアゾール、テトラヒドロイソキノリン、テトラヒドロキノリン、4H-キノリジン、インドリン、イソインドリン、テトラヒドロチエノ[2,3-c]ピリジン、テトラヒドロベンゾアゼピンなどの9ないし14員縮合多環式(好ましくは2または3環式)窒素含有非芳香族複素環が挙げられる。
当該「トリチル系保護基」としては、例えば、任意の置換基(例えば、C1-6アルコキシ基、C1-6アルキル基、ハロゲン原子等から選ばれる置換基(2個以上の置換基が一緒になって環を形成していてもよい))で置換されていてもよいトリチル基が挙げられ、具体的には、トリチル基(Tr)、モノメトキシトリチル基(例えば、4-メトキシトリチル基(MMTr))、ジメトキシトリチル基(例えば、4,4’-ジメトキシトリチル基(DMTr))、9-フェニルキサンテン-9-イル基(ピクシル基)等が挙げられ、好ましくは、4,4’-ジメトキシトリチル基(DMTr)が挙げられる。
当該「シリル系保護基」としては、例えば、任意の置換基(例えば、C1-6アルコキシ基、C1-6アルキル基、フェニル基等から選ばれる置換基)でトリ置換されたシリル基が挙げられ、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、tert-ブチルジメチルシリル基、ジメチルメトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基、tert-ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、好ましくは、トリメチルシリル基が挙げられる。
当該「アシル系保護基」としては、例えば、アセチル基、t-ブトキシカルボニル基、ベンゾイル基、レブリノイル基等が挙げられる。
本明細書中、「置換された」とは、1~3個の置換基で置換可能な位置で置換されている態様を意味する。2または3置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
ハロゲン原子(例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素);
シアノ基;
アルキル基(例えば、C1-6アルキル基);
アルコキシ基(例えば、C1-6アルコキシ基);
アルコキシ-アルコキシ基(例えば、C1-6アルコキシ-C1-6アルコキシ基(例、メトキシ-メトキシ、メトキシ-エトキシ、エトキシ-エトキシ等));
アラルキルオキシ基(例えば、C7-16アラルキルオキシ基(例、ベンジルオキシ));
保護された水酸基(例えば、C1-6アルキル-カルボニルオキシ基(例、アセトキシ、プロパノイルオキシ)、C6-14アリール-カルボニルオキシ基(例、ベンゾイルオキシ、1-ナフトイルオキシ、2-ナフトイルオキシ)、C1-6アルコキシ-カルボニルオキシ基(例、メトキシカルボニルオキシ、エトキシカルボニルオキシ、プロポキシカルボニルオキシ、ブトキシカルボニルオキシ)、モノ-またはジ-C1-6アルキル-カルバモイルオキシ基(例、メチルカルバモイルオキシ、エチルカルバモイルオキシ、ジメチルカルバモイルオキシ、ジエチルカルバモイルオキシ)、C6-14アリール-カルバモイルオキシ基(例、フェニルカルバモイルオキシ、ナフチルカルバモイルオキシ)等);アリール基(例えば、C6-14アリール基);
保護されたアミノ基(例えば、アシルアミノ基(例えば、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基(例、アセチルアミノ)、C2-6アルケニル-カルボニルアミノ基(例、クロトノイルアミノ)、C3-10シクロアルキル-カルボニルアミノ基(例、シクロブタンカルボニルアミノ、シクロペンタンカルボニルアミノ、シクロヘキサンカルボニルアミノ、シクロヘプタンカルボニルアミノ)、C3-10シクロアルケニル-カルボニルアミノ基(例、2-シクロヘキセンカルボニルアミノ)、C6-14アリール-カルボニルアミノ基(例、ベンゾイルアミノ)、C7-16アラルキル-カルボニルアミノ基(例、ベンジルカルボニルアミノ)、C6-14アリールオキシ-カルボニルアミノ基(例、フェニルオキシカルボニルアミノ、ナフチルオキシカルボニルアミノ)、C7-16アラルキルオキシ-カルボニルアミノ基(例、ベンジルオキシカルボニルアミノ、フェネチルオキシカルボニルアミノ)、カルバモイルアミノ基、モノ-またはジ-C1-6アルキル-カルバモイルアミノ基、モノ-またはジ-C2-6アルケニル-カルバモイルアミノ基(例、ジアリルカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C3-10シクロアルキル-カルバモイルアミノ基(例、シクロプロピルカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C6-14アリール-カルバモイルアミノ基(例、フェニルカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C7-16アラルキル-カルバモイルアミノ基、5ないし14員芳香族複素環カルバモイルアミノ基(例、ピリジルカルバモイルアミノ)、チオカルバモイルアミノ基、モノ-またはジ-C1-6アルキル-チオカルバモイルアミノ基(例、メチルチオカルバモイルアミノ、N-エチル-N-メチルチオカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C2-6アルケニル-チオカルバモイルアミノ基(例、ジアリルチオカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C3-10シクロアルキル-チオカルバモイルアミノ基(例、シクロプロピルチオカルバモイルアミノ、シクロヘキシルチオカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C6-14アリール-チオカルバモイルアミノ基(例、フェニルチオカルバモイルアミノ)、モノ-またはジ-C7-16アラルキル-チオカルバモイルアミノ基(例、ベンジルチオカルバモイルアミノ、フェネチルチオカルバモイルアミノ)、5ないし14員芳香族複素環チオカルバモイルアミノ基(例、ピリジルチオカルバモイルアミノ);C1-6アルキルアミノ基(例、メチルアミノ);N,N-ジ-C1-6アルキルアミノ基(例、N,N-ジメチルアミノ)、C3-10シクロアルキルアミノ基(例、シクロプロピルアミノ);C6-14アリールアミノ基(例、フェニルアミノ)等)、
ここで、保護されたアミノ基としては、より好ましくは、アシルアミノ基、さらに好ましくは、ホルミルアミノ基またはC1-10アルキル-カルボニルアミノ基;
置換されていてもよいカルバモイル基(例えば、カルバモイル基、モノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基(例、モノ-またはジ-メチル-カルバモイル)、モノ-またはジ-C2-6アルケニル-カルバモイル基(例、モノ-またはジ-アリルカルバモイル)、モノ-またはジ-C3-10シクロアルキル-カルバモイル基(例、シクロプロピルカルバモイル、シクロヘキシルカルバモイル)、モノ-またはジ-C6-14アリール-カルバモイル基(例、フェニルカルバモイル)、モノ-またはジ-C7-16アラルキル-カルバモイル基、モノ-またはジ-C1-6アルキル-カルボニル-カルバモイル基(例、アセチルカルバモイル、プロピオニルカルバモイル)、モノ-またはジ-C6-14アリール-カルボニル-カルバモイル基(例、ベンゾイルカルバモイル)、5ないし14員芳香族複素環カルバモイル基(例、ピリジルカルバモイル)、
ここで、置換されていてもよいカルバモイル基としては、より好ましくは、カルバモイル基またはモノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基、さらに好ましくは、カルバモイル基またはC1-10アルキル-カルバモイル基;
等が挙げられる。
ここで、「核酸塩基」は、例えば、アデニル基、グアニル基およびシトシル基または修飾核酸塩基のアミノ基が保護されていてもよく、アミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、4-メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、4-tert-ブチルフェノキシアセチル、4-イソプロピルフェノキシアセチル等により保護されていてもよい。
Xは、前記で定義した通りであるが、好ましくは、
置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(但し、シアノエトキシ基を除く)、
置換されていてもよいC6-14アリール-オキシ基、
置換されていてもよいC3-10シクロアルキル-オキシ基、
置換されていてもよい3ないし14員非芳香族複素環-オキシ基、
置換されていてもよいC1-6アルキル基、
置換されていてもよいC2-6アルケニル基、または
置換されていてもよいC6-14アリール基であり、
より好ましくは、
C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシ-C1-6アルコキシ基およびC7-16アルコキシ基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよいC6-14アリール-オキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよいC3-6シクロアルキル-オキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよい5または6員非芳香族複素環-オキシ基、
1~3個のC1-6アルコキシ基で置換されていてもよいC1-6アルキル基、
C1-6アルキル基およびC6-14アリール基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC2-6アルケニル基、または
C1-6アルキル基およびC1-6アルコキシ基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC6-14アリール基であり、
さらに好ましくは、
C1-6アルコキシ基、
C6-14アリール-オキシ基、
C3-6シクロアルキル-オキシ基、
5または6員非芳香族複素環-オキシ基、
C1-6アルキル基、
C2-6アルケニル基、または
C6-14アリール基であり、
最も好ましくは、
C1-6アルコキシ基、
フェニル-オキシ基、または
C1-6アルキル基である。
水素原子または置換されていてもよいトリチル系保護基、
より好ましくは、
トリチル基、モノメトキシトリチル基(例えば、4-メトキシトリチル基)、またはジメトキシトリチル基(例えば、4,4’-ジメトキシトリチル基)であり、
最も好ましくは、
ジメトキシトリチル基である。
置換されていてもよいC1-6アルキル基であるか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい窒素含有非芳香族複素環を形成する、
より好ましくは、
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、C1-6アルキル基であるか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、3ないし8員単環式窒素含有非芳香族複素環を形成する。
水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、
置換されていてもよいC1-6アルキル基、
