JP2016204316A - 核酸固相合成用リンカー及び担体 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー、該リンカーを担持した核酸固相合成用担体（ユニバーサルサポート）、及び該担体を用いた核酸の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明は、下記式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】本発明は、下記式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体を提供する。
【選択図】なし
Description
本発明は、核酸固相合成に用いるリンカー、該リンカーを担持してなる固相合成用担体、及び該担体を用いた核酸の製造方法に関する。
ＤＮＡやＲＮＡ等の核酸の化学合成には、ホスホロアミダイト法を用いた固相合成法が広く用いられている。固相ホスホロアミダイト法では、概ね以下の工程により核酸合成を行う。
先ず、合成する核酸の３'末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーと、３'−ＯＨ基を介してエステル結合させ、固相合成用担体上にあらかじめ担持させる（ヌクレオシドリンカー）。次に、このヌクレオシドリンカーが担持された固相合成用担体を、反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。
以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの５'−ＯＨ基の脱保護を行う工程；
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）を活性化剤（テトラゾール等）の存在下、脱保護した５'−ＯＨ基ヘのカップリングを行う工程；
（３）無水酢酸などにより未反応の５'−ＯＨ基をキャップする工程；及び
（４）含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程：からなる合成反応が行われる。この合成サイクルを繰り返し、３'末端から５'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持った核酸が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（非特許文献１）。
先ず、合成する核酸の３'末端になるヌクレオシドを、スクシニル基などの開裂性リンカーと、３'−ＯＨ基を介してエステル結合させ、固相合成用担体上にあらかじめ担持させる（ヌクレオシドリンカー）。次に、このヌクレオシドリンカーが担持された固相合成用担体を、反応カラムに入れ、核酸自動合成装置にセットする。
以降は核酸自動合成装置の合成プログラムに従い、反応カラム中、一般に以下の工程：
（１）トリクロロ酢酸／ジクロロメタン溶液などの酸により保護ヌクレオシドの５'−ＯＨ基の脱保護を行う工程；
（２）ヌクレオシドホスホロアミダイト（核酸モノマー）を活性化剤（テトラゾール等）の存在下、脱保護した５'−ＯＨ基ヘのカップリングを行う工程；
（３）無水酢酸などにより未反応の５'−ＯＨ基をキャップする工程；及び
（４）含水ヨウ素などによりホスファイトを酸化する工程：からなる合成反応が行われる。この合成サイクルを繰り返し、３'末端から５'末端方向にオリゴヌクレオチドの伸長反応を進めることで、目的の配列を持った核酸が合成される。
最後に、アンモニア水やメチルアミン溶液などにより開裂性リンカーを加水分解させ、合成した核酸を固相合成用担体から切り離す（非特許文献１）。
しかしながら、上記のような合成を行う場合、前述したように、出発物質である３'末端となるヌクレオシドを、開裂性リンカーを介してあらかじめ固相合成用担体に担持しておく必要がある。さらに、合成したい核酸の配列により３'末端は異なり、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの場合はｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、ｄＴの４種類が、ＲＮＡの場合にもｒＡ、ｒＧ、ｒＣ、ｒＵの４種類が必要となり、さらに修飾オリゴヌクレオチドを合成する場合には修飾されたヌクレオシドをあらかじめ担持した固相合成用担体が必要になり煩雑であった。
そこで前記の問題点を克服するため、固相担体と出発物質を繋ぐリンカーとして、これまで一般に用いられてきたヌクレオシド・スクシニルリンカー等に替わり、ユニバーサルリンカーを担持した固相合成用担体（ユニバーサルサポート）が考案されている。ユニバーサルサポートを用いると、目的の核酸の３’末端がどのような種類のヌクレオシド又はヌクレオチドであっても、３’末端になるヌクレオシドホスホロアミダイドを通常の核酸自動合成と同じ工程で反応させて合成を開始し、目的の核酸を合成した後、通常と同様の方法で固相合成用担体から切り出すだけであり、前述のように種々のヌクレオシド−リンカーを担持した固相合成用担体を準備する必要がない。
例えば、３’末端がヒドロキシ基の核酸を合成できるユニバーサルサポートがいくつか提案されている（特許文献１〜５並びに非特許文献２及び３）。これらのユニバーサルサポートの構造中には、隣り合う２個の炭素原子が有り、一方の炭素原子には核酸合成の開始点となる−ＯＨ基が、もう一方の炭素原子には保護基を外すと求核基となる基（例えば−ＯＨ基、−ＮＨ２基、−ＳＨ基）が結合されており、核酸合成後のアンモニア水などによる核酸の切出し時に、これらの求核基の保護基も外れて３'末端のリンを攻撃し、環状リン酸エステルを生成する形で３'末端からリン酸基が切り離される。いずれも３'末端がヒドロキシ基となる核酸の合成に用いられる。
このような、３'末端がヒドロキシ基を有する核酸は、核酸医薬などの生化学の分野において幅広く求められているため、非常に有用である。
このような、３'末端がヒドロキシ基を有する核酸は、核酸医薬などの生化学の分野において幅広く求められているため、非常に有用である。
しかしながら、これまで知られているユニバーサルサポートを用いる方法では、ＤＮＡやＲＮＡの合成効率が十分ではなかった。
このような経緯から、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー及び該リンカーを担持している核酸固相合成用担体が求められている。
このような経緯から、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー及び該リンカーを担持している核酸固相合成用担体が求められている。
Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry（2000）3.1.1-3.1.28
Bio Techniques，22，752-756（1997）
Tetrahedron，57，4977-4986（2001）
本発明は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができるユニバーサルリンカー、該リンカーを担持した核酸固相合成用担体、及び該担体を用いた核酸の製造方法を提供することを目的とする。
すなわち、本発明は以下の通りである。
〔１〕 式（Ｉ）：
〔１〕 式（Ｉ）：
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
〔２〕 式（ＩＩ）：
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。
〔３〕 Ｌが、式（Ｌ）：
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基である上記〔２〕に記載の核酸固相合成用リンカー。
で表される二価の基である上記〔２〕に記載の核酸固相合成用リンカー。
〔４〕 Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である上記〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の核酸固相合成用リンカー。
〔５〕 酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である上記〔１〕〜〔４〕の何れかに記載の核酸固相合成用リンカー。
〔６〕 式（ＩＩＩ）：
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｓｐは、固相担体を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する核酸固相合成用担体。
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｓｐは、固相担体を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する核酸固相合成用担体。
〔７〕 Ｌが、式（Ｌ）：
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基である上記〔６〕に記載の核酸固相合成用担体。
で表される二価の基である上記〔６〕に記載の核酸固相合成用担体。
〔８〕 Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である上記〔６〕または〔７〕に記載の核酸固相合成用担体。
〔９〕 酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である上記〔６〕〜〔８〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
〔１０〕 ＳｐとＬの結合が、アミド結合又はエステル結合である上記〔６〕〜〔９〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
〔１１〕 Ｓｐが、多孔質ポリマー担体又はガラス系多孔質担体の固相担体である、上記〔６〕〜〔１０〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体。
〔１２〕 上記〔６〕〜〔１１〕の何れかに記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
〔１３〕 該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、上記〔１２〕に記載の製造方法。
本発明の核酸固相合成用担体は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができる。
本発明は、下記式（Ｉ）で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカーを提供する。
〔式中、
