JP3188243B2 - ５’−修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

５’−修飾オリゴヌクレオチド

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は有機ホスフェート
（phosphate）化学および固体状態のオリゴヌクレオチ
ド合成の分野にある。さらに詳細には、本発明は、オリ
ゴヌクレオチドの５’末端に安定的に付着し得、そして
活性化されるとき、遊離アミノ基を有する任意の分子に
このオリゴヌクレオチドを複合体化させるのに用いられ
得る官能性アルデヒド基またはスルフヒドリル基を提供
する活性化可能な部分を有する、反応性亜リン酸（phos
phorous）中間体に関する。
【０００２】
【従来の技術】標識物、リガンド、固体表面、重合体ま
たは他の分子あるいは他の表面にオリゴヌクレオチドを
カップリングさせるために、遊離官能基を有するオリゴ
ヌクレオチドを提供することが必要である。末端官能基
を有するオリゴヌクレオチドを提供する技術の１つは、
従来の固相の自動合成方法で所望のオリゴヌクレオチド
を合成すること、および修飾ホスホルアミダイトによっ
てこのオリゴヌクレオチドの５’末端に官能基を導入す
ることを、包含する。
【０００３】Agrawal,S.,ら、Nucl. Acids Res. (1986)
14:6227-6245は、オリゴヌクレオチドの５’末端に導
入され得る、脱保護によって活性化され得、オリゴヌク
レオチドの５’末端に遊離アミノ基を提供し得る活性化
可能な基を有する、修飾ホスホルアミダイトを記載す
る。リンカー（第6236頁のVIII）であるO-(2-(9-フルオ
レニルメトキシカルボニル)アミノエチル)-O-(2-シアノ
エチル)-N-N-ジイソプロピルホスホルアミダイトは、デ
オキシヌクレオシド-2-シアノエチル-N-N-ジイソプロピ
ルホスホルアミダイトを用いて、自動DNA合成機で所望
のオリゴヌクレオチドの末端に付加される。この付加物
は脱保護され、（9-フルオレニルメトキシカルボニル基
はアンモニアで除去される）遊離アミノ基を提供する。
【０００４】Kremsky,J.N.ら、Nucl. Acids Res. (198
7) 15:2891-2909は、オリゴヌクレオチドの５’末端に
導入され、続いて修飾され、オリゴヌクレオチドを固定
するのに用いられる５’カルボキシ基またはアルデヒド
基を提供する官能化されたホスホルアミダイト（第2893
頁の１）を記載する。
【０００５】他の官能化されたホスホルアミダイトであ
るO-6-(4',4"-ジメトキシトリフェニルメチルチオ)ヘキ
シル-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホル
アミダイトは、Clontech Laboratoriesより市販されて
いる。この分子は、通常のホスホルアミダイトプロトコ
ールを用いてオリゴヌクレオチドに導入される。このジ
メトキシトリチルで保護されたスルフヒドリル基は硝酸
銀で脱保護され得、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に
遊離スルフヒドリルを生成する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
種々のタイプのオリゴヌクレオチド合成法に用いられ
得、そして一旦オリゴヌクレオチドの５’末端に付加さ
れると遊離アルデヒド基またはスルフヒドリル基に変換
され得る活性化可能な基を有する、新規な修飾亜リン酸
中間体を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この遊離アルデヒド基／
スルフヒドリル基は、標識物、リガンド、重合体または
固体表面にオリゴヌクレオチドをカップリングまたは複
合体化させるのに有用である。これらの新しい中間体は
以下の基準を満たす：1)活性化可能な基は、従来のオリ
ゴヌクレオチド合成の手順の全ての工程に適する；2)活
性化は、オリゴヌクレオチドに損傷を与えない条件下で
行われる；3)カップリングは、オリゴヌクレオチドまた
はオリゴヌクレオチドがカップリングされる部分に損傷
を与えない条件下で行われる。
【０００８】本発明の新規なリン含有化合物には、オリ
ゴヌクレオチド合成のH-ホスホネート法、ホスホトリエ
ステル法、ホスホルクロリダイト（phosphorchloridit
e）法およびホスホルアミダイト法において有用な中間
体、および５’修飾によって生じるメチルホスホネート
類、メチルホスフェート類、ホスホロチオエート類およ
びホスホルアミダイト類のようなホスホジエステル類似
物を包含する中間体が包含される。これらの化合物は、
一般に、下記の式で定義され得る：
【０００９】
【化９】
【００１０】ここで、Ｘは： (i)Ｘ1がＯ-であり、そしてＸ2が水素またはＲＯ-（こ
こでＲは保護基である）である場合には、酸素であり； (ii)以下の(a)または(b)の場合には、存在せず、(a)Ｘ1
が塩素であり、そしてＸ2がメチルまたはＲＯ-である、
または(b)Ｘ2がＲＯ-であり、そしてＸ1がＮＲ1Ｒ2であ
り、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立して、１〜６個の炭
素原子のアルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキ
ル、または６〜２０個の炭素原子のアリールであり、ま
たは窒素原子と一緒に互いに結合し、４〜７個の炭素原
子および原子番号が８から16までの包括的な（inclusiv
e）環状（annular）カルコゲン原子（ＯまたはＳ）０〜
１個の環式構造を形成する；Ｇは１〜20個の炭素原子の
ヒドロカルビレン基であり；そしてＺは、ビシナルジオ
ール炭素原子の１個でＧに結合したヒドロキシ保護され
たビシナルジオール基、またはジスルフィド基のイオウ
原子の１個でＧに結合したジスルフィド基であり、但
し、Ｚが該ジスルフィド基である場合、Ｇは少なくとも
４個の炭素原子を有する。
【００１１】Ｘが酸素であり、Ｘ1がＯ-であり、そして
Ｘ2が水素である上記化合物は、H-ホスホネートであ
り、そしてオリゴヌクレオチド合成のH-ホスホネート法
（SinhaおよびCook、NAR (1988) 16:2659-2669）に用い
られる。H-ホスホネートは、一旦オリゴヌクレオチドの
５’末端に導入されると、ホスファイトジエステル類、
ホスホロチオエート類、またはホスホルアミデート類に
変換し得る（Millerら、NAR (1983) 11:5189-5204，Eck
stein、Ann Rev Biochem (1985) 54:367-402，ならびに
FroehlerおよびMatteucci、NAR(1988) 16:4831-483
9）。同様に、Xが酸素であり、Ｘ1がＯ-であり、そして
Ｘ2がＲＯ-である上記化合物は、オリゴヌクレオチド合
成へのホスホトリエステルアプローチに用いられる（Ga
reggら、Chemica Scripta (1985) 26:5）。Ｘが存在せ
