JPH04112894A - ホスフィン化合物及びこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成方法 - Google Patents
ホスフィン化合物及びこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明はオリゴヌクレオチドの化学合成に有用な新規ホ
スフィン化合物およびそれを用いて得られるヌクレオシ
ドホスホロアミダイト誘導体、さらにそれを用いたオリ
ゴヌクレオチドの合成方法に関する。
スフィン化合物およびそれを用いて得られるヌクレオシ
ドホスホロアミダイト誘導体、さらにそれを用いたオリ
ゴヌクレオチドの合成方法に関する。
［従来の技術および発明が解決しようとする課題１オリ
ゴヌクレオチドの化学合成方法として、ホスホロアミダ
イト法と■−ホスホ洋−ト法が最も効果的な手段として
知られている。しかしながらホスホロアミダイト法にお
いては、原料となるリン化合物の合成が、該リン化合物
の高沸点（１０３−１０５°Ｃ／ ０．０８ｍｍＨｇ）
故に容易でない。
ゴヌクレオチドの化学合成方法として、ホスホロアミダ
イト法と■−ホスホ洋−ト法が最も効果的な手段として
知られている。しかしながらホスホロアミダイト法にお
いては、原料となるリン化合物の合成が、該リン化合物
の高沸点（１０３−１０５°Ｃ／ ０．０８ｍｍＨｇ）
故に容易でない。
また■−ホスホネート法においては、縮合反応に用いる
試薬の不安定性、反応中における塩酸塩の生成といった
問題がある。
試薬の不安定性、反応中における塩酸塩の生成といった
問題がある。
［課題を解決するための手段１
本発明者らはかかる従来法の問題点を解決するため鋭意
検討した結果、新規なホスフィン化合物を合成し、この
化合物が従来使用されてきたリン化合物より容易に合成
できることを見い出した。
検討した結果、新規なホスフィン化合物を合成し、この
化合物が従来使用されてきたリン化合物より容易に合成
できることを見い出した。
さらにこのホスフィン化合物を用いて、ホスホロアミダ
イトユニットを合成し、これを用いてオリゴヌクレオチ
ドを合成できることを見い出し本発明を完成するに到っ
た。
イトユニットを合成し、これを用いてオリゴヌクレオチ
ドを合成できることを見い出し本発明を完成するに到っ
た。
すなわち、本発明の要旨は、
式： （ＣＦ３）２ＣＨＣＨ２ＯＰ（Ｒ）２ （Ｉ）〔
式中、ＲはハロゲンまたはＮ（Ｒつ２（Ｒ１はアルキル
基、ピロリジル基、モルホリノ基を表す。）を表す。〕 で示される新規なホスフィン化合物に存する。
式中、ＲはハロゲンまたはＮ（Ｒつ２（Ｒ１はアルキル
基、ピロリジル基、モルホリノ基を表す。）を表す。〕 で示される新規なホスフィン化合物に存する。
このホスフィン化合物から新規なホスホロアミダイトユ
ニットが合成される。
ニットが合成される。
本発明のもう一つの要旨は、
式： （ＣＦ ３）２ＣＨＣＨ２ＯＰ（Ｒ）２ （Ｉ）
〔式中、ＲはハロゲンまたはＮＣＲ’）２（Ｒｌはアル
キル基、ピロリジル基、モルホリノ基を表す。）を表す
。〕 で示される新規なホスフィン化合物を用いることを特徴
とするオリゴヌクレオチドの合成方法に存する。
〔式中、ＲはハロゲンまたはＮＣＲ’）２（Ｒｌはアル
キル基、ピロリジル基、モルホリノ基を表す。）を表す
。〕 で示される新規なホスフィン化合物を用いることを特徴
とするオリゴヌクレオチドの合成方法に存する。
ＲのハロゲンとしてはＣＱが好ましい。Ｒ１がアルキル
基の場合、アルキル基の炭素数は２〜４であってよいか
、化合物の安定性や蒸留精製の容易さなとからイソプロ
ピル基が最も望ましい。
基の場合、アルキル基の炭素数は２〜４であってよいか
、化合物の安定性や蒸留精製の容易さなとからイソプロ
ピル基が最も望ましい。
本発明のホスフィン化合物は、媒体として乾燥したＴＨ
Ｆ、ＣＨ２ＣＱ２、Ｅｔ２０を用いて、０〜２０°Ｃの
温度、より好ましくは０〜１５°Ｃの温度でｐＨを７．
０として好ましく合成される。
Ｆ、ＣＨ２ＣＱ２、Ｅｔ２０を用いて、０〜２０°Ｃの
