JPH0588240B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

（産業上の利用分野） 本発明はホスフアイト法によるオリゴヌクレオ
チド合成に必要なホスホロアミダイト類の簡便な
合成法に関する。 本発明により得られるホスホロアミダイト類
は、遺伝子工学における重要な素材であるオリゴ
ヌクレオチドを合成するための原料として、きわ
めて有用な化合物である。 （従来の技術） 従来オリゴヌクレオチドの合成法としては、ヌ
クレオシドの3′−位と他のヌクレオシドの5′−位
とをリン酸エステルの形で結合させる縮合反応の
種類によつて、トリエステル法、ジエステル法、
ホスフアイト法などが知られている。これらの縮
合反応のうちトリエステル法は下記の反応式
〔〕 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、B¹およびB²は保護
基を有することもある核酸塩基残基を、R²は水
酸基の保護基を、R³はリン酸の保護基を、R⁴は
水素原子または保護基を有する水酸基を、R⁵は
水酸基の保護基を表わす） で示されるように、縮合剤の存在下にヌクレオシ
ド3′−リン酸エステルとヌクレオシド5′−アルコ
ールを縮合させてリン酸トリエステルとする反応
であり、反応収率、反応の容易さなどの点から現
在比較的多く用いられている合成法であるが、反
応速度が遅く、また縮合剤による5′−位水酸基の
スルホニル化という副反応のため、収率が低下す
るなどの欠点を有している。これに対してホスフ
アイト法による縮合反応は下記の反応式〔〕 反応式〔〕

