JP2549495B2 - 燐酸化剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は燐酸化剤として有用な式III

【化１１】 ｛式中、Ｒ¹は式IIIａまたはIIIｂ

【化１２】 で表される基を示し、上記式中Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷は同
一または相異なることができて各々水素またはメチルを
示し、 Ｒ⁸は式IIIｃ、IIIｄまたはIIIｅあるいはシアノまたは
Ａｒの基を示し、

【化１３】 （上記式中、Ｒ¹⁰は低級アルキルまたはＡｒを示し、Ｇ
は同一または相異なることができて、ＣまたはＮを示す
が、しかし少くとも１個のＧはＮを表し、Ａｒは塩素、
弗素、ニトロおよびシアノの系に属する１〜５個の同一
または相異なる置換基により置換しうるかあるいは該電
子求引性置換基の外に１個または２個の親油基により置
換しうるフェニル基を示し、ｙは０、１または２であ
る）、 Ｒ⁹は式IIIｆまたはIIIｇ

【化１４】 で表される基を示し、上記式中Ｙは塩素、臭素または沃
素の系に属する同一または相異なる置換基を示す。Ｒ²
はＲ¹の意味を有することができ、その際同一または相
異なっていてもよく、あるいはＲ²は低級アルキル、式I
IIｈ −ＣＨ₂−Ａｒ IIIｈ を有する基またはＡｒを示すが、ただし後者はアルカリ
によりＲ¹よりも容易に分裂されうることを条件とす
る。

【０００２】Ｒ^５およびＲ^８は一緒になって以下の式

【化１５】 を有する基を表し、そしてＲ^３およびＲ^４は同一または
相異なることができて、１〜８個の炭素原子を有するア
ルキル、５〜１２個の炭素原子を有するシクロアルキ
ル、ベンジルまたはフェニルを示すかあるいはそれらが
結合している窒素原子と一緒になって、適切ならばさら
に別のヘテロ原子および置換基を含有する飽和または不
飽和複素環式環を示す｝を有する化合物に関する。さら
に詳しく言えば本発明は、式ＩＩＩにおいてＲ^１および
Ｒ^２は互いに独立していて、−ＣＨ_３、ＮＣ−ＣＨ_２−
ＣＨ_２−またはＯ_２Ｎ−Ｃ_６Ｈ_４−ＣＨ_２−ＣＨ_２−を
示しそしてＲ^３およびＲ^４は両方ともイソプロピル基を
示す化合物に関する。

【０００３】該化合物は式中Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷が水素
を示し、Ｒ⁸がシアノ、フェニルを示すかあるいはニト
ロ、塩素、あるいは１個または２個のＣ₈〜Ｃ₂₄炭化水
素基により置換されているフェニルを示し、Ｒ⁹が式III
ｆを有する基を示し、Ｒ²が低級アルキルであるかある
いはＲ¹の意味を有しそしてＲ³およびＲ⁴がＣ₁〜Ｃ₆ア
ルキル、シクロヘキシル、ベンジルまたはフェニルを示
しあるいは窒素原子と一緒になってピロリジル、ピペリ
ジル、モルホリル、トリアゾロ、ベンゾトリアゾロまた
はテトラゾロを示しさらに塩素、弗素、ニトロまたはシ
アノにより置換されうる芳香族基であることができる化
合物であり、さらに好ましくはＲ⁸がモノニトロフェニ
ル、ジニトロフェニル、モノクロロフェニル、ジクロロ
フェニル、トリクロロフェニルまたは２−クロロ−４−
ニトロフェニルあるいは電子求引性置換基の外に１個ま
たは２個のＣ₁₂〜Ｃ₁₈炭化水素基により置換されている
フェニルを示し、Ｒ⁹がトリクロロメチルであり、Ｒ²が
メチルでありそしてＲ³およびＲ⁴が低級アルキルを示す
化合物である。

【０００４】本発明はまた式IV

【化１６】 〔式中、Ｒ¹、Ｒ²およびｎは前述の定義を有し、Ｒはも
はやそれ以上燐酸化しうる水素原子を有していない有機
基であり、Ｚは酸素、硫黄、または−ＮＨ−を表しそし
てｎは１または１より大きい数を示す〕を有する化合物
に関する。

【０００５】該化合物は式中Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷が水素
を示し、Ｒ⁸がシアノ、フェニルであるかあるいはニト
ロ、塩素あるいは１個または２個のＣ₈〜Ｃ₂₄炭化水素
基により置換されるフェニルであり、Ｒ⁹が式IIIｆの基
を示し、Ｒ²が低級アルキルであるかあるいはＲ¹の意味
を有しそしてｎが１または２を示す化合物であり、さら
に好ましくは式中Ｒ⁸がモノニトロフェニル、ジニトロ
フェニル、モノクロロフェニル、ジクロロフェニル、ト
リクロロフェニルまたは２−クロロ−４−ニトロフェニ
ルを示すかあるいは電子求引性置換基の外に１個または
２個のＣ₁₂〜Ｃ ₁₈炭化水素基により置換されるフェニル
を示し、Ｒ⁹がトリクロロメチルであり、Ｒ²がメチルで
ありそしてＲ³およびＲ⁴が低級アルキルを示す化合物で
ある。