温度、より好ましくは０〜１５°Ｃの温度でｐＨを７．
０として好ましく合成される。
本発明によりオリゴヌクレオチドを合成するには、ホス
ホロアミダイト法を用いることが好ましい。ホスホロア
ミダイトユニットは、媒体として乾燥したＴＨＦＳＣＨ
，Ｃｌ２２を用いて、０〜２００Ｃの温度、より好まし
くは０〜１０°Ｃの温度でｐＨを７．０として好ましく
合成され、目的のオリゴヌクレオチドは、該ホスホロア
ミダイトから媒体として乾燥したＣＨ３ＣＮを用いて、
１０〜２０°Ｃの温度、より好ましくは１０〜２０°Ｃ
の温度でｐＨを７．０として好ましく合成される。
ホロアミダイト法を用いることが好ましい。ホスホロア
ミダイトユニットは、媒体として乾燥したＴＨＦＳＣＨ
，Ｃｌ２２を用いて、０〜２００Ｃの温度、より好まし
くは０〜１０°Ｃの温度でｐＨを７．０として好ましく
合成され、目的のオリゴヌクレオチドは、該ホスホロア
ミダイトから媒体として乾燥したＣＨ３ＣＮを用いて、
１０〜２０°Ｃの温度、より好ましくは１０〜２０°Ｃ
の温度でｐＨを７．０として好ましく合成される。
本発明の化合物は合成及び蒸留精製が容易であり、核酸
の化学合成用試薬として極めて有用である。
の化学合成用試薬として極めて有用である。
［実施例］
以下本発明を実施例により詳細に説明する。
実施例１（合成例）
ヘキサフルオロインブトキシ−ジクロロホスフィンの合
成 ４０°Ｃに冷却した三塩化リン（１８０ｍ１２）の無水
アセトニトリル（１００ｍ１２）溶液に、ヘキサフルオ
ロイソブチルアルコール（５４，６ｇ、０．３ｍｏｆ２
）の無水アセトニトリル（１００＋ｎ１２）溶液をゆっ
くりと約１時間滴下し、その後室温で約１３時間（終夜
）反応させた。反応溶液を減圧下に濃縮して溶媒および
過剰の三塩化リンを除いた後、減圧蒸留により沸点３３
〜３５℃／１３ｍｍＨｇのへキサフルオロイソブトキシ
−ジクロロホスフィン留分４０．２９ｇ（１４：１４ｍ
ｍｏＩ２：収率４７．５％）を得た。
成 ４０°Ｃに冷却した三塩化リン（１８０ｍ１２）の無水
アセトニトリル（１００ｍ１２）溶液に、ヘキサフルオ
ロイソブチルアルコール（５４，６ｇ、０．３ｍｏｆ２
）の無水アセトニトリル（１００＋ｎ１２）溶液をゆっ
くりと約１時間滴下し、その後室温で約１３時間（終夜
）反応させた。反応溶液を減圧下に濃縮して溶媒および
過剰の三塩化リンを除いた後、減圧蒸留により沸点３３
〜３５℃／１３ｍｍＨｇのへキサフルオロイソブトキシ
−ジクロロホスフィン留分４０．２９ｇ（１４：１４ｍ
ｍｏＩ２：収率４７．５％）を得た。
分析結果を以下に示す。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＱ、−ＴＭＳ）： ３．５〜４．
２（ｍ、２Ｈ）、２．１〜２．９（ｍ、ＩＨ）”Ｐ
ＮＭＲ（ＣＤＣＩ２３） ： ｌ ７７−８８ｐｐｍ
実施例２ トキシークロロホヌフィンの合成 ７８°Ｃに冷却したヘキサフルオロイソブトキシ−ジク
ロロホスフィン（３３，６５ｇ、１１８ｍｍｏｆｆ）の
無水ジエチルエーテル（３００ｍＱ）溶液に、ジイソプ
ロピルアミン（３５ｍ（１，２，１当量、２５０ ｍｍ
ｏのの無水ジエチルエーテル（ｌｏｏｍ（り溶液をゆっ
くりと約３０分滴下し、その後室温で約２４時間（終夜
）反応させた。生成した塩酸塩を吸引濾過により除き、
エーテルで洗浄した。
２（ｍ、２Ｈ）、２．１〜２．９（ｍ、ＩＨ）”Ｐ
ＮＭＲ（ＣＤＣＩ２３） ： ｌ ７７−８８ｐｐｍ
実施例２ トキシークロロホヌフィンの合成 ７８°Ｃに冷却したヘキサフルオロイソブトキシ−ジク
ロロホスフィン（３３，６５ｇ、１１８ｍｍｏｆｆ）の
無水ジエチルエーテル（３００ｍＱ）溶液に、ジイソプ
ロピルアミン（３５ｍ（１，２，１当量、２５０ ｍｍ
ｏのの無水ジエチルエーテル（ｌｏｏｍ（り溶液をゆっ
くりと約３０分滴下し、その後室温で約２４時間（終夜
）反応させた。生成した塩酸塩を吸引濾過により除き、
エーテルで洗浄した。
濾液と洗液をあわせたものを減圧下に濃縮し、減圧蒸留
により留分３４．１８ｇ（収率８３．３％）を得た。こ
