JP2001302684A - ５’−修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

５’−修飾オリゴヌクレオチド

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JP2001302684A JP2001065808A JP2001065808A JP2001302684A JP 2001302684 A JP2001302684 A JP 2001302684A JP 2001065808 A JP2001065808 A JP 2001065808A JP 2001065808 A JP2001065808 A JP 2001065808A JP 2001302684 A JP2001302684 A JP 2001302684A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 種々の型式のオリゴヌクレオチド合成法に用
いられ、一旦オリゴヌクレオチドの５’末端に付加され
ると遊離アルデヒド基またはスルフヒドリル基に変換さ
れ得る活性化可能な基を有する、新規な修飾亜リン酸中
間体を提供する。 【解決手段】 一般式１の化合物。 （Ｘ2はＲＯなどであり、Ｘ1はＮＲ1Ｒ2などであり、Ｒ
1、Ｒ2はＣ１〜Ｃ２のアルキル基などであり、またＮと
一緒に環式構造ととってもよい。ＧはＣ２〜Ｃ２０のヒ
ドロカルビレン基であり、Ｚはビシナルジオール基炭素
原の１つによってＧに結合した、ヒドロキシ保護された
該ビシナルジオール基などである。）

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は有機ホスフェート
（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）化学および固体状態のオリゴヌ
クレオチド合成の分野にある。さらに詳細には、本発明
は、オリゴヌクレオチドの５’末端に安定的に付着し
得、そして活性化されるとき、遊離アミノ基を有する任
意の分子にこのオリゴヌクレオチドを複合体化させるの
に用いられ得る官能性アルデヒド基またはスルフヒドリ
ル基を提供する活性化可能な部分を有する、反応性亜リ
ン酸（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｕｓ）中間体に関する。
【０００２】
【従来の技術】標識物、リガンド、固体表面、重合体ま
たは他の分子あるいは他の表面にオリゴヌクレオチドを
カップリングさせるために、遊離官能基を有するオリゴ
ヌクレオチドを提供することが必要である。末端官能基
を有するオリゴヌクレオチドを提供する技術の１つは、
従来の固相の自動合成方法で所望のオリゴヌクレオチド
を合成すること、および修飾ホスホルアミダイトによっ
てこのオリゴヌクレオチドの５’末端に官能基を導入す
ることを、包含する。
【０００３】Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，ら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８６） １４：６２２７
−６２４５は、オリゴヌクレオチドの５’末端に導入さ
れ得る、脱保護によって活性化され得、オリゴヌクレオ
チドの５’末端に遊離アミノ基を提供し得る活性化可能
な基を有する、修飾ホスホルアミダイトを記載する。リ
ンカー（第６２３６頁のＶＩＩＩ）であるＯ−（２−
（９−フルオレニルメトキシカルボニル）アミノエチ
ル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ−Ｎ−ジイソプロ
ピルホスホルアミダイトは、デオキシヌクレオシド−２
−シアノエチル−Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ
ダイトを用いて、自動ＤＮＡ合成機で所望のオリゴヌク
レオチドの末端に付加される。この付加物は脱保護さ
れ、（９−フルオレニルメトキシカルボニル基はアンモ
ニアで除去される）遊離アミノ基を提供する。
【０００４】Ｋｒｅｍｓｋｙ，Ｊ．Ｎ．ら、Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８７） １５：２８９
１−２９０９は、オリゴヌクレオチドの５’末端に導入
され、続いて修飾され、オリゴヌクレオチドを固定する
のに用いられる５’カルボキシ基またはアルデヒド基を
提供する官能化されたホスホルアミダイト（第２８９３
頁の１）を記載する。
【０００５】他の官能化されたホスホルアミダイトであ
るＯ−６−（４’，４”−ジメトキシトリフェニルメチ
ルチオ）ヘキシル−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ
−ジイソプロピルホスホルアミダイトは、Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより市販されている。
この分子は、通常のホスホルアミダイトプロトコールを
用いてオリゴヌクレオチドに導入される。このジメトキ
シトリチルで保護されたスルフヒドリル基は硝酸銀で脱
保護され得、オリゴヌクレオチド鎖の５’末端に遊離ス
ルフヒドリルを生成する。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明の主な目的は、
種々のタイプのオリゴヌクレオチド合成法に用いられ
得、そして一旦オリゴヌクレオチドの５’末端に付加さ
れると遊離アルデヒド基またはスルフヒドリル基に変換
され得る活性化可能な基を有する、新規な修飾亜リン酸
中間体を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】この遊離アルデヒド基／
スルフヒドリル基は、標識物、リガンド、重合体または
固体表面にオリゴヌクレオチドをカップリングまたは複
合体化させるのに有用である。これらの新しい中間体は
以下の基準を満たす：１）活性化可能な基は、従来のオ
リゴヌクレオチド合成の手順の全ての工程に適する；
２）活性化は、オリゴヌクレオチドに損傷を与えない条
件下で行われる；３）カップリングは、オリゴヌクレオ
チドまたはオリゴヌクレオチドがカップリングされる部
分に損傷を与えない条件下で行われる。
【０００８】本発明の新規なリン含有化合物には、オリ
ゴヌクレオチド合成のＨ−ホスホネート法、ホスホトリ
エステル法、ホスホルクロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）法およびホスホルアミダイト法
において有用な中間体、および５’修飾によって生じる
メチルホスホネート類、メチルホスフェート類、ホスホ
ロチオエート類およびホスホルアミダイト類のようなホ
スホジエステル類似物を包含する中間体が包含される。
これらの化合物は、一般に、下記の式で定義され得る：
【０００９】
【化９】
【００１０】ここで、Ｘは： （ｉ）Ｘ1がＯ-であり、そしてＸ２が水素またはＲＯ-
（ここでＲは保護基である）である場合には、酸素であ
り； （ｉｉ）以下の（ａ）または（ｂ）の場合には、存在せ
ず、（ａ）Ｘ1が塩素であり、そしてＸ2がメチルまたは
ＲＯ-である、または（ｂ）Ｘ2がＲＯ-であり、そして
Ｘ1がＮＲ1Ｒ2であり、ここで、Ｒ1およびＲ2は、独立
して、１〜６個の炭素原子のアルキル、３〜８個の炭素
原子のシクロアルキル、または６〜２０個の炭素原子の
アリールであり、または窒素原子と一緒に互いに結合
し、４〜７個の炭素原子および原子番号が８から１６ま
での（両端含む）環状（ａｎｎｕｌａｒ）カルコゲン原
子（ＯまたはＳ）０〜１個の環式構造を形成する；Ｇは
１〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であり；そ
してＺは、ビシナルジオール炭素原子の１個でＧに結合
したヒドロキシ保護されたビシナルジオール基、または
ジスルフィド基のイオウ原子の１個でＧに結合したジス
ルフィド基であり、但し、Ｚが該ジスルフィド基である
場合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有する。
【００１１】Ｘが酸素であり、Ｘ1がＯ-であり、そして