【０００６】アシル化しうるヒドロキシル、メルカプト
およびアミノ化合物を本発明の式IIIを有する亜燐酸ジ
エステル−ジアルキルアミドと反応させ、生成する式IV
の亜燐酸トリエステル、チオエステルまたはジエステル
アミドを酸化して５価の燐を含有する相当する化合物を
得ついで燐酸化試薬から生ずる２個のアルコールまたは
フェノール基を塩基の手段によって分裂させると燐酸、
チオ燐酸およびセレノ燐酸のエステル、チオエステルお
よびアミドが製造される。

【０００７】この製造は特に式Ｉ

【化１７】 を有する化合物の製造であり、それは式II

【化１８】 を有する化合物を少くともｎモルの式III

【化１９】 を有する燐酸化試薬と反応させ、生成する式IV

【化２０】 を有する化合物を酸化しついで式Ｖ

【化２１】 を有する酸化された化合物から前記式Ｉの化合物を塩基
手段により単離させることからなる。

【０００８】前記式中、各記号は以下の意味を有する。
Ｒはもはやそれ以上燐酸化しうる水素原子を有していな
い有機基であり、Ｘは酸素、硫黄またはセレンを示し、
Ｚは酸素、硫黄または−ＮＨ−を表し、Ｋａｔは１モル
当量の陽イオンを表し、Ｒ¹は式IIIａまたはIIIｂ

【化２２】 で表される基を示し、上記式中Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷は同
一または相異なることができて各々水素またはメチルを
示し、Ｒ⁸は式IIIｃ、IIIｄまたはIIIｅあるいはシアノ
またはＡｒの基を示し、

【化２３】 （上記式中、Ｒ¹⁰は低級アルキルまたはＡｒを示し、Ｇ
は同一または相異なることができて、ＣまたはＮを示す
が、しかし少くとも１個のＧはＮを表し、Ａｒは塩素、
弗素、ニトロおよびシアノの系に属する１〜５個の同一
または相異なる置換基により置換しうるかあるいは該電
子求引性置換基の外に１個または２個の親油基により置
換しうるフェニル基を示し、ｙは０、１または２であ
る）、ｎは１または１より大きい数を表し、Ｒ⁹は式III
ｆまたはIIIｇ

【化２４】 （上記式中Ｙは塩素、臭素または沃素の系に属する同一
または相異なる置換基を示す）で表される基を示し、Ｒ
²はＲ¹の意味を有することができ、かつその際、同一ま
たは相異なることができあるいはＲ²は低級アルキル、
式IIIｈ −ＣＨ₂−Ａｒ IIIｈ を有する基またはＡｒを示すことができるが、ただし後
者はアルカリによりＲ¹よりも容易に分裂されうること
を条件とし、Ｒ⁵およびＲ⁸は一緒になって次の式IIIｉ

【化２５】 を有する基を表すことができそしてＲ²もメチルの場合
にはＲ¹もメチルを表すことができる。

【０００９】基Ｒ³およびＲ⁴の性質は臨界的ではない
が、ただし式IIの化合物との反応中、基−ＮＲ³Ｒ⁴が分
裂される。Ｒ³およびＲ⁴は同一または相異なることがで
き、それらは１〜８個の炭素原子を有するアルキル、５
〜１２個、好適には８個までの炭素原子を有するシクロ
アルキル、ベンジルまたはフェニルを表すかあるいはそ
れらが結合している窒素原子と一緒になって、適切なら
ばさらに別のヘテロ原子および置換基を含有する飽和ま
たは不飽和複素環式環を表す。

【００１０】前記各記号の好ましい意味は以下のとおり
である。Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷は水素を示し、Ｒ⁸はシア
ノ、フェニルまたはニトロ化フェニル特にモノニトロフ
ェニル例えばｐ−ニトロフェニルまたはジニトロフェニ
ル例えば２,５−ジニトロフェニル、塩素化フェニル特
にモノクロロフェニル、ジクロロフェニルまたはトリク
ロロフェニルあるいは２−クロロ−４−ニトロフェニル
および１個または２個の炭化水素基特に６〜２４個より
好ましくは１２〜１８個の炭素原子を有するアルカン基
により置換されるニトロフェニルを示す。Ｒ⁹は好まし
くは式中Ｙが好適には塩素を表す式IIIｆの基を示す。
Ｒ²は低級アルキル特にメチルであるかあるいはＲ¹の意
味を有しかつその際それはＲ¹と同一であるのが有利で
ある。