置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または
置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり、
より好ましくは、
水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり、
さらに好ましくは、
水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
C1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、およびモノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(特に好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基)、
C2-6アルケニルオキシ基、または
C2-6アルキニルオキシ基である。
水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、
置換されていてもよいC1-6アルキル基、
置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または
置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり、
より好ましくは、
水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり、
さらに好ましくは、
水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
C1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、およびモノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(特に好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基)、
C2-6アルケニルオキシ基、または
C2-6アルキニルオキシ基である。
水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基、置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、または置換されていてもよいC1-6アルキルチオ基であり、
より好ましくは、
水素原子、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、またはC1-6アルキルチオ基である。
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成するが、より好ましくは、
以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいC1-6アルキル基を示す。)
で表される基を形成し、
最も好ましくは、
以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子またはC1-6アルキル基を示す。)
で表される基を形成する。
[ヌクレオチド誘導体(I-A)]
Xが、置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(但し、シアノエトキシ基を除く)、
置換されていてもよいC6-14アリール-オキシ基、
置換されていてもよいC3-10シクロアルキル-オキシ基、
置換されていてもよい3ないし14員非芳香族複素環-オキシ基、
置換されていてもよいC1-6アルキル基、
置換されていてもよいC2-6アルケニル基、または
置換されていてもよいC6-14アリール基であり;
Yが、水素原子または置換されていてもよいトリチル系保護基であり;
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいC1-6アルキル基であるか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい窒素含有非芳香族複素環を形成し;
R1が、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいC1-6アルキル基、置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり;
R2が、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいC1-6アルキル基、置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基、または置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基であり;
R3が、水素原子、置換されていてもよいC1-6アルキル基、置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、または置換されていてもよいC1-6アルキルチオ基であるか、または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいC1-6アルキル基を示す。)
で表される基を形成し;
Baseが、修飾されていてもよい核酸塩基である、ヌクレオチド誘導体(I)。
Xが、C1-6アルコキシ基、C1-6アルコキシ-C1-6アルコキシ基およびC7-16アルコキシ基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよいC6-14アリール-オキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよいC3-6シクロアルキル-オキシ基、
C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、および保護された水酸基から選択された1~3個の置換基で置換されていてもよい5または6員非芳香族複素環-オキシ基、1~3個のC1-6アルコキシ基で置換されていてもよいC1-6アルキル基、
C1-6アルキル基およびC6-14アリール基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC2-6アルケニル基、または
C1-6アルキル基およびC1-6アルコキシ基から選択される1~3個の置換基で置換されていてもよいC6-14アリール基であり;
Yが、水素原子、トリチル基、モノメトキシトリチル基、またはジメトキシトリチル基であり;
Z1およびZ2が、それぞれ独立して、C1-6アルキル基であるか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、3ないし8員単環式窒素含有非芳香族複素環を形成し;
R1が、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルキル基(好ましくは、C1-6アルキル基)、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、およびモノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、より好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基)、
シアノ基、C1-6アルコキシ基および保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基(好ましくは、C2-6アルケニルオキシ基)、または
シアノ基、C1-6アルコキシ基および保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基(好ましくは、C2-6アルキニルオキシ基)であり;
R2が、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルキル基(好ましくは、C1-6アルキル基)、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基(好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、アシルアミノ基、カルバモイル基、およびモノ-またはジ-C1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、より好ましくは、シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基)、
シアノ基、C1-6アルコキシ基および保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルケニルオキシ基(好ましくは、C2-6アルケニルオキシ基)、または
シアノ基、C1-6アルコキシ基および保護されたアミノ基、および置換されていてもよいカルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC2-6アルキニルオキシ基(好ましくは、C2-6アルキニルオキシ基)であり;
R3が、水素原子、C1-6アルキル基、C1-6アルコキシ基、またはC1-6アルキルチオ基であるか、または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子またはC1-6アルキル基を示す。)
で表される基を形成し;
Baseが、修飾されていてもよい核酸塩基である、ヌクレオチド誘導体(I)。
Xが、C1-6アルコキシ基、
C6-14アリール-オキシ基、
C3-6シクロアルキル-オキシ基、
5または6員非芳香族複素環-オキシ基、
C1-6アルキル基、
C2-6アルケニル基、または
C6-14アリール基であり
(より好ましくは、C1-6アルコキシ基、
フェニル-オキシ基、またはC1-6アルキル基であり);
[ヌクレオチド誘導体(I-D)]
R1が、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
C1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
C2-6アルケニルオキシ基、または
C2-6アルキニルオキシ基であり;
R2が、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、
C1-6アルキル基、
シアノ基、C1-6アルコキシ基、ホルミルアミノ基、C1-10アルキル-カルボニルアミノ基、カルバモイル基、およびC1-10アルキル-カルバモイル基から選択される基で置換されていてもよいC1-6アルコキシ基、
C2-6アルケニルオキシ基、または
C2-6アルキニルオキシ基である、ヌクレオチド誘導体(I-A)、(I-B)または(I-C)。
本発明の実施においては、上記ヌクレオチド誘導体(I)は、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持されるが、より具体的には、
(固相担体(SM))-(スペーサー(L))-(ユニバーサルリンカー(UL))-(ヌクレオチド誘導体(I))(以下、「固相担体連結-ヌクレオチド誘導体(I)」とも表記する)
で示される態様で共有結合を介してヌクレオチド誘導体(I)は固相担体に連結される。なお、ユニバーサルリンカーを直接固相担体に連結することができる場合には、スペーサーは必須ではない。
以下では、(固相担体(SM))-(スペーサー(L))-(ユニバーサルリンカー(UL))の連結体を、単に「固相担体」と表記する場合がある。