Ｘ2が水素である上記化合物は、Ｈ−ホスホネートであ
り、そしてオリゴヌクレオチド合成のＨ−ホスホネート
法（ＳｉｎｈａおよびＣｏｏｋ、ＮＡＲ （１９８８）
１６：２６５９−２６６９）に用いられる。Ｈ−ホス
ホネートは、一旦オリゴヌクレオチドの５’末端に導入
されると、ホスファイトジエステル類、ホスホロチオエ
ート類、またはホスホルアミデート類に変換し得る（Ｍ
ｉｌｌｅｒら、ＮＡＲ （１９８３） １１：５１８９
−５２０４，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ （１９８５） ５４：３６７−４０２，な
らびにＦｒｏｅｈｌｅｒおよびＭａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｎ
ＡＲ（１９８８） １６：４８３１−４８３９）。同様
に、Ｘが酸素であり、Ｘ1がＯ-であり、そしてＸ2がＲ
Ｏ-である上記化合物は、オリゴヌクレオチド合成への
ホスホトリエステルアプローチに用いられる（Ｇａｒｅ
ｇｇら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ （１９８
５） ２６：５）。Ｘが存在せず、そしてＸ1が塩素で
あり、そしてＸ2がＲＯ-である場合、得られる化合物は
ホスホクロリダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｃｈｌｏｒｉｄｉ
ｔｅ）であり、これはオリゴヌクレオチド合成のための
ホスホクロリダイト法に用いられる（Ｗａｄａら、Ｊ
Ｏｒｇ Ｃｈｅｍ （１９９１） ５６：１２４３−１
２５０）。上記式のホスホルアミダイトが好適である。
【００１２】本発明の好ましいホスホルアミダイトは次
の式で表され得る：
【００１３】
【化１０】
【００１４】ここで、Ｒは塩基に不安定な保護基であ
り、Ｒ1およびＲ2は、独立して、１〜６個の炭素原子の
アルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル、また
は６〜２０個の炭素原子のアリールであり、または窒素
原子と一緒に互いに結合し、４〜７個の炭素原子および
原子番号が８から１６までの包括的な環状カルコゲン原
子（ＯまたはＳ）０〜１個の環式構造を形成し、Ｇは１
〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であり、そし
てＺは、ビシナルジオールの炭素原子の１個でＧに結合
したヒドロキシ保護されたビシナルジオール基、または
ジスルフィド基のイオウ原子の１個でＧに結合したジス
ルフィド基であり、但し、Ｚが該ジスルフィド基である
場合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有する。
【００１５】本発明の他の局面は、次の式の５’修飾オ
リゴヌクレオチドである：
【００１６】
【化１１】
【００１７】ここで、（Ｏ．Ｎ．）はオリゴヌクレオチ
ド鎖を表し、Ｘは原子番号が８から１６までの包括的な
カルコゲン原子（ＯまたはＳ）であり、Ｘ1はＯ-、メチ
ル、−ＯＣＨ3またはＮＲ1Ｒ2（ここで、Ｒ1およびＲ2
は独立して水素または１〜６個の炭素原子のアルキルで
ある）であり、Ｇは１〜２０個の炭素原子のヒドロカル
ビレン基であり、そしてＺは、ビシナルジオールの炭素
原子の１個でＧに結合したヒドロキシ保護されたビシナ
ルジオール基、またはジスルフィド基のイオウ原子の１
個でＧに結合したジスルフィド基であり、但し、Ｚが該
ジスルフィド基である場合、Ｇは少なくとも４個の炭素
原子を有する。
【００１８】本発明のさらなる局面は、ヒドロキシ保護
基が遊離ヒドロキシル基を残すために除去された上記修
飾オリゴヌクレオチドである。本発明のさらに他の局面
は、Ｚが、オリゴヌクレオチドに末端アルデヒド基を形
成するために酸化された脱保護ビシナルジオール基を表
す、上記５’修飾オリゴヌクレオドである。
【００１９】本発明の他の局面は、末端アルデヒド基を
有する上記オリゴヌクレオチドと遊離アミノ基含有担体
分子との複合体である。この複合体は、アルデヒド基と
遊離アミノ基との間の反応により、形成される。本発明
のさらなる局面は、次式の、部分的に保護されたトリオ
ールである：
【００２０】
【化１２】
【００２１】ここで、Ｙ1およびＹ2は、独立して、ヒド
ロキシ保護基であり、または１原子の架橋によって連結
して５員環保護基を形成し、そしてＧは上記と同様であ
る。Ｇは、好適には、４〜２０個の炭素原子のアルキレ
ンである。本発明の他の局面は、次の式のジスルフィド
である： Ｙ3−Ｏ−Ｇ−Ｓ−Ｓ−Ｇ−ＯＨ （５） ここで、Ｙ3はヒドロキシ保護基であり、そしてＧは上
記と同様である。Ｇで表される２つの二価基は同一で有
り得るが、異なっていてもよい。好ましくは、これらは
同一で、このジスルフィドを対称的にする。好ましく
は、Ｙ3は塩基に安定である。好ましくは、Ｇは４〜２
０個の炭素原子のアルキレンである。
【００２２】別の局面において、本発明は以下の：
【００２３】
【化１３】
【００２４】式の化合物を提供する。ここで、（ａ）Ｘ
1は塩素であり、かつＸ2は、メチルもしくはＲＯ−であ
るか、または（ｂ）Ｘ2は、ＲＯ−であり、かつ、ＮＲ1
Ｒ2であって、ここで、Ｒ1およびＲ 2は、独立して、１
〜６炭素原子のアルキル、３〜８個の炭素原子のシクロ
アルキル、もしくは６〜２０個の炭素原子のアリール、
または一緒に結合して窒素原子とともに、４〜７個の炭
素原子および０〜１個の両端（ＯまたはＳ）を含む原子
番号８〜１６の環状カルコゲン原子の環状構造を形成
し；Ｒは、保護基であり；Ｇは、２〜２０個の炭素原子
のヒドロカルビレン基であり；そしてＺは、ビシナルジ
オールの炭素原子の１つによってＧに結合した、ヒドロ
キシ保護された、該ビシナルジオール基であるか、また
はジスルフィド基の原子において、硫黄のうちの一つに
よってＧに結合した、該ジスルフィド基であっり、ただ
し、Ｇは、Ｚが該ジスルフィド基である場合に、少なく
とも４炭素原子のものである。
【００２５】１つの実施態様において、本発明は、以下
の式：
【００２６】
【化１４】
【００２７】のホスホルアミダイトであって、ここで、
Ｒは、塩基に不安定な保護基であり、Ｒ1およびＲ2は、
独立して、１〜６個の炭素原子のアルキル、３〜８炭素
原子のシクロアルキル、６〜２０個の炭素原子のアリー
ル、または一緒に結合して窒素原子とともに、４〜７個
の炭素原子および０〜１個の両端を含む原子番号８〜１
６の環状カルコゲン原子の環状構造を形成し；Ｇは、２
〜２０炭素原子のヒドロカルビレン基であり；そしてＺ
は、ビシナルジオール基炭素原子の１つによってＧに結
合した、ヒドロキシ保護された、該ビシナルジオール基
であるか、またはジスルフィド基、硫黄原子のうちの一
つによってＧに結合した、該ジスルフィドであり、ただ
し、Ｇは、Ｚが該ジスルフィド基である場合に、少なく
とも４炭素原子のものである、ホスホルアミダイトを提
供する。
【００２８】別の実施態様において、Ｚは、
【００２９】
【化１５】
【００３０】であり、ここで、Ｒ3およびＲ4は、独立し
て、水素、１〜２０個の炭素原子のアルキルまたは６〜
２０個の炭素原子の単環式アリールであり、そしてＹ1
およびＹ2は、独立して、ヒドロキシ保護基であるか、
または１原子架橋によって連結されて、５員環保護基を
形成するか、または
【００３１】
【化１６】
【００３２】であって、ここで、Ｒ5は、１〜２０個の
炭素原子のアルキレン基、または６〜２０個の炭素原子
の単環式アリーレン基であり、そしてＹ3は、ヒロドキ
シ保護基である。
【００３３】別の実施態様において、Ｒ1およびＲ2がイ
ソプロピルである。
【００３４】別の実施態様において、Ｒ3およびＲ4は、
水素であり、Ｒ5は、−（ＣＨ2）6−であり、そして、
Ｙ1、Ｙ2およびＹ3は、ベンゾイルまたはジメトキシト
リチルである。
【００３５】別の実施態様において、Ｒ1およびＲ2がイ
ソプロピルであり、Ｇが−（ＣＨ2）4−であり、Ｚが
【００３６】
【化１７】
【００３７】であり、ここで、Ｙ1およびＹ2は、ベンゾ
イルである。
【００３８】別の実施態様において、Ｒ1およびＲ2がそ
れぞれイソプロピル基であり、Ｇが−（ＣＨ2）4−であ
り、Ｚが
【００３９】
【化１８】
【００４０】であり、ここで、Ｙ1は、ベンゾイルであ