ず、そしてＸ1が塩素であり、そしてＸ2がＲＯ-である
場合、得られる化合物はホスホクロリダイト（phosphoc
hloridite）であり、これはオリゴヌクレオチド合成の
ためのホスホクロリダイト法に用いられる（Wadaら、J
Org Chem (1991) 56:1243-1250）。上記式のホスホルア
ミダイトが好適である。
【００１２】本発明の好ましいホスホルアミダイトは次
の式で表され得る：
【００１３】
【化１０】
【００１４】ここで、Ｒは塩基に不安定な保護基であ
り、Ｒ1およびＲ2は、独立して、１〜６個の炭素原子の
アルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル、また
は６〜20個の炭素原子のアリールであり、または窒素原
子と一緒に互いに結合し、４〜７個の炭素原子および原
子番号が８から16までの包括的な環状カルコゲン原子
（ＯまたはＳ）０〜１個の環式構造を形成し、Ｇは１〜
20個の炭素原子のヒドロカルビレン基であり、そしてＺ
は、ビシナルジオールの炭素原子の１個でＧに結合した
ヒドロキシ保護されたビシナルジオール基、またはジス
ルフィド基のイオウ原子の１個でＧに結合したジスルフ
ィド基であり、但し、Ｚが該ジスルフィド基である場
合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有する。
【００１５】本発明の他の局面は、次の式の５’修飾オ
リゴヌクレオチドである：
【００１６】
【化１１】
【００１７】ここで、（O.N.）はオリゴヌクレオチド鎖
を表し、Xは原子番号が８から16までの包括的なカルコ
ゲン原子（ＯまたはＳ）であり、Ｘ1はＯ-、メチル、−
ＯＣＨ3またはＮＲ1Ｒ2（ここで、Ｒ1およびＲ2は独立
して水素または１〜６個の炭素原子のアルキルである）
であり、Ｇは１〜20個の炭素原子のヒドロカルビレン基
であり、そしてＺは、ビシナルジオールの炭素原子の１
個でＧに結合したヒドロキシ保護されたビシナルジオー
ル基、またはジスルフィド基のイオウ原子の１個でＧに
結合したジスルフィド基であり、但し、Ｚが該ジスルフ
ィド基である場合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有
する。
【００１８】本発明のさらなる局面は、ヒドロキシ保護
基が遊離ヒドロキシル基を残すために除去された上記修
飾オリゴヌクレオチドである。本発明のさらに他の局面
は、Ｚが、オリゴヌクレオチドに末端アルデヒド基を形
成するために酸化された脱保護ビシナルジオール基を表
す、上記５’修飾オリゴヌクレオドである。
【００１９】本発明の他の局面は、末端アルデヒド基を
有する上記オリゴヌクレオチドと遊離アミノ基含有担体
分子との複合体である。この複合体は、アルデヒド基と
遊離アミノ基との間の反応により、形成される。本発明
のさらなる局面は、次式の、部分的に保護されたトリオ
ールである：
【００２０】
【化１２】
【００２１】ここで、Ｙ1およびＹ2は、独立して、ヒド
ロキシ保護基であり、または１原子の架橋によって連結
して５員環保護基を形成し、そしてＧは上記と同様であ
る。Ｇは、好適には、４〜20個の炭素原子のアルキレン
である。本発明の他の局面は、次の式のジスルフィドで
ある： Ｙ3−Ｏ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−ＯＨ （５） ここで、Ｙ3はヒドロキシ保護基であり、そしてＧは上
記と同様である。Ｇで表される２つの二価基は同一で有
り得るが、異なっていてもよい。好ましくは、これらは
同一で、このジスルフィドを対称的にする。好ましく
は、Ｙ3は塩基に安定である。好ましくは、Ｇは４〜20
個の炭素原子のアルキレンである。
【００２２】
【発明の実施の形態】先に示したように、本発明のホス
ホルアミダイトは次の式で表され得る：
【００２３】
【化１３】
【００２４】ここで、Ｒはメチルまたは塩基に不安定な
保護基であり、Ｒ1およびＲ2は、１〜６個の炭素原子の
アルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル、また
は６〜20個の炭素原子のアリールであり、または窒素原
子と一緒に互いに結合し、４〜７個の炭素原子および原
子番号が８から16までの包括的な環状カルコゲン原子
（ＯまたはＳ）０〜１個の環式構造を形成し、Ｇは１〜
20個の炭素原子のヒドロカルビレン基であり、そしてZ
は、ビシナルジオールの炭素原子の１個でＧに共有結合
したヒドロキシ保護されたビシナルジオール基、または
ジスルフィド基のイオウ原子の１個でＧに共有結合した
ジスルフィド基であり、但し、Ｚが前記ジスルフィド基
である場合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有する。
【００２５】好ましくは、Ｒはβ-シアノエチルであ
り、Ｒ1およびＲ2は共にイソプロピルであり、そしてＧ
は−(ＣＨ2)n−（ここで、ｎは包括的に、４から６まで
の整数である）である。Ｒで表される他の保護基の例に
は、β-ニトロエチル、2,2,2-トリクロロエチル、メチ
ル、1,1-ジメチル-2,2,2-トリクロロエチル、2,2,2-ト
リブロモエチル、ベンジル、o-クロロフェニル、p-ニト
ロフェニルエチル、2-メチルスルホニルエチル、および
1,1-ジメチル-2-シアノエチルがある。Ｒ1およびＲ2で
表され得る他の基の例には、ブチル、ヘキシル、ノニ
ル、ドデシル、およびヘキサデシルのような他のアルキ
ル基、シクロプロピル、シクロブチル、シクロヘキシル
およびシクロオクチルのようなシクロアルキル基、フェ
ニル、トリル、ベンジル、キシリルおよびナフチルのよ
うなアリール基、および互いに連結されるときの複素環
式基、例えばモルホリノ、ピペリジニルおよびチオモル
ホリノがある。Ｇで表され得る他のヒドロカルビレン基
の例には、分枝アルキレン、およびシクロアルキレンを
含有する基（例えば、シクロヘキシレン）またはフェニ
レンがある。Ｇは、主に不活性スペーサー部分として機
能し、そしてその構造中に、不活性スペーサーとして働
く機能に影響を与えない置換基および／またはヘテロ原
子（例えば、Ｏ、Ｓ、Ｎ）を有し得ることが理解される
であろう。
【００２６】Ｚで表されるヒドロキシ保護されたビシナ
ルジオール基は、好適には、次の式のものである：
【００２７】
【化１４】
【００２８】ここで、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水
素、１〜20個の炭素原子のアルキルまたは６〜20個の炭
素原子の単環式アリーレンであり、そしてＹ1およびＹ2
は、独立して、ヒドロキシ保護基であり、または１原子
（Ｃ、ＳまたはＳｉ）架橋によって（点線で示されるよ
うに）連結され、５員環保護基を形成し得る。Ｙ1およ
びＹ2は、化学合成（すなわち、従来の自動ホスホルア
ミダイト合成）の際、この分子をオリゴヌクレオチド鎖
の５’末端に付加する間安定であるという性質を有し、
そしてその後、オリゴヌクレオチド鎖に損傷を与えるこ