のジイソプロピルアミノ−へキサフルオロインブトキシ
−クロロホスフィン留分の沸点は８７−８９°（！／１
．５ｍｍＨｇと低かった。
により留分３４．１８ｇ（収率８３．３％）を得た。こ
のジイソプロピルアミノ−へキサフルオロインブトキシ
−クロロホスフィン留分の沸点は８７−８９°（！／１
．５ｍｍＨｇと低かった。
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ２．−ＴＭＳ）： ２．９〜４
−３ （ｍ、５Ｈ）、０．７−１．７ （ｍ、１２Ｈ）
”Ｐ ＮＭＲＣＣＤＣＱｓ） ： ｌ ７７−９５ｐ
ｐｍ実施例３ ホスホロアミダイトユニットの合成 塩基部分のアミノ基及び５′−水酸基を保護したヌクレ
オシド誘導体（１ｍｍｏｆｆ）の無水ＴＨＦ（３〜４
＋ｎＱ）溶液にジイソプロピルエチルアミン４当量を加
えた。その溶液を水冷下に撹拌し、そこに実施例２で合
成したジイソプロピルアミノ−ヘキサフルオロインブト
キシ−クロロホスフィン２当量を加え、室温で約１時間
反応させてアミン塩酸塩（白い沈殿）を生成し、ＴＬＣ
で原料の消失を確認した後、飽和食塩水と酢酸エチルを
加えた。水層を酢酸エチルで抽出し有機層とあわせたも
のを無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下に濃縮した。
−３ （ｍ、５Ｈ）、０．７−１．７ （ｍ、１２Ｈ）
”Ｐ ＮＭＲＣＣＤＣＱｓ） ： ｌ ７７−９５ｐ
ｐｍ実施例３ ホスホロアミダイトユニットの合成 塩基部分のアミノ基及び５′−水酸基を保護したヌクレ
オシド誘導体（１ｍｍｏｆｆ）の無水ＴＨＦ（３〜４
＋ｎＱ）溶液にジイソプロピルエチルアミン４当量を加
えた。その溶液を水冷下に撹拌し、そこに実施例２で合
成したジイソプロピルアミノ−ヘキサフルオロインブト
キシ−クロロホスフィン２当量を加え、室温で約１時間
反応させてアミン塩酸塩（白い沈殿）を生成し、ＴＬＣ
で原料の消失を確認した後、飽和食塩水と酢酸エチルを
加えた。水層を酢酸エチルで抽出し有機層とあわせたも
のを無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下に濃縮した。
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（下記注意
参照）で精製することにより、対応するホスホロアミダ
イトユニットを得た。
参照）で精製することにより、対応するホスホロアミダ
イトユニットを得た。
各ヌクレオシド誘導体の収率及び”Ｐ−ＮＭＲのスペク
トルデータを以下に示す。
トルデータを以下に示す。
塩基 収率（％） ”Ｐ−ＮＭＲ（ｐｐｍ）Ａ”
−９１，８１４７，９８，１４８，２８ｃ′”
７４．０ １４７．６６．１４８．１１Ｃ”
６８．８ １４８．３３Ｔ ８３．
９ １４７．９５注二カラムクロマトグラフイーに
使用したシリカゲルは、カラム作成時に１％のトリエチ
ルアミンを含むジクロロメタン溶液でその酸性度を落と
してかもカラムに充填した。さらに石油エーテルまたは
ヘキサンでその溶媒を置換したものに対して混合物を充
填し、初めに石油エーテルまたはヘキサンを流し、さら
にジクロロメタン、ジクロロメタンと酢酸エチルの３〜
１混合液の順で溶出しｌこ。
−９１，８１４７，９８，１４８，２８ｃ′”
７４．０ １４７．６６．１４８．１１Ｃ”
６８．８ １４８．３３Ｔ ８３．
９ １４７．９５注二カラムクロマトグラフイーに
使用したシリカゲルは、カラム作成時に１％のトリエチ
ルアミンを含むジクロロメタン溶液でその酸性度を落と
してかもカラムに充填した。さらに石油エーテルまたは
ヘキサンでその溶媒を置換したものに対して混合物を充
填し、初めに石油エーテルまたはヘキサンを流し、さら
にジクロロメタン、ジクロロメタンと酢酸エチルの３〜
１混合液の順で溶出しｌこ。
実施例４
チミジンニ量体の合成（液相法）
無水アセトニトリル２０ｍＱに３′−〇−ベンゾイルチ
ミジン１当量と実施例３で合成した５′Ｏ−ジメトキシ
トリチル３′−〇−ホスホロアミダイトユニット１．４