で表される二価基である。
ここで、スペーサーの構造が非対称構造である場合は、左右の結合部位のいずれが、本発明のヌクレオチド誘導体(I)と結合していてもよい。
例えば、ユニバーサルリンカー(UL)に、HO-L-で表される基を、対応する酸無水物と反応させて、スペーサーを導入した後、溶媒中、縮合剤および塩基の存在下、固相担体と反応させることにより、「(固相担体(SM))-(スペーサー(L))-(ユニバーサルリンカー(UL))連結体」を得た後、当該連結体を、オリゴヌクレオチド自動合成装置の反応カラムに投入し、その後のヌクレオチド伸長反応の起点となる、本発明のヌクレオチド誘導体(I)を、後記の実施例/製造例に記載された具体的な方法や、当技術分野で公知の方法を適宜適用して、第1の(3’末端となる)ヌクレオチドとしてユニバーサルリンカー(UL)に結合させることより「固相担体連結-ヌクレオチド誘導体(I)」を製造することができる。
ここで、「(固相担体(SM))-(スペーサー(L))-(ユニバーサルリンカー(UL))連結体」が、市販されている場合には、当該市販品を用いてもよい。
工程(2)は、工程(1)で得た「固相担体連結-ヌクレオチド誘導体(I)」のヌクレオチド誘導体(I)を起点として、目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程である。
なお、「固相担体連結-ヌクレオチド誘導体(I)」においては、ヌクレオチド誘導体(I)は、具体的には「ヌクレオチド誘導体残基(II)」の形態を取ることとなる。
ここで、「核酸モノマー」は、オリゴヌクレオチド配列に応じて適宜選択されるヌクレオシドホスホロアミダイトであり、後記の実施例/製造例に記載された具体的な方法や、当技術分野で公知の方法を適宜適用して、製造することができる。また、当該「核酸モノマー」が市販されている場合には、市販品を用いてもよい。例えば、以下の式(A):
で表される化合物により代表される一群のヌクレオシドホスホロアミダイトが挙げられる。
ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の本発明の「ヌクレオチド誘導体(I)」を用いてもよい。
工程(3)は、得られた目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体からの切り出し反応に付す工程である。
本工程での切り出し反応は、後記の実施例/製造例に記載された具体的な方法や、当技術分野で公知の方法を適宜適用して、当業者であれば、実施することができる。例えば、オリゴヌクレオチドが結合している固相担体を、アンモニア、アミン類および/または塩基で処理して、目的配列のオリゴヌクレオチドを回収することにより行われる。
アンモニアとしては、濃アンモニア水が挙げられる。アミン類としては、例えば、アルキルアミン(メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等)が挙げられる。塩基としては、炭酸カリウム等の金属炭酸塩が挙げられる。アンモニア、アミン類、および/または塩基は、1種または2種以上を組み合わせて用いることができる。
アンモニア、アミン類、および/または塩基は、溶媒と混合して用いるのが望ましい。溶媒としては、例えば、水、アルコール類(例えば、メタノール、エタノール等)等が挙げられる。これらの溶媒は2種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。
工程(3)は、より具体的には、アンモニア、アミン類、および/または塩基の溶液を、オリゴヌクレオチドが結合している固相担体が投入されたカラム中に流し込むことにより、オリゴヌクレオチドが結合している固相担体と接触させることにより行われる。
工程(3)での切り出し反応では、その反応温度は反応条件に従って適宜選択され特に限定はされないが、通常室温下~加温下の範囲で行われる。また、反応時間は反応条件に従って適宜選択され特に限定はされないが、通常1分~10時間の範囲内で行われる。
1)濃アンモニア水を室温下~加温下で接触させること、
2)濃アルキルアミン水溶液/濃アンモニア水の混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
3)炭酸カリウムのアルコール溶液を室温下~加温下で接触させること、または
4)アルキルアミン/水またはアルキルアミン/水/アルコールの混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
により行われる。
さらに好ましくは、オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)28%アンモニア水を室温下で接触させること、
2)40%メチルアミン水溶液/28%アンモニア水の1:1の混合溶液(AMA溶液)を室温下で接触させること、
3)50mM炭酸カリウムのメタノール溶液を室温下で接触させること、または
4)t-ブチルアミン/水またはt-ブチルアミン/水/メタノールの混合溶液を加温下で接触させること
により行われる。
上記の通り、本発明のヌクレオチド誘導体(I)を用いたオリゴヌクレオチド合成においては、極めてマイルドな切り出し条件下でも効率的に目的とするオリゴヌクレオチドを切り出すことができる。本発明者らは、本発明のヌクレオチド誘導体(I)を用いた場合には、1,2-ジオール構造を有するシンプルな1,2-ジオール誘導体を、ユニバーサルリンカーとして用いることができることを併せて見出した。
より具体的には、以下の式(III):
Y1およびY2は、水素原子または水酸基の保護基を示す。)
で表される1,2-ジオール誘導体(以下、「1,2-ジオール誘導体(III)」とも表記する)を、ユニバーサルリンカーとして用いることができることを見出した。
「鎖状または環状の置換基」としては、ヌクレオチド誘導体(I)について前記した「アルキル基」、「アルケニル基」、「アルキニル基」および「アルコキシ基」が「鎖状の置換基」として挙げられ、また前記した「環状基」が「環状の置換基」として挙げられる。ここで、各基は、置換されていてもよい。
「置換されていてもよい環」における環としては、「複素環」が挙げられる。
ここで「複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる1ないし4個のヘテロ原子をそれぞれ含有する、芳香族複素環および非芳香族複素環が挙げられる。
当該「芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる1ないし4個のヘテロ原子を含有する5ないし14員(好ましくは5ないし10員、より好ましくは5ないし6員)の芳香族複素環が挙げられる。該「芳香族複素環」の好適な例としては、チオフェン、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、1,2,4-オキサジアゾール、1,3,4-オキサジアゾール、1,2,4-チアジアゾール、1,3,4-チアジアゾール、トリアゾール、テトラゾール、トリアジンなどの5ないし6員単環式芳香族複素環が挙げられる。
また、「非芳香族複素環」としては、例えば、環構成原子として炭素原子以外に窒素原子、硫黄原子および酸素原子から選ばれる1ないし4個のヘテロ原子を含有する3ないし14員(好ましくは4ないし10員、より好ましくは5ないし6員)の非芳香族複素環が挙げられる。該「非芳香族複素環」の好適な例としては、アジリジン、オキシラン、チイラン、アゼチジン、オキセタン、チエタン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、ピラゾリン、ピラゾリジン、チアゾリン、チアゾリジン、テトラヒドロイソチアゾール、テトラヒドロオキサゾール、テトラヒドロイソオキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、テトラヒドロピリジン、ジヒドロピリジン、ジヒドロチオピラン、テトラヒドロピリミジン、テトラヒドロピリダジン、ジヒドロピラン、テトラヒドロピラン、テトラヒドロチオピラン、モルホリン、チオモルホリン、アゼパン、ジアゼパン、アゼピン、アゾカン、ジアゾカン、オキセパンなどの3ないし8員(より好ましくは、5ないし6員)単環式非芳香族複素環が挙げられる。
「水酸基の保護基」としては、ヌクレオチド誘導体(I)について前記した「水酸基の保護基」が挙げられる。
以上の各基や各基が置換されていてもよい置換基の好ましい具体例についても、ヌクレオチド誘導体(I)について説明されたものが挙げられる。
X1~X4は、それぞれ独立して、水素原子であるか、
X1~X4の任意の2つの基(好ましくは、隣接する炭素原子上に存在する2つの基)は、結合可能な位置で互いに結合し、それらが結合する炭素原子とともに、置換されていてもよい5ないし6員非芳香族複素環(より好ましくは、5ないし6員酸素含有非芳香族複素環、最も好ましくは、テトラヒドロフラン)を形成し;
Y1は、水素原子またはトリチル系保護基(より好ましくは、4,4’-ジメトキシトリチル基)であり;
Y2は、水素原子である。
[1-A]オリゴヌクレオチドの固相合成方法におけるヌクレオチド伸長反応により合成されたオリゴヌクレオチドであって、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持された、式(II):
**は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合位置を示し;
RZは、OまたはSを示し;
Xは、置換されていてもよいアルコキシ基(但し、シアノエトキシ基を除く)、
置換されていてもよい環状基-オキシ基、
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアルコキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、および
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。)
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドを、
固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[2-A](1)式(I):
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
Yは、水素原子または水酸基の保護基を示し;
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル基を示すか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい複素環を形成する;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアルコキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、または置換されていてもよいアルコキシ基を示し、および
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。]
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させる工程、
(2)目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程(ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の上記式(I)で表されるヌクレオチド誘導体を用いてもよい)、