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」としては、メチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ｓｅｃ−ペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基などが挙げられる。中でもメチル基、エチル基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基」としては、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基、ｎ−プロピルカルバモイル基、イソプロピルカルバモイル基、ｎ−ブチルカルバモイル基、イソブチルカルバモイル基、ｓｅｃ−ブチルカルバモイル基、ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル基、ｎ−ペンチルカルバモイル基、イソペンチルカルバモイル基、ｓｅｃ−ペンチルカルバモイル基、ｔｅｒｔ−ペンチルカルバモイル基、ヘキシルカルバモイル基、ジメチルカルバモイル基、ジエチルカルバモイル基、ジ−ｎ−プロピルカルバモイル基、ジ−イソプロピルカルバモイル基、ジ−ｎ−ブチルカルバモイル基、ジ−イソブチルカルバモイル基、ジ−ｓｅｃ−ブチルカルバモイル基、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルカルバモイル基、ジ−ｎ−ペンチルカルバモイル基、ジ−イソペンチルカルバモイル基、ジ−ｓｅｃ−ペンチルカルバモイル基、ジ−ｔｅｒｔ−ペンチルカルバモイル基、ジヘキシルカルバモイル基、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルカルバモイル基などが挙げられる。中でもメチルカルバモイル基、エチルカルバモイル基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基」としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ−ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ−ブトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基などが挙げられる。中でもメトキシ基、ｔｅｒｔ−ブトキシ基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−６アルキルチオ基」としては、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ-プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ−ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ−ブチルチオ基、ｔｅｒｔ−ブチルチオ基、ｎ−ペンチルチオ基、イソペンチルチオ基、ｓｅｃ−ペンチルチオ基、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ基、ヘキシルチオ基などが挙げられる。中でもメチルチオ基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−７アシル基」並びに「Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、Ｃ１−７アシルアミノ基」中の「Ｃ１−７アシル」部分としては、(1)ホルミル基、(2)カルボキシ基、(3)Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、(4)Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基、(5)ベンゾイル基等が挙げられる。
「Ｃ１−６アルキル−カルボニル基」としては、アセチル基、プロパノイル基、ブタノイル基、イソブタノイル基、ペンタノイル基、イソペンタノイル基、ヘキサノイル基などが挙げられる。中でもアセチル基が好ましい。
「Ｃ１−６アルコキシ−カルボニル基」としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｎ−プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ−ブトキシカルボニル基、ｎ−ペンチルオキシカルボニル基、イソペンチルオキシカルボニル基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニル基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニル基、ヘキシルオキシカルボニル基などが挙げられる。中でもメトキシカルボニル基が好ましい。
上記した「Ｃ１−７アシル基」又は「Ｃ１−７アシル」部分の中でも、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基、ベンゾイル基等が好ましく、アセチル基、ベンゾイル基が特に好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−７アシルオキシ基」としては、ホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、イソペンタノイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基、メトキシカルボニルオキシ基、エトキシカルボニルオキシ基、ｎ−プロポキシカルボニルオキシ基、イソプロポキシカルボニルオキシ基、ｎ−ブトキシカルボニルオキシ基、ｎ−ペンチルオキシカルボニルオキシ基、イソペンチルオキシカルボニルオキシ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニルオキシ基、ヘキシルオキシカルボニルオキシ基、ベンゾイルオキシ基などが挙げられる。中でもアセチルオキシ基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−７アシルアミノ基」としては、ホルミルアミノ基、アセチルアミノ基、プロパノイルアミノ基、ブタノイルアミノ基、イソブタノイルアミノ基、ペンタノイルアミノ基、イソペンタノイルアミノ基、ヘキサノイルアミノ基、メトキシカルボニルアミノ基、エトキシカルボニルアミノ基、ｎ−プロポキシカルボニルアミノ基、イソプロポキシカルボニルアミノ基、ｎ−ブトキシカルボニルアミノ基、ｎ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、イソペンチルオキシカルボニルアミノ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニルアミノ基、ヘキシルオキシカルボニルアミノ基、ベンゾイルアミノ基などが挙げられる。中でもアセチルアミノ基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−７アシルチオ基」としては、ホルミルチオ基、アセチルチオ基、プロパノイルチオ基、ブタノイルチオ基、イソブタノイルチオ基、ペンタノイルチオ基、イソペンタノイルチオ基、ヘキサノイルチオ基、メトキシカルボニルチオ基、エトキシカルボニルチオ基、ｎ−プロポキシカルボニルチオ基、イソプロポキシカルボニルチオ基、ｎ−ブトキシカルボニルチオ基、ｎ−ペンチルオキシカルボニルチオ基、イソペンチルオキシカルボニルチオ基、ｓｅｃ−ペンチルオキシカルボニルチオ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシカルボニルチオ基、ヘキシルオキシカルボニルチオ基、ベンゾイルチオ基などが挙げられる。中でもアセチルチオ基が好ましい。
本明細書中、「ハロゲン原子」としては、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられる。中でも塩素原子、フッ素原子、臭素原子が好ましい。
「ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基」としては、上記の「Ｃ１−６アルキル基」における例示に加えて、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基で置換されたＣ１−６アルキル基（下記で詳述）、フェノキシメチル基、アセチルオキシメチル基、アセチルチオメチル基、アセチルアミノメチル基等が挙げられる。
本明細書中、「ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基で置換されたＣ１−６アルキル基」としては、メトキシメチル基、メトキシエチル基、メトキシｎ-プロピル基、メトキシイソプロピル基、エトキシメチル基、ｎ-プロポキシメチル基、ｎ−ブトキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、クロロメトキシメチル基などが挙げられる。中でもメトキシメチル基、メトキシエチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、クロロメトキシメチル基が好ましい。
「Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基」としては、フェニル基、Ｃ１−６アルコキシ基で置換されたフェニル基、Ｃ１−６アルキル基で置換されたフェニル基、ハロゲン原子で置換されたフェニル基、ニトロで置換されたフェニル基（それぞれ、下記で詳述）等が挙げられる。
本明細書中、「Ｃ１−６アルコキシ基で置換されたフェニル基」としては、メトキシフェニル基、エトキシフェニル基、ｎ−プロピルフェニルオキシ基、イソプロピルオキシフェニル基、ｎ−ブチルオキシフェニル基、イソブチルオキシフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基などが挙げられる。中でもメトキシフェニル基、エトキシフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシフェニル基、ジメトキシフェニル基が好ましい。
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基で置換されたフェニル基」としては、メチルフェニル基、エチルフェニル基、ｎ−プロピルフェニル基、イソプロピルフェニル基、ｎ−ブチルフェニル基、イソブチルフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基などが挙げられる。中でも、メチルフェニル基、ｔｅｒｔ−ブチルフェニル基、ジメチルフェニル基が好ましい。
本明細書中、「ハロゲン原子で置換されたフェニル基」としては、塩化フェニル基、フッ化フェニル基、臭化フェニル基、ジ塩化フェニル基、ジフッ化フェニル基、ジ臭化フェニル基などが挙げられる。中でも、フッ化フェニル基、臭化フェニル基、ジ臭化フェニル基が好ましい。
本明細書中、「ニトロ基で置換されたフェニル基」としては、２−ニトロフェニル基、３−ニトロフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。中でも、４−ニトロフェニル基が好ましい。
本明細書中、「シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基」としては、上記の「Ｃ１−６アルコキシ基」における例示に加えて、シアノメトキシ基、メチルチオメトキシ基、メトキシメトキシ基、シアノメトキシメトキシ基などが挙げられる。