り、そしてＹ2は、ジメトキシトリチルである。
【００４１】別の実施態様において、Ｚが、以下の式の
ヒドロキシ保護された、ビシナルジオール基
【００４２】
【化１９】
【００４３】であり、ここで、Ｒ6およびＲ7は独立し
て、水素、６〜３０個のアリールまたは炭素原子の置換
アリール、１〜２０個の炭素原子のアルキル、あるいは
炭素原子が３０未満の芳香族置換アルキルであるが、た
だし、Ｒ6およびＲ7は同時に水素でない。
【００４４】別の実施態様において、Ｒ6およびＲ7がそ
れぞれ以下：水素、フェニル、１〜８個の炭素原子のア
ルキルで置換されたフェニル、１〜８個の炭素原子のア
ルコキシで置換されたフェニル、Ｆ、ＣｌおよびＢｒか
らなる群から選択される１〜４個のハロゲン原子で置換
されたフェニル、ニトロ基で置換されたフェニル基また
はフェニルで置換されたフェニルであって、ただし、Ｒ
6およびＲ7は同時に水素でない。
【００４５】別の実施態様において、Ｒ6が水素であ
り、そしてＲ7が、フェニル、ｐ−ブチルフェニル、ｐ
−メトキシフェニル、ｐ−ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、
またはビフェニルである。
【００４６】別の実施態様において、Ｒ1およびＲ2はイ
ソプロピルであり、Ｇが−（ＣＨ2）6−であり、そして
Ｚは −Ｓ−Ｓ−Ｒ5−Ｏ−Ｙ3 であって、ここで、Ｒ5は−（ＣＨ2）6−であり、そし
てＹ3はジメトキシトリチルである。
【００４７】
【発明の実施の形態】先に示したように、本発明のホス
ホルアミダイトは次の式で表され得る：
【００４８】
【化２０】
【００４９】ここで、Ｒはメチルまたは塩基に不安定な
保護基であり、Ｒ1およびＲ2は、１〜６個の炭素原子の
アルキル、３〜８個の炭素原子のシクロアルキル、また
は６〜２０個の炭素原子のアリールであり、または窒素
原子と一緒に互いに結合し、４〜７個の炭素原子および
原子番号が８から１６までの包括的な環状カルコゲン原
子（ＯまたはＳ）０〜１個の環式構造を形成し、Ｇは１
〜２０個の炭素原子のヒドロカルビレン基であり、そし
てＺは、ビシナルジオールの炭素原子の１個でＧに共有
結合したヒドロキシ保護されたビシナルジオール基、ま
たはジスルフィド基のイオウ原子の１個でＧに共有結合
したジスルフィド基であり、但し、Ｚが前記ジスルフィ
ド基である場合、Ｇは少なくとも４個の炭素原子を有す
る。
【００５０】好ましくは、Ｒはβ−シアノエチルであ
り、Ｒ1およびＲ2は共にイソプロピルであり、そしてＧ
は−（ＣＨ2）n−（ここで、ｎは包括的に、４から６ま
での整数である）である。Ｒで表される他の保護基の例
には、β−ニトロエチル、２，２，２−トリクロロエチ
ル、メチル、１，１−ジメチル−２，２，２−トリクロ
ロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、ベンジル、
ｏ−クロロフェニル、ｐ−ニトロフェニルエチル、２−
メチルスルホニルエチル、および１，１−ジメチル−２
−シアノエチルがある。Ｒ1およびＲ2で表され得る他の
基の例には、ブチル、ヘキシル、ノニル、ドデシル、お
よびヘキサデシルのような他のアルキル基、シクロプロ
ピル、シクロブチル、シクロヘキシルおよびシクロオク
チルのようなシクロアルキル基、フェニル、トリル、ベ
ンジル、キシリルおよびナフチルのようなアリール基、
および互いに連結されるときの複素環式基、例えばモル
ホリノ、ピペリジニルおよびチオモルホリノがある。Ｇ
で表され得る他のヒドロカルビレン基の例には、分枝ア
ルキレン、およびシクロアルキレンを含有する基（例え
ば、シクロヘキシレン）またはフェニレンがある。Ｇ
は、主に不活性スペーサー部分として機能し、そしてそ
の構造中に、不活性スペーサーとして働く機能に影響を
与えない置換基および／またはヘテロ原子（例えば、
Ｏ、Ｓ、Ｎ）を有し得ることが理解されるであろう。
【００５１】Ｚで表されるヒドロキシ保護されたビシナ
ルジオール基は、好適には、次の式のものである：
【００５２】
【化２１】
【００５３】ここで、Ｒ3およびＲ4は、独立して、水
素、１〜２０個の炭素原子のアルキルまたは６〜２０個
の炭素原子の単環式アリーレンであり、そしてＹ1およ
びＹ2は、独立して、ヒドロキシ保護基であり、または
１原子（Ｃ、ＳまたはＳｉ）架橋によって（点線で示さ
れるように）連結され、５員環保護基を形成し得る。Ｙ
1およびＹ2は、化学合成（すなわち、従来の自動ホスホ
ルアミダイト合成）の際、この分子をオリゴヌクレオチ
ド鎖の５’末端に付加する間安定であるという性質を有
し、そしてその後、オリゴヌクレオチド鎖に損傷を与え
ることなく、除去され得る。さらに、後述されるよう
に、脱保護された基のビシナルジオール構造は、それ自
身が酸化によって「活性化」され得、ジオールから官能
性アルデヒドに変換される。Ｙ1およびＹ2は同一か、ま
たは異なり得、そしてホスホルアミダイト化学を用いる
通常の自動固相オリゴヌクレオチド化学に適する、個々
のヒドロオキシ保護基のいずれであっても良い。このよ
うなブロッキング基の例には、ジメトキシトリチル（Ｄ
ＭＴ）、トリチル、ピキシル（ｐｉｘｙｌ）、ベンゾイ
ル、アセチル、イソブチニル（ｉｓｏｂｕｔｙｎｙ
ｌ）、ｐ−ブロモベンゾイル、ｔ−ブチルジメチルシリ
ルおよびピバロイルがある。これらの保護基は、同じ
か、または異なる処理によって除去され得る。Ｒ3およ
びＲ4が水素であり、そしてＹ1およびＹ2がベンゾイル
またはＤＭＴであるビシナルジオール基は特に好まし
い。
【００５４】示されたように、Ｙ1およびＹ2は１原子架
橋によって結合され得、それゆえ、５員環を形成する。
適切な架橋原子にはケイ素、イオウおよび炭素が挙げら
れる。好ましくは、１原子架橋は炭素橋である。それゆ
え、このジオール基は、好ましくは、アセタールまたは
ケタール、すなわち、
【００５５】
【化２２】
【００５６】として保護される。
【００５７】架橋原子およびその置換基は、オリゴヌク
レオチドにリンカーを付加するのに用いられるシーケン
ス中の引続く反応に対し安定であることが重要である。
このジオール保護基はまた、実質的にオリゴヌクゴレオ
チドを分解させない温和な条件下で除去されなければな
らない。例えば、強い酸性条件では、オリゴレオチドの
脱プリン（ｄｅｐｕｒｉｎａｔｉｏｎ）が起こる。適切
なＲ6基およびＲ7基には、アリール基および６〜３０個
の炭素原子の置換アリール基、Ｃ1−Ｃ20アルキル基、
および３０個未満の炭素原子の芳香族置換アルキル基が
包含される。好ましいのは、フェニル、およびＣ1−Ｃ8
アルキル、Ｃ1-8アルコキシ；原子１〜４個のフッ素、
塩素、臭素、ニトロ−、またはフェニルで置換されたフ
ェニルである。最も好ましいのは、Ｒ6がフェニル、ｐ
−ブチルフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ−ｔｅｒ
ｔ−ブチルフェニル、およびビフェニルであるアセター
ル構造である。保護基の安定性は、特定の用途のため、
置換基を適切に選択することにより調節され得ることは
当業者にとって周知である。
【００５８】前記アセタールおよびケタールは、対応す
るトリオールから１工程で直接に、容易に調製される。
本発明のこの実施態様の重要かつ予期せぬ特徴は、分子
中の他の遊離アルコールの存在下で、ビシナルジオール
が選択的に保護されることである。それゆえ、Ｙ1およ
びＹ2がＨであるトリオールは、酸触媒の存在下で、単
に、アルデヒドと接触してアセタールを生成し、または
ケトンと接触してケタールを生成する。好ましくは、こ
の接触は、反応の間に形成された水が減圧の使用または
溶媒共沸により、反応の間に除去される条件下で行われ
る。または、低沸点のアルコールのアセタールまたはケ
タールが、アセタール交換反応において、アルデヒドま
たはケトンの代わりに同様に用いられ得る。
【００５９】前記アセタールおよびケタールのホスホル
アミダイトはここに記載の通常の方法により調製され、
そしてこれらはまた、ここで記載されるように、合成の
際にオリゴヌクレオチドにカップリングされる。この合
成および遊離の、カップリングされたオリゴヌクレオチ
ドの精製の後、保護基は温和な酸による加水分解によっ
てジオールを生成し、これは複合体化反応に用いられる