【００１１】Ｒ³およびＲ⁴は１〜６個の炭素原子を有す
るアルキル特に低級アルキル、シクロヘキシル、ベンジ
ルまたはフェニルを表しそして窒素原子と一緒になって
ピロリジル、ピペリジル、モルホリル、トリアゾロ、ベ
ンゾトリアゾロまたはテトラゾロを表し、そして該芳香
族基は塩素、弗素、ニトロまたはシアノにより置換され
ていてもよい。「低級」なる表現は４個までの炭素原子
を有する基を表す。ＸおよびＺは酸素を表すのが好まし
い。ｎは１〜６、特に１または２、最適には１を表す。
式中Ｒ¹がメチル以外である式IIIの化合物は新規であ
り、式VIの化合物も同様である。

【００１２】式中Ｒ¹およびＲ²が２−（４−ニトロフェ
ニル）−エチルを表し、ＸおよびＺが酸素を表しそして
Ｒがチミジル基を表す式Ｖの化合物はF. Himmelsbach氏
等による「Tetrahedron Letters」23 (1982) 4793〜47
96に開示されている。これらの化合物はチミジンをビス
−（ｐ−ニトロフェニルエチル）ホスホロモノクロリデ
ートと反応させることにより得られ、その際５′−位置
のヒドロキシル基が第一にアシル化される。この燐酸化
試薬はどちらかと云えば不安定であり、高真空下で蒸留
することもあるいは固体形態で調製することもできなか
った。三塩化燐が出発物質として使用される場合式Ｖを
有する化合物の製造は既知経路による５個の反応段階を
要するが、一方これらの化合物は本発明による経路によ
っては４個の段階で製造されうる。前述の文献によれば
式Ｖの化合物はその後さらに反応してオリゴヌクレオチ
ドを与えそして最終的には１,５−ジアザビシクロ〔５,
４,０〕ウンデク−５−エン（ＤＢＵ）を用いて後者か
らｐ−ニトロフェニルエチル基が分裂される。

【００１３】式IIIの化合物は三塩化燐からそれ自体既
知の方法によって、それをヒドロキシル化合物Ｒ¹−Ｏ
ＨおよびＲ²−ＯＨおよび第二アミンＨ−ＮＲ³Ｒ⁴と反
応させることにより入手しうる。遊離第二アミンの代り
に相当するシリル化合物を用いることも可能である。三
塩化燐中の塩素原子の置換順序はヒドロキシルまたはア
ミノ化合物の反応性に左右される。すなわち例えば式VI

【化２６】 を有する化合物は以下の経路によって得ることができ
る。

【００１４】ａ） 三塩化燐を最初に塩基存在下におい
てメタノールと反応させそしてその反応生成物を塩基存
在下においてジイソプロピルアミンついで２−（ｐ−ニ
トロフェニル）−エタノールと反応させるか、 ｂ） 三塩化燐を最初に２−（ｐ−ニトロフェニル）−
エタノールついでジイソプロピルアミンそして最後にメ
タノールと反応させるかあるいは ｃ） 三塩化燐を最初にジイソプロピルアミンと反応さ
せついでその生成物を２−（ｐ−ニトロフェニル）−エ
タノールついでメタノールと反応させる。 一般式IIIで表される燐酸化試薬とヒドロキシル化合物
との反応は弱酸（例えばテトラゾール）またはアミン塩
酸塩の存在下で等モル量または僅かに過剰量例えば５０
モル％まで、好適には２５モル％までの燐酸化試薬を使
用して溶液状態で実施されるかあるいは弱酸の存在下大
過剰の燐酸化試薬を使用して固相合成の形態で実施され
る。例えばヒドロキシル成分が担体に付着している場合
燐酸化試薬は１０倍〜２０倍のモル過剰量で用いられ
る。反応が溶液状態で実施される場合溶媒は勿論、燐酸
化試薬およびアシル化されるべき成分に対して不活性で
なければならない。この反応は−８０〜＋８０℃、好適
には−２０〜＋５０℃、特に好適には０〜２５℃の温度
で実施される。

【００１５】基Ｒ¹およびＲ²の選択により、特にＲ⁸が
親油性置換基を有するフェニルを表す場合には式IVを有
する燐酸化生成物は幾分か顕著な親油性質を有する。こ
れらの親油性化合物は例えばクロマトグラフィー例えば
“逆相”物質（例えばオクタデシルシリル基を含有する
市販シリカゲル）上の高圧液体クロマトグラフィーによ
り非燐酸化出発物質から容易に分離できる。置換基Ｒ¹
およびＲ²の選択は、勿論、基Ｒの化学的性質すなわち
ホスフェート基が導入されうる化合物に左右される。そ
れ以上の燐酸化可能なＨ−Ｚ基を含有しない基としての
Ｒの定義は式IIIを有する燐酸化試薬がかなり非特異的
方法でアシル化し、すなわち選択的燐酸化反応では各水
素原子が、存在しうるさらにそれ以上の燐酸化可能なＺ
−Ｈ基中の適当な保護基によって既に置換されたことを
意味するものとして理解されるべきである。“燐酸化可
能な”Ｚ−Ｈ基とはここではアシル化条件下で反応しう
るＺ−Ｈ基、すなわちその反応性が立体障害または不活
性化基によって損われてしまったＺ−Ｈ基はしたがって
除外されるべきであるということを意味するものと解さ
れるべきである。