(3)得られた目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[3-A]固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)濃アンモニア水を室温下~加温下で接触させること、
2)濃アルキルアミン水溶液/濃アンモニア水の混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
3)炭酸カリウムのアルコール溶液を室温下~加温下で接触させること、または、
4)アルキルアミン/水またはアルキルアミン/水/アルコールの混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
により行われる、上記[1-A]または[2-A]に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
[4-A]固相担体からの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)28%アンモニア水を室温下で接触させること、
2)40%メチルアミン水溶液/28%アンモニア水の1:1の混合溶液(AMA溶液)を室温下で接触させること、
3)50mM炭酸カリウムのメタノール溶液を室温下で接触させること、または、
4)t-ブチルアミン/水またはt-ブチルアミン/水/メタノールの混合溶液を加温下で接触させること、
により行われる、上記[3-A]に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。
以下では、上記式3a~3f、および3hで表されるホスホロアミダイトを、ヌクレオチド誘導体3a~3f、および3hとも表記し、式3gで表されるホスホロアミダイトを、化合物3gとも表記する。化合物3gは、既知のホスホロアミダイトであり、本発明のヌクレオチド誘導体(I)の対照として使用された。
2.ヌクレオチド誘導体3b~3fは、以下の方法により合成した。
報告されている文献(Bioconjugate Chem.,2008,19,1696-1706)に従って合成した。アルゴン気流下、市販の化合物1(3.00g、5.51mmol)の無水ジクロロメタン(20mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(2.40mL、13.2mmol)を加えた。0℃でビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(1.56g、6.61mmol)を加えて、室温で1.5時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2:1)で精製し、化合物2(2.62g、収率61%)を白色固体として得た。
報告されている文献(Bioorg.Med.Chem.Lett.,2015,25,3610-3615.)に従って合成した。アルゴン気流下、化合物2(150mg、0.194mmol)の無水アセトニトリル(2mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(40.5μL、0.232mmol)とエタノール(13.5μL、0.232mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(30.2mg、0.232mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3b(78.0mg、収率56%)を白色固体として得た。
アルゴン気流下、化合物2(150mg、0.194mmol)の無水アセトニトリル(2mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(40.5μL、0.232mmol)とイソプロパノール(17.9μL、0.232mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(30.2mg、0.232mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3c(64.0mg、収率45%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.99(brs,1H),7.66,7.63(d×2,1H,J=1.0Hz),7.42-7.39(m,2H),7.31-7.22(m,6H),6.84-6.81(m,4H),6.44-6.39(m,1H),4.65-4.59(m,1H),4.21,4.18(d×2,1H,J=2.0Hz),4.07-3.89(m,1H),3.79(s,6H),3.59-3.46(m,3H),3.36-3.30(m,1H),2.57-2.45(m,1H),2.33-2.26(m,1H),1.39-1.36(m,3H),1.26-1.04(m,18H)
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ145.2,144.6
IR(ATR):2966.0,2928,1686,1607,1508cm-1
HRMS(ESI-TOF):calcd.forC40H52N3aO8P
[M+Na]+756.3390,found 756.3391
アルゴン気流下、化合物2(150mg、0.194mmol)の無水アセトニトリル(2mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(40.5μL、0.232mmol)と2-メチルプロパノール(21.5μL、0.232mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(30.2mg、0.232mmol)を加えて、室温で1時間撹拌した。酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3d(68.0mg、収率44%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ7.96(brs,1H),7.66,7.62(brs×2,1H),7.41-7.39(m,2H),7.31-7.22(m,6H),6.83-6.82(m,4H),6.43-6.39(m,1H),4.67-4.62(m,1H),4.22,4.15(d×2,1H,J=2.0Hz),3.79(s,6H),3.61-3.46(m,3H),3.42-3.16(m,3H),2.56-2.45(m,1H),2.33-2.28(m,1H),1.88-1.66(m,1H),1.40,1.39(s×2,3H),1.16-1.04(m,12H),0.92-0.81(m,6H)
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ147.2,146.9
IR(ATR):2963.0,2929,1686,1607,1508cm-1
HRMS(ESI-TOF):calcd.forC41H54N3NaO8P
[M+Na]+ 770.3546,found 770.3539
アルゴン気流下、化合物2(200mg、0.258mmol)の無水アセトニトリル(2mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(54.1μL、0.310mmol)と2,2-ジメチル-1-プロパノール(27.3mg、0.310mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(40.4mg、0.310mmol)を加えて、室温で2時間撹拌した。反応終了後、酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=5:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3e(94.8mg、収率47%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.03(brs,1H),7.66,7.61(d×2,1H,J=1.0Hz),7.40(dd,2H,J=2.0Hz,J=8.0Hz),7.30-7.22(m,6H),6.84-6.81(m,4H),6.43-6.40(m,1H),4.68-4.62(m,1H),4.20,4.14(d×2,1H,J=2.0Hz),3.79(s,6H),3.60-3.45(m,3H),3.39-3.26(m,2H),3.19-3.06(m,1H)2.55-2.45(m,1H),2.33-2.32(m,1H),1.40-1.38(m,3H),1.27-1.25(m,1H),1.17-1.04(m,12H),0.91,0.82(s×2,9H)
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ147.6,147.4
IR(ATR)cm-1:2962,1684,1607,1508
HRMS(ESI-TOF):calcd. for C42H56N3NaO8P [M+Na]+ 784.3703, found 784.3701
報告されている文献(J.Org.Chem.,1995,60,925-930.)に従って合成した。アルゴン気流下、化合物2(500mg、0.645mmol)の無水アセトニトリル(6mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(270μL、1.55mmol)とフェノール(70.0mg、0.774mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(101mg、0.774mmol)を加えて、室温で3時間撹拌した。反応終了後、5%炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてクエンチし、酢酸エチルで希釈した。有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3f(328mg、収率63%)を白色固体として得た。
アルゴン気流下、市販の化合物4(1.0g、1.88mmol)の無水ジクロロメタン(10mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.788mL、4.51mmol)を加えた。0℃でビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(534mg、2.26mmol)を加えて、室温で1.5時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2:1)で精製し、化合物5(1.09g、収率73%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.34(brs,1H),8.01(d,2H,J=8.0Hz),7.40(d,2H,J=7.5Hz),7.30-7.22(m,7H),6.84-6.82(m,4H),6.02(d,J=8.0Hz,1H),5.25(d,J=8.0Hz,1H),4.37-4.33(m,1H),4.26-4.25(m,1H),3.88(dd,J=4.0,3.5Hz,1H),3.79(s,6H),3.59-3.42(m,6H),3.56(s,3H),1.17(d,J=2Hz,6H),1.16(d,J=2Hz,6H),1.14(d,J=7.0Hz,6H),1.04(d,J=6.5Hz,6H).
