PT100691B - Intermediarios de fosforos modificados para fornecer grupos funcionais na extremidade 5' dos oligonucleotidos - Google Patents
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Description
INTERMEDIÁRIOS DE FOSFORO MODIFICADOS PARA FORNECER GRUPOS FUNCIONAIS MA EXTREMIDADE 5' DOS OLIGONUCLEOTIDOS”
Resumo: (máx. 150 palavras) @
Esta invenção refere-se a fosforaraidites da fórmula:
~ - 1 2
I e R são, individualente, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átoos de carbono, ou arilo do 6 a 20 átomos de carbono, ou são unidos ara formar, com_o átomo de nitrogénio, uma estrutura cíclica de 4-7 átomos
G é em que R é um grupo protector de base-lábil, R u ‘ ff
P de carbono e de 0 a 1 átomo de caícogánio de número atómico 8 a 16, um grupo hidrocarbileno de 1 a 20 átomos de carbono, e Z é um grupo df-·* - -- * '--· ' * - diois vicinais, ou um grupo disulfureto, e dos átomos de enxofre do grupo disulfureto 1 iol vicinal hidroxi-protegido ligado a G por um dos átomos de carbono iois vicinais, ou um grupo disulfureto, e estando ligado a G por um uu.awa.xuj.cuu, com a condição de G ter, pe .□ menos, 4 átomos de carbono quando Z é o referido grupo disulfureto.-
INSTITUTO NACIONAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL
DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES
42/374 ΜΗΝΗ li
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FOLHA DO RESUMO (Continuação)
| Modalidade e n.° (Π) | T D | Data do pedido (22) | Classificação Internacional (51) |
| Resumo (continuação) (57) Estas fosforaaidites são usadas na síntese oligonuGleotídica automatizada convencional para introduzir um grupo aldeído funcional ou um grupo tiol na extremidade 5' gc oligonucleótido, para assim fornecer um local reactivo no cligcnucleótido, o qual pode ser usado para conjugar o oligonucleótido com moléculas que contêm um grupo amino livre, ou um centro electrofilico, reactivo com um grupo tiol. |
DSM-5 -JHMREISiESa.·»»»------Titular: LA JOLLA PHARMACEUTICAL COMPANY
Epígrafe: INTERMEDIÁRIOS DE FOSFORO MODIFICADOS PARA FORNECER
GRUPOS FUNCIONAIS NA EXTREMIDADE '5' DOS
OLIGONUCLEOTIDOS
MEMÓRIA
DESCRITIVA
Campo do invento presente invento encontra-se no campo da química de fosfatos orgânicos e sintese de oligonucleótidos de estado sólido. Mais particularmente, diz respeito a intermediários de fósforo reactivos, que podem ser ligados de forma estável à
| extremidade | 5' | de um oligonucleótido, e | que | têm | uma | metade | |
| activável | que, | quando | activada, | fornece | um | aldeído ou | grupo |
| sulfidrilo | funcional | que pode | ser usado | para | conjugar o | ||
| oligonucleótido | com qualquer molécula que | possua um | grupo | amina |
livre.
Antecedentes do invento
E necessário fornecer oligonucleótidos com um grupo funcional livre, de modo a acoplar o oligonucleótido a marcadores, ligandos, superfícies sólidas, polímeros e outras moléculas ou superfícies.
Uma técnica para fornecer oligonucleótidos com um grupo
ο funcional terminal envolve a síntese do oligonucleôtido desejado através de procedimentos convencionais de sintese automatizada de estado-sólido, e a incorporação do grupo funcional na extremidade 5' do oligonucleôtido via uma fosforamidite modificada.
Agrawal, S., et al., Nucl. Acids Res. (1986)
14:6227:6245, descrevem uma fosforamidite modificada que pode ser introduzida na extremidade 5' de um oligonucleôtido que tenha um grupo activável, que possa ser activado por desprotecção, de modo a fornecer um grupo amina livre na extremidade terminal 5' do oligonucleôtido. 0 linker (VIII na página 6236), 0-(2-(9fluorenilmetoxicarbonil) aminoetil)-0-(2-cianoetil)-N-Ndiisopropil fosforamidite, é adicionado à extremidade do oligonucleôtido desejado, num sintetisador automático de DNA, usando desoxinucleosido - 2 - cianoetil- N - N - diisopropil fosforamidites. 0 citado é desprotegido (o grupo 9fluorenilmetoxicarbonil é removido com amónia), de modo a fornecer um grupo amina livre.