【００１６】基Ｒ¹およびＲ²は大抵ホスフェート基を遊
離させるために塩基を用いて分裂されるので、基Ｒ¹お
よびＲ²の性質および用いる塩基の性質が基Ｒの感度に
左右する。したがって、Ｒが十分に安定である場合その
切断はアルカリ水溶液によって実施することができ、そ
の際Ｒ¹およびＲ²の選択もまた比較的非臨界的である。
基Ｒ上に敏感な基が存在する場合、反応は例えば前記文
献に開示されているそれ自体既知の方法で、例えば非水
性系中において適当な塩基例えばＤＢＵを使用して実施
される。基Ｒ¹およびＲ²の切断はそれ自体既知の方法に
より実施される。

【００１７】ホスフェートトリエステルからのメチル基
の切断は塩基例えばトリエチルアミンの存在下チオフェ
ノールまたはチオクレゾールを用いて実施されうる。こ
の反応は−１００〜＋１００℃、好適には−６０〜＋６
０℃、特に好適には−２０〜＋３０℃の温度で都合よく
実施される。β−除去反応中に除去されうる群、すなわ
ち例えば基IIIｂが存在する化合物は例えば亜鉛のよう
な金属を用いることによりあるいは電圧制御された電解
還元により除去できる。この反応は−５０〜＋８０℃、
好適には−２０〜＋５０℃、特に好適には０〜３０℃の
温度で有利に実施される。電気陰性置換基含有のエチル
基は非ヌクレオフィル系塩基によって除去することがで
きそしてこれもまた重合担体に付着しうる。この反応は
−６０〜＋１００℃、好適には−２０〜＋５０℃、特に
好適には０〜３０℃の温度で有利に実施される。

【００１８】電気陰性置換基含有のエチル基が式Ｖの化
合物から分裂される場合には、減少する反応性の順序で
示されている以下の塩基を用いることが有利である。 ａ） 式VII

【化２７】 （式中Ｒ¹¹、Ｒ¹²およびＲ¹³は同一または相異なる低級
アルキル基好ましくはメチルまたはエチルを示しそして
ＡおよびＡ′は鎖中に２〜４個の炭素原子を有する低級
アルキレン基好ましくは１,３−プロピレンを示す）を
有する環状燐酸トリアミド−イミド、 ｂ） １,５,７−トリアザビシクロ〔４,４,０〕デセ−
５−エン（ＴＢＤ）およびまた７−メチル−１,５,７−
トリアザビシクロ〔４,４,０〕デセ−５−エン、 ｃ） １,８−ジアザビシクロ〔４,３,０〕ノネ−５−
エン（ＤＢＮ）、ＤＢＵおよびまた低級アルカリ金属ア
ルコレート特にナトリウムアルカノレートおよびカリウ
ムアルカノレート例えばナトリウムメチレート、ナトリ
ウムエチレートまたはカリウム第３ブチレートおよび ｄ） １,１,３,３−テトラメチルグアニジン。 Ｒ¹および適切ならばＲ²もβ−シアノエチルである化合
物はアンモニアにより分裂されることができ、したがっ
てこれら化合物は、他の保護基がアンモニアによって分
裂される場合に用いられるのが好ましい。

【００１９】本発明方法の大きな利点は敏感な化合物が
燐酸化されうる点にある。塩基による基Ｒ¹およびＲ²の
切断において前記で指摘のように、本発明による方法は
多数の態様を可能にしそれ故に個々の反応段階が基Ｒに
おけるさらに進んだ各反応と統合されうる。この特徴は
基Ｒ¹およびＲ²の切断のためばかりでなく、酸化反応の
ためそして所望ならば１個以上のホスフェート基の導入
のためにも適切である。さらに重要な本発明の利点は、
ホスフェート基それ自体のみならずチオホスフェートお
よびセレノホスフェート基をも導入することができる点
に見ることができる。これにより、例えばHimmelsbach
氏等の方法によっては入手され得ない天然物質の化学的
類似体への簡単な入手経路が達成できる。