13C-NMR(125MHz,CDCl3)δ162.9,158.7,149.9,144.3,140.2,135.3,135.1,130.3,128.3,127.9,127.1,113.2,101.9,87.4,87.2,84.0,83.9,82.9,82.8,70.4,70.3,62.1,58.6,55.2,44.7,44.6,24.6,24.5,24.4,24.2,24.1,24.0.
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ118.3.
IR(ATR)cm-1:2968,1684,1508.
HRMS(FAB):calcd for C43H60N4O8P [M+H]+,791.4149, found 791.4147.
アルゴン気流下、市販の化合物6(310mg、0.543mmol)の無水ジクロロメタン(5mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.227mL、1.30mmol)を加えた。0℃でビス(ジイソプロピルアミノ)クロロホスフィン(154mg、0.652mmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去し、粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2:1)で精製し、化合物7(210mg、収率48%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.30(brs,1H),7.69(d,1H,J=1.0Hz),7.49-7.47(m,2H),7.37-7.34(m,4H),7.30-7.22(m,5H),6.84-6.82(m,4H),4.59(s,1H),4.08(d,1H,J=9.0Hz),3.89,3.85(ABq,2H,J=18.0,7.5Hz),3.79(s,6H),3.58(d,1H,J=11.0Hz),3.43-3.36(m,5H),1.73(s,3H),1.13(d,J=6.5Hz,6H),1.10(d,J=7.0Hz,6H),1.03(d,J=6.5Hz,6H),0.91(d,J=6.5Hz,6H).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ117.6.
IR(ATR)cm-1:2966,1687,1607,1508.
HRMS(ESI-TOF):calcd for C44H60N4O8P
[M+H]+ 803.4149, found 803.4148.
アルゴン気流下、化合物5(600mg、0.759mmol)の無水アセトニトリル(5mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(0.16mL、0.911mmol)とエタノール(53μL、0.911mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(119mg、0.911mmol)を加えて、室温で2.5時間撹拌した。酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=4:1)で精製し、化合物3bOMe(219mg、収率39%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.73(brs,1H),8.08(d,0.3H,J=8.0Hz,1H),8.04(d,0.7H,J=8.0Hz),7.86(brs,1H),7.43-7.36(m,2H),7.37-7.22(m,7H),6.85-6.82(m,4H),5.99(d,0.7H,J=8.0Hz),5.97(d,0.3H,J=8.0Hz),5.18-5.15(m,1H),4.59-4.55(m,0.3H),4.48-4.44(m,0.7H),4.24-4.21(m,1H),3.84-3.82(m,1H),3.80(s,6H),3.67-3.47(m,9H),1.26-1.03(m,16H).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ148.3,147.9.
IR(ATR)cm-1:2966,1607,1508.
HRMS(FAB):calcd for C39H51N3O9P [M+H]+ 736.3363, found 736.3375.
アルゴン気流下、化合物7(110mg、0.134mmol)の無水アセトニトリル(2mL)溶液に、ジイソプロピルエチルアミン(28.6μL、0.164mmol)とエタノール(9.6μL、0.164mmol)を加えた。エチルチオテトラゾール(21.3mg、0.164mmol)を加えて、室温で4時間撹拌した。酢酸エチルで希釈し、有機層を水で2回、飽和食塩水で1回洗浄後、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧蒸留した。粗成績体をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:1)で精製し、ヌクレオチド誘導体3bLNA(33.0mg、収率32%)を白色固体として得た。
1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.21(brs,1H),7.70(brs,1H),7.49-7.46(m,2H),7.37-7.22(m,7H),6.85-6.82(m,4H),5.65(s,0.7H),5.64(s,0.3H),4.57(s,0.7H),4.51(s,0.3H),4.35(d,0.3H,J=9.0Hz),4.26(d,0.7H,J=6.5Hz),3.87(d,1H,J=7.5Hz),3.80-3.79(m,7H),3.71-3.47(m,5H),3.45-3.41(m,1H),1.61(s,3H),1.22-0.99(m,15H).
31P-NMR(202MHz,CDCl3)δ147.2.
IR(ATR)cm-1:2966,1687,1607,1508.
HRMS(ESI-TOF):calcd for C40H50N3NaO9P
[M+Na]+ 770.3182, found 770.3182.