Kremsky, J.N., et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15:28912909, descrevem uma fosforamidite funcional (1 na página 2893) ) que é introduzida na extremidade 5' do oligonucleôtido e depois modificada para fornecer um grupo 5' carboxi ou aldeído, que é usado para imobilizar o oligonucleôtido.
Uma outra fosforamidite funcional, 0-6-(4',4''dimetoxitrifenilmetiltio)hexil - 0 -(2-cianoetil)-N-N-diisopropil fosforamidite, está disponível comercialmente pela Clontech Laboratories. Esta molécula é incorporada em oligonucleótidos usando protocolos convencionais de fosforamidite. 0 grupo sulfidrilo protegido por dimetoxitritil pode ser desprotegido com
nitrato de prata de modo a conseguir um grupo sulfidrilo livre na extremidade 5' da cadeia do oligonucleótido.
Um principal objectivo do presente invento é fornecer um novo intermediário de fósforo modificado que possa ser empregue nos vários tipos de métodos de sintese de oligonucleótidos, e que possui grupos activáveis que podem ser convertidos em grupos aldeido ou sulfidrilo livres, uma vez que tenha sido adicionado à extremidade 5' de um oligonucleótido, 0 grupo aldeido/sulfidrilo livre é útil para acoplar ou oligonucleótido a marcadores, ligandos, polímeros sólidas. Estes novos intermediários possuem caracteristicas:
1) o grupo activável é compatível etapas dos procedimentos convencionais de oligonucleótidos;
não danificam o oligonucleótido; 3) a junção é condições que não danificam o oligonucleótido ou a conjugar o
| >u superfícies | |
| as seguintes | |
| . com todas | as |
| sintese | de |
| condições | que |
| efectuada | sob |
| metade à | qual |
o oligonucleótido é acoplado.
Exposição do invento ) Os novos compostos do invento contendo fósforo incluem intermediários que são úteis nos métodos H-fosfonato,
| fosfotriéster, | fosforcloridite | e fosforamidite de sintese | ! de | |
| oligonucleótidos | , bem como | intermediários | que resultam | em |
| modificações 5' | que envolvem | análogos de | fosfodiéster | como |
| metilfosfonatos, | metilfosfatos, | fosforotioatos | e fosforamidatos, | |
| Estes | compostos podem | ser definidos | genericamente | pela |
seguinte fórmula: χ il
X -P-O-G-Z (1)
em que X é: 1-2 - (i) oxigénio quando X é 0 e X é hidrogénio ou RO quando R é um grupo protector;
(ii) não está presente quando (a) X é cloro e X é metilo ou RO , ou quando (b) X2 é RO e X1 é NRXR2 em que R1 e R2 são individualmente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou arilo de 6 a 20 átomos de carbono, ou estão juntos de modo a formar com o átomo de nitrogénio uma estrutura cíclica de 4 a 7 átomos de carbono, e 0 a 1 átomos de calcogénio anulares de número atómico 8 a 16 inclusivé (O ou S);
G é um grupo hidrocarbileno com 1 a 20 átomos de carbono; e Z é um grupo diol vicinal hidroxi-protegido ligado a G por um dos átomos de carbono vicinais ou um grupo disulfureto ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto, com a condição de que G tem pelo menos 4 átomos de carbono quando Z é o dito grupo disulfureto.
' 1 2
Os compostos acima em que X é oxigénio, X é O , e X é hidrogénio, são H-fosfonatos e são empregues no método do Hfosfonato de síntese de oligonucleótidos (Sinha e Cook, NAR (1988) 16:2659-2669). Os H-fosfonatos podem ser convertidos a diésteres de fosfito, fosforotioatos ou fosforoamidatoá, uma vez incorporados na extremidade 5' de um oligonucleótido (Miller et al,, NAR (1983) 11:5189-5204, Eckstein, Ann Rev Biochem (1985) 367—402, e Froehler e Matteucci, NAR (1988) 16:4831-4839) .