【００２０】一般式Ｖ（Ｘ＝Ｏ）を有するホスフェート
を得るための一般式IVを有する化合物の酸化は類似化合
物に関して知られた既知の方法で実施される。使用でき
る酸化剤の例としては四酸化二窒素または沃素を挙げる
ことができるが、特にパーオキシド類とりわけ無水ｔ−
ブチルヒドロパーオキシドが好ましい。反応は適度な極
性溶媒例えばニトリル（例えばアセトニトリル）または
ハロゲン化特に塩素化低級炭化水素（例えばクロロホル
ム）中で実施するのが好ましい。この反応は有利には−
１００〜＋１００℃、好適には−５０〜＋６０℃、特に
好適には−２０〜＋３０℃の温度で実施される。Ｘが硫
黄またはセレンを示す一般式Ｖの化合物の製造は一般式
IVを有する化合物と元素状硫黄またはセレンとの直接反
応によって実施される。例えばテトラヒドロフランのよ
うな極性溶媒中において化学量論的量の硫黄またはセレ
ンと共に撹拌すると一般式Ｖを有する相当するチオホス
フェートまたはセレノホスフェートが良好な収量で生成
する。この反応は有利には−１００〜＋１００℃、好適
には−５０〜＋６０℃、特に好適には−２０〜＋３０℃
の温度で実施される。

【００２１】既に強調してきたことだが、本発明は基Ｒ
の化学的性質を相当な範囲まで考慮することを可能にし
かつこの基はまた敏感な基あるいは分子部分をも含有し
うる。したがって式IIを有する適当な出発物質は脂肪族
または芳香族ヒドロキシル、メルカプトおよびアミノ化
合物、すなわちアルコール類、フェノール類、メルカプ
タン類、チオフェノール類および脂肪族および芳香族ア
ミンである。天然物質またはこれらに類似の化合物例え
ばステロイド誘導体、燐脂質およびとりわけ糖ないし糖
誘導体例えばヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌク
レオチドまたはポリヌクレオチドが特に有利に燐酸化さ
れうる。

【００２２】今日使用されるホスフェート保護基の組み
合わせによって末端未保護ホスフェート基含有ヌクレオ
チドをホスファイト方法にしたがって製造することはさ
らに大きな努力でもって単に可能であるかあるいは全く
不可能であるかである。トリエステル合成で度々使用さ
れる、保護基のｏ−クロロフェニルβ−シアノエチルホ
スフェート組み合わせも、β−シアノエチル基を維持し
ながらのｏ−クロロフェニル基の加水分解が可能でない
ので末端ホスフェートを与えない。すなわち末端５′−
ヒドロキシル基の燐酸化はヌクレオシドトリホスフェー
ト通常アデノシントリホスフェートおよびキナーゼ例え
ば（Ｔ４）−ポリヌクレオチドキナーゼを用いて従来既
知の方法にしたがって実施されてきた。この方法はどち
らかと云えば費用がかかる。

【００２３】本発明によれば、今や５′−ヒドロキシル
基の燐酸化は単離されたオリゴヌクレオチド上のみなら
ず、また担体に付着された化合物上においてさえも化学
的手段によって実施できる。本発明方法はヌクレオシ
ド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたはポリヌク
レオチドが害されないように穏和な条件下で実施する。
しかしながら、本発明はまた例えば３′−ヒドロキシル
基を燐酸化することにより別の点におけるヌクレオチド
あるいは単量体、オリゴマーまたは重合体のヌクレオチ
ド中へのホスフェート基の導入をも可能にし、あるいは
リボヌクレオシドまたはリボヌクレオチドの場合には
２′−位中への導入を可能ならしめる。以下の例におい
て、ヌクレオチドの、困難であることの知られている分
野で本発明をより詳細に説明する。しかしながら、ヌク
レオチドの燐酸化はホスフェート基導入の非常に一般的
な方法において代表的であるのでこれは本発明を限定す
るものとしてみなすべきではない。

【００２４】一般式ＩＩＩを有する本発明の燐酸化試薬
の製造 実施例 １ 亜燐酸メチルエステル−〔（ｐ−ニトロフェニル）−エ
チルエステル〕−ジイソプロピルアミド（式ＶＩ） ５．０１ｇ（３０ミリモル）の完全に乾燥した２−（ｐ
−ニトロフェニル）エタノールを６０ｍｌの新たに蒸留
したメチレンクロライド中に溶解し、これに２４ｍｌの
ジイソプロピルアミンを加える。混合物を約０℃に冷却
しそして６ｍｌ（３３ミリモル）の亜燐酸メチルエステ
ル−ジイソプロピルアミド−クロライドを撹拌しながら
５分間で滴加しそして混合物をこの温度でさらに１０分
間撹拌する。ついでこの反応混合物をあらかじめ４５０
ｍｌのｐＨ７ホスフェートバッファーで洗浄した７５０
ｍｌ酢酸エチルで希釈する。酢酸エチル相を４５０ｍｌ
ホスフェートバッファー（ｐＨ７）で振盪させることに
より３回抽出しそして硫酸ナトリウムで乾燥しついで濃
縮する。生成する油状物を３０℃で高真空中において乾
燥する。これにより^３１Ｐ−ＮＭＲによれば８６％純粋
である９ｇの油状物が得られる。生成物はさらに５：
４：１の容量比である酢酸エチル／メチレンクロライド
／トリエチルアミンで平衡されている短シリカゲルカラ
ム上で、可動相として同一系を使用してクロマトグラフ
ィーにかけることにより濃縮できる。これより冷蔵庫
（−２０℃）中で固化する油状物が得られる。 ^３１Ｐ−ＮＭＲ：δ＝１４９ｐｐｍ ^１Ｈ−ＮＭＲ：Ｐ−Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ_２−δ−３．７５ｐｐｍ，ｍ〔２〕 Ｐ−Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ _２ −δ＝２．９８ｐｐｍ，ｔ〔２〕 Ｐ−ＯＣＨ _３ δ＝３．３５ｐｐｍ，ｄ〔３〕 ｍ＝多重線〔強度〕， ｓ＝一重線，ｄ＝二重線，ｔ＝三重線