アルデヒドを生成する酸化反応のための基質である。代
表的な温和な加水分解条件は８０％酢酸／水、２５℃で
３０分であり、通常のオリゴヌクレオチド合成でジメト
キシトリチル基を除去するのに用いられる条件と同様で
ある。
【００６０】好ましいジスルフィド基は次の式を有する
もので表される： −Ｓ−Ｓ−Ｒ5−Ｏ−Ｙ3 ここで、Ｒ5は１〜２０個の炭素原子のアルキレン基ま
たは６〜２０個の炭素原子の単環式アリーレン基であ
り、そしてＹ3は（前記のような）ヒドロキシ保護基で
ある。
【００６１】最も好ましくは、Ｒ5は４〜６個の炭素原
子のアルキレンであり、−ＯＹ3はアルキレン基のω炭
素原子に結合し、そしてＹ3はトリチルである。後述さ
れるように、この基のジスルフィド構造は、それ自身が
還元によって「活性化」され得、スルフィド結合が切断
され、そして遊離スルフヒドリル基を生成する。
【００６２】Ｚがビシナルジオールを表すホスホルアミ
ダイトは、式ＨＣ＝ＣＨ−Ｇ−ＯＨのアルコールから調
製され得る。このアルコールのヒドロキシル基は保護さ
れ、そしてこの二重結合はジオール基を形成するために
酸化される。ジオールのヒドロキシルは、その後、直角
的に（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）除去可能な保護基
（Ｙ2およびＹ3）、すなわち、ビシナルジオールの保護
基を除去せずに、元々のヒドロキシの保護基が除去され
得るような保護基で保護される。次に、元々のヒドロキ
シの保護基は除去され、生じた脱保護されたヒドロキシ
は適切なホスフィチル化剤（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔ
ｉｎｇ ａｇｅｎｔ）と反応される。
【００６３】Ｚがジスルフィドを表すホスホルアミダイ
トは、対称または非対称ジスルフィドから調製され得
る。対称ジスルフィドを用いる一般の反応式は図３に示
され、そして以下の実施例３、に説明されている。非対
称ジスルフィドは、Ｍａｎｎｅｒｖｉｋ，Ｂ．，および
Ｌａｒｓｏｎ， Ｋ．， Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｅｎｚｙ
ｍ． （１９８１） ７７：４２０−４２４、またはＭ
ｕｋｕｉｙａｍａ， Ｔ．，およびＴａｋａｈａｓｈ
ｉ， Ｋ．， Ｔｅｔ Ｌｅｔｔ （１９６８） ５９
０７−５９０８の記載により、調製され得る。例として
は、対応するチオスルフィネートを提供するため、対称
ジスルフィド（ＨＯ−Ｇ−ＳＳ−Ｇ−ＯＨ）は過酸化水
素および蟻酸で酸化される。このチオスルフィネートを
メルカプタン（例えば、ＨＳ−Ｇ’−ＯＹ3、ここで、
Ｙ3は前記されたものと同様であり、Ｇ’は出発物質の
対称ジスルフィドにあるＧとは異なっている）を用いて
３より大きいｐＨで処理することにより、非対称ジスル
フィド（ＨＯ−Ｇ−ＳＳ−Ｇ’−ＯＹ3）が得られる。
このジスルフィドは、ホスホルアミダイトを得るために
ホスフィチル化剤と反応され得る。
【００６４】本発明のホスホルアミダイトは、オリゴヌ
クレオチドを調製するのに用いられる通常の自動ホスホ
ルアミダイト法を用いてオリゴヌクレオチド鎖の５’末
端に付加され得る。Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， Ｍ．Ｄ．，
およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．， Ｔｅｔ Ｌｅ
ｔｔ （１９８０） ５２１：７１９および米国特許第
４，５００，７０７号を参照せよ。このオリゴヌクレオ
チド鎖自身は同様の方法で調製され得る。本発明のホス
ホルアミダイトが付加されたこのオリゴヌクレオチドの
長さおよび配列は、得られる５’−官能化されたオリゴ
ヌクレオチドの使用に依存する。例えば、オリゴヌクレ
オチドが、欧州特許出願公開公報第０４３８２５９号に
記載の目的（すなわち、全身性エリテマトーデス（ＳＬ
Ｅ）の治療）に用いられるならば、このオリゴヌクレオ
チドはＳＬＥ抗体に結合する能力を有するべきである。
もしこのオリゴヌクレオチドが標識されたプローブとし
て用いられるならば、その長さおよび配列は、目的とす
るヌクレオチドの配列にハイブリダイズすることができ
るべきである。
【００６５】前記したように、得られた修飾オリゴヌク
レオチドは次の式で表される：
【００６６】
【化２３】
【００６７】ここで、（Ｏ．Ｎ．）はオリゴヌクレオチ
ド鎖を表し、そしてＸ、Ｘ1、ＧおよびＺは先に定義さ
れたものである。５’という名称は、修飾基がオリゴヌ
クレオチド鎖の５’末端に付着することを示す。この鎖
は、典型的には、１０〜２００個のヌクレオチドの長さ
であり、より一般的には、２０〜６０個のヌクレオチド
の長さである。一旦、ホスホルアミダイトがオリゴヌク
レオチド鎖の５’末端に付加されると、保護基（Ｙ1、
Ｙ2、Ｙ3）は、遊離ヒドロキシ基を生成するために適切
な処理（例えば、塩基処理または酸処理）によって除去
され得る。ビシナルジオールの場合では、ジオール基
は、末端アルデヒド基を形成するため、例えば、過ヨウ
素酸塩で酸化される。ジスルフィド基の場合では、この
ジスルフィドは、適切な還元剤、例えばジチオトレイト
ールまたは２−メルカプトエタノールのようなメルカプ
タンまたは水素化ホウ素で還元され、ジスルフィド結合
が切断され、末端スルフヒドリル基を形成する。
【００６８】得られた５’修飾オリゴヌクレオチドは、
アルデヒド基によって遊離アミノ基を有する標識体、担
体、または他の分子にカップリングし得、またはスルフ
ヒドリル基によってマレイミドまたはα−ハロアセチル
基のような求電子中心、あるいはアクリレートまたはア
クリルアミドのような他の適切なマイクル（Ｍｉｃｈａ
ｅｌ）受容体に、カップリングし得る。このような担体
の例には、Ｄ−リシンとＤ−グルタミン酸との共重合体
のようなアミノ酸重合体、または免疫グロブリン、また
は上に列挙したような基を含むように本質的に誘導体化
された他の重合体がある。
【００６９】
【実施例】次の実施例により本発明をさらに例示する。
これらの実施例は如何なる意味でも、本発明を限定する
ことを意図しない。これらの実施例中では、Ｅｔ＝エチ
ル、Ａｃ＝アセチル、およびＴＨＦ＝テトラヒドロフラ
ンである。
【００７０】（実施例１） Ｏ−（５，６−（ビス−Ｏ−ベンゾイルオキシ）−ヘキ
シル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプ
ロピルホスホルアミダイトの調製 図１はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る本発明の反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は
下に記載される。
【００７１】Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチオルジメチルシリ
ル）−５−ヘキセノール、５： １０４ｍＬの中ＤＭＦ
の５−ヘキセン−１−オール１２．４７ｍＬ（１０．４
ｇ、１０４ｍｍｏｌ）の溶液に１５．６６ｇ（２３０ｍ
ｍｏｌ）のイミダゾールおよび２０．０ｇ（１３０ｍｍ
ｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロリド（Ｔ
ＢＤＭＳＣｌ）を加えた。混合物を室温で４時間撹拌
し、そして２００ｍＬのＥｔＯＡｃおよび１００ｍＬの
飽和ＮａＨＣＯ3溶液の間に分配した。ＥｔＯＡｃ層を
１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液、１００ｍＬの飽和
ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾過
し、そして約１００ｍＬの容積に濃縮した。減圧蒸留に
より７０．０７ｇの５を得た：
【００７２】
【表１】
【００７３】１−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリ
ル）−１，５，６−ヘキサントリオール、６： ９２ｍ
Ｌのアセトン中の９．８６ｇ（４６．０ｍｍｏｌ）の５
の溶液に２３ｍＬのＨ2Ｏ中の６．４６ｇ（５５．２ｍ
ｍｏｌ）のＮ−メチルモルホリンオキシド（ＮＭＭＯ）
を加えた。この混合物に２．５％のＯｓＯ4のｔｅｒｔ