アルゴン気流下、固相担体lcaa-CPG(Amino-SynBaseTM CPG1000/110(LCAA)、Biosearch Technologies製)(200mg、アミノ基含有量:11.2μmol)の無水アセトニトリル(1mL)懸濁液に、ジイソプロピルエチルアミン(3.80μL、22.4μmol)、HBTU(4.25mg、11.2μmol)と文献(Bioorganic & Med.Chem.,1997,5,2235-2243.)に従って合成した化合物8(5.20mg、11.2μmol)を加えた。室温で1時間撹拌した後に反応液をろ過し、固相担体をアセトニトリルで洗浄、さらに一晩真空乾燥した。得られた固相担体をCapA溶液(1-メチルイミダゾールのアセトニトリル溶液、0.5mL)とCapB溶液(無水酢酸のアセトニトリル溶液、0.5mL)に懸濁して30分間撹拌した。再び反応液をろ過し、固相担体をアセトニトリルで洗浄後、一晩真空乾燥することでCPG1固相担体を得た。CPG1の化合物8担持量はDMTrアッセイ法(*)により定量し、39±2.8mol/gであった。
CPG1と同様の方法で、文献(Nucleic Acids Res.,1987,15,3113-3129.)に従って合成した化合物9(5.36mg、11.2μmol)を用いてCPG2固相担体を合成した。CPG2の化合物9担持量はDMTrアッセイ法により定量し、33±0.9mol/gであった。
(*)DMTrアッセイ法:固相担体をデブロッキング溶液(3w/v%トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液)で処理し、脱保護されたDMTr(ジメトキシトリチル)基の量を吸光度測定(504nm)することにより、間接的に担持量を定量する方法。
オリゴヌクレオチドの合成は、GeneDesign nS-8II Oligonucleotides Synthesizer(ジーンデザイン社製)を用いて通常のホスホロアミダイト法に従って行った。合成スケールは0.2μmolとし、トリチルOFF条件で行った。市販のTのホスホロアミダイト(化合物3gと同じ)、市販のAcCのホスホロアミダイト、市販のPacAのホスホロアミダイト、および市販のiPrPacGのホスホロアミダイトは0.1Mの無水アセトニトリル溶液として調製して用いた。活性化剤としては5-エチルチオ-1H-テトラゾール(0.25M無水アセトニトリル溶液)を用い、縮合時間はヌクレオチド誘導体3a-3f、3h、化合物3gで10分間(以上、ユニバーサルリンカーとの縮合時)、市販のTのホスホロアミダイト、市販のAcCのホスホロアミダイト、市販のPacAのホスホロアミダイト、市販のiPrPacGのホスホロアミダイトでは25秒間(以上、ユニバーサルリンカー以外のヌクレオチドとの縮合時)とした。
以下に、合成スキームの概要と合成したオリゴヌクレオチドの構造を示す。なお、本明細書中において、AcC、PacA、およびiPrPacGは、それぞれCAc、APac、およびGiPrPacとも表記する。
但し、T、CAc、APac、GiPrPacが、オリゴヌクレオチド配列を構成する核酸モノマーとして記載されている場合は、それぞれの当該核酸塩基がデオキシ-D-リボースに結合したデオキシリボヌクレオチドを意味する。また、Uが、オリゴヌクレオチド配列を構成する核酸モノマーとして記載されている場合は、当該核酸塩基がD-リボースに結合したリボヌクレオチドを意味する。)
市販のCPG3(Glen Research社製Universal Support)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体3a-3f、3h、3bOMe、3bLNA、化合物3gを3’末端に導入したT-10merオリゴヌクレオチド(CPG3a-h)、T-9mer-UOMeオリゴヌクレオチド(CPG3bOMe)、T-9mer-TLNAオリゴヌクレオチド(CPG3bLNA)、および(複数種の核酸モノマーから構成される11mer)-Tオリゴヌクレオチド(CPG3e-mix)を合成した。
以下に、合成スキームの概要と合成したオリゴヌクレオチドの構造を示す。
実施例B1に従って合成したCPG1を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、ヌクレオチド誘導体3aまたは化合物3gを3’末端に導入したT-10merオリゴヌクレオチド(CPG1aおよびCPG1g)を合成した。
(2)CPG2aおよびg:
実施例B2に従って合成したCPG2を固相担体として用い、CPG1aと同様の方法に従ってT-10merオリゴヌクレオチド(CPG2aおよびCPG2g)を合成した。
実施例D1:CPG3a-h、CPG3bOMe、CPG3bLNA、およびCPG3e-mixからの切り出し
オリゴヌクレオチドの切り出しの概要を、以下に示す。
T10は、T-10merオリゴヌクレオチド(配列番号1)、
T10-adductは、T-10merオリゴヌクレオチドにユニバーサルリンカーが切り離されずに結合した状態のオリゴヌクレオチド、
T9UOMeは、T-9mer-UOMeオリゴヌクレオチド(配列番号2)、
T9UOMe-adductは、T-9mer-UOMeオリゴヌクレオチドにユニバーサルリンカーが切り離されずに結合した状態のオリゴヌクレオチド、
T9TLNAは、T-9mer-TLNAオリゴヌクレオチド(配列番号3)、および
mix-12merは、GGATGTTCTCGTの塩基配列を有する複数種の核酸モノマーから構成された12merオリゴヌクレオチド(配列番号4
)をそれぞれ示す。)
(*1)T9TLNA-adductは、観測されなかった。
1)28%アンモニア水で室温下2時間処理
2)40%メチルアミン水溶液/28%アンモニア水=1:1(AMA)溶液で室温下5分間処理
3)50mM炭酸カリウムのメタノール溶液で室温下4時間処理
また、CPG3e-mixからのオリゴヌクレオチドの切り出しは、上記の1)と3)の条件で行った。
以上の各条件下で処理した後に、切り出し結果を逆相HPLCにより分析した。HPLC分析条件を、以下の表1に示す。
CPG3e-mixからのオリゴヌクレオチドの切り出しの結果を示すHPLCチャートを図2に示す。
また、それぞれのCPG3a-hの切り出しの際、放出される目的のオリゴヌクレオチド(T10)と副生成するオリゴヌクレオチド(T10-adduct)の生成比をまとめた表(表2)も示す。ここで、T10-adductの構造は、文献(Tetrahedron,2021,92,132261.)の記載との比較により同定した。
同様に、CPG3bOMeおよびCPG3bLNAの切り出しの際、放出される目的のオリゴヌクレオチド(T9UOMeおよびT9TLNA)と副生成するオリゴヌクレオチド(T9UOMe-adductおよびT9TLNA-adduct)の生成比をまとめた表(表3および表4)も示す。
CPG3eおよびCPG3gからのオリゴヌクレオチドの切り出しの結果を示すHPLCチャートを、図3[条件4)での切り出し]および図4[条件5;上記表1と同条件)
での切り出し]にそれぞれ示す。
条件4)および条件5)での、放出される目的のオリゴヌクレオチド(T10)と副生成するオリゴヌクレオチド(T10-adduct)の生成比をまとめた表(T10:T10-adduct)を、表5および表6に、それぞれ示す。
オリゴヌクレオチドの切り出しの概要を、以下に示す。
それぞれのCPGの切り出しの際、放出される目的のオリゴヌクレオチド(T10)(配列番号1)と副生成するオリゴヌクレオチド(T10-adduct)の生成比を、HPLCチャートのピーク面積比で算出した値で表8に示す。
を利用すれば、ユニバーサルサポートをよりシンプルな構造としたユニバーサルサポートと同じ「1,2-ジオール構造」を持つエチレングリコール樹脂(CPG1)を固相担体とする場合でも、十分速やかにオリゴヌクレオチドを切り出すことができることが明らかとなった。
このように、シンプルな構造を有する1,2-ジオール誘導体をユニバーサルリンカーとして用いることができる点も本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法の特徴の一つである。
以下の各式中、DMTrは、4,4’-ジメトキシトリチル基、Meは、メチル基、iPrは、イソプロピル基、tBuは、t-ブチル基、Acは、アセチル基をそれぞれ示す。
製造例E1:化合物10の合成
1H-NMR(CDCl3,400MHz);δ7.94(1H,brs),7.65(1H,d,J=0.8Hz),7.42-7.39(2H,m),7.31-7.24(7H,m),6.85-6.82(4H,m),6.01(1H,d,J=4.0Hz),4.43(1H,dd,J=10.8,5.6Hz),4.15-4.11(2H,m),4.08-4.03(1H,m),3.79(6H,s),3.78-3.73(1H,m),3.65-3.60(1H,m),3.56-3.51(3H,m),3.42-3.39(1H,m),3.39(3H,s),1.37(3H,s).
LRMS(ESI-QTOF):m/z 641.2360[M+Na]+
1H-NMR(CD3CN,400MHz);δ9.13(1H,brs),7.53-7.44(3H,m),7.36-7.23(7H,m),6.89-6.86(4H,m),5.92-5.90(1H,m),4.46-4.38(1H,m),4.21-3.91(3H,m),3.84-3.72(8H,m), 3.64-3.49(4H,m),3.42-3.27(5H,m),1.39-1.35(3H,m),1.22-1.13(12H,m),1.09-1.03(6H,m).