となく、除去され得る。さらに、後述されるように、脱
保護された基のビシナルジオール構造は、それ自身が酸
化によって「活性化」され得、ジオールから官能性アル
デヒドに変換される。Ｙ1およびＹ2は同一か、または異
なり得、そしてホスホルアミダイト化学を用いる通常の
自動固相オリゴヌクレオチド化学に適する、個々のヒド
ロオキシ保護基のいずれであっても良い。このようなブ
ロッキング基の例には、ジメトキシトリチル（DMT）、
トリチル、ピキシル（pixyl）、ベンゾイル、アセチ
ル、イソブチニル（isobutynyl）、p-ブロモベンゾイ
ル、t-ブチルジメチルシリルおよびピバロイルがある。
これらの保護基は、同じか、または異なる処理によって
除去され得る。Ｒ3およびＲ4が水素であり、そしてＹ1
およびＹ2がベンゾイルまたはDMTであるビシナルジオー
ル基は特に好ましい。
【００２９】示されたように、Ｙ1およびＹ2は１原子架
橋によって結合され得、それゆえ、５員環を形成する。
適切な架橋原子にはケイ素、イオウおよび炭素が挙げら
れる。好ましくは、１原子架橋は炭素橋である。それゆ
え、このジオール基は、好ましくは、アセタールまたは
ケタール、すなわち、
【００３０】
【化１５】
【００３１】として保護される。
【００３２】架橋原子およびその置換基は、オリゴヌク
レオチドにリンカーを付加するのに用いられるシーケン
ス中の引続く反応に対し安定であることが重要である。
このジオール保護基はまた、実質的にオリゴヌクゴレオ
チドを分解させない温和な条件下で除去されなければな
らない。例えば、強い酸性条件では、オリゴレオチドの
脱プリン（depurination）が起こる。適切なＲ6基およ
びＲ7基には、アリール基および６〜30個の炭素原子の
置換アリール基、Ｃ1−Ｃ20アルキル基、および30個未
満の炭素原子の芳香族置換アルキル基が包含される。好
ましいのは、フェニル、およびＣ1−Ｃ8アルキル、Ｃ
1-8アルコキシ；原子１〜４個のフッ素、塩素、臭素、
ニトロ-、またはフェニルで置換されたフェニルであ
る。最も好ましいのは、Ｒ6がフェニル、p-ブチルフェニ
ル、p-メトキシフェニル、p-tert-ブチルフェニル、お
よびビフェニルであるアセタール構造である。保護基の
安定性は、特定の用途のため、置換基を適切に選択する
ことにより調節され得ることは当業者にとって周知であ
る。
【００３３】前記アセタールおよびケタールは、対応す
るトリオールから１工程で直接に、容易に調製される。
本発明のこの実施態様の重要かつ予期せぬ特徴は、分子
中の他の遊離アルコールの存在下で、ビシナルジオール
が選択的に保護されることである。それゆえ、Ｙ1およ
びＹ2がＨであるトリオールは、酸触媒の存在下で、単
に、アルデヒドと接触してアセタールを生成し、または
ケトンと接触してケタールを生成する。好ましくは、こ
の接触は、反応の間に形成された水が減圧の使用または
溶媒共沸により、反応の間に除去される条件下で行われ
る。または、低沸点のアルコールのアセタールまたはケ
タールが、アセタール交換反応において、アルデヒドま
たはケトンの代わりに同様に用いられ得る。
【００３４】前記アセタールおよびケタールのホスホル
アミダイトはここに記載の通常の方法により調製され、
そしてこれらはまた、ここで記載されるように、合成の
際にオリゴヌクレオチドにカップリングされる。この合
成および遊離の、カップリングされたオリゴヌクレオチ
ドの精製の後、保護基は温和な酸による加水分解によっ
てジオールを生成し、これは複合体化反応に用いられる
アルデヒドを生成する酸化反応のための基質である。代
表的な温和な加水分解条件は80％酢酸／水、25℃で30分
であり、通常のオリゴヌクレオチド合成でジメトキシト
リチル基を除去するのに用いられる条件と同様である。
【００３５】好ましいジスルフィド基は次の式を有する
もので表される： −Ｓ−Ｓ−Ｒ5−Ｏ−Ｙ3 ここで、Ｒ5は１〜20個の炭素原子のアルキレン基また
は６〜20個の炭素原子の単環式アリーレン基であり、そ
してＹ3は（前記のような）ヒドロキシ保護基である。
【００３６】最も好ましくは、Ｒ5は４〜６個の炭素原
子のアルキレンであり、−ＯＹ3はアルキレン基のω炭
素原子に結合し、そしてＹ3はトリチルである。後述さ
れるように、この基のジスルフィド構造は、それ自身が
還元によって「活性化」され得、スルフィド結合が切断
され、そして遊離スルフヒドリル基を生成する。
【００３７】Ｚがビシナルジオールを表すホスホルアミ
ダイトは、式ＨＣ＝ＣＨ−Ｇ−ＯＨのアルコールから調
製され得る。このアルコールのヒドロキシル基は保護さ
れ、そしてこの二重結合はジオール基を形成するために
酸化される。ジオールのヒドロキシルは、その後、直角
的に（orthogonally）除去可能な保護基（Ｙ2および
Ｙ3）、すなわち、ビシナルジオールの保護基を除去せ
ずに、元々のヒドロキシの保護基が除去され得るような
保護基で保護される。次に、元々のヒドロキシの保護基
は除去され、生じた脱保護されたヒドロキシは適切なホ
スフィチル化剤（phosphitylating agent）と反応され
る。
【００３８】Ｚがジスルフィドを表すホスホルアミダイ
トは、対称または非対称ジスルフィドから調製され得
る。対称ジスルフィドを用いる一般の反応式は図３に示
され、そして以下の実施例３、に説明されている。非対
称ジスルフィドは、Mannervik,B.,およびLarson, K., M
eth. in Enzym. (1981) 77:420-424、またはMukuiyama,
T.,およびTakahashi, K., Tet Lett (1968) 5907-5908
の記載により、調製され得る。例としては、対応するチ
オスルフィネートを提供するため、対称ジスルフィド
（ＨＯ−Ｇ−ＳＳ−Ｇ−ＯＨ）は過酸化水素および蟻酸
で酸化される。このチオスルフィネートをメルカプタン
（例えば、ＨＳ−Ｇ’−ＯＹ3、ここで、Ｙ3は前記され
たものと同様であり、Ｇ’は出発物質の対称ジスルフィ
ドにあるＧとは異なっている）を用いて３より大きいｐ
Ｈで処理することにより、非対称ジスルフィド（ＨＯ−
Ｇ−ＳＳ−Ｇ’−ＯＹ3）が得られる。このジスルフィ
ドは、ホスホルアミダイトを得るためにホスフィチル化
剤と反応され得る。
【００３９】本発明のホスホルアミダイトは、オリゴヌ
クレオチドを調製するのに用いられる通常の自動ホスホ
ルアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチド鎖の５’末
端に付加され得る。Matteucci, M.D.,およびCaruthers,
M.H., Tet Lett (1980) 521:719および米国特許第4,50
0,707号を参照せよ。このオリゴヌクレオチド鎖自身は
同様の方法で調製され得る。本発明のホスホルアミダイ
トが付加されたこのオリゴヌクレオチドの長さおよび配
列は、得られる５’-官能化されたオリゴヌクレオチド
の使用に依存する。例えば、オリゴヌクレオチドが、欧
州特許出願公開公報第0438259号に記載の目的（すなわ
ち、全身性エリテマトーデス(SLE)の治療）に用いられ