−ブチルアルコール溶液（３６０ｍｇの溶液、９．０ｍ
ｇのＯｓＯ4、３５μｍｏｌ）４３３ｕＬおよび３０％
Ｈ2Ｏ2 ５０ｕＬを加えた。この混合物を１６時間撹拌
し、それに１４ｍＬのＨ2Ｏ中の４７４ｍｇのナトリウ
ムジチオナイト（ｓｏｄｉｕｍ ｄｉｔｈｉｏｎｉｔ
ｅ）の溶液を加えた。さらに０．５時間後に、この混合
物をセライトで濾過した。濾液をＭｇＳＯ4で乾燥し、
そして１５０ｍＬのブフナー漏斗中の１”のシリカゲル
で、２５０ｍＬづつのＥｔＯＡｃを警告 2用いて濾過し
た。生成物を含有する留分を濃縮し、１１．０ｇの粘性
油状物６を得た：
【００７４】
【表２】
【００７５】５，６−（ビス−Ｏ−ベンゾイル）−１−
Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１，５，６
−ヘキサントリオール、７：１０６ｍＬのピリジン中の
５．２９ｇ（２１．３ｍｍｏｌ）の６の溶液に６．１８
ｍＬ（７．４８ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）の塩化ベンゾイ
ルを加えた。この混合物を１８時間撹拌し、ロータリー
エバポレーターで濃縮した。この混合物を１００ｍＬの
冷１Ｎ ＨＣｌおよび１００ｍＬのＥｔＯＡｃの間で分
配した。酸性であることを確認するため、水層のｐＨを
検査した。ＥｔＯＡｃ層を１００ｍＬのＨ2Ｏおよび１
００ｍＬの飽和ＮａＣｌで順次洗浄し、乾燥し（ＭｇＳ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮して１０．３３ｇの粘性黄
色油状物７を得た：
【００７６】
【表３】
【００７７】５，６−（ビス−Ｏ−ベンゾイル）−１，
５，６−ヘキサントリオール、８：１０．９ｍＬのＴＨ
Ｆ中の２．６２ｇ（５．３６ｍｍｏｌ）の７の溶液に、
ＴＨＦ中の１Ｎのフッ化テトラブチルアンモニウム（Ｃ
ＴＢＡＦ）溶液１０．７ｍＬ（１０．７ｍｍｏｌ）を加
えた。この混合物を１６時間撹拌した。この混合物を２
５ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液および３×２５ｍＬのＥ
ｔＯＡｃの間で分配した。合わせたＥｔＯＡｃ抽出物を
飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、濾
過し、そして粘性油状物に濃縮し、この濃縮物をシリカ
ゲルクロマトグラフィー（１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡ
ｃ）で精製して８２３ｍｇの粘性油状物８を得た：
【００７８】
【表４】
【００７９】Ｏ−（５−６−（ビス−Ｏ−ベンゾイルオ
キシ）−ヘキシル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，
Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト、９： １４．
９ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の１．０２ｇ（２．９８ｍｍｏ
ｌ）の８および２５５ｍｇ（１．４９ｍｇ）のジイソプ
ロピルアンモニウムテトラゾリド（ＤＩＰＡＴ、ジイソ
プロピルアミンおよびテトラゾールのアセトニトリル溶
液を１対１のモル比で混合し、白色固体に濃縮して調製
した）の溶液に、２．０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の９８９ｍ
ｇ（３．２８ｍｍｏｌ）のＯ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，
Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト
を加えた。この混合物を４時間撹拌し、そして２５ｍＬ
のＣＨ2Ｃｌ2および２５ｍＬの冷却した飽和ＮａＨＣＯ
3溶液の間で分配した。ＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＣｌ溶
液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして濃
縮した。２５ｍｍのカラム中の２”プラグの塩基性アル
ミナで濾過し、９：１ ＥｔＯＡｃ／Ｅｔ3Ｎで溶離し
て精製し、１．５ｇ（９３％）の粘性油状物９を得た：
【００８０】
【表５】
【００８１】（実施例２） Ｏ−５−ベンジルオキシ−６−Ｏ−（４’，４”−ジメ
トキシトリチル）ヘキシル−Ｏ−（２−シアノエチル）
−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイトの調製 図２はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は下に記載
される。
【００８２】６−Ｏ−（４’，４”−ジメトキシトリフ
ェニルメチル）−１−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチル
シリル）−１，５，６−ヘキサントリオール、１０：
２２ｍＬのピリジン中の１．１１ｇ（４．４７ｍｍｏ
ｌ）の６および８９１ｕＬ（６３８ｍｇ、６．３０ｍｍ
ｏｌ）のＥｔ3Ｎの溶液に、１．８１ｇ（５．３３ｍｍ
ｏｌ）の４，４’−ジメトキシトリフェニルメチルクロ
リドを加えた。この混合物を室温で１６時間撹拌し、濃
縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー（２９：７
０：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／Ｅｔ３Ｎ）で精製し
２．０６ｇ（８５％）の粘性油状物１０を得た；ＴＬＣ
Ｒｆ ．３５（３９：６０：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサ
ン／Ｅｔ３Ｎ）。
【００８３】５−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−（４’，
４”−ジメトキシトリフェニルメチル）−１−Ｏ−（ｔ
ｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−１，５，６−ヘキサ
ントリオール、１１： １９ｍＬのピリジン中の２．０
６ｇ（３．８ｍｍｏｌ）の１０の溶液に５３２ｍＬ（６
４４ｍｇ、４．５８ｍｍｏｌ）の塩化ベンゾイルを加
え、そしてこの混合物を２０時間撹拌し、そして大部分
のピリジンを除去するために、浴の温度を３０℃より下
に保持して、ロータリーエバポレーターで濃縮した。こ
の混合物を５０ｍＬのＥｔＯＡｃおよび５０ｍＬの飽和
ＮａＨＣＯ3溶液の間で分配した。ＥｔＯＡｃ層を５０
ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ3溶液、２５ｍＬの飽和ＮａＣｌ
溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして
濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー（１０：８
９：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン／Ｅｔ3Ｎ）で精製し、
１．６６ｇの粘性油状物１１を得た：
【００８４】
【表６】
【００８５】５−Ｏ−ベンゾイル−６−Ｏ−（４’，
４”−ジメトキシトリフェニルメチル）−１，５，６−
ヘキサントリオール、１２： ５．２ｍＬのＴＨＦ中の
１．６６ｇ（２．５６ｍｍｏｌ）の１１の溶液に、Ｎ2
雰囲気にて、５．１２ｍＬ（５．１２ｍｍｏｌ）の１Ｍ
フッ化テトラブチルアンモニウムのＴＨＦ溶液を加え
た。この混合物を室温で３時間撹拌し、そしてロータリ
ーエバポレーターで濃縮した。シリカゲルクロマトグラ
フィー（１：１ ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）で精製し、
１．１８ｇ（８６％）の粘性油状物１２を得た。さらな
る精製は、分取ＨＰＬＣ（１２ｍＬ／ｍｉｎ、９：１
ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ、２２．４ｍｍ Ｃ１８）により、可