31P-NMR(CD3CN,162MHz);δ147.6,147.1.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 808.4109[M+H]+
1H-NMR(CD3CN,400MHz);δ9.11(1H,brs),7.53-7.44(3H,m),7.35-7.23(7H,m),6.88-6.86(4H,m),5.93-5.90(1H,m),4.50-4.42(1H,m),4.22-4.13(2H,m),3.86-3.72(8H,m), 3.65-3.24(10H,m),3.20-3.06(1H,m),1.38-1.35(3H,m),1.24-1.14(9H,m),1.04-1.03(3H,m),0.90-0.80(9H,m).
31P-NMR(CD3CN,162MHz);δ149.8,149.5.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 836.4615[M+H]+
1H-NMR(CD3CN,400MHz);δ9.01(1H,brs),7.86-7.75(1H,m),7.48-7.43(2H,m),7.36-7.24(7H,m),6.89-6.86(4H,m),5.84-5.83(1H,m),5.22-5.17(1H,m),4.47-4.32(1H,m),4.17-3.86(5H,m), 3.77(6H,m),3.67-3.54(2H,m),3.49-3.36(2H,m),2.74-2.60(2H,m), 1.23-1.10(15H,m),1.06-1.05(3H,m)
31P-NMR(CD3CN,162MHz);δ147.9,146.9.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 789.3420[M+H]+
1H-NMR(CD3CN,400MHz);δ9.03(1H,brs),7.84-7.73(1H,m),7.47-7.42(2H,m),7.36-7.23(7H,m),6.90-6.85(4H,m),5.99-5.87(2H,m),5.33-5.27(1H,m),5.24-5.14(2H,m),4.47-4.35(1H,m),4.28-3.94(5H,m),3.77(6H,m),3.65-3.53(2H,m),3.44-3.34(2H,m),1.22-1.13(12H,m),1.11-1.09(3H,m),1.06-1.04(3H,m).
31P-NMR(CD3CN,162MHz);δ147.5,147.2.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 776.3499[M+H]+
(2)粗精製の化合物18(7.62g,<27.0mmol)をピリジンで3回共沸した。得られた残渣をピリジン(90mL)に溶解させた後、4,4’-ジメトキシトリチルクロリド(11.0g,32.4mmol)を加えて15時間攪拌した。反応終了後、飽和重曹水でクエンチを行った後、酢酸エチルによる抽出を行った。硫酸マグネシウムによる有機層の乾燥と溶媒の減圧留去を行った後、トルエンで3回共沸した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/n-ヘキサン=1/1)で精製を行い、化合物19(12.8g,81%)を得た。
1H-NMR(CDCl3,400MHz);δ8.00-7.98(2H,m),7.41-7.37(2H,m), 7.32-7.25(7H,m),6.87-6.83(4H,m),5.97(1H,d,J=2.4Hz),5.28(1H,dd,J=8.0,2.4Hz),4.55-4.44(3H,m),4.24(1H,dd,J=4.0,2.8Hz),4.06(1H,dt,J=6.8,2.0Hz),3.80(6H,s),3.57-3.50(2H,m),2.53(1H,d,J=8.0Hz),2.51(1H,t,J=2.4).
LRMS(ESI-QTOF):m/z 607.1871[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.07(1H,brs),7.79-7.69(1H,m),7.44-7.39(m,2H),7.33-7.20(7H,m),6.80-6.93(4H,m),5.86-5.84(1H,m),5.24-5.22(1H,m),4.51-4.41(1H,m),4.37-4.32(2H,m),4.28-4.23(1H,m),4.17-4.10(1H,m),4.06-4.00(1H,m),3.92-3.53(8H,m),3.43-3.31(2H,m),2.72-2.63(2H,m),2.50―2.47(1H,m),1.92-1.89(1H,m),0.97-1.27(12H,m).
31P-NMR(162MHz,CD3CN)δ150.7,150.3.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 807.3075[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.05(brs,1H),7.79-7.69(1H,m),7.48-7.40(2H,m),7.32-7.20(7H,m),6.86-6.82(4H,m),5.86(1H,m),5.26-5.22(1H,m),4.44-4.32(2H,m),4.24-4.18(1H、m),4.15-3.88(2H,m),3.73(6H,s),3.64-3.51(2H,m),3.41-3.29(2H,m),2.70-2.68(1H,m),1.92-1.89(1H,m),1.19-1.01(18H,m).
31P-NMR(162MHz,CD3CN)δ147.7,147.6.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 774.3848[M+H]+
1H-NMR(400MHz,DMSO-D6)δ7.96(1H,brs),7.76(1H,t,J=5.3Hz),7.65(1H,d,J=8.2Hz),5.58(1H,s),5.53(1H,d,J=8.2Hz),4.23(1H,dd,J=8.0,4.4Hz),4.13(1H,d,J=12.3Hz),4.03(1H,d,J=4.6Hz),3.99-3.90(2H,m),3.78-3.65(2H,m),3.14-3.07(2H,m),1.77(3H,s),1.69-1.63(2H,m),1.06-0.98(28H,m).
LRMS(ESI-QTOF):m/z 608.3365[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,DMSO-D6)δ11.32(1H,brs), 7.93(1H,d,J=8.2Hz),7.77(1H,t,J=5.7Hz),5.83(1H,d,J=5.0Hz),5.64(1H,d,J=7.8Hz),5.15-5.13(2H,m),4.09(1H,qd,J=5.2,1.8Hz),3.88-3.84(2H,m),3.65(1H,dq,J=12.3,2.7Hz),3.58-3.47(2H,m),3.17(1H,d,J=5.0Hz),3.12-3.02(2H,m),1.78(3H,s),1.65-1.58(2H,m).
LRMS(ESI-QTOF):m/z 366.1188[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,DMSO-D6)δ11.38(1H,brs),7.79(1H,t,J=5.3Hz),7.72(1H,d,J=8.2Hz),7.39-7.23(9H,m),6.90(4H,d,J=8.5Hz),5.79(1H,d,J=3.7Hz),5.28(1H,d,J=8.2Hz),5.20(1H,d,J=6.4Hz),4.21-4.16(1H,m),3.98-3.94(1H,m),3.90(1H,t,J=4.1Hz),3.74(6H,s),3.59(2H,t,J=6.2Hz),3.25-3.20(1H,m),3.15-3.05(2H,m),1.78(3H,s),1.67-1.61(2H,m).
LRMS(ESI-QTOF):m/z 668.2421[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.09(1H,brs),7.82-7.70(1H,m),7.41(2H,m),7.33-7.20(7H,m),6.85(4H,m),6.44(1H,brs),5.84-5.82(1H,m),5.21-5.17(1H,m),4.50-4.36(1H,m),4.15-4.09(1H,m),4.05-3.97(2H,m),3.87-3.52(11H,m),3.44-3.32(2H,m),3.21-3.14(2H,m),2.67-2.45(2H,m),1.80―1.79(3H,m),1.61-1.75(2H,m),0.99-1.23(12H,m).
31P-NMR(162MHz,CD3CN)δ150.2,149.8.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 868.3463[M+Na]+
1H-NMR(400MHz,CD3CN)δ9.03(1H,brs),7.82―7.69(1H,m),7.48-7.39(2H,m),7.32-7.21(7H,m),6.89-6.83(4H,m),6.45(1H,brs),5.84-5.82(1H,m),5.23-5.16(1H,m),4.43-4.27(1H,m),4.13-3.89(3H,m),3.77-3.47(10H,m),3.44-3.28(2H,m),3.25-3.07(2H,m),1.80―1.79(3H,m),1.73-1.63(2H,m),1.23-1.01(18H,m).