本明細書中、「モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基」としては、メチルアミノ基、エチルアミノ基、ｎ−プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ｎ−ブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ｓｅｃ−ブチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ブチルアミノ基、ｎ−ペンチルアミノ基、イソペンチルアミノ基、ｓｅｃ−ペンチルアミノ基、ｔｅｒｔ−ペンチルアミノ基、ヘキシルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジ−ｎ−プロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジ−ｎ−ブチルアミノ基などが挙げられる。中でもメチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、ジエチルアミノ基が好ましい。
本明細書中、「置換されていてもよい」とは、無置換または１〜３個の置換基で置換されている態様を意味する。２または３置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本明細書中、「置換された」とは、１〜３個の置換基で置換されている態様を意味する。２または３置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
本明細書中、「置換された」とは、１〜３個の置換基で置換されている態様を意味する。２または３置換の場合、各置換基は同一であっても異なっていてもよい。
ある好ましい実施形態では、Ｘは、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である。
酸により脱離するヒドロキシ基の保護基は、トリクロロ酢酸又はジクロロ酢酸などのブレンステッド酸により脱保護可能な保護基であれば限定されないが、例えば、トリチル系保護基、シリル系保護基等が挙げられる。
本明細書中、「トリチル系保護基」としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ハロゲン原子等から選ばれる置換基（２個以上の置換基が一緒になって環を形成していてもよい））で置換されていてもよいトリチル基が挙げられ、具体的には、トリチル基（Ｔｒ）、モノメトキシトリチル基（例えば、４−メトキシトリチル基（ＭＭＴｒ））、ジメトキシトリチル基（例えば、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ））、９−フェニルキサンテン−９−イル基（ピクシル基）等が挙げられ、好ましくは、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）である。
本明細書中、「シリル系保護基」としては、例えば、任意の置換基（例えば、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、フェニル基等から選ばれる置換基）でトリ置換されたシリル基が挙げられ、具体的には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、ジメチルメトキシシリル基、メチルジメトキシシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基等が挙げられ、好ましくは、トリメチルシリル基である。
酸により脱離するヒドロキシ基の保護基は、酸による脱保護が容易であることから、トリチル系保護基が好ましく、４，４’−ジメトキシトリチル基（ＤＭＴｒ）がより好ましい。
Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ好ましくは水素原子である。
Ｒ５は、好ましくは水素原子、臭素原子、ニトロ基、シアノ基、シアノメトキシ基、メチルチオメトキシ基、フェノキシメチル基、フェニルチオ基、アセチルオキシメチル基、アセチルアミノ基、アセチル基、アセチルチオメチル基、ニトロフェニル基（４−ニトロフェニル基）、ジブロモフェニル基（３，５−ジブロモフェニル基）、メトキシメトキシ基、クロロメトキシメチル基、ｔｅｒｔ−ブトキシメチル基、ベンゾイル基、メチルチオ基、アセチルアミノメチル基、シアノメトキシメトキシ基などであり、より好ましくは、水素原子である。
式（Ｉ）で表される化合物（核酸固相合成用リンカー）は、固相合成において反応基質（即ち核酸）と担体を結びつけるためのリンカーであり、核酸固相合成用担体の合成開始部位（即ち、後述するＳｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造）を形成する際の原料として用いることができる。ここで、合成開始部位とは、固相合成の伸長反応を行う際に、最初に反応基質を化学結合させる部分を示す。
また、本発明は、下記式（ＩＩ）で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカーを提供する。
〔式中、Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
Ｌは、アンモニア及び／又はアミン類等のアルカリで処理することにより、Ｌ及びＯの共有結合が切断される構造であれば特に限定されるものではなく、
例えば、式（Ｘ）：
例えば、式（Ｘ）：
〔式中、Ｌ１は、不活性な二価の基を表し；＊及び＊＊は、それぞれ、結合部位を表す。〕
で表される二価の基であり；
好ましくは、スクシニル基（Ｌ１が−ＣＨ２ＣＨ２−）である。
で表される二価の基であり；
好ましくは、スクシニル基（Ｌ１が−ＣＨ２ＣＨ２−）である。
本明細書中、「不活性な二価の基」の「不活性な」とは、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基、スルファニル基、スルホ基等の固相合成反応を阻害する官能基を有さないことを示す。
Ｌ１は、好ましくは、主鎖が、炭素原子、酸素原子、硫黄原子及び窒素原子から選ばれる原子（好ましくは、１〜２００個、より好ましくは、１〜２５個、さらに好ましくは、１〜１０個）からなる不活性な二価の基である。
Ｌ１は、より好ましくは、式：−［（ＣＲ２）ａ−Ａ−］ｂ−（ＣＲ２）ｃ−〔式中、Ａは、結合手、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＣＯ−、−Ｐｈ−、−ＯＰｈＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−等を表し；Ｒは、それぞれ独立して、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキルチオ基等を表し；ａ及びｃは、それぞれ独立して、１〜６（好ましくは１〜３）の整数を表し、ｂは、０〜６（好ましくは０〜３）の整数を表す。〕で表される二価の基である。
Ｌ１は、さらに好ましくは、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−Ｐｈ−、−ＣＨ２ＰｈＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２ＰｈＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２ＣＨ２−等である。
Ｌ１は、特に好ましくは、−ＣＨ２ＣＨ２−である。
上記の「Ｐｈ」は、１，４−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，２−フェニレンを示す。
式（ＩＩ）で表される化合物（核酸固相合成用リンカー）は、固相合成において反応基質（即ち核酸）と担体を結びつけるためのリンカーであり、核酸固相合成用担体の合成開始部位（即ち、後述するＳｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造）を形成する際の原料として用いることができる。ここで、合成開始部位とは、固相合成の伸長反応を行う際に、最初に反応基質を化学結合させる部分を示す。固相合成において、式（ＩＩ）中、ＨＯ−Ｌ−で表される部位を予め固相担体に化学結合させておき、Ｘで表される保護基を脱保護して得られるヒドロキシ基に反応基質を化学結合させて、化学反応を繰り返し、伸長させることができる。
また、式（ＩＩ）で表される化合物は、塩の形態も包含する。塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩）等が挙げられる。
また、本発明は、下記式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体（ユニバーサルサポート）を提供する。
〔式中、Ｓｐは、固相担体を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
本明細書中、「核酸」とは、ヌクレオチドがホスホジエステル結合により連結された鎖状の化合物（オリゴヌクレオチド）を意味し、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。核酸は１本鎖、２本鎖のいずれであってもよいが、核酸合成機による効率的な合成が可能であることから、好ましくは１本鎖である。本明細書において「核酸」には、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）等のプリン塩基及びチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）等のピリミジン塩基を含有するオリゴヌクレオチドのみでなく、これらの修飾核酸塩基を含有する修飾オリゴヌクレオチドも含まれる。
Ｓｐで表される固相担体は、過剰に用いた試薬を洗浄によって簡単に除去できる固相合成用の担体であれば特に限定されないが、例えば、ガラス系多孔質担体、又はポリスチレン系多孔質担体、アクリルアミド系多孔質担体などの多孔質ポリマー担体等が挙げられ、好ましくは、ポリスチレン系多孔質担体、ガラス系多孔質担体であり、より好ましくは、ポリスチレン系多孔質担体である。
本明細書中、「ガラス系多孔質担体」とは、ガラスを構成成分として含む多孔質担体をいい、例えば、粒子形状の多孔質ガラス粒子（ＣＰＧ）等が挙げられるが、これらに限定されない。より具体的には、前記ＣＰＧとしては、長鎖のアミノアルキルスペーサーを有するＣＰＧ固相担体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ固相担体）が好適に用いられ、更には、長鎖ヌクレオチドの合成の場合においては、ＣＰＧの孔が２０〜４００ｎｍ、より好ましくは５０〜２００ｎｍ、更に好ましくは１００ｎｍのものが最も好ましく用いられる。
本明細書中、「ポリスチレン系多孔質担体」とは、主にスチレン又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するポリスチレン系多孔質担体が好ましい。
ポリスチレン系多孔質担体としては、例えば、スチレン−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体粒子からなる多孔質担体（特開２００５−０９７５４５、特開２００５−３２５２７２及び特開２００６−３４２２４５を参照）、又はスチレン−（メタ）アクリロニトリル−ヒドロキシスチレン−ジビニルベンゼン系共重合体からなる多孔質担体（特開２００８−０７４９７９を参照）等が挙げられる。