【００２５】実施例 ２ 亜燐酸メチルエステル−２−シアノエチル−エステル−
ジイソプロピルアミド（式ＶＩＩＩ）

【化２８】 実施例２と類似の方法で０．６８ｍｌ（１０ミリモル）
の２−シアノエタノールを２０ｍｌの新たに蒸留したメ
チレンクロライド中において８ｍｌのジイソプロピルエ
チルアミンの存在下、２ｍｌ（１１ミリモル）の亜燐酸
メチルエステル−ジイソプロピルアミド−クロライドと
反応させる。高真空中３０℃で乾燥させて、^３１Ｐ−Ｎ
ＭＲによれば９４％の式ＶＩＩＩを有する化合物を含有
する２．５ｇの油状物を得る。 ^３１Ｐ−ＮＭＲ：δ＝１５０ｐｐｍ ^１Ｈ−ＮＭＲ：Ｐ−ＯＣＨ _２ ＣＨ_２−ＣＮ δ＝３．７５ｐｐｍ，ｍ〔２〕 Ｐ−ＯＣＨ_２ ＣＨ _２ −ＣＮ δ＝２．６０ｐｐｍ，ｔ〔２〕 Ｐ−ＯＣＨ _３ δ＝３．３５ｐｐｍ，ｄ〔３〕

【００２６】実施例 ３ 亜燐酸ビス−〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−エチルエ
ステル〕−ジイソプロピルアミド（式ＩＸ）

【化２９】 ４０ｍｌ無水テトラヒドロフラン中の１６ｇ（０．１モ
ル）２−（ｐ−ニトロフェニル）−エタノールの溶液に
２６ｍｌ（０．１５モル）ジイソプロピルエチルアミン
を加え、混合物を０℃に冷却する。これに撹拌しながら
１０ｇ（０．０５モル）亜燐酸ジイソプロピルアミド−
ジクロライドを１５分で加える。ついで反応混合物を放
置して室温にしそしてさらに約３０分間反応させる。ア
ミン塩酸塩を吸引濾去し、フィルターケークを少量のテ
トラヒドロフランで洗浄しそして合一した濾液を濃縮し
て固形残留物を得る。この残留物の１ｇを７：２：１の
容量比であるトルエン／ｎ−ヘキサン／トリエチルアミ
ンを使用して７０ｇのシリカゲル上でカラムクロマトグ
ラフィーにより精製する。これより０．９５ｇの粉末が
得られ、これは^３１Ｐ−ＮＭＲによれば９６％純粋であ
る。 ^３１Ｐ−ＮＭＲ：δ＝１４７．５ｐｐｍ ^１Ｈ−ＮＭＲ：Ｐ−ＯＣＨ _２ ＣＨ_２− δ＝３．８５ｐｐｍ，ｍ〔４〕 Ｐ−ＯＣＨ_２ ＣＨ _２ − δ＝２．９８ｐｐｍ，ｔ〔４〕 Ｐ−Ｎ−ＣＨ δ＝３．５ ｐｐｍ，ｍ〔２〕 Ｐ−Ｎ−ＣＨ（ＣＨ _３ ） _２ δ＝１．１３ｐｐｍ，ｄ〔１２〕