31P-NMR(162MHz,CD3CN)δ147.3,147.1.
LRMS(ESI-QTOF):m/z 835.3854[M+H]+
オリゴヌクレオチドの合成は、Oligpilot 100 (Cytiva社)を用いて通常のホスホロアミダイト法に従って行った。担体として下記のPrimer Support 5G Unylinker 350(PS1)を用い、合成スケールは50μmolとし、トリチルOFF条件で行った。
なお、以下の各式中、DMTrは、4,4’-ジメトキシトリチル基、Phは、フェニル基、Meは、メチル基、iPrは、イソプロピル基、Acは、アセチル基、CEは、2-シアノエチル基をそれぞれ示す。
以下に、合成スキームの概要と合成したオリゴヌクレオチドの構造を示す。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体12c、12e、12gを3’末端に導入したT-9mer-(MOE)Tオリゴヌクレオチド(PS1cA(n=9)、PS1eA(n=9)、PS1gA(n=9))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体14c、14gを3’末端に導入したT-1mer-(2’-OCE)Uオリゴヌクレオチド(PS1cB(n=1)、PS1gB(n=1))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体14c、14gを3’末端に導入したT-9mer-(2’-OCE)Uオリゴヌクレオチド(PS1cB(n=9)、PS1gB(n=9))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体16c、16gを3’末端に導入したT-1mer-(2’-O-allyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cC(n=1)、PS1gC(n=1))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体16c、16gを3’末端に導入したT-9mer-(2’-O-allyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cC(n=9)、PS1gC(n=9))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体20c、20gを3’末端に導入したT-1mer-(2’-O-propargyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cD(n=1)、PS1gD(n=1))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体20c、20gを3’末端に導入したT-9mer-(2’-O-propargyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cD(n=9)、PS1gD(n=9))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体25c、25gを3’末端に導入したT-1mer-(2’-O-(3-acetamido)propyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cE(n=1)、PS1gE(n=1))を合成した。
市販のPS1(Cytiva社製Primer Support 5G Unylinker 350)を固相担体として用い、DNA自動合成装置によって、上述のヌクレオチド誘導体25c、25gを3’末端に導入したT-9mer-(2’-O-(3-acetamido)propyl)Uオリゴヌクレオチド(PS1cE(n=9)、PS1gE(n=9))を合成した。
以下の各式中、Phは、フェニル基、Meは、メチル基、iPrは、イソプロピル基、Acは、アセチル基、CEは、2-シアノエチル基をそれぞれ示す。
また、Tは、チミニル基、Uは、ウラシル基をそれぞれ示す(ここで、チミニル基、ウラシル基は、チミン一価基、ウラシル一価基をそれぞれ示す)。
但し、Tが、オリゴヌクレオチド配列を構成する核酸モノマーとして記載されている場合は、当該核酸塩基がデオキシ-D-リボースに結合したデオキシリボヌクレオチドを意味する。また、Uが、オリゴヌクレオチド配列を構成する核酸モノマーとして記載されている場合は、当該核酸塩基がD-リボースに結合したリボヌクレオチドを意味する。
オリゴヌクレオチドの切り出し概要を以下に示す。
条件:
28%アンモニア水/33wt%メチルアミン-エタノール溶液=1:1、25℃、40分間処理
以上の条件下で処理した後に、切り出し結果を逆相HPLCにより分析した。HPLC分析条件を以下の表10に示す。
オリゴヌクレオチドの切り出し概要を以下に示す。
TnB~E(n=9)は、T9-(2′-アルコキシ)Uオリゴヌクレオチド(配列番号6~9)、および
TnB~E-adduct(n=1、あるいはn=9)は、前述の各オリゴヌクレオチドにユニバーサルリンカーが切り離されずに結合した状態のオリゴヌクレオチドを示す。)
条件:
28%アンモニア水/33wt%メチルアミン-エタノール溶液=1:1、25℃、40分間処理
Claims (6)
- オリゴヌクレオチドの固相合成方法におけるヌクレオチド伸長反応により合成されたオリゴヌクレオチドであって、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持された、式(II):
**は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドへの結合位置を示し;
RZは、OまたはSを示し;
Xは、置換されていてもよいアルコキシ基(但し、シアノエトキシ基を除く)、
置換されていてもよい環状基-オキシ基、
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。)
で表されるヌクレオチド誘導体を、そのオリゴヌクレオチド配列の3’末端に有するオリゴヌクレオチドを、
固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。 - (1)式(I):
置換されていてもよいアルキル基、
置換されていてもよいアルケニル基、または
置換されていてもよいアリール基を示し;
Yは、水素原子または水酸基の保護基を示し;
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル基を示すか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい複素環を形成する;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。]
で表されるヌクレオチド誘導体を、ユニバーサルリンカーを介して固相担体に担持させる工程、
(2)目的とするオリゴヌクレオチド配列に応じて、核酸モノマーを順次縮合させて、ヌクレオチドを伸長させる工程(ここにおいて、核酸モノマーとして、1または2以上の上記式(I)で表されるヌクレオチド誘導体を用いてもよい)、
(3)得られた目的とする配列を有するオリゴヌクレオチドを、固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応に付す工程、
を含むオリゴヌクレオチドの固相合成方法。 - 固相担体およびユニバーサルリンカーからの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)濃アンモニア水を室温下~加温下で接触させること、
2)濃アルキルアミン水溶液/濃アンモニア水の混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
3)炭酸カリウムのアルコール溶液を室温下~加温下で接触させること、または、
4)アルキルアミン/水またはアルキルアミン/水/アルコールの混合溶液を室温下~加温下で接触させること、
により行われる、請求項1または2に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。 - 固相担体からの切り出し反応が、当該オリゴヌクレオチドがユニバーサルリンカーを介して担持された固相担体に、
1)28%アンモニア水を室温下で接触させること、
2)40%メチルアミン水溶液/28%アンモニア水の1:1の混合溶液(AMA溶液)を室温下で接触させること、
3)50mM炭酸カリウムのメタノール溶液を室温下で接触させること、または、
4)t-ブチルアミン/水またはt-ブチルアミン/水/メタノールの混合溶液を加温下で接触させること、
により行われる、請求項3に記載のオリゴヌクレオチドの固相合成方法。 - 式(Ia):
Yは、水素原子または水酸基の保護基を示し;
Z1およびZ2は、それぞれ独立して、置換されていてもよいアルキル基を示すか、または、
Z1およびZ2は、互いに結合して、それらが結合する窒素原子とともに、置換されていてもよい複素環を形成する;
R1は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R2は、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、置換されていてもよいアルケニルオキシ基、または置換されていてもよいアルキニルオキシ基を示し;
R3は、水素原子、置換されていてもよいアルキル基、置換されていてもよいアルコキシ基、または置換されていてもよいアルキルチオ基を示すか、
または
R2およびR3は、互いに結合して、以下の式(-R2-R3-の順で示す):
-O-C(Ra)2-、-O-C(Rb)2-C(Rc)2-、-O-C(Rd)2-О-、-N(Re)-C(Rf)2-、-N(Rg)-CО-、-S-C(Rh)2-、または-C(Ri)2-C(Rj)2-
(上記式中、Ra~Rjは、それぞれ独立して、水素原子または置換されていてもよいアルキル基を示す。)
で表される基を形成する;および
Baseは、修飾されていてもよい核酸塩基を示す。)
で表されるヌクレオチド誘導体。
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