当量を溶解し、ＩＨ−テトラゾール４当量を加えた。室
温で約１時間撹拌しＴＬＣで原料の消失を確認した後、
ＴＨＦと水とｐｙの４４＋３：３混合液中０．１Ｍ
Ｉ２により酸化した。約５分撹拌した後、飽和食塩水と
酢酸エチルを加え、水層を酢酸エチルで抽出し有機層と
あわせたものを無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下に
濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶出溶媒ジクロロメタン：メタノール−９８：２）で
精製することにより、対応する完全に保護されたチミジ
ンニ量体が定量的に得られｌこ。
ミジン１当量と実施例３で合成した５′Ｏ−ジメトキシ
トリチル３′−〇−ホスホロアミダイトユニット１．４
当量を溶解し、ＩＨ−テトラゾール４当量を加えた。室
温で約１時間撹拌しＴＬＣで原料の消失を確認した後、
ＴＨＦと水とｐｙの４４＋３：３混合液中０．１Ｍ
Ｉ２により酸化した。約５分撹拌した後、飽和食塩水と
酢酸エチルを加え、水層を酢酸エチルで抽出し有機層と
あわせたものを無水硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下に
濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
（溶出溶媒ジクロロメタン：メタノール−９８：２）で
精製することにより、対応する完全に保護されたチミジ
ンニ量体が定量的に得られｌこ。
実施例５
チミジンニ量体の脱保護
完全に保護されたチミジンニ量体１１２ｍｇ（０。
１ ｍｍｏ４）にアセトニトリル１ｍ（２およびトリエ
チルアミン０ 、１．４ ｍＱ （１ｍｍｏＬ Ｉ
Ｏ当量）を加え、室温で約１０分撹拌した。ＴＬＣで原
料の消失および新たなスポットの生成を確認した後、減
圧下に溶媒とトリエチルアミンを留去し、さらに濃アン
モニア水（５ｍｇ）を加えて５０°Ｃで約３時間処理し
ｔこ。
チルアミン０ 、１．４ ｍＱ （１ｍｍｏＬ Ｉ
Ｏ当量）を加え、室温で約１０分撹拌した。ＴＬＣで原
料の消失および新たなスポットの生成を確認した後、減
圧下に溶媒とトリエチルアミンを留去し、さらに濃アン
モニア水（５ｍｇ）を加えて５０°Ｃで約３時間処理し
ｔこ。
この溶液を濃縮し８０％酢酸５ｍ１２を加えて室温で約
１０分撹拌させた後、溶液を減圧濃縮した。
１０分撹拌させた後、溶液を減圧濃縮した。
コノ溶液のＨＰＬＣ分析によりチミジンニ量体の生成か
確認された。
確認された。
この化合物の構造は、ヘビ毒ホスホジェステラーゼによ
る酵素分解の後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、チミジ
ンと３′−チミジル酸との比がｌ：ｌであったことから
決定した。
る酵素分解の後にＨＰＬＣ分析を行ったところ、チミジ
ンと３′−チミジル酸との比がｌ：ｌであったことから
決定した。
実施例６
チミジン１５量体の合成（固相法）
ＣＰＧ （コントロールポアグラス）に３′末端を結合
させた５′−ジメトキシトリチルチミジン２μｍｏＱ当
量に対して以下に示す操作を１４回繰り返し行った。
させた５′−ジメトキシトリチルチミジン２μｍｏＱ当
量に対して以下に示す操作を１４回繰り返し行った。
Ｃつ Ｃつ
以上の操作を１４回繰り返したＣＰＧに対し濃アンモニ
ア水を加えて目的化合物をＣＰＧより切断し、さらに濃
アンモニア水中で約５０°ＣＴｌ０時間処理してリン酸
部位の保護基の除去を行った。
ア水を加えて目的化合物をＣＰＧより切断し、さらに濃
アンモニア水中で約５０°ＣＴｌ０時間処理してリン酸
部位の保護基の除去を行った。
得られた溶液を減圧下で濃縮しＨＰＬＣを用いて目的部
分のピークを分取し減圧下で濃縮した。さらに５′末端
に結合しているジメトキントリチル基を切断するために
残渣に８０％酢酸を加えて室温で約１５分処理した後、
減圧下に濃縮した。これをＨＰＬＣで分取することによ
って目的とするチミジン１５量体を得た。この化合物は