能であった：
【００８６】
【表７】
【００８７】Ｏ−５−ベンゾイルオキシ−６−Ｏ−
（４’，４”−ジメトキシトリフェニルメチル）ヘキシ
ル−Ｏ−（２’−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロ
ピルホスホルアミダイト、１３： ６．５ｍＬのＣＨ2
Ｃｌ2中の６８１ｍｇ（１．２６ｍｍｏｌ）の１２およ
び１１１ｍｇ（０．６５ｍｍｏｌ）ジイソプロピルアン
モニウムテトラゾリドの溶液に、１．０ｍＬのＣＨ2Ｃ
ｌ2中の４１７ｍｇ（１．３８ｍｍｏｌ）のＯ−シアノ
エチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホス
ホロジアミダイト溶液を加えた。この混合物を２時間撹
拌し、そして２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2および２５ｍＬの冷
却した飽和ＮａＨＣＯ3溶液の間で分配した。ＣＨ2Ｃｌ
2相を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2Ｓ
Ｏ4）、濾過し、そして濃縮した。２５ｍｍのカラム中
の２”プラグの塩基性アルミナで濾過し、９：１ ＣＨ
2Ｃｌ2／Ｅｔ3Ｎで溶離して精製し、７９８ｍｇの粘性
油状物１３を得た：1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3） １．
１９ （ｍ， １２Ｈ），１．４２ （ｍ， ２Ｈ），
１．６５ （ｍ， ２Ｈ）， １．８１ （ｍ，２
Ｈ）， ２．６９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．２８ （ｄ
ｄ， ２Ｈ）， ３．５７ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７
８ （ｓ， ６Ｈ）（下に重なるｍ， ２Ｈ）， ５．
４０ （ｍ， １Ｈ）， ６．７９ （ｄｄ， ４
Ｈ）， ７．２７−７．６４ （ｍ， １２Ｈ），
８．１７ （ｄ， ２Ｈ）；31Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣ
ｌ3、１５％ Ｈ3ＰＯ4 内部標準） １４８．０； Ｈ
ＲＭＳ （ＦＡＢ， ＭＨ＋），Ｃ43Ｈ54Ｏ7Ｎ2Ｐ1と
した計算値 ７４１．３６６９，実測値７４１．３６７
８。
【００８８】（実施例３） Ｏ−（１４−（４’，４”−ジメトキシトリフェニルメ
トキシ）−７，８−ジチオテトラデシル）−Ｏ−（２−
シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミ
ダイトの調製 図３はこのホスホルアミダイトを調製するのに用いられ
る反応式を模式的に示す。この反応式の詳細は下に記載
される。
【００８９】Ｓ−（６−ヒドロキシヘキシル）イソチオ
ウロニウムクロリド、１４： ４９ｍＬのエタノール中
の１６．６ｍＬ（２０．０ｇ、１４６ｍｍｏｌ）の６−
クロロヘキサノールの溶液に１１．１ｇ（１４６ｍｍｏ
ｌ）のチオウレアを加え、そしてこの混合物を２４時間
還流した。この混合物を０℃まで冷却し、生成物を結晶
化した。この結晶を減圧濾過により収集し、そして乾燥
し、２８．４ｇ（９２％）の白色固体物質１４を得た：
ｍｐ １２２−１２４℃； 1Ｈ ＮＭＲ （ＤＭＳ
Ｏ） １．４０ （ｍ， ４Ｈ）， １．６５ （ｍ，
２Ｈ）， ３．２１ （ｔ， ２Ｈ） ３．４１
（ｔ， ２Ｈ）， ９．２７および９．３３（重なる広
い一重線，４Ｈ）。
【００９０】６−メルカプトヘキサン−１−オール、１
５： １２０ｍＬのＨ2Ｏおよび１２０ｍＬのＥｔＯＨ
中の１７．８ｍｇ（８３．６ｍｍｏｌ）の１４の溶液に
９．２５ｇのＮａＯＨペレットを加えた。この混合物を
４時間還流した。この混合物を注意深く約７５ｍＬまで
濃縮し、そして濃縮物を減圧蒸留によって精製し、７．
４ｇ（６６％）の１５を得た：ｂｐ ９５−１０５℃
＠ ５ ｍｍ Ｈｇ；1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3）
１．４１ （ｍ， ９Ｈ） ２．５９ （ｄｔ， ２
Ｈ）， ３．６９ （下に重なる広いｓを有するｔ，３
Ｈ）。
【００９１】ビス−（６−ヒドロキシヘキシル）ジスル
フィド、１６： １０ｍＬのＭｅＯＨおよび１３．７ｍ
Ｌ（９．９７ｇ、９８．５ｍｍｏｌ）のＥｔ3Ｎ中の
４．２６ｇ（３１．７ｍｍｏｌ）の１５の溶液に、Ｎ2
雰囲気および氷浴で冷却下にて、９０ｍＬのＭｅＯＨ中
の４．０２ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）のＩ2溶液を１０分
間かけて滴下した。冷却浴を外し、そしてこの混合物を
室温で４時間撹拌した。この混合物をロータリーエバポ
レーターで濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィ
ー（１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）で精製し、３．１
２ｇ（７３％）の薄黄色固体物質１６を得た：ＴＬＣ
Ｒｆ ．１８ （１：１ ヘキサン／ＥｔＯＡｃ）；
ｍｐ ３８−４８℃； 1Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ3）
１．１５−２．２０（ｍ， １６Ｈ）， ２．７３
（ｔ， ４Ｈ）， ３．７０ （ｔ，４Ｈ）。
【００９２】モノ−Ｏ−（４’，４”−ジメトキシトリ
フェニルメチル）−ビス−（６−ヒドロキシヘキシル）
ジスルフィド、１７： ３．１２ｇ（１１．７ｍｍｏ
ｌ）の１６および４５ｍＬのピリジンの溶液に、３．９
７ｇ（１１．７ｍｍｏｌ）の４，４’−ジメトキシトリ
フェニルメチルクロライドを加え、そしてこの混合物を
室温で１６時間撹拌した。ロータリーエバポレーターで
大部分のピリジンを除去し、そして残渣を１００ｍＬの
飽和ＮａＨＣＯ3溶液および１００ｍＬのＥｔＯＡｃの
間で分配した。ＥｔＯＡｃ層を５０ｍＬの飽和ＮａＣｌ
溶液で洗浄し、乾燥し（Ｎａ2ＳＯ4）、濾過し、そして
油状物に濃縮した。シリカゲルクロマトグラフィー
（９：１ ＣＨ2Ｃｌ2／ＥｔＯＡｃ）で精製し、２．８
４ｇ（４３％）の粘性油状物１７を得た：
【００９３】
【表８】
【００９４】Ｏ−（１４−（４’，４”−ジメトキシト
リフェニルメトキシ）−７，８−ジチオテトラデシル）
−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル
ホスホルアミダイト、１８： ６．８ｍＬのＣＨ2Ｃ
ｌ2中の７７１ｍｇ（１．３６ｍｍｏｌ）の１７および
１１６ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）のジイソプロピルアン
モニウムテトラゾリドの溶液に、Ｎ2雰囲気下にて、
０．５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中の４５８ｍｇ（１．５２ｍｍ
ｏｌ）のＯ−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テト
ライソプロピルホスホロジアミダイトの溶液を加えた。
この混合物を４時間撹拌し、そして２５ｍＬのＮａＨＣ
Ｏ3および３×２５ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2の間で分配した。
合わせたＣＨ2Ｃｌ2層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、乾
燥し（Ｎａ2ＣＯ3）、濾過し、そして油状物に濃縮し
た。２５ｍｍのカラム中の２”プラグの塩基性アルミナ
で濾過し、９：１ ＣＨ2Ｃｌ2／Ｅｔ3Ｎで溶離して精
製し、８３１ｍｇ（８０％）の粘性油状物１８を得た；
【００９５】
【表９】
【００９６】（実施例４） オリゴヌクレオチドへの実施例１のホスホルアミダイト
の付加 ５倍モル過剰（７６０ｍｇ）の実施例１のホスホルアミ
ダイトを、１０ｇ（３００μモル）のＣＰＧ（制御細孔
グラス）支持体に付着したオリゴヌクレオチドの５’末
端にカップリングした。この合成は、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ
８８００ ＤＮＡ合成器で、ＤＮＡ合成のための製造
者のプロトコールを用いることにより、行われた。これ
とは別に、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ−Ａｓｓｅｍ
ｂｌｅｒ ＤＮＡ合成器での１μモル規模の反応で、カ
ップリング効率が、トリチルの脱離により、９６％に決
定された。この決定のためには、実施例３からのホスホ
ルアミダイトが用いられた。
【００９７】反応後、ＣＰＧを１００ｍｌの濃アンモニ
アに懸濁させ、そして５５℃で終夜保持した。濾過後、
脱保護されたオリゴヌクレオチドを塩化ナトリウムグラ
ジエントおよびイオン−交換クロマトグラフィーによっ
て精製した。
【００９８】画分をポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より分析した。生成物含有画分をプールし、３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ溶液で０．３Ｍ ＮａＣｌに調節し、そして等容積
の冷イソプロピルの添加により沈澱させた。
【００９９】生成物を遠心で収集し、そして真空下で乾
燥した。
【０１００】次に、このペレットを４０ｍｌの水に溶解
し、そして５倍モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウム
（本実施例では、精製されたオリゴヌクレオチド２ｇに
対し８３．６ｍｇである）を用いて０℃で３０分間処理
することにより酸化させた。溶液を再び０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌに調節し、そして上記のように沈澱させ、この反応
で生成したホルムアルデヒドを除去した。遠心および乾
燥した後、この物質を次の工程に用いた。
【０１０１】（実施例５） Ｄ−グルタミン酸、Ｄ−リシン（ＤＥＫ）重合体への実
施例４のオリゴヌクレオチドの複合体化 １００ｍｇの酸化されたオリゴヌクレオチド（２．５μ
モル）を１．３３ｍｌの１００ｍＭ ＮａＢＯ３（ｐＨ
８．０）に溶解した。次に、２．５ｍｇのＤＥＫ（０．
２５μモル、ＭＷｔ １０，０００、Ｄ−グルタミン酸
対Ｄ−リシンが６０：４０ 重量比）および０．７９ｍ
ｇ ＮａＣＮＢＨ3（１２．５μモル）を加えた。この
混合物を３７℃で３日間インキュベートした。縮合物を
Ｓ−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｕｐｐｓａｌａ、
Ｓｗｅｄｅｎ）クロマトグラフィーで精製した。
【０１０２】標準的な８％ＤＮＡ配列決定用ポリアクリ
ルアミドゲルで観察するため、画分をアルファ３２Ｐ
ｄｄＡＴＰおよび末端トランスフェラーゼで標識した。
【０１０３】各種の放射標識された画分は、図４に示さ
れるように、電気泳動およびオートラジオグラフィーに
より可視化された。”２”で示されるレーンは複合体化
されていない全長のオチゴヌクレオチドを含有し、そし
て矢印は５０−マーの位置を示す。”１”で示されるレ
ーンは減少した分子量の種々の複合体を含有する。より
高く置換されている（領域Ａ）オリゴ−ＤＥＫ複合体を
含有する画分は、二重鎖ＤＮＡ−ＤＥＫ複合体を構成す
るための、相補的オリゴヌクレオチド鎖への次のアニー
リングのため、収集された。
【０１０４】（実施例６） キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏｌｅ
Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）（ＫＬＨ）への
実施例４のオリゴヌクレオチドの複合体化 １００ｍｇの粗製の酸化されたオリゴヌクレオチド
（２．５μモル）を１．３３ｍｌの５０ｍＭ ＮａＢＯ
3（ｐＨ８．０）に溶解した。次に、３１．３ｍｇのＫ
ＬＨ（０．２０８μモル）および２．０ｍｇのＮａＣＮ
ＢＨ3（３１．８μモル）を加えた。この混合物（２．
０ｍｌ）を３７℃で３日間インキュベートした。縮合生
成物をＳ−２００クロマトグラフィーで精製した。各画
分を、前記のＤ−ＥＫのための方法と同じ方法で放射標
識し、そして電気泳動およびオートラジオグラフィーを
行った後、図５に示されるように可視化した。”１”で
示されるレーンは高分子量複合体であり、”２”で示さ
れるレーンは大部分、複合体化されていないオリゴを含
有し、そして矢印は５０−マーの位置を示す。有機化
学、特に、オリゴヌクレオチド合成および誘導体化の分
野の当業者にとって明らかな、本発明を実施するための
上記実施態様に対する改変は、下記クレームの範囲内に
入ることを意図する。オリゴ−ＫＬＨ複合体を含有する
画分は、二重鎖ＤＮＡ−ＫＬＨ複合物を構成するため
の、相補的オリゴヌクレオチド鎖への次のアニーリング
のため、収集された。
【０１０５】（実施例７） アセタール保護されたジオールホスホルアミダイトの調
製 ４−（４−ヒドロキシ−１−ブチル）−２−フェニル−
１，３ジオキソラン：１，２，６−トリヒドロキシヘキ
サン（２．５８ｇ）およびベンズアルデヒドジメチルア
セタール（３．１８ｇ）の混合物を、トルエンスルホン
酸水和物（２．０８ｇ）で処理する。この混合物を室温
で６０時間撹拌し、そして飽和重炭酸ナトリウム水溶液
（５０ｍｌ）および塩化メチレン（２０ｍｌ）の間で分
配する。両層を分離し、水層を塩化メチレンで再抽出
し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そ
して油状物（２．６６ｇ）に濃縮する。この油状物をカ
ラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ 酢酸エ
チル／ヘキサン（ｈｅｘａｎｅｓ））で精製する。適切
な画分の収集および濃縮により油状の表題化合物（１．
１９ｇ）が得られた：ＴＬＣ Ｒｆ＝０．１８（シリ
カ、１：１ 酢酸エチル／ヘキサン）；
【０１０６】
【表１０】
【０１０７】ベンズアルデヒドジメチルアセタールの代
わりにベンズアルデヒドを用いて開始すること以外は同
じ方法でも、表題化合物が得られる。
【０１０８】（４−（２−フェニル−１，３−ジオキソ
ール−４−イル）ブチル）−Ｏ−（２−シアノエチル）
−Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト：上記ジ
オキソラン（１．１９ｇ）の溶液、および塩化メチレン
（２２ｍｌ）中のジイソプロピルアミン（２．０ｍｌ）
を、シアノエチルジイソプロピルクロロホスホルアミダ
イト（０．９２ｍｌ）で処理し、２４℃で１．５時間撹
拌する。この混合物を飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２
５ｍｌ）および塩化メチレン（２５ｍｌ）の間で分配す
る。両層を分離し、水層を塩化メチレンで再抽出し、有
機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして油
状物（２．１３ｇ）に濃縮する。この油状物をカラムク
ロマトグラフィー（塩基性アルミナ、１：１ 塩化メチ
レン／ヘキサン（ｈｅｘａｎｅｓ）、１％トリエチルア
ミン）で精製する。適切な画分の収集および濃縮により
油状の表題化合物（１．２８ｇ）が得られる：
【０１０９】
【表１１】
【０１１０】同じ方法で、下記ホスホルアミダイトが調
製される：（４−（２−メトキシフェニル−１，３−ジ
オキソール−４−イル）ブチル）−Ｏ−（２−シアノエ
チル）−Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト；
（４−（２−ｐ−ブチルフェニル−１，３−ジオキソー
ル−４−イル）ブチル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−
Ｎ−Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト；（４−
（２−ビフェニル−１，３−ジオキソール−４−イル）
ブチル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ−Ｎ−ジイソ
プロピルホスホルアミダイト；（４−（２−メチル−２
−フェニル−１，３−ジオキソール−４−イル）ブチ