本明細書中、「アクリルアミド系多孔質担体」とは、主にアクリルアミド又はその誘導体の構造単位から構成される樹脂からなる多孔質担体であり、中でも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましく、ヒドロキシ基を有するアクリルアミド系多孔質担体が好ましい。
アクリルアミド系多孔質担体としては、例えば、芳香族モノビニル化合物−ジビニル化合物−（メタ）アクリルアミド誘導体系共重合体からなる多孔質担体等が挙げられる。Ｓｐが、アクリルアミド系固相担体である場合において、（メタ）アクリルアミド誘導体モノマー由来の構造単位の含有量は、少なすぎると核酸の合成量の減少及び合成純度の低下を回避し得るという効果が得られず、他方、多すぎると多孔質樹脂ビーズを形成し難い。従って好ましくは０．３〜４ｍｍｏｌ／ｇ、より好ましくは０．４〜３．５ｍｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは０．６〜３ｍｍｏｌ／ｇである。
本発明において、固相担体は、式（ＬＩＩＩ）：
〔式中、各記号は、上記定義の通りである。〕
で表される構造が導入可能な官能基を有する固相担体であればよい。なかでも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基（特に好ましくは、ヒドロキシ基）を有する固相担体であることが好ましい。この場合において、ＳｐとＬの結合は、例えば、アミド結合又はエステル結合（好ましくは、エステル結合）である。
で表される構造が導入可能な官能基を有する固相担体であればよい。なかでも、アミノ基及び／又はヒドロキシ基（特に好ましくは、ヒドロキシ基）を有する固相担体であることが好ましい。この場合において、ＳｐとＬの結合は、例えば、アミド結合又はエステル結合（好ましくは、エステル結合）である。
本発明において、固相担体中の、式（ＬＩＩＩ）で表される構造が導入可能な官能基の含有量は、特に限定されるものではないが、該官能基の含有量が少なすぎると核酸の収量が低下し、他方、該官能基の含有量が多すぎると、得られる核酸の純度が低下する。従って好ましくは１０〜２０００μｍｏｌ／ｇ、より好ましくは、５０〜１０００μｍｏｌ／ｇ、更に好ましくは１００〜８００μｍｏｌ／ｇである。
式（ＬＩＩＩ）で表される構造が導入可能な官能基がヒドロキシ基である場合、本発明の多孔質粒子のヒドロキシ基量はＪＩＳ Ｋ００７０に基づいた滴定により測定される。
本発明において、固相担体の形状は、特に限定されず、平板状、粒子状、繊維状等いずれの形状であってもよいが、合成反応容器への充填効率を高くすることができ、該反応容器が破損し難いという点から、好ましくは粒子の形状を呈する多孔質ポリマー粒子である。本明細書にて、「粒子」とは、厳密な球状を呈することを意味するのではなく、一定形状（例えば、楕円球状などの略球状、多面体形状、円柱形状、金平糖形状などの異型形状など）を有していればよいことを意味する。
本発明において、固相担体の大きさ（体積）は、特に限定されないが、多孔質粒子のレーザー回折（散乱式）により測定される平均粒径が１μｍよりも小さいと、カラムに充填して使用した場合に背圧が高くなりすぎる、又は送液速度が遅くなるという不具合が生じ、他方、平均粒径が１０００μｍよりも大きいと、カラムに充填したとき、担体粒子間の空隙が大きくなり、一定容量のカラムに効率よく担体粒子を充填することが困難となる。従って好ましくは１〜１０００μｍ、より好ましくは５〜５００μｍ、更に好ましくは１０〜２００μｍである。
本発明において、固相担体の多点ＢＥＴ法により測定した比表面積は、特に限定されないが、比表面積が０．１ｍ２／ｇより小さいと有機溶媒中での膨潤度が低くなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向があり、他方、５００ｍ２／ｇより大きいと、細孔径が小さくなるため、合成反応が起こりにくくなる傾向がある。従って好ましくは０．１〜５００ｍ２／ｇ、より好ましくは１０〜３００ｍ２／ｇ、更に好ましくは５０〜２００ｍ２／ｇである。
本発明において、固相担体の水銀圧入法により測定される平均細孔径は、特に限定はされないが、孔径が小さすぎる場合、合成反応の場が小さくなり所望の反応が起き難くなる、又はヌクレオチド長が所望の数より少なくなる傾向があり、他方、孔径が大きすぎる場合には、反応場であるポリマー粒子表面のヒドロキシ基と反応に関わる物質との接触機会が少なくなるため、歩留まりが低下する傾向がある。従って好ましくは１〜２００ｎｍ、より好ましくは５〜１００ｎｍ、更に好ましくは２０〜７０ｎｍである。
本発明において、固相担体は、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）として市販されている低膨潤性架橋ポリスチレン粒子が特に好ましい。ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）を用いた核酸固相合成方法は、不純物によるピーク面積が少なく、ラボスケールから大量合成系までの幅広いスケールにおいて高収率・高純度が保証されるため、好適に用いられる。
式（ＩＩＩ）で示される核酸固相合成用担体における、Ｓｐで表される固相担体に結合する式（ＬＩＩＩ）で表される構造の形成量（ユニバーサルリンカーの結合量）は、特に限定されるものではないが、リンカーの結合量が少なすぎると核酸の収量が低下するため、好ましくは、４５μｍｏｌ／ｇ以上であり、より好ましくは、５０μｍｏｌ／ｇ以上、さらに好ましくは、６０μｍｏｌ／ｇ以上である。
なお、固相担体に結合するリンカーの量は、分光光度計を用いて公知の方法により測定することができる。
本発明の核酸固相合成用担体の製造方法は、特に限定されないが、例えば、以下のスキーム１（工程１〜８）で示される方法で製造することができる。
〔式中、Ｒ１’〜Ｒ５’は、Ｒ１〜Ｒ５と同意義であり；ＰＧは、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃはそれぞれＣ１−６アルキル基を表し；ＬＧは、置換スルホニルオキシ基を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
本明細書中、「置換スルホニルオキシ基」としては、例えば、アルキルスルホニルオキシ基類（例えば、メチルスルホニルオキシ、エチルスルホニルオキシ、トリフルオロメチルスルホニルオキシ等）、アリールスルホニルオキシ基類（例えば、ベンゼンスルホニルオキシ、ｐ−トルエンスルホニルオキシ、２，４，６−トリメチルベンゼンスルホニルオキシ、２−ニトロベンゼンスルホニルオキシ、４−ニトロベンゼンスルホニルオキシ等）等が挙げられる。
１．工程１
上記スキームの工程１は、化合物（１）を、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒｂ又はＲａ−Ｃ（ＯＲｄ）２−Ｒｂ（式中、ＲｄはＣ１−６アルキル基を示し；その他の記号は、上記定義の通りである。）で表される化合物と、酸条件下で反応させて、化合物（２）を得る工程である。本工程は、無溶媒で行ってもよいし、或いは不活性な溶媒を用いてもよい。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、ケトン系溶媒（例えば、アセトン等）等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、濃硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸等の無機酸類；酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸類が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。
上記スキームの工程１は、化合物（１）を、Ｒａ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒｂ又はＲａ−Ｃ（ＯＲｄ）２−Ｒｂ（式中、ＲｄはＣ１−６アルキル基を示し；その他の記号は、上記定義の通りである。）で表される化合物と、酸条件下で反応させて、化合物（２）を得る工程である。本工程は、無溶媒で行ってもよいし、或いは不活性な溶媒を用いてもよい。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、ケトン系溶媒（例えば、アセトン等）等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。酸としては、例えば、塩酸、硫酸、濃硫酸、硝酸、臭化水素酸、リン酸等の無機酸類；酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、フタル酸、フマル酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸類が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。
２．工程２
上記スキームの工程２は、溶媒中、塩基存在下、化合物（２）をスルホニル化剤と反応させて化合物（３）を得る工程である。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）等が挙げられる。溶媒としては、上記塩基を溶媒として用いてもよく、或いは工程１で挙げられたものと同様の不活性な溶媒を用いてもよい。スルホニル化剤としては、例えば、スルホン酸無水物（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸無水物）又はスルホニルハライド（例えば、ｐ−トルエンスルホニルクロリド）等が挙げられる。
上記スキームの工程２は、溶媒中、塩基存在下、化合物（２）をスルホニル化剤と反応させて化合物（３）を得る工程である。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）等が挙げられる。溶媒としては、上記塩基を溶媒として用いてもよく、或いは工程１で挙げられたものと同様の不活性な溶媒を用いてもよい。スルホニル化剤としては、例えば、スルホン酸無水物（例えば、ｐ−トルエンスルホン酸無水物）又はスルホニルハライド（例えば、ｐ−トルエンスルホニルクロリド）等が挙げられる。
３．工程３
上記スキームの工程３は、溶媒中、塩基存在下、化合物（３）をエステル化剤と反応させて化合物（４）を得る工程である。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）等が挙げられる。溶媒としては、上記塩基を溶媒として用いてもよく、或いは工程１で挙げられたものと同様の不活性な溶媒を用いてもよい。エステル化剤としては、例えば、（ＲｃＣＯ）２Ｏ（式中、Ｒｃは上記定義の通りである。）で表される化合物が挙げられる。また、必要に応じて、活性剤を用いてもよい。活性剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
上記スキームの工程３は、溶媒中、塩基存在下、化合物（３）をエステル化剤と反応させて化合物（４）を得る工程である。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）等が挙げられる。溶媒としては、上記塩基を溶媒として用いてもよく、或いは工程１で挙げられたものと同様の不活性な溶媒を用いてもよい。エステル化剤としては、例えば、（ＲｃＣＯ）２Ｏ（式中、Ｒｃは上記定義の通りである。）で表される化合物が挙げられる。また、必要に応じて、活性剤を用いてもよい。活性剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