２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度及び鎖長
を確認した。
分のピークを分取し減圧下で濃縮した。さらに５′末端
に結合しているジメトキントリチル基を切断するために
残渣に８０％酢酸を加えて室温で約１５分処理した後、
減圧下に濃縮した。これをＨＰＬＣで分取することによ
って目的とするチミジン１５量体を得た。この化合物は
２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で純度及び鎖長
を確認した。
［発明の効果］
本発明のホスフィン化合物は安定であるので長時間保存
することかでき、沸点が比較的低いので容易に合成する
ことができる。また、本発明によれば反応中に生成する
塩酸塩による問題もなくオリゴヌクレオチドを合成する
ことができる。
することかでき、沸点が比較的低いので容易に合成する
ことができる。また、本発明によれば反応中に生成する
塩酸塩による問題もなくオリゴヌクレオチドを合成する
ことができる。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、式：（ＣＦ＿３）＿２ＣＨＣＨ＿２ＯＰ（Ｒ）＿２
（ I ）〔式中、ＲはハロゲンまたはＮ（Ｒ＾１）＿２
（Ｒ＾１はアルキル基、ピロリジル基、モルホリノ基を
表す。）を表す。〕 で示されるホスフィン化合物。 ２、式：（ＣＦ＿３）＿２ＣＨＣＨ＿２ＯＰ（Ｒ）＿２
（ I ）〔式中、ＲはハロゲンまたはＮ（Ｒ＾１）＿２
（Ｒ＾１はアルキル基、ピロリジル基、モルホリノ基を
表す。）を表す。〕 で示されるホスフィン化合物を用いることを特徴とする
オリゴヌクレオチドの合成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23218890A JPH04112894A (ja) | 1990-08-31 | 1990-08-31 | ホスフィン化合物及びこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23218890A JPH04112894A (ja) | 1990-08-31 | 1990-08-31 | ホスフィン化合物及びこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04112894A true JPH04112894A (ja) | 1992-04-14 |
Family
ID=16935382
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23218890A Pending JPH04112894A (ja) | 1990-08-31 | 1990-08-31 | ホスフィン化合物及びこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04112894A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023113038A1 (ja) * | 2021-12-17 | 2023-06-22 | リードファーマ株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
-
1990
- 1990-08-31 JP JP23218890A patent/JPH04112894A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TETRAHEDRON LETT.=1988 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023113038A1 (ja) * | 2021-12-17 | 2023-06-22 | リードファーマ株式会社 | オリゴヌクレオチドの製造方法 |
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