【化】

【化】 （反応式〔〕において、B¹、B²、R²、R³、R⁴
およびR⁵は前記と同一の意味を、R⁶はクロル基
またはテトラゾール基を表わす） で示されるように、ホスフアイト体はすでに活性
化されているため縮合剤を必要とせず、従つて縮
合剤による副反応もおこらず、反応も数分間で完
結するという利点を有する。 （発明が解決しようとする問題点） ホスフアイト法によるオリゴヌクレオチド合成
は、レツチンゲル（Letsinger）らにより提案
〔ジヤーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカ
ル・ソサイエテイ（Journal of the American
Chemical Society），98，3655（1976）〕されたも
ので、下記の反応式〔〕 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、Ｒは２−フエノキシ
アセチル基を、TCEは２，２，２−トリクロロ
エチル基を、MTrはメトキシトリチル基を、Ｔ
はチミンを表わす） で示されるように、5′−位水酸基を２−フエノキ
シアセチル基で保護したチミジンにリン酸化剤
（トリクロロエチルジクロリダイト）を反応させ
てホスホロアミダイトとしたのち、このホスホロ
アミダイトと3′−位水酸基をメトキシトリチル基
で保護したチミジンとを反応し、次いでヨウ素−
水により酸化してチミジンのダイマーを得てい
る。しかし、このリン酸化剤は湿気に対して非常
に不安定であるため、カルーテル（Caruthers）
らは下記の反応式〔〕 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、DMTrはジメトキシ
トリチル基を、R′は−オキソバレリル基を、Ｔ
は前記と同一の意味を表わす） で示すように、反応式〔〕で用いたリン酸化剤
のクロル基の１つをジメチルアミノ基に代えたリ
ン酸化剤を、5′−位水酸基をジメトキシトリチル
基で保護したチミジンと反応させてチミジン−ホ
スホロアミダイトを得ている。このホスホロアミ
ダイトは比較的安定であり、抽出操作により精製
することが可能である。このホスホロアミダイト
はテトラゾールにより活性化したのち次の縮合反
応に用いられる〔テトラヘドロン・レターズ
（Tetrahedron Letters）、1859（1981）〕。なお、
現在はジメチルアミノ基の代りにジイソプロピル
アミノ基を導入したホスホロアミダイトが一般に
用いられている。 すなわち、現在通常に用いられているホスホロ
アミダイトの合成法では、下記の反応式〔〕 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、iPrはイソプロピル
基を、R¹は置換基を有することもあるアルキル
基またはアリール基でありリン酸保護基となりう
る基を、B¹およびR²は前記と同一の意味を表わ
す） で示すように、まず脂肪族または芳香族アルコー
ルと三塩化リンを反応させてジクロリダイト体と
し、次いでジイソプロピルアミンと反応させて得
られたリン酸化剤を、5′−位水酸基を保護したヌ
クレオシドと反応させてホスホロアミダイトとす
るものであり、この方法では得られたホスホロア
ミダイトのリン酸保護基R¹が、リン酸化剤合成
に用いるアルコールに対応して決定されるため、
１種類のリン酸化剤からは１種類のリン酸保護基
をもつホスホロアミダイトしか合成できず、従つ
てホスホロアミダイトのリン酸保護基に対応する
数だけのリン酸化剤を必要とする。またこの方法
ではリン酸保護基として導入される保護基R¹の
種類も限定されるという問題点を有する。 （問題点を解決するための手段） 本発明者らは上記の如き問題点を解決するため
に検討を加えた結果、下記の反応式〔〕に示す
ホスホロアミダイトの新規な合成法を見い出し、
本発明を完成したものである。 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、ＸはＯ、Ｓまたは
NHを、B¹、R¹、R²およびiPrは前記と同一の意
味を表わす） すなわち、ジイソプロピルアミンと三塩化リン
を反応させてリン酸化剤（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピ
ルアミノホスホジクロリダイト）を合成したの
ち、このリン酸化剤を用いて5′−位水酸基を保護
したヌクレオシドの3′−位水酸基のリン酸化を行
い、引続き対応するアルコール類、フエノール
類、チオール類もしくはアミン類のいずれかと反
応させることで、リン酸保護基R¹を自由に選択
し、かつ容易に導入することを可能にしたもので
ある。 さらに本発明を上記の反応式〔〕により具体
的に説明すると、三塩化リンと２当量のジイソ
プロピルアミンとを、エーテル溶媒中、反応温
度10℃以下で１〜５時間反応する。反応終了後、
析出した塩を別し、液を常圧で蒸留してエー
テルを留去したのち、オイル状の残渣を更に減圧
蒸留して無色透明液体のリン酸化剤Ｎ、Ｎ−ジイ
ソプロピルアミノホスホジクロリダイトが得ら
れる。次に、このリン酸化剤と、5′−位水酸基
を保護基R²例えばトリチル基、メトキシトリチ
ル基、ジメトキシトリチル基などの脱保護反応の
さい選択的に脱離する保護基により保護したヌク
レオシドとを、ジイソプロピルエチルアミンの
存在下に、−10℃前後の低温で15〜60分間反応を
行い、ヌクレオシドの3′−位水酸基をリン酸化
した反応中間体とする。次いで、この反応中間
体を単離することなく、引続き一般式(1) R¹−XH (1) （式中、R¹およびＸは前記と同一の意味を表
わす） で示される化合物とを、ジイソプロピルエチル
アミンの存在下に、室温で15〜60分間反応させる
ことで、リン酸保護基R¹を導入したホスホロア
ミダイトが好収率で得られる。なお、一般式(1)
において、R¹は置換基を有することもあるアル
キル基またはアリール基であり、リン酸保護基と
なり得るものである。従つて一般式(1)で示される
化合物としては、アルコール類、フエノール
類、チオール類もしくはアミン類が用いられ、代
表的なものとしてはメタノール、２−シアノエタ
ノール、トリクロロエタノール、トリクロロジメ
チルエタノール、クロロフエノール、ベンゼンチ
オール、ｐ−ニトロベンゼンチオール、アニリン
などが例示されるが、本発明の目的を達成する化
合物であればこれらに限定されるものではない。 また、本発明におけるヌクレオシドは2′−位
が水素原子である2′−デオキシリポヌクレオシド
のほか、2′−位が水酸基であるリポヌクレオシド
の場合も、2′−位水酸基を適切な保護基により保
護することにより、2′−デオキシリポヌクレオシ
ドと同様に用いることができる。 また、本発明の如き合成法をとることにより、
従来のホスホロアミダイトはＰ−Ｏ結合によりリ
ン酸保護基が結合しているのみであつたのに対
し、本発明ではＰ−Ｏ結合のほかＰ−Ｓ結合、Ｐ
−Ｎ結合によるリン酸保護基の結合を可能とした
ものであり、Ｐ−Ｓ結合、Ｐ−Ｎ結合を有するホ
スホロアミダイトは新規な化合物である。 さらに本発明で得られたホスホロアミダイトを
用い、下記の反応式〔〕 反応式〔〕

【化】 （反応式〔〕において、B¹、B²、R¹、R²、R³
およびiPrは前記と同一の意味を表わす） で示すように、ホスホロアミダイト3′−位水酸基
を保護したヌクレオシドとをアセトニトリル中テ
トラゾールの存在下に縮合反応を行い、次いでヨ
ウ素−水で酸化して完全保護したジヌクレオチド
を得る。このジヌクレオチドの保護基を選択的に
部分脱離し、更に縮合反応をくり返すことによ
り、鎖長が２個以上のオリゴヌクレオチドを合成
することができる。 （発明の効果） 本発明で用いるリン酸化剤Ｎ、Ｎ−ジイソプロ
ピルアミノホスホジクロリダイトは、三塩化リン
とジイソプロピルアミンより容易に合成でき、従
来のリン酸化剤に比して保存安定性が良好であ
る。また、本発明のホスホロアミダイトの合成法
は、従来の合成法では導入しにくかつたリン酸保
護基を容易に導入可能にすると共に、従来得られ
なかつたＰ−Ｓ結合、Ｐ−Ｎ結合によるリン酸保
護基の結合を可能としたものである。 （実施例および実験例） 実施例 １ リン酸化剤（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ
ホスホジクロリダイト）の合成 三塩化リン21.8ml（0.25モル）を含む乾燥エー
テル100mlを塩化ナトリウム−氷で約−10℃に冷
却した中へ、攪拌しながら乾燥エーテル70mlに溶
解したジイソプロピルアミン70.1ml（0.5モル）
を、約2.5時間を要して滴下する。滴下終了後、
反応液の温度を室温まで戻し、更に１時間攪拌を
続けて反応を完結させる。次いで析出した塩を
別し、液を常圧で蒸留してエーテルを留差す
る。更に黄色オイル状の残渣を減圧蒸留して、無
色透明液体のＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホス
ホジクロリダイトを67％の収率で得た。 沸点 72〜73℃／７mmHg 31P−NMR スペクトルを第１図に示す。 チミジン−ホスホロアミダイトの合成