４．工程４
上記スキームの工程４は、溶媒中、化合物（４）を酸と反応させて化合物（５）を得る工程である。溶媒は、工程１で挙げられたものと同様のものに加え、水、アルコール系溶媒（例えば、メタノール、エタノール等）を用いることができる。酸は、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
上記スキームの工程４は、溶媒中、化合物（４）を酸と反応させて化合物（５）を得る工程である。溶媒は、工程１で挙げられたものと同様のものに加え、水、アルコール系溶媒（例えば、メタノール、エタノール等）を用いることができる。酸は、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
５．工程５
上記スキームの工程５は、溶媒中、化合物（５）を、塩基条件下にて、保護化剤と反応させて化合物（６ａ）及び（６ｂ）を得る工程である。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、無機塩基（例えば、炭酸ナトリウム等）等が挙げられる。保護化剤は、「酸により脱離するヒドロキシ基の保護基」を導入する際に有機合成において一般に用いられる試薬であれば特に限定されず、例えば、ハロゲン化トリチル類（例えば、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド等）、ハロゲン化シリル類（例えば、トリメチルシリルクロライド等）等が挙げられる。
上記スキームの工程５は、溶媒中、化合物（５）を、塩基条件下にて、保護化剤と反応させて化合物（６ａ）及び（６ｂ）を得る工程である。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。塩基としては、例えば、有機塩基（例えば、ピリジン、トリエチルアミン等）、無機塩基（例えば、炭酸ナトリウム等）等が挙げられる。保護化剤は、「酸により脱離するヒドロキシ基の保護基」を導入する際に有機合成において一般に用いられる試薬であれば特に限定されず、例えば、ハロゲン化トリチル類（例えば、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド等）、ハロゲン化シリル類（例えば、トリメチルシリルクロライド等）等が挙げられる。
６．工程６
上記スキームの工程６は、溶媒中、塩基条件下にて、加熱処理することにより化合物（Ｉ’）を得る工程である。溶媒としては、例えば、水等が挙げられる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
上記スキームの工程６は、溶媒中、塩基条件下にて、加熱処理することにより化合物（Ｉ’）を得る工程である。溶媒としては、例えば、水等が挙げられる。塩基としては、例えば、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
７．工程７
上記スキームの工程７は、化合物（Ｉ’）に、ＨＯ−Ｌ−で表される基を導入して化合物（ＩＩ’）を得る工程である。導入する方法としては、例えば、溶媒中、対応する酸無水物と反応させる方法が挙げられる。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。酸無水物としては、導入する基に対応するものであればよく、例えば、コハク酸無水物、グルタル酸無水物等が挙げられる。また、必要に応じて、塩基や活性剤を加えてもよい。塩基は、工程５で挙げられたものと同様のものを用いることができる。活性剤は、工程３で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
上記スキームの工程７は、化合物（Ｉ’）に、ＨＯ−Ｌ−で表される基を導入して化合物（ＩＩ’）を得る工程である。導入する方法としては、例えば、溶媒中、対応する酸無水物と反応させる方法が挙げられる。溶媒は、不活性な溶媒であればよく、工程１で挙げられたものと同様のものを用いることができる。酸無水物としては、導入する基に対応するものであればよく、例えば、コハク酸無水物、グルタル酸無水物等が挙げられる。また、必要に応じて、塩基や活性剤を加えてもよい。塩基は、工程５で挙げられたものと同様のものを用いることができる。活性剤は、工程３で挙げられたものと同様のものを用いることができる。
８．工程８
上記スキームの工程７は、化合物（ＩＩ’）を、溶媒中、縮合剤及び塩基の存在下、固相担体と反応させることにより、核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）を得る工程である。溶媒は、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、ニトリル系溶媒（例えば、アセトニトリル）等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。縮合剤としては、例えば、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびその塩酸塩等が挙げられる。塩基としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール等が挙げられる。
上記スキームの工程７は、化合物（ＩＩ’）を、溶媒中、縮合剤及び塩基の存在下、固相担体と反応させることにより、核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）を得る工程である。溶媒は、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）、アミド系溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等）、ニトリル系溶媒（例えば、アセトニトリル）等が挙げられ、これら２種以上を混合して用いてもよい。縮合剤としては、例えば、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）およびその塩酸塩等が挙げられる。塩基としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール等が挙げられる。
得られた核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）は、必要により、公知の方法によりキャッピング処理を行ってもよい。例えば、未反応のカルボキシ基は、前記溶媒中、前記縮合剤、前記塩基の存在下、メタノール、エタノールなどのアルコール類とエステル化することによりキャッピングすることができ、未反応の−ＯＨ基又は−ＮＨ２基は、前記溶媒中、前記塩基の存在下、無水酢酸と反応させてアセチル化することによりキャッピングすることができる。
なお、工程１〜８それぞれにおいて、反応温度や反応時間は、用いる試薬、濃度条件、反応速度などに応じて適宜設定すればよく、例えば、反応温度は、通常−８０から１５０℃であり、反応時間は、通常０．１から２００時間である。各試薬の量は、各反応により適宜設定すればよく、例えば、反応基質に対して、０．０１モル当量〜過剰量である。また、原料化合物は、塩の形態であってもよい。
本発明の核酸固相合成用担体を用いた核酸合成は、核酸自動合成装置を用い、自体公知の種々の合成法を用いることができる。本明細書において、「核酸合成反応」とは、特に核酸を構成するヌクレオチドの伸長反応を意味する。即ち、固相担体上に結合したヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに、ヌクレオチドを順次結合させることにより、伸長されたオリゴヌクレオチドを得る。
該核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。
該核酸合成反応としては、Ｈ−ホスホネイト法、ホスホエステル法、固相ホスホロアミダイト法などが挙げられるが、なかでも、核酸の合成能力が高く、高純度の核酸が得られることから、固相ホスホロアミダイト法が好ましい。
固相ホスホロアミダイト法による核酸合成反応の好ましい実施態様としては、例えば、本発明の核酸固相合成用担体（ＩＩＩ’）を核酸自動合成装置の反応カラムに投入し、下記で表される工程Ａ１〜Ａ３を経て、さらに工程Ｂ１〜Ｂ３を単数又は複数回繰り返し、最後に工程Ｃ２（必要に応じて工程Ｃ１）を経ることにより核酸を製造する方法が挙げられる。
〔式中、Ｂａｓｅは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を表し；ＷＧは、それぞれ独立して、電子吸引性基を表し；Ｒ６は、それぞれ独立して、水素原子、又は保護されていてもよいヒドロキシ基を表し；Ｒ７は、それぞれ独立して、Ｏ又はＳを表し；Ｒ８及びＲ９は、それぞれ独立して、Ｃ１−６アルキル基を示すか、或いは一緒になって環を形成してもよく；ｎは、０以上の整数を表し；ｍは、１以上の整数を表し；その他の記号は、上記定義の通りである。〕
本明細書中、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基、アデニル基、グアニル基や、これらの修飾核酸塩基である、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等が挙げられる。
本明細書中、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アデニル基、グアニル基及びシトシル基又は修飾核酸塩基のアミノ基が保護されていてもよいことを示し、アミノ基の保護基としては、核酸の保護基として使用されるものであれば特に制限されず、具体的には、例えば、ベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリル、フェニルアセチル、フェノキシアセチル、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、４−イソプロピルフェノキシアセチル等が挙げられる。
ＷＧで表される「電子吸引性基」としては、例えば、シアノ、ニトロ、Ｃ１−６アルキルスルホニル、ハロゲン原子を挙げることができ、中でも、シアノが好ましい。
Ｒ６で表される「保護されていてもよいヒドロキシ基」としては、２−シアノエチル、２−ニトロエチル、４−ニトロフェネチル、フェニルスルホニルエチル、メチルスルホニルエチル、トリメチルシリルエチル、ジフェニルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、メチルフェニルカルバモイル、１−ピロリジニルカルバモイル、モルホリノカルバモイル、４−（ｔｅｒｔ−ブチルカルボキシ）ベンジル、４−［（ジメチルアミノ）カルボキシ］ベンジル、４−（フェニルカルボキシ）ベンジル、及びシリル系保護基等で保護されていてもよいヒドロキシ基が挙げられる。
ｎは、好ましくは、０〜２００の整数であり、より好ましくは、１〜１００の整数である。ｍは、好ましくは、１〜２０１の整数であり、より好ましくは、２〜１０１の整数である。
１．脱保護工程（工程Ａ１、Ｂ１及びＣ１）