【００２７】原料化合物の製造 例１ 亜燐酸メチルエステル−ジイソプロピルアミド−クロラ
イド ２５０ｍｌ無水エーテルおよび２５０ｍｌ無水ぺンタン
の混合物中に最初に１２７ｇ（０．９６モル）の亜燐酸
メチルエステル−ジクロライドを取り、これに１００ｍ
ｌ無水エーテルおよび１００ｍｌ無水ぺンタン中の２７
０ｍｌ（１．９２モル）ジイソプロピルアミンの溶液を
激しく撹拌しかつ窒素ブランケットしながら−１５℃で
２時間を要して滴加する。反応混合物を撹拌しながら室
温まで昇温せしめついでさらに２時間撹拌する。ついで
それを再び−１５℃に冷却しそして塩酸塩を不活性ガス
の下、濾過により反応溶液から除去する。フィルターケ
ークを等容量の無水エーテルおよび無水ぺンタンからな
る７５０ｍｌ冷混合物ですすぐ。濾液を一緒にしそして
溶媒を水ポンプ真空下で除去する。残留物を８０ｃｍビ
グルーカラム（Ｖｉｇｒｅｕｘｃｏｌｕｍｎ）による高
真空蒸留に２回付す。これより、^３１Ｐ−ＮＭＲによれ
ば９９％の単一物質（δ＝１８５ｐｐｍ）からなる８０
ｇの主フラクション（沸点３８〜４１℃，０．１ｍｂａ
ｒにおいて）が得られる。

【００２８】例２ 亜燐酸２−（ｐ−ニトロフェニル）−エチルエステル−
ジクロライド ５ｇ（３０ミリモル）の２−（ｐ−ニトロフェニル）−
エタノールを１００ｍｌ無水エーテル中に溶解して−２
０〜−３０℃でかつ撹拌しながら、滴加する２５．５ｍ
ｌ（１５０ミリモル）の新たに蒸留した三塩化燐と４０
分間反応させる。エーテルを水ポンプ真空下０℃で除去
しついで過剰の三塩化燐を高真空下で除去しそして残留
油状物を高真空中で乾燥させる。^３１Ｐ−ＮＭＲ：δ＝
１７９．８ｐｐｍ，全てのＰの９３％。

【００２９】例３ 亜燐酸ジイソプロピルアミド−ジクロライド ８７ｍｌ（１モル）の三塩化燐を８００ｍｌ石油エーテ
ル中に溶解し、その溶液を５℃に冷却しついでこれに６
６０ｍｌ石油エーテル中の２８３ｍｌ（２モル）ジイソ
プロピルアミンの溶液を５℃で１時間撹拌しながら滴加
する。この温度で１時間撹拌を続け、沈殿したアミン塩
酸塩を濾去し、石油エーテルを水ポンプ真空下で除去し
そして残留物を真空（０．２ｍｂａｒ）中で蒸留する。
３８〜４１℃での得られた主フラクションは９８ｇの油
状物であり、これは冷蔵庫（−２０℃）中で放置すると
結晶化しそして９９％純粋である（^３１Ｐ−ＮＭＲ，δ
＝１７０ｐｐｍ）。

【００３０】燐酸化反応 ５′ホスフェート基：ＮｃｏＩ−リンカーである５′Ｐ
ＣＣＡＴＧＧ３′を含有する一本鎖オリゴヌクレオチド
の化学合成 参考例 ３′−末端に位置するヌクレオシド、すなわち本実施例
の場合にはグアノシンをm.J.Gait氏等による「ヌクレイ
ックアシッズレス、（Nucleic Acids Res.)」 8(1980)；
1081〜1096に記載の方法により３′−ヒドロキシル基を
経る共有結合によって“調整された多孔性ガラス”（co
ntrolled pore glass）（ＣＰＧ，ピアース社製）に付
ける。これは最初にシリカゲルを３−（トリエトキシシ
リル）−プロピルアミンと、エタノールを除去しつつ反
応させることにより実施されてＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合が生
成される。グアノシンをパラニトロフェノールおよび
Ｎ,Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下に
おいてＮ²′−イソブチリル−３′−Ｏ−スクシノイル
−５′−ジメトキシトリチルエーテルの形態において前
記調製担体と反応させ、スクシノイル基の遊離カルボキ
シル基がプロピルアミン基のアミノ基をアシル化する。

【００３１】以下の合成段階において、塩基成分は５′
−Ｏ−ジメトキシトリチルヌクレオシド−３′−亜燐酸
モリメチルエステル−ジアルキルアミドまたはエステル
−ジクロライドの形態で用いられ、アデニンはＮ⁶−ベ
ンゾイル化合物として存在し、シトシンはＮ⁴−ベンゾ
イル化合物として、グアニンはＮ²−イソブチリル化合
物として存在しそしてチミンはアミノ基を含有していな
いために保護基なしで存在する。オリゴヌクレオチド鎖
組立のための反応サイクルは次のとおりである。付着さ
れた１μモルのグアノシンを含有する２５mg重合担体を
順次以下の剤で処理する。