【化】

【化】 乾燥ジクロロメタン２mlおよび乾燥Ｎ、Ｎ−ジ
イソプロピルエチルアミン１ml中に、前記で得
たリン酸化剤１〜450μを溶解し、食塩−氷で−
10℃に冷却、窒素雰囲気下で攪拌しながら、乾燥
ジクロロメタン３mlに溶解した5′−０−ジメトキ
シトリチル−チミジン２〜0.5mmoを10分間で滴
下した。滴下終了後約30分間攪拌を続けてリン酸
化反応を行い、反応中間体３〜とする。反応中間体
３〜中に、乾燥ジクロロメタン３mlに溶解したメタ
ノール10当量を滴下したのち、室温で30分間攪拌
を続けてリン酸保護基としてメトキシ基を有する
チミジン−アミダイト４〜を得た。このチミジン−
アミダイト４〜はシリカゲルカラム（φ2cm×５cm）
（メルクタイプ60）でジクロロメタン／酢酸エチ
ル／トリエチルアミン＝50／50／２（Ｖ／Ｖ／Ｖ）
により精製した。収率76％。 実施例 ２〜９ 実施例１−で得られた反応中間体３〜に、実施
例１−のメタノールの代りに第１表記載のアル
コール、フエノール、チオフエノール、アニリン
（以下、アルコール等と総称）それぞれ10当量を
実施例１−と同じ条件で反応させ、精製して、
用いたアルコール等に対応するリン酸保護基を有
するチミジンーアミダイトを第１表記載の収率で
得た。代表的なアミダイトの³¹Ｐ−NMRスペク
トルを第２〜４図に示す。 （以下余白）

【表】

【化】 前記実施例で得られたチミジン−アミダイト
４〜′（リン酸保護基Ｒは第２表に記載）0.15mmo
と3′−０−ベンゾイル−チミジン５〜0.1mmo
を合わせてピリジン共沸し、窒素置換したのち、
アセトニトリル３mlに溶解したテトラゾール
1.5mmoを加えて、室温で30分間縮合反応を行
う。次に室温下に0.1Mヨウ素（テトラヒドロフ
ラン／ピリジン／水＝40／10／１）をヨウ素の色
が持続するまで加え、更に30分間攪拌して酸化を
行う。反応は進行はそれぞれの段階において、
TLC（クロロホルム／メタノール＝10／１）ある
いはRTLC（アセトン／水＝７／３）で確認した。
酸化反応終了後、ジクロロメタン−５％亜硫酸水
素ナトリウム水溶液で抽出し、有機層を水で２回
洗浄したのち濃縮する。残渣をシリカゲルカラム
（メルクタイプ60H）により精製し、少量のクロ
ロホルムに溶解したのちｎ−ペンタンに滴下して
粉末化したジヌクレオチドを第２表記載の収率で
得た。

【表】

【図面の簡単な説明】 第１図はリン酸化剤

【式】の³¹P −NMRスペクトルを示す。第２〜４図はそれぞ
れ次のチミジン−アミダイトの³¹Ｐ−NMRスペ
クトルを示す。 第２図

【化】 第３図

【化】 第４図

【化】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 三塩化リンとジイソプロピルアミンを反応さ
   せて得られるリン酸化剤Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
   アミノホスホジクロリダイトと、5′−位水酸基を
   保護基により保護したヌクレオシドとを反応させ
   て、該ヌクレオシドの3′−位水酸基をリン酸化し
   たのち、一般式(1) R¹−XH(1) （式中、ＸはＯ，ＳまたはNHを、R¹は置換基
   を有することもあるアルキル基またはアリール基
   であり、リン酸保護基となりうる基を表わす） で示されるアルコール類、フエノール類、チオー
   ル類もしくはアミン類のいずれかと反応させて一
   般式(2) 【化】 （式中、Ｂは保護基を有することもある核酸塩基
   残基を、R²は水酸基の保護基を、iPrはイソプロ
   ピル基を、ＸおよびR¹は前記と同一の意味を表
   わす） で示されるホスホロアミダイト類を合成すること
   を特徴とするホスホロアミダイト類の合成法。