上記スキームにおいて、工程Ａ１、Ｂ１及びＣ１で示される脱保護工程は、酸を反応カラムに流し、担体（ＩＩＩ’）、（ＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ）におけるヒドロキシ基の保護基を脱保護する工程である。酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。酸は単独で用いてもよいし、溶媒と混合して用いてもよい。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
上記スキームにおいて、工程Ａ１、Ｂ１及びＣ１で示される脱保護工程は、酸を反応カラムに流し、担体（ＩＩＩ’）、（ＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ）におけるヒドロキシ基の保護基を脱保護する工程である。酸としては、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリクロロ酢酸、メタンスルホン酸、塩酸、酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸等が挙げられる。酸は単独で用いてもよいし、溶媒と混合して用いてもよい。溶媒としては、例えば、ハロゲン系溶媒（例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等）、芳香族系溶媒（例えば、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等）、脂肪族系溶媒（例えば、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等）、エーテル系溶媒（例えば、ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、テトラヒドロフラン等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
２．縮合工程（工程Ａ２及びＢ２）
上記スキームにおいて、工程Ａ２及びＢ２で示される縮合工程は、溶媒中、ホスホロアミダイト（Ｖ）を、担体（ＩＩＩ’’）又は（ＸＩＩＩ）のヒドロキシ基と縮合反応させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。本工程では、必要に応じて活性剤を用いてもよい。活性剤としては、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ−フェニルベンズイミダゾリウムトリフラート、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、Ｎ−ＰｈＩＭＰ、５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート、トリアゾリウムトリフラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はＮ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロポレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。上記の反応後、必要に応じて、無水酢酸処理によるアセチル化などの公知の方法により、未反応のヒドロキシ基にキャップを行ってもよい。また、本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
上記スキームにおいて、工程Ａ２及びＢ２で示される縮合工程は、溶媒中、ホスホロアミダイト（Ｖ）を、担体（ＩＩＩ’’）又は（ＸＩＩＩ）のヒドロキシ基と縮合反応させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。本工程では、必要に応じて活性剤を用いてもよい。活性剤としては、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、ベンズイミダゾリウムトリフラート（ＢＩＴ）、Ｎ−フェニルベンズイミダゾリウムトリフラート、イミダゾリウムトリフラート（ＩＭＴ）、Ｎ−ＰｈＩＭＰ、５−ニトロベンズイミダゾリウムトリフラート、トリアゾリウムトリフラート、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）又はＮ−（シアノメチル）ピロリジニウムテトラフルオロポレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。上記の反応後、必要に応じて、無水酢酸処理によるアセチル化などの公知の方法により、未反応のヒドロキシ基にキャップを行ってもよい。また、本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
３．酸化工程（工程Ａ３及びＢ３）
上記スキームにおいて、工程Ａ３及びＢ３で示される酸化工程は、溶媒中、担体（ＩＶ）又は（ＸＩＶ）を、酸化剤又は硫化剤と反応させて、酸化又は硫化させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ−クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等が挙げられる。硫化剤としては、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、硫黄等が挙げられる。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
上記スキームにおいて、工程Ａ３及びＢ３で示される酸化工程は、溶媒中、担体（ＩＶ）又は（ＸＩＶ）を、酸化剤又は硫化剤と反応させて、酸化又は硫化させる工程である。溶媒としては、例えば、脱保護工程と同様のものが挙げられる。酸化剤としては、ヨウ素、ｍ−クロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、２−ブタノンペルオキシド、ビス（トリメチルシリル）ペルオキシド、１，１−ジヒドロペルオキシシクロドデカン、過酸化水素等が挙げられる。硫化剤としては、３−（（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン、硫黄等が挙げられる。本工程の最後には上記で挙げられたような溶媒で洗浄を行うことが望ましい。
４．後処理工程（工程Ｃ２）
上記スキームにおいて、工程Ｃ２で示される後処理工程は、担体（ＸＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ’）を、アンモニア及び／又はアミン類で処理して核酸（ＸＸＩＩＩ）を回収する工程である。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。アンモニア及び／又はアミン類は、溶媒と混合して用いるのが望ましい。溶媒としては、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。この工程により、中間体（ＸＸＶ）を経て、３’末端にヒドロキシ基を有する核酸（ＸＸＩＩＩ）が生成される。
上記スキームにおいて、工程Ｃ２で示される後処理工程は、担体（ＸＸＩＩ）又は（ＸＸＩＩ’）を、アンモニア及び／又はアミン類で処理して核酸（ＸＸＩＩＩ）を回収する工程である。アミン類としては、例えば、メチルアミン、エチルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン等が挙げられる。アンモニア及び／又はアミン類は、溶媒と混合して用いるのが望ましい。溶媒としては、例えば、水、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール等）等が挙げられる。これらの溶媒は２種以上を適宜の割合で混合して用いてもよい。この工程により、中間体（ＸＸＶ）を経て、３’末端にヒドロキシ基を有する核酸（ＸＸＩＩＩ）が生成される。
以下に、実施例を示して、本発明をより詳細に説明するが、本発明は以下に記載の実施例によって限定されるものではない。
合成例１
化合物（ｈ１）及び（ｈ２）を下記の合成スキームに従って合成した（有限会社新成化学に委託した）。
化合物（ｈ１）及び（ｈ２）を下記の合成スキームに従って合成した（有限会社新成化学に委託した）。
〔式中、Ｔｏｓは、ｐ−トルエンスルホニル基を示し；Ａｃは、アセチル基を示し；ＤＭＴｒは、４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。〕
（工程１） Ｄ−リボース（ａ）をアセトンに溶解し、濃硫酸１滴を加え５０℃で４時間加熱した。炭酸ナトリウムを加え１０分間撹拌した後、ろ過し、化合物（ｂ）を得、そのまま次の工程に用いた。
（工程２） 工程１で得られた化合物（ｂ）をピリジンに溶解し、氷冷下、１当量のＴｏｓ−Ｃｌを加えて、２時間撹拌した。酢酸エチルで抽出し、化合物（ｃ）を得た。
（工程３） 工程２で得られた化合物（ｃ）をピリジンに溶解し、過剰量の無水酢酸及び触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。酢酸エチルで抽出した後、シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｄ）を得た。
（工程４） 工程３で得られた化合物（ｄ）を９０％ＴＦＡ／水に溶解し、室温にて３０分間撹拌した。窒素ブローにて乾燥させた後、ジクロロメタンに溶解し、炭酸ナトリウムを加えて１０分間撹拌し、ろ過し、濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｅ）を得た。
（工程５） 工程４で得られた化合物（ｅ）をピリジンに溶解し、冷却下１．５当量のＤＭＴｒ−Ｃｌを加えた。室温にて終夜撹拌した後、濃縮し、塩基性シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｆ１）及び（ｆ２）を得た。
（工程６） 工程５で得られた化合物（ｆ１）及び（ｆ２）の反応液に、５０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて、５０℃終夜撹拌した。酢酸エチルで抽出、濃縮し、塩基性シリカゲルカラムで精製した。ＤＭＴｒ基の結合位置が異なる化合物（ｇ１）、（ｇ２）をそれぞれ分離し、それぞれを目的物として得た。ＤＭＴ基の結合位置は生成物のＮＭＲ分析で同定した。
（工程７） 工程６で得られた化合物（ｇ１）又は（ｇ２）をピリジンに溶解し、過剰量の無水コハク酸と触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。減圧濃縮後にＨＰＬＣで分取し、化合物（ｈ１）及び（ｈ２）を得た。
（工程１） Ｄ−リボース（ａ）をアセトンに溶解し、濃硫酸１滴を加え５０℃で４時間加熱した。炭酸ナトリウムを加え１０分間撹拌した後、ろ過し、化合物（ｂ）を得、そのまま次の工程に用いた。
（工程２） 工程１で得られた化合物（ｂ）をピリジンに溶解し、氷冷下、１当量のＴｏｓ−Ｃｌを加えて、２時間撹拌した。酢酸エチルで抽出し、化合物（ｃ）を得た。
（工程３） 工程２で得られた化合物（ｃ）をピリジンに溶解し、過剰量の無水酢酸及び触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。酢酸エチルで抽出した後、シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｄ）を得た。