るならば、このオリゴヌクレオチドはSLE抗体に結合す
る能力を有するべきである。もしこのオリゴヌクレオチ
ドが標識されたプローブとして用いられるならば、その
長さおよび配列は、目的とするヌクレオチドの配列にハ
イブリダイズすることができるべきである。
【００４０】前記したように、得られた修飾オリゴヌク
レオチドは次の式で表される：
【００４１】
【化１６】
【００４２】ここで、（O.N.）はオリゴヌクレオチド鎖
を表し、そしてＸ、Ｘ1、ＧおよびＺは先に定義された
ものである。５’という名称は、修飾基がオリゴヌクレ
オチド鎖の５’末端に付着することを示す。この鎖は、
典型的には、10〜200個のヌクレオチドの長さであり、
より一般的には、20〜60個のヌクレオチドの長さであ
る。一旦、ホスホルアミダイトがオリゴヌクレオチド鎖
の５’末端に付加されると、保護基（Ｙ1、Ｙ2、Ｙ3）
は、遊離ヒドロキシ基を生成するために適切な処理（例
えば、塩基処理または酸処理）によって除去され得る。
ビシナルジオールの場合では、ジオール基は、末端アル
デヒド基を形成するため、例えば、過ヨウ素酸塩で酸化
される。ジスルフィド基の場合では、このジスルフィド
は、適切な還元剤、例えばジチオトレイトールまたは2-
メルカプトエタノールのようなメルカプタンまたは水素
化ホウ素で還元され、ジスルフィド結合が切断され、末
端スルフヒドリル基を形成する。
【００４３】得られた５’修飾オリゴヌクレオチドは、
アルデヒド基によって遊離アミノ基を有する標識体、担
体、または他の分子にカップリングし得、またはスルフ
ヒドリル基によってマレイミドまたはα-ハロアセチル
基のような求電子中心、あるいはアクリレートまたはア
クリルアミドのような他の適切なマイクル（Michael）
受容体に、カップリングし得る。このような担体の例に
は、D-リシンとD-グルタミン酸との共重合体のようなア
ミノ酸重合体、または免疫グロブリン、または上に列挙
したような基を含むように本質的に誘導体化された他の
重合体がある。
【００４４】
【実施例】次の実施例により本発明をさらに例示する。
これらの実施例は如何なる意味でも、本発明を限定する
ことを意図しない。これらの実施例中では、Et＝エチ
ル、Ac＝アセチル、およびTHF＝テトラヒドロフランで
ある。 （実施例１） O-(5,6-(ビス-O-ベンゾイルオキシ)-ヘキシル)-O-(2-シ
アノエチル）-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト
の調製 図１はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る本発明の反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は
下に記載される。
【００４５】O-(tert-ブチオルジメチルシリル)-5-ヘキ
セノール、５： 104mLの中DMFの5-ヘキセン-1-オール1
2.47mL（10.4g、104mmol）の溶液に15.66g（230mmol）
のイミダゾールおよび20.0g（130mmol）のtert-ブチル
ジメチルシリルクロリド（TBDMSCl）を加えた。混合物
を室温で４時間撹拌し、そして200mLのEtOAcおよび100m
Lの飽和NaHCO3溶液の間に分配した。EtOAc層を100mLの
飽和NaHCO3溶液、100mLの飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥
し（MgSO4）、濾過し、そして約100mLの容積に濃縮し
た。減圧蒸留により70.07gの５を得た：
【００４６】
【表１】
【００４７】1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-
ヘキサントリオール、６： 92mLのアセトン中の9.86g
（46.0mmol）の５の溶液に23mLのH2O中の6.46g（55.2mm
ol）のN-メチルモルホリンオキシド（NMMO）を加えた。
この混合物に2.5％のOsO4のtert-ブチルアルコール溶液
（360mgの溶液、9.0mgのOsO4、35μmol）433uLおよび30
％H2O2 50uLを加えた。この混合物を16時間撹拌し、そ
れに14mLのH2O中の474mgのナトリウムジチオナイト（so
dium dithionite）の溶液を加えた。さらに0.5時間後
に、この混合物をセライトで濾過した。濾液をMgSO4で
乾燥し、そして150mLのブフナー漏斗中の1"のシリカゲ
ルで、250mLづつのEtOAcを用いて濾過した。生成物を含
有する留分を濃縮し、11.0gの粘性油状物６を得た：
【００４８】
【表２】
【００４９】5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1-O-(tert-ブチ
ルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサントリオール、７：10
6mLのピリジン中の5.29g（21.3mmol）の６の溶液に6.18
mL（7.48g、53.2mmol）の塩化ベンゾイルを加えた。こ
の混合物を18時間撹拌し、ロータリーエバポレーターで
濃縮した。この混合物を100mLの冷1N HClおよび100mLの
EtOAcの間で分配した。酸性であることを確認するた
め、水層のpHを検査した。EtOAc層を100mLのH2Oおよび1
00mLの飽和NaClで順次洗浄し、乾燥し（MgSO4）、濾過
し、そして濃縮して10.33gの粘性黄色油状物７を得た：
【００５０】
【表３】
【００５１】5,6-(ビス-O-ベンゾイル)-1,5,6-ヘキサン
トリオール、８： 10.9mLのTHF中の2.62g（5.36mmol）
の7の溶液に、THF中の1Nのフッ化テトラブチルアンモニ
ウム（CTBAF）溶液10.7mL（10.7mmol）を加えた。この
混合物を16時間撹拌した。この混合物を25mLの飽和NaHC
O3溶液および3×25mLのEtOAcの間で分配した。合わせた
EtOAc抽出物を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し（MgS
O4）、濾過し、そして粘性油状物に濃縮し、この濃縮物
をシリカゲルクロマトグラフィー（1:1 ヘキサン／EtOA
c）で精製して823mgの粘性油状物８を得た：
【００５２】
【表４】
【００５３】O-(5-6-(ビス-O-ベンゾイルオキシ)-ヘキ
シル)-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホスホ
ルアミダイト、９： 14.9mLのCH2Cl2中の1.02g（2.98m
mol）の8および255mg（1.49mg）のジイソプロピルアン
モニウムテトラゾリド（DIPAT、ジイソプロピルアミン
およびテトラゾールのアセトニトリル溶液を１対１のモ
ル比で混合し、白色固体に濃縮して調製した）の溶液
に、2.0mLのCH2Cl2中の989mg（3.28mmol）のO-シアノエ