ル）−Ｏ−（２−シアノエチル）−Ｎ−Ｎ−ジイソプロ
ピルホスホルアミダイト。
【０１１１】（実施例８）オリゴヌクレオチドへの実施
例７のホスホルアミダイトの付加：実施例７のホスホル
アミダイトは、実施例４の方法で、オリゴヌクレオチド
にカップリングされる。精製の後、アセタール保護基は
８０％酢酸／水で、４０分間かけて除去される。この反
応の進度は、Ｇｅｎ Ｐａｋ Ｆａｘ カラム（Ｗａｔ
ｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用い、ｐＨ７．５の
０．５Ｍリン酸ナトリウムで、１．０Ｍ塩化ナトリウム
／１０％メタノールグラジエントを用いたＨＰＬＣによ
り、モニターされる。
【０１１２】有機亜リン酸化学、ヌクレオチド化学、オ
リゴヌクレオチド合成、または関連する分野の当業者に
とって明らかな、本発明を実施するための上記実施態様
に対する改変は、下記クレームの範囲内に入ることを意
図する。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１の合成式の模式図である。
【図２】図２は、実施例２の合成式の模式図である。
【図３】図３は、実施例３の合成式の模式図である。
【図４】図４は、実施例５に記載のゲルのオートラジオ
グラムである。
【図５】図５は、実施例６に記載のゲルのオートラジオ
グラムである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デイビッド エス．ジョーンズ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92127 サンディエゴ，フロリンド ロード 11265 (72)発明者 ジョン ピー．ハックマン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92130 サンディエゴ，ナンバー128， カーメ ル ビスタ ロード 12275 (72)発明者 マイケル ジェイ．コンラッド アメリカ合衆国 カリフォルニア 92129 サンディエゴ，ペナノバ ストリート 11336 (72)発明者 スティーブン クーツ アメリカ合衆国 カリフォルニア 92067 ランチョ サンタ フェ， ランチョ ディエクエノ ロード 6151 (72)発明者 ダグラス アラン リビングストン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122 サンディエゴ，フィオレ テラス ナン バー115 5260

Claims (11)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の： 【化１】 式の化合物であって、ここで、 （ａ）Ｘ1は塩素であり、かつＸ2は、メチルもしくはＲ
    Ｏ−であるか、または（ｂ）Ｘ2は、ＲＯ−であり、か
    つ、ＮＲ1Ｒ2であって、ここで、Ｒ1およびＲ 2は、独立
    して、１〜６炭素原子のアルキル、３〜８個の炭素原子
    のシクロアルキル、もしくは６〜２０個の炭素原子のア
    リール、または一緒に結合して窒素原子とともに、４〜
    ７個の炭素原子および０〜１個の両端（ＯまたはＳ）を
    含む原子番号８〜１６の環状カルコゲン原子の環状構造
    を形成し；Ｒは、保護基であり；Ｇは、２〜２０個の炭
    素原子のヒドロカルビレン基であり；そしてＺは、ビシ
    ナルジオールの炭素原子の１つによってＧに結合した、
    ヒドロキシ保護された、該ビシナルジオール基である
    か、またはジスルフィド基の原子において、硫黄のうち
    の一つによってＧに結合した、該ジスルフィド基であっ
    り、ただし、 Ｇは、Ｚが該ジスルフィド基である場合に、少なくとも
    ４炭素原子のものである、化合物。
  2. 【請求項２】 以下の式： 【化２】 のホスホルアミダイトであって、ここで、 Ｒは、塩基に不安定な保護基であり、Ｒ1およびＲ2は、
    独立して、１〜６個の炭素原子のアルキル、３〜８炭素
    原子のシクロアルキル、６〜２０個の炭素原子のアリー
    ル、または一緒に結合して窒素原子とともに、４〜７個
    の炭素原子および０〜１個の両端を含む原子番号８〜１
    ６の環状カルコゲン原子の環状構造を形成し；Ｇは、２
    〜２０炭素原子のヒドロカルビレン基であり；そしてＺ
    は、ビシナルジオール基炭素原子の１つによってＧに結
    合した、ヒドロキシ保護された、該ビシナルジオール基
    であるか、またはジスルフィド基、硫黄原子のうちの一
    つによってＧに結合した、該ジスルフィドであり、ただ
    し、 Ｇは、Ｚが該ジスルフィド基である場合に、少なくとも
    ４炭素原子のものである、ホスホルアミダイト。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載のホスホルアミダイトで
    あって、ここで、Ｚは、 【化３】 であり、ここで、 Ｒ3およびＲ4は、独立して、水素、１〜２０個の炭素原
    子のアルキルまたは６〜２０個の炭素原子の単環式アリ
    ールであり、そしてＹ1およびＹ2は、独立して、ヒドロ
    キシ保護基であるか、または１原子架橋によって連結さ
    れて、５員環保護基を形成するか、または 【化４】 であって、ここで、 Ｒ5は、１〜２０個の炭素原子のアルキレン基、または
    ６〜２０個の炭素原子の単環式アリーレン基であり、そ
    してＹ3は、ヒロドキシ保護基である、ホスホルアミダ
    イト。
  4. 【請求項４】 Ｒ1およびＲ2がイソプロピルである、請
    求項３に記載のホスホルアミダイト。
  5. 【請求項５】 Ｒ3およびＲ4は、水素であり、Ｒ5は、
    −（ＣＨ2）6−であり、そして、Ｙ1、Ｙ2およびＹ
    3は、ベンゾイルまたはジメトキシトリチルである、請
    求項４に記載のホスホルアミダイト。
  6. 【請求項６】 Ｒ1およびＲ2がイソプロピルであり、Ｇ
    が−（ＣＨ2）4−であり、Ｚが 【化５】 であり、ここで、Ｙ1およびＹ2は、ベンゾイルである、
    請求項２に記載のホスホルアミダイト。
  7. 【請求項７】 Ｒ1およびＲ2がそれぞれイソプロピル基
    であり、Ｇが−（ＣＨ2）4−であり、Ｚが 【化６】 であり、ここで、Ｙ1は、ベンゾイルであり、そしてＹ2
    は、ジメトキシトリチルである、請求項２に記載のホス
    ホルアミダイト。
  8. 【請求項８】 Ｚが、以下の式のヒドロキシ保護され
    た、ビシナルジオール基 【化７】 であり、ここで、Ｒ6およびＲ7は独立して、水素、６〜
    ３０個のアリールまたは炭素原子の置換アリール、１〜
    ２０個の炭素原子のアルキル、あるいは炭素原子が３０
    未満の芳香族置換アルキルであるが、ただし、Ｒ6およ
    びＲ7は同時に水素でない、請求項２に記載のホスホル
    アミダイト。
  9. 【請求項９】 Ｒ6およびＲ7がそれぞれ以下：水素、フ
    ェニル、１〜８個の炭素原子のアルキルで置換されたフ
    ェニル、１〜８個の炭素原子のアルコキシで置換された
    フェニル、Ｆ、ＣｌおよびＢｒからなる群から選択され
    る１〜４個のハロゲン原子で置換されたフェニル、ニト
    ロ基で置換されたフェニル基またはフェニルで置換され
    たフェニルであって、ただし、Ｒ6およびＲ7は同時に水
    素でない、請求項８に記載のホスホルアミダイト。
  10. 【請求項１０】 Ｒ6が水素であり、そしてＲ7が、フェ
    ニル、ｐ−ブチルフェニル、ｐ−メトキシフェニル、ｐ
    −ｔｅｒｔ−ブチルフェニル、またはビフェニルであ
    る、請求項８に記載のホスホルアミダイト。
  11. 【請求項１１】 請求項２に記載のホスホルアミダイト
    であって、Ｒ1およびＲ2がイソプロピルであり、Ｇが−
    （ＣＨ2）6−であり、そしてＺが 【化８】 であって、ここで、Ｒ5は−（ＣＨ2）6−であり、そし
    てＹ3はジメトキシトリチルである、ホスホルアミダイ
    ト。
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