【００３２】ａ） ニトロメタン ｂ） １,２−ジクロロエタン中のトリクロロ酢酸の３
％溶液 ｃ） ニトロメタン ｄ） アセトニトリル ｅ） ０.２ml無水アセトニトリル中における１０〜２
０μモルの相当するヌクレオシドホスファイトおよび１
００μモルのテトラゾール（５分） ｆ） ４０％ルチジンおよび１０％ジメチルアミノピリ
ジンを含有するテトラヒドロフラン中の無水酢酸の２０
％溶液（２分） ｇ） アセトニトリル ｈ） 水２０％およびルチジン４０％を含有するテトラ
ヒドロフラン ｉ） ５：４：１の容量比であるコリジン／水／テトラ
ヒドロフラン中における沃素の３％溶液 ｊ） アセトニトリル

【００３３】“ホスファイト”は前記の場合にはデオキ
シリボース−３′−モノ亜燐酸モノメチルエステルであ
ると理解されるべきであり、その第３原子価は塩素また
は第三アミノ基例えばモルホリノ基によって飽和されて
いる。種々の合成段階各々における収量は４９６nmの波
長におけるジメトキシトリチル陽イオンの吸収を測定す
ることによって脱トリチル化反応（ｂ）後に分光測光に
より測定できる。５′−ヒドロキシル基の化学燐酸化の
ための反応サイクルは原則として前記実施例のようにし
て実施されるが、しかし以下の点に相違が見られる。そ
れは第一にｅ）において２０μモルの相当する燐酸化試
薬（例えば式VIを有する化合物）および１００μモルの
テトラゾールを０.２mlの無水テトラヒドロフラン／ア
セトニトリル（等容量混合物）中において１０〜２０分
間反応させる点、第二に段階ｆ）が省略される点そして
第三に段階ｉ）の時間が５分に延長される点である。

【００３４】オリゴヌクレオチドの合成が完了したらオ
リゴマーのメチルホスフェート保護基をｐ−チオクレゾ
ールおよびトリエチルアミンを用いて分裂する。ついで
このオリゴヌクレオチドをアンモニアで３時間処理する
ことにより固体担体から分離する。塩基のアミノ保護基
はオリゴマーを濃アンモニアで２〜３日間処理すること
により定量的に分裂される。

【００３５】ａ） 燐酸化試薬、亜燐酸メチルエステル
−〔２−（ｐ−ニトロフェニル）−エチルエステル〕−
ジイソプロピルアミド（VI）の場合には５′−ヒドロキ
シル基上に２−（ｐ−ニトロフェニル）−エチルホスフ
ェート基を有するオリゴヌクレオチドが保護基の除去後
に得られる。このホスフェートエステルは“逆相”物質
上のＨＰＬＣによって精製できるが、これは特に良好な
ヒドロキシル成分の除去をもたらす。ｐ−ニトロフェニ
ルエチル基は上記エステルを９：１容量比のピリジン／
水中の０.９Ｍ ＴＢＤで室温において８時間処理するこ
とにより分裂される。この後、ＨＰＬＣまたは７Ｍ尿素
を有する２０％強度ポリアクリルアミド上のゲル電気泳
動によれば出発物質はもはや存在しない。この反応混合
物に１mlの２Ｍ酢酸を加えついで濃縮する。残留物を可
動相として０.０２Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム
（pH７）を使用して、セファデックスＧ５０（^RＳＥＰ
ＨＡＤＥＸ Ｇ５０、登録商標）を含有するカラム上で
塩から取り出す。生成する５′−ホスフェート−オリゴ
ヌクレオチドはポリヌクレオチドリガーゼによって重合
されて二重鎖の反復ＤＮＡを与えることができそしてこ
れはついで再び制限酵素Ｈｅａ III（切断部位：ＧＧ↓
ＣＣ）で切断されうる。

【００３６】ｂ） 燐酸化試薬、亜燐酸メチルエステル
−２−シアノエチル−エステル−ジイソプロピルアミド
（VIII）および亜燐酸ビス−（２−シアノエチルエステ
ル）−ジイソプロピルアミド（Ｘ）

【化３０】 の場合には遊離５′−ホスフェートｐＣＣＡＴＧＧがア
ンモニア分裂（室温で３日間または７５℃で１０時間濃
アンモニアを用いて実施される）直後に得られる。 ｃ） 燐酸化試薬、亜燐酸ビス−〔２−（ｐ−ニトロフ
ェニル）−エチルエステル〕−ジイソプロピルアミド
（IX）の場合には、チオフェノレートおよびアンモニア
処理後にホスフェート２−（ｐ−ニトロフェニル）−エ
チルエステルも得られついでこのエステルは適当な塩基
例えばＤＢＵまたはＴＢＤによって分裂されて保護基を
有していない５′−ホスフェートを与えることができ
る。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式ＩＩＩ 【化１】 ｛式中、Ｒ^１およびＲ^２は互いに独立していて、−ＣＨ
   _３、ＮＣ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−またはＯ_２Ｎ−Ｃ_６Ｈ_４−
   ＣＨ_２−ＣＨ_２−を示しそしてＲ^３およびＲ^４は両方と
   もイソプロピル基を示す）を有する化合物。