チル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダ
イトを加えた。この混合物を４時間撹拌し、そして25mL
のCH2Cl2および25mLの冷却した飽和NaHCO3溶液の間で分
配した。CH2Cl2層を飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し（Na
2SO4）、濾過し、そして濃縮した。25mmのカラム中の2"
プラグの塩基性アルミナで濾過し、9:1 EtOAc/Et3Nで溶
離して精製し、1.5g（93％）の粘性油状物９を得た：
【００５４】
【表５】
【００５５】（実施例２） O-5-ベンジルオキシ-6-O-(4',4"-ジメトキシトリチル)
ヘキシル-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソプロピルホス
ホルアミダイトの調製 図２はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は下に記載
される。
【００５６】6-O-(4',4"-ジメトキシトリフェニルメチ
ル)-1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-1,5,6-ヘキサン
トリオール、１０： 22mLのピリジン中の1.11g（4.47m
mol）の６および891uL（638mg、6.30mmol）のEt3Nの溶
液に、1.81g（5.33mmol）の4,4'-ジメトキシトリフェニ
ルメチルクロリドを加えた。この混合物を室温で16時間
撹拌し、濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー
（29:70:1 EtOAc／ヘキサン／Et3N）で精製し2.06g（85
％）の粘性油状物１０を得た；TLC Rf .35（39:60:1 Et
OAc／ヘキサン／Et3N）。
【００５７】5-O-ベンゾイル-6-O-(4',4"-ジメトキシト
リフェニルメチル)-1-O-(tert-ブチルジメチルシリル)-
1,5,6-ヘキサントリオール、１１： 19mLのピリジン中
の2.06g（3.8mmol）の１０の溶液に532mL（644mg、4.58
mmol）の塩化ベンゾイルを加え、そしてこの混合物を20
時間撹拌し、そして大部分のピリジンを除去するため
に、浴の温度を30℃より下に保持して、ロータリーエバ
ポレーターで濃縮した。この混合物を50mLのEtOAcおよ
び50mLの飽和NaHCO3溶液の間で分配した。EtOAc層を50m
Lの飽和NaHCO3溶液、25mLの飽和NaCl溶液で洗浄し、乾
燥し（Na2SO4）、濾過し、そして濃縮した。シリカゲル
クロマトグラフィー（10:89:1 EtOAc／ヘキサン／Et
3N）で精製し、1.66gの粘性油状物１１を得た：
【００５８】
【表６】
【００５９】5-O-ベンゾイル-6-O-(4',4"-ジメトキシト
リフェニルメチル)-1,5,6-ヘキサントリオール、１２：
5.2mLのTHF中の1.66g（2.56mmol）の１１の溶液に、N
2雰囲気にて、5.12mL（5.12mmol）の1Mフッ化テトラブ
チルアンモニウムのTHF溶液を加えた。この混合物を室
温で３時間撹拌し、そしてロータリーエバポレーターで
濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（1:1 EtOAc
／ヘキサン）で精製し、1.18g（86％）の粘性油状物12
を得た。さらなる精製は、分取HPLC（12mL／min、9:1 M
eOH／H2O、22.4mm C18）により、可能であった：
【００６０】
【表７】
【００６１】O-5-ベンゾイルオキシ-6-O-(4',4"-ジメト
キシトリフェニルメチル)ヘキシル-O-(2'-シアノエチ
ル)-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト、１３：
6.5mLのCH2Cl2中の681mg（1.26mmol）の１２および111m
g（0.65mmol）ジイソプロピルアンモニウムテトラゾリ
ドの溶液に、1.0mLのCH2Cl2中の417mg（1.38mmol）のO-
シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロ
ジアミダイト溶液を加えた。この混合物を２時間撹拌
し、そして25mLのCH2Cl2および25mLの冷却した飽和NaHC
O3溶液の間で分配した。CH2Cl2相を飽和NaCl溶液で洗浄
し、乾燥し（Na2SO4）、濾過し、そして濃縮した。25mm
のカラム中の2"プラグの塩基性アルミナで濾過し、9:1
CH2Cl2／Et3Nで溶離して精製し、798mgの粘性油状物１
３を得た：1HNMR (CDCl3) 1.19 (m, 12H), 1.42 (m, 2
H), 1.65 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 2.69 (m, 2H), 3.28
(dd, 2H), 3.57 (m, 4H), 3.78 (s, 6H)(下に重なるm,
2H), 5.40 (m, 1H), 6.79 (dd, 4H), 7.27-7.64 (m, 1
2H), 8.17 (d, 2H)；31P NMR (CDCl3、15% H3PO4 内部
標準) 148.0; HRMS (FAB, MH+)，C43H54O7N2P1とした計
算値 741.3669，実測値 741.3678。 （実施例３） O-(14-(4',4"-ジメトキシトリフェニルメトキシ)-7,8-
ジチオテトラデシル)-O-(2-シアノエチル)-N,N-ジイソ
プロピルホスホルアミダイトの調製 図３はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は下に記載
される。
【００６２】S-(6-ヒドロキシヘキシル)イソチオウロニ
ウムクロリド、１４： 49mLのエタノール中の16.6mL
（20.0g、146mmol）の6−クロロヘキサノールの溶液に1
1.1g（146mmol）のチオウレアを加え、そしてこの混合
物を24時間還流した。この混合物を0℃まで冷却し、生
成物を結晶化した。この結晶を減圧濾過により収集し、
そして乾燥し、28.4g（92％）の白色固体物質14を得
た：mp 122-124℃; 1H NMR(DMSO) 1.40 (m, 4H), 1.65
(m, 2H), 3.21 (t, 2H) 3.41 (t, 2H), 9.27および9.3
3(重なる広い一重線，4H)。
【００６３】6-メルカプトヘキサン-1-オール、１５：
120mLのH2Oおよび120mLのEtOH中の17.8mg（83.6mmol）
の14の溶液に9.25gのNaOHペレットを加えた。この混合
物を４時間還流した。この混合物を注意深く約75mLまで
濃縮し、そして濃縮物を減圧蒸留によって精製し、7.4g
（66％）の１５を得た：bp 95-105℃ ＠ 5 mm Hg; 1H
NMR (CDCl3) 1.41 (m, 9H) 2.59 (dt, 2H), 3.69 (下に