（工程４） 工程３で得られた化合物（ｄ）を９０％ＴＦＡ／水に溶解し、室温にて３０分間撹拌した。窒素ブローにて乾燥させた後、ジクロロメタンに溶解し、炭酸ナトリウムを加えて１０分間撹拌し、ろ過し、濃縮した後、シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｅ）を得た。
（工程５） 工程４で得られた化合物（ｅ）をピリジンに溶解し、冷却下１．５当量のＤＭＴｒ−Ｃｌを加えた。室温にて終夜撹拌した後、濃縮し、塩基性シリカゲルカラムで精製し、化合物（ｆ１）及び（ｆ２）を得た。
（工程６） 工程５で得られた化合物（ｆ１）及び（ｆ２）の反応液に、５０％水酸化ナトリウム水溶液を加えて、５０℃終夜撹拌した。酢酸エチルで抽出、濃縮し、塩基性シリカゲルカラムで精製した。ＤＭＴｒ基の結合位置が異なる化合物（ｇ１）、（ｇ２）をそれぞれ分離し、それぞれを目的物として得た。ＤＭＴ基の結合位置は生成物のＮＭＲ分析で同定した。
（工程７） 工程６で得られた化合物（ｇ１）又は（ｇ２）をピリジンに溶解し、過剰量の無水コハク酸と触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。減圧濃縮後にＨＰＬＣで分取し、化合物（ｈ１）及び（ｈ２）を得た。
実施例１
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
合成例１に示される方法により得られた化合物（ｈ１）及び（ｈ２）と、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））０．５ｇをアセトニトリル５ｍＬに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ０．０１４ｇ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．０１３ｍＬを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。固相担体をアセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、無水酢酸０．２５ｍＬ、Ｎ−メチルイミダゾール０．２５ｍＬ、ピリジン０．３８ｍＬ、４−ジメチルアミノピリジン０．０１２５ｇ、アセトニトリル４．１３ｍＬを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、アセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、下記式：
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
合成例１に示される方法により得られた化合物（ｈ１）及び（ｈ２）と、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））０．５ｇをアセトニトリル５ｍＬに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ０．０１４ｇ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン０．０１３ｍＬを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。固相担体をアセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、無水酢酸０．２５ｍＬ、Ｎ−メチルイミダゾール０．２５ｍＬ、ピリジン０．３８ｍＬ、４−ジメチルアミノピリジン０．０１２５ｇ、アセトニトリル４．１３ｍＬを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、アセトニトリル２５０ｍＬで洗浄後、下記式：
〔式中、円は固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ）を表す。なお、立体の表記は省略する。〕
で示される核酸固相合成用担体（Ａ）を得た。
核酸固相合成用担体（Ａ）における、リンカーの固相担体ヘの結合量を、分光光度計による吸光度（４１２ｎｍ）の測定により算出した。リンカーの固相担体ヘの結合量は、６３．２μｍｏｌ／ｇであった。
核酸固相合成用担体（Ａ）１５．８ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／エタノール（３：１）混合溶液に５５℃で１５時間浸漬して、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
で示される核酸固相合成用担体（Ａ）を得た。
核酸固相合成用担体（Ａ）における、リンカーの固相担体ヘの結合量を、分光光度計による吸光度（４１２ｎｍ）の測定により算出した。リンカーの固相担体ヘの結合量は、６３．２μｍｏｌ／ｇであった。
核酸固相合成用担体（Ａ）１５．８ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＤＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／エタノール（３：１）混合溶液に５５℃で１５時間浸漬して、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
比較例１
ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した核酸固相合成用担体を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
実施例１と同様にして市販の固相担体ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）に、開裂性リンカーＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＯＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を結合した。該化合物の固相担体ヘの結合量を、実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は４２μｍｏｌ／ｇであった。
この担体２３．８ｍｇを反応カラムに充填し、実施例１と同様にして、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
ＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅを結合した核酸固相合成用担体を用いた、ＤＮＡ２０ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｎ）の合成
実施例１と同様にして市販の固相担体ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）（日東電工株式会社製）に、開裂性リンカーＤＭＴ−ｄＴ−３’−ｓｕｃｃｉｎａｔｅ（Ｂｅｉｊｉｎｇ ＯＭ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ製）を結合した。該化合物の固相担体ヘの結合量を、実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は４２μｍｏｌ／ｇであった。
この担体２３．８ｍｇを反応カラムに充填し、実施例１と同様にして、２０ｍｅｒ（５’−ＡＴＡＣＣＧＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＴＴ−３’：配列番号１）のＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｎ（５’末端保護基を外さない方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、固相担体からの該ＤＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。
実験例１
実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。図１（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。
その結果、実施例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；６４３９）。一方、比較例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークも、３'末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが、確認された（分子量（測定値）；６４３９）。
実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。図１（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例１及び比較例１にて得られたＤＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；３０℃）。
その結果、実施例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；６４３９）。一方、比較例１で作製したＤＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークも、３'末端にヒドロキシ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド２０ｍｅｒであることが、確認された（分子量（測定値）；６４３９）。
実施例２
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
実施例１で作製した本発明の核酸固相合成用担体（Ａ）１５．８ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／メチルアミン（１：１）混合溶液に６５℃で１．５時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、トリエチルアミン３フッ化水素／ジメチルスルホキシド（５：１）を加え、６５℃で１．５時間保温し、ＲＮＡ２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護し、５０μＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた。
核酸固相合成用担体（Ａ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
実施例１で作製した本発明の核酸固相合成用担体（Ａ）１５．８ｍｇを反応カラムに充填し、ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成装置 ＡＢＩ３４００（アプライドバイオシステムズ製）を用いて、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、該ＲＮＡオリゴヌクレオチドが結合した固相担体を３０％アンモニア水／メチルアミン（１：１）混合溶液に６５℃で１．５時間浸漬して、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、トリエチルアミン３フッ化水素／ジメチルスルホキシド（５：１）を加え、６５℃で１．５時間保温し、ＲＮＡ２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護し、５０μＭ酢酸ナトリウム溶液を加えた。