重なる広いsを有するt，3H)。
【００６４】ビス-（6-ヒドロキシヘキシル）ジスルフ
ィド、１６： 10mLのMeOHおよび13.7mL（9.97g、98.5m
mol）のEt3N中の4.26g（31.7mmol）の１５の溶液に、N2
雰囲気および氷浴で冷却下にて、90mLのMeOH中の4.02g
（15.8mmol）のI2溶液を10分間かけて滴下した。冷却浴
を外し、そしてこの混合物を室温で４時間撹拌した。こ
の混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、そして
シリカゲルクロマトグラフィー（1:1 ヘキサン／EtOA
c）で精製し、3.12g（73％）の薄黄色固体物質１６を得
た：TLC Rf .18 (1:1 ヘキサン／EtOAc); mp 38-48℃;
1H NMR (CDCl3) 1.15-2.20(m, 16H), 2.73 (t, 4H), 3.
70 (t, 4H)。
【００６５】モノ-O-(4',4"-ジメトキシトリフェニルメ
チル)-ビス-(6-ヒドロキシヘキシル）ジスルフィド、１
７： 3.12g（11.7mmol）の１６および45mLのピリジン
の溶液に、3.97g（11.7mmol）の4,4'-ジメトキシトリフ
ェニルメチルクロライドを加え、そしてこの混合物を室
温で16時間撹拌した。ロータリーエバポレーターで大部
分のピリジンを除去し、そして残渣を100mLの飽和NaHCO
3溶液および100mLのEtOAcの間で分配した。EtOAc層を50
mLの飽和NaCl溶液で洗浄し、乾燥し（Na2SO4）、濾過
し、そして油状物に濃縮した。シリカゲルクロマトグラ
フィー（9:1 CH2Cl2／EtOAc）で精製し、2.84g（43％）
の粘性油状物１７を得た：
【００６６】
【表８】
【００６７】O-(14-(4',4"-ジメトキシトリフェニルメ
トキシ)-7,8-ジチオテトラデシル)-O-(2-シアノエチル)
-N,N-ジイソプロピルホスホルアミダイト、１８： 6.
8mLのCH2Cl2中の771mg（1.36mmol）の１７および116mg
（0.68mmol）のジイソプロピルアンモニウムテトラゾリ
ドの溶液に、N2雰囲気下にて、0.5mLのCH2Cl2中の458mg
（1.52mmol）のO-シアノエチル-N,N,N',N'-テトライソ
プロピルホスホロジアミダイトの溶液を加えた。この混
合物を４時間撹拌し、そして25mLのNaHCO3および3×25m
LのCH2Cl2の間で分配した。合わせたCH2Cl2層を飽和NaC
l溶液で洗浄し、乾燥し（Na2CO3）、濾過し、そして油
状物に濃縮した。25mmのカラム中の2"プラグの塩基性ア
ルミナで濾過し、9:1 CH2Cl2／Et3Nで溶離して精製し、
831mg（80％）の粘性油状物１８を得た；
【００６８】
【表９】
【００６９】（実施例４） オリゴヌクレオチドへの実施例１のホスホルアミダイト
の付加 ５倍モル過剰（760mg）の実施例１のホスホルアミダイ
トを、10g（300μモル）のCPG（制御細孔グラス）支持
体に付着したオリゴヌクレオチドの５’末端にカップリ
ングした。この合成は、Milligen 8800 DNA合成器で、D
NA合成のための製造者のプロトコールを用いることによ
り、行われた。これとは別に、Pharmacia Gene-Assembl
er DNA合成器での１μモル規模の反応で、カップリング
効率が、トリチルの脱離により、96％に決定された。こ
の決定のためには、実施例３からのホスホルアミダイト
が用いられた。
【００７０】反応後、CPGを100mlの濃アンモニアに懸濁
させ、そして55℃で終夜保持した。濾過後、脱保護され
たオリゴヌクレオチドを塩化ナトリウムグラジエントお
よびイオン-交換クロマトグラフィーによって精製し
た。
【００７１】画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。生成物含有画分をプールし、3M NaCl溶
液で0.3M NaClに調節し、そして等容積の冷イソプロピ
ルの添加により沈澱させた。
【００７２】生成物を遠心で収集し、そして真空下で乾
燥した。
【００７３】次に、このペレットを40mlの水に溶解し、
そして５倍モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウム（本実
施例では、精製されたオリゴヌクレオチド2gに対し83.6
mgである）を用いて0℃で30分間処理することにより酸
化させた。溶液を再び0.3M NaClに調節し、そして上記
のように沈澱させ、この反応で生成したホルムアルデヒ
ドを除去した。遠心および乾燥した後、この物質を次の
工程に用いた。 （実施例５） D-グルタミン酸、D-リシン（DEK）重合体への実施例４
のオリゴヌクレオチドの複合体化 100mgの酸化されたオリゴヌクレオチド（2.5μモル）を
1.33mlの100mM NaBO3（pH8.0）に溶解した。次に、2.5m
gのDEK（0.25μモル、MWt 10,000、D-グルタミン酸対D-
リシンが60:40 重量比）および0.79mg NaCNBH3（12.5μ
モル）を加えた。この混合物を37℃で３日間インキュベ
ートした。縮合物をS-200（Pharmacia、 Uppsala、Swed
en）クロマトグラフィーで精製した。
【００７４】標準的な8％DNA配列決定用ポリアクリルア
ミドゲルで観察するため、画分をアルファ32P ddATPお
よび末端トランスフェラーゼで標識した。
【００７５】各種の放射標識された画分は、図４に示さ
れるように、電気泳動およびオートラジオグラフィーに
より可視化された。”２”で示されるレーンは複合体化
されていない全長のオチゴヌクレオチドを含有し、そし
て矢印は50−マーの位置を示す。”１”で示されるレー
ンは減少した分子量の種々の複合体を含有する。より高
く置換されている（領域Ａ）オリゴ−DEK複合体を含有
する画分は、二重鎖DNA-DEK複合体を構成するための、
相補的オリゴヌクレオチド鎖への次のアニーリングのた
め、収集された。 （実施例６） キーホールリンペットヘモシアニン（Keyhole Limpet H
emocyanin）（KLH）への実施例４のオリゴヌクレオチド
の複合体化 100mgの粗製の酸化されたオリゴヌクレオチド（2.5μモ
ル）を1.33mlの50mM NaBO3（pH8.0）に溶解した。次
に、31.3mgのKLH（0.208μモル）および2.0mgのNaCNBH3
（31.8μモル）を加えた。この混合物（2.0ml）を37℃
で３日間インキュベートした。縮合生成物をS-200クロ
マトグラフィーで精製した。各画分を、前記のD-EKのた
めの方法と同じ方法で放射標識し、そして電気泳動およ
びオートラジオグラフィーを行った後、図５に示される
ように可視化した。”１”で示されるレーンは高分子量
複合体であり、”２”で示されるレーンは大部分、複合
体化されていないオリゴを含有し、そして矢印は50-マ
ーの位置を示す。有機化学、特に、オリゴヌクレオチド
合成および誘導体化の分野の当業者にとって明らかな、
本発明を実施するための上記実施態様に対する改変は、
下記クレームの範囲内に入ることを意図する。オリゴ-K
LH複合体を含有する画分は、二重鎖DNA-KLH複合物を構
成するための、相補的オリゴヌクレオチド鎖への次のア
ニーリングのため、収集された。 （実施例７） アセタール保護されたジオールホスホルアミダイトの調
製 4-（4-ヒドロキシ-1-ブチル）-2-フェニル-1,3ジオキソ
ラン： 1,2,6-トリヒドロキシヘキサン（2.58g）およ
びベンズアルデヒドジメチルアセタール（3.18g）の混
合物を、トルエンスルホン酸水和物（2.08g）で処理す
る。この混合物を室温で60時間撹拌し、そして飽和重炭
酸ナトリウム水溶液（50ml）および塩化メチレン（20m
l）の間で分配する。両層を分離し、水層を塩化メチレ
ンで再抽出し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、
濾過し、そして油状物（2.66g）に濃縮する。この油状
物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、1:1 酢酸
エチル／ヘキサン(hexanes)）で精製する。適切な画分
の収集および濃縮により油状の表題化合物（1.19g）が
得られた：TLC Rf＝0.18（シリカ、1:1 酢酸エチル／ヘ
キサン）；
【００７６】
【表１０】
【００７７】ベンズアルデヒドジメチルアセタールの代
わりにベンズアルデヒドを用いて開始すること以外は同
じ方法でも、表題化合物が得られる。
【００７８】(4-(2-フェニル-1,3-ジオキソール-4-イ
ル)ブチル）-O-（2-シアノエチル)-N-N-ジイソプロピル
ホスホルアミダイト：上記ジオキソラン（1.19g）の溶
液、および塩化メチレン（22ml）中のジイソプロピルア
ミン（2.0ml）を、シアノエチルジイソプロピルクロロ
ホスホルアミダイト（0.92ml）で処理し、24℃で1.5時
間撹拌する。この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液
（25ml）および塩化メチレン（25ml）の間で分配する。
両層を分離し、水層を塩化メチレンで再抽出し、有機層
を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして油状物
（2.13g）に濃縮する。この油状物をカラムクロマトグ
ラフィー（塩基性アルミナ、1:1 塩化メチレン／ヘキサ
ン(hexanes)、１％トリエチルアミン）で精製する。適
切な画分の収集および濃縮により油状の表題化合物（1.
28g）が得られる：
【００７９】
【表１１】
【００８０】同じ方法で、下記ホスホルアミダイトが調
製される：(4-(2-メトキシフェニル-1,3-ジオキソール-
4-イル)ブチル)-O-(2-シアノエチル)-N-N-ジイソプロピ
ルホスホルアミダイト；(4-(2-p-ブチルフェニル-1,3-
ジオキソール-4-イル)ブチル)-O-(2-シアノエチル）-N-
N-ジイソプロピルホスホルアミダイト；(4-(2-ビフェニ
ル-1,3-ジオキソール-4-イル)ブチル)-O-(2-シアノエチ
ル)-N-N-ジイソプロピルホスホルアミダイト；(4-(2-メ
チル-2-フェニル-1,3-ジオキソール-4-イル)ブチル)-O-
(2-シアノエチル)-N-N-ジイソプロピルホスホルアミダ
イト。 （実施例８）オリゴヌクレオチドへの実施例７のホスホ
ルアミダイトの付加：実施例７のホスホルアミダイト
は、実施例４の方法で、オリゴヌクレオチドにカップリ
ングされる。精製の後、アセタール保護基は80％酢酸／
水で、40分間かけて除去される。この反応の進度は、Ge
n Pak Fax カラム(Waters Associates)を用い、pH7.5の
0.5Mリン酸ナトリウムで、1.0M塩化ナトリウム／10％メ
タノールグラジエントを用いたHPLCにより、モニターさ
れる。
【００８１】有機亜リン酸化学、ヌクレオチド化学、オ
リゴヌクレオチド合成、または関連する分野の当業者に
とって明らかな、本発明を実施するための上記実施態様
に対する改変は、下記クレームの範囲内に入ることを意
図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の合成式の模式図である。
【図２】図２は、実施例２の合成式の模式図である。
【図３】図３は、実施例３の合成式の模式図である。
【図４】図４は、実施例５に記載のゲルのオートラジオ
グラムである。
【図５】図５は、実施例６に記載のゲルのオートラジオ
グラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョン ピー．ハックマン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130 サンディエゴ，ナンバー128， カーメル ビスタ ロード 12275 (72)発明者 マイケル ジェイ．コンラッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 92129 サンディエゴ，ペナノバ スト リート 11336 (72)発明者 スティーブン クーツ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067 ランチョ サンタ フェ， ラ ンチョ ディエクエノ ロード 6151 (72)発明者 ダグラス アラン リビングストン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122 サンディエゴ，フィオレ テラ ス ナンバー115 5260 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07H 21/00 C07F 9/24 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (24)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の式の５’−修飾オリゴヌクレオチ
    ド： 【化１】 ここで、 （Ｏ．Ｎ．）はオリゴヌクレオチド鎖を表し； ＸはＯまたはＳであり； Ｘ1は、Ｏ-、ＣＨ3、ＯＣＨ3またはＮＲ1Ｒ2（ここで、
    Ｒ1およびＲ2は、独立して、１〜６個の炭素原子のアル
    キル基、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル基、また
    は６〜２０個の炭素原子のアリール基であるか、あるい
    はＲ1およびＲ2は窒素原子と一緒に互いに結合し、４〜
    ７個の炭素原子およびＯまたはＳから選択される０〜１
    個の環状原子の環式構造を形成する）； Ｇは、４〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であ
    り；そしてＺは、以下からなる群から選択される； 【化２】 ここで、 Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素、１〜２０個の炭素原