比較例２
核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
エチレン及びフランをシュレンク型反応管に加えて、室温で反応させた。触媒として四酸化オスミウムを用いて、生成物を酸化させた。次に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを反応させて、一部のヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護し、化合物を得た。その化合物を、ピリジンに溶解し、過剰量の無水コハク酸と触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。その後、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））をアセトニトリルに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。アセトニトリル２５０ｍLで洗浄した後、無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、アセトニトリルを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、アセトニトリル２５０ｍLで洗浄した後、下記式：
核酸固相合成用担体（Ｂ）を用いた、ＲＮＡ２１ｍｅｒ（ＤＭＴ−ｏｆｆ）の合成
エチレン及びフランをシュレンク型反応管に加えて、室温で反応させた。触媒として四酸化オスミウムを用いて、生成物を酸化させた。次に、４，４’−ジメトキシトリチルクロリドを反応させて、一部のヒドロキシ基をＤＭＴｒ基で保護し、化合物を得た。その化合物を、ピリジンに溶解し、過剰量の無水コハク酸と触媒量のＤＭＡＰを加え、室温にて終夜撹拌した。その後、ヒドロキシ基を有する多孔質ポリスチレン系固相担体（日東電工株式会社製、ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標））をアセトニトリルに分散し、前記の化合物、ＨＢＴＵ、Ｎ,Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを加えて、２８℃で２３時間反応させ、前記の化合物を固相担体に担持した。アセトニトリル２５０ｍLで洗浄した後、無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、ピリジン、４−ジメチルアミノピリジン、アセトニトリルを加えて、２８℃で２２時間反応させて未反応のヒドロキシ基をキャップし、アセトニトリル２５０ｍLで洗浄した後、下記式：
〔式中、円は固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ）を表す。なお、立体の表記は省略する。〕
で示される核酸固相合成用担体（Ｂ）を得た。
核酸固相合成用担体（Ｂ）における、リンカーの固相担体ヘの結合量を、実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は、３６．８μｍｏｌ／ｇであった。
この担体２７．１ｍｇを反応カラムに充填し、実施例２と同様にして、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護した。
で示される核酸固相合成用担体（Ｂ）を得た。
核酸固相合成用担体（Ｂ）における、リンカーの固相担体ヘの結合量を、実施例１と同様の方法により測定した結果、結合量は、３６．８μｍｏｌ／ｇであった。
この担体２７．１ｍｇを反応カラムに充填し、実施例２と同様にして、２１ｍｅｒ（５’ｒ（ＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＵＡＣＣＡＵＧＵ）ｄＴ３’：配列番号２）のＲＮＡオリゴヌクレオチドをＤＭＴ−ｏｆｆ（５’末端保護基を外す方法）で合成した（合成スケール１μｍｏｌ）。合成後に、固相担体からの該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの切出しを行った。その後、２’末端保護基、ＴＢＤＭＳ基を脱保護した。
実験例２
実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。図２（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。
その結果、実施例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；７０３６）。一方、比較例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは２本あり、一方は３'末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであったが、もう一方は、ＲＮＡ２１ｍｅｒにリンカーが結合したものであることが確認された（分子量（測定値）；７２１９）。
表１に、実験例１及び２で得られたデータをまとめて示す。
実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による測定を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出；２６０ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；１００ｍＭ ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。図２（ａ）、（ｂ）にそれぞれのＨＰＬＣチャートを示した。
また、実施例２及び比較例２にて得られたＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液について、ＬＣ−ＭＳ分析を行った（測定条件：カラム；Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ ＯＳＴ Ｃ１８ ２．５μｍ ５０×４．６ｍｍ、ＵＶ検出;２５４ｎｍ、ＢｕｆｆｅｒＡ；ＨＦＩＰ／７ｍＭ ＴＥＡ ｉｎ Ｗａｔｅｒ、ｐＨ８．０、ＢｕｆｆｅｒＢ；メタノール、温度；６０℃）。
その結果、実施例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは、３’末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであることが確認された（分子量（測定値）；７０３６）。一方、比較例２で作製したＲＮＡオリゴヌクレオチドのメインピークは２本あり、一方は３'末端にヒドロキシ基を有するＲＮＡオリゴヌクレオチド２１ｍｅｒであったが、もう一方は、ＲＮＡ２１ｍｅｒにリンカーが結合したものであることが確認された（分子量（測定値）；７２１９）。
表１に、実験例１及び２で得られたデータをまとめて示す。
本発明の核酸固相合成用担体は、副生成物の発生を抑えることができ、より効率的にＤＮＡやＲＮＡを合成することができるため、様々な核酸医薬の製造開発において、幅広く用いることができる。
配列番号１：人工合成されたオリゴヌクレオチド（２０ｍｅｒ）
配列番号２：人工合成されたオリゴヌクレオチド（２１ｍｅｒ）
Claims (13)
- 式（Ｉ）：
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。 - 式（ＩＩ）：
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される化合物からなる核酸固相合成用リンカー。 - Ｌが、式（Ｌ）：
で表される二価の基である請求項２に記載の核酸固相合成用リンカー。 - Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である請求項１〜３の何れか１項に記載の核酸固相合成用リンカー。
- 酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である請求項１〜４の何れか１項に記載の核酸固相合成用リンカー。
- 式（ＩＩＩ）：
Ｘは、水素原子、又は酸により脱離するヒドロキシ基の保護基を表し；
Ｌは、アルカリにより切断される連結部分を表し；
Ｓｐは、固相担体を表し；
Ｚ１がＣＨＲ５を表し且つＺ２がＯを表すか、或いはＺ１がＯを表し且つＺ２がＣＨＲ５を表し；
Ｒ１〜Ｒ５は、それぞれ独立して、（１）水素原子；（２）シアノ基；（３）ニトロ基；（４）Ｃ１−６アルキル基でモノ−又はジ−置換されていてもよいカルバモイル基；（５）ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、フェノキシ基、Ｃ１−７アシルオキシ基、Ｃ１−７アシルチオ基、及びＣ１−７アシルアミノ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基；（６）Ｃ１−６アルコキシ基、Ｃ１−６アルキル基、ニトロ基及びハロゲン原子から選ばれる置換基で置換されていてもよいフェニル基；（７）フェニルチオ基；（８）シアノ基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基、シアノ基、及びＣ１−６アルキルチオ基から選ばれる置換基で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基；（９）Ｃ１−６アルキルチオ基；（１０）Ｃ１−７アシル基；（１１）モノ又はジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基；（１２）Ｃ１−７アシルアミノ基；又は（１３）ハロゲン原子を表す。〕
で示される構造を有する核酸固相合成用担体。 - Ｌが、式（Ｌ）：
で表される二価の基である請求項６に記載の核酸固相合成用担体。 - Ｘが、酸により脱離するヒドロキシ基の保護基である請求項６または７に記載の核酸固相合成用担体。
- 酸により脱離するヒドロキシ基の保護基が、トリチル系保護基又はシリル系保護基である請求項６〜８の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体。
- ＳｐとＬの結合が、アミド結合又はエステル結合である請求項６〜９の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体。
- Ｓｐが、多孔質ポリマー担体又はガラス系多孔質担体の固相担体である請求項６〜１０の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体。
- 請求項６〜１１の何れか１項に記載の核酸固相合成用担体上で核酸合成反応を行う工程を含む、核酸の製造方法。
- 該核酸合成反応が、固相ホスホロアミダイト法により行われる、請求項１２に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2015089198A JP2016204316A (ja) | 2015-04-24 | 2015-04-24 | 核酸固相合成用リンカー及び担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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