    子のアルキル基、または６〜２０個の炭素原子の単環式
    アリール基であり； Ｒ5は、１〜２０個の炭素原子のアルキレン基、または
    ６〜２０個の炭素原子の単環式アリーレン基であり； Ｒ6およひＲ7は、独立して、水素、１〜２０個の炭素原
    子のアルキル基、６〜３０個の炭素原子のアリール基ま
    たは置換アリール基、あるいは炭素原子が３０未満の芳
    香族置換アルキル基であるが、ただし、Ｒ6およびＲ7は
    同時に水素でない； Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、独立して、ヒドロキシル保護基
    である。
  2. 【請求項２】 Ｚが以下である、請求項１に記載の５’
    −修飾オリゴヌクレオチド： 【化３】
  3. 【請求項３】 Ｚが以下である、請求項１に記載の５’
    −修飾オリゴヌクレオチド： 【化４】
  4. 【請求項４】 Ｚが以下である、請求項１に記載の５’
    −修飾オリゴヌクレオチド：−Ｓ−Ｓ−Ｒ5−Ｏ−Ｙ3。
  5. 【請求項５】 Ｒ3およびＲ4がそれぞれ水素である、請
    求項２または請求項３に記載の５’−修飾オリゴヌクレ
    オチド。
  6. 【請求項６】 Ｒ6およびＲ7がそれぞれ以下からなる群
    から選択される、請求項３に記載の５’−修飾オリゴヌ
    クレオチド： 水素； フェニル基； １〜８個の炭素原子のアルキル基で置換されたフェニル
    基； １〜８個の炭素原子のアルコキシ基で置換されたフェニ
    ル基； Ｆ、ＣｌおよびＢｒからなる群から選択される１〜４個
    のハロゲン原子で置換されたフェニル基； ニトロ基で置換されたフェニル基； フェニル基で置換されたフェニル基。
  7. 【請求項７】 Ｒ6が水素であり、そしてＲ7が、フェニ
    ル、ｐ−ブチルフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−
    ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、およびビフェニルからなる
    群から選択される、請求項３に記載の５’−修飾オリゴ
    ヌクレオチド。
  8. 【請求項８】 Ｒ5が−（ＣＨ2）6−である、請求項４
    に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチド。
  9. 【請求項９】 Ｒ1およびＲ2がそれぞれイソプロピル基
    である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の５’−修
    飾オリゴヌクレオチド。
  10. 【請求項１０】 Ｙ1、Ｙ2およびＹ3が、独立して、ジ
    メトキシトリチル、トリチル、ピキシル、ベンゾイル、
    アセチル、イソブチニル、ｐ−ブロモベンゾイル、ｔ−
    ブチルジメチルシリル、およびピバロイルからなる群か
    ら選択されるヒドロキシル保護基である、請求項１、
    ２、４、５、８および９のいずれか１項に記載の５’−
    修飾オリゴヌクレオチド。
  11. 【請求項１１】 Ｙ1およびＹ2の各々がベンゾイルまた
    はジメトキシトリチルである、請求項１、２、５および
    ９のいずれか１項に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチ
    ド。
  12. 【請求項１２】 Ｙ1およびＹ2の各々がベンゾイルであ
    る、請求項１、２、５および９のいずれか１項に記載の
    ５’−修飾オリゴヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 Ｙ1がベンゾイルであり、そしてＹ2が
    ジメトキシトリチルである、請求項１、２、５および９
    のいずれか１項に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチ
    ド。
  14. 【請求項１４】 Ｙ3がベンゾイルまたはジメトキシト
    リチルである、請求項１、４、８および１０のいずれか
    １項に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 Ｇが−（ＣＨ2）4−である、請求項１
    〜１４のいずれか１項に記載の５’−修飾オリゴヌクレ
    オチド。
  16. 【請求項１６】 Ｙ1およびＹ2の両方が遊離ヒドロキシ
    基を残すために除去される、請求項１、２、５および９
    のいずれか１項に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチ
    ド。
  17. 【請求項１７】 Ｚが、以下の式の、末端アルデヒド基
    を有する５’−修飾オリゴヌクレオチドを形成するため
    に酸化される、請求項２、３、５、６、７および９のい
    ずれか１項に記載の５’−修飾オリゴヌクレオチド： 【化５】
  18. 【請求項１８】 請求項１７に記載の５’−修飾オリゴ
    ヌクレオチドとアミノ基を有する担体分子を使用して複
    合体を作製する方法であって、該複合体が、該担体分子
    の該アミノ基と該５’−修飾オリゴヌクレオチドを酸化
    することによって形成された前記末端アルデヒド基との
    間の反応により形成され、該複合体が、以下の式： 【化６】 を有する、方法。
  19. 【請求項１９】 前記担体分子が重合体である、請求項
    １８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記担体分子がアミノ酸重合体であ
    る、請求項１８に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 Ｚが、以下の式の、前記５’−修飾オ
    リゴヌクレオチド上に末端チオール基を形成するために
    還元される、請求項４、８および９のいずれか１項に記
    載の５’−修飾オリゴヌクレオチド： 【化７】
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の５’−修飾オリゴ
    ヌクレオチドと官能基を有する担体分子を使用して複合
    体を作製する方法であって、該複合体が、該担体分子の
    該官能基と該５’−修飾オリゴヌクレオチドを還元する
    ことによって形成された前記末端チオール基との間の反
    応により形成され、該複合体が、以下の式： 【化８】 を有する、方法。
  23. 【請求項２３】 前記担体分子が重合体である、請求項
    ２２に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記担体分子がアミノ酸重合体であ
    る、請求項２２に記載の方法。
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