Correspondentemente, os compostos acima em que X é oxigénio, X1 é e X é RO são usados na abordagem fosfotriéster para sintetisar oligonucleótidos (Garegg, et al., Chemica Scripta (1985) 2j6:5) . Quando X não está presente e X1 é cloro e X2 é R0~, o composto resultante é fosfocloridite e é usado na técnica de fosfocloridite para a síntese de oligonucleótidos (Wada et al., J
Org. Chem. ( 1991) 56:1243-1250) . São preferidas as fosforamidites com a fórmula acima.
As fosforamidites preferidas do invento podem ser representadas pela fórmula: R-0-P-O-G-Z /\
R1 R2 <2) ι ι > >
s _ <
2 em que R é um grupo protector de base lábil, R e R são individualmente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou arilo de 6 a 20 >
átomos de carbono, ou estão juntos de modo a formar com o átomo de nitrogénio uma estrutura ciclica de 4 a 7 átomos de carbono e 0 a 1 átomos de calcogénio anulares de números atómico 8 a 16 inclusivé (O ou S), G é um grupo hidrocarbileno com 1 a 20 átomos de carbono; e Z é um grupo diol vicinal hidroxi-protégido ligado a G por dois átomos de carbono vicinais ou um grupo disulfureto ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto, com a condição de que G tem pelo menos 4 átomos de carbono quando Z é o dito grupo disulfureto.
Um outro aspecto do invento é um oligonucleótido modificado 5' de fórmula:
X1
I (O.N.)-5'-O-P-O-G-Z (3)
X em que (O.N.) representa uma cadeia de oligonucleótido,
X é um átomo de calcogénio de número atómico de 8 a 16 inclusivé (0 ou S), X1 é 0“, metilo, -OCH3 ou NRXR2 em que R1 e R2 são individualmente hidrogénio ou alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, G é um grupo hidrocarbileno com 1 a 20 átomos de carbono; e Z é um grupo diol vicinal hidroxi-protegido ligado a G por um dos átomos de carbono vicinais ou um grupo disulfureto ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto, com a condição de que G tem pelo menos 4 átomos de carbono quando Z é o dito grupo dissulfureto.
»
Um outro aspecto do invento é o oligonucleótido modificado acima descrito, em que os grupos hidroxi-protectores foram removidos para deixar livres grupos hidroxilo.
Ainda outro aspecto do invento é o oligonucleotido modificado 5' acima descrito no qual Z representa um grupo diol vicinal desprotegido que foi oxidado para formar um grupo aldeido terminal no oligonucleótido.
Um outro aspecto do invento é um conjugado do oligonucleótido acima citado, tendo um grupo aldeido terminal e uma molécula transportadora contendo um grupo amina livre, em que o conjugado é formado pela reacção entre o grupo aldeido e o grupo amina livre.
Ainda outro aspecto do invento é um triol parcialmente protegido com a fórmula:
yl-0 0-Y2
H-C-C-G-OH (4)
II
Η H
2 em que Y e Y são individualmente grupos protectores hidroxilo ou estão juntos por uma ponte de um único átomo de
ο carbono para formar um grupo protector em anel de cinco membros, e G é descrito como acima. Preferencialmente G é um alquileno com 4 a 20 átomos de carbono.
Um outro aspecto do invento é um disulfureto com a fórmulas γ3-O-G-S-S-G-OH em que Y é um grupo protector hidroxilo e G é como descrito acima. Os dois grupos divalentes representados por G podem ser os mesmos ou diferentes. De preferência são os mesmos, formando um disulfureto simétrico. De prefrência, Y é uma base estável. De preferência G ê um alquileno com 4 a 20 átomos de carbono.
Breve Descrição dos Esquemas
As Figuras 1-3 são diagramas esquemáticos dos esquemas de síntese descritos nos Exemplos 1-3.
As Figuras 4 e 5 são autoradiogramas dos geles descritos nos Exemplos 5 e 6.
Modos de realização do invento
I
Como indicado acima, as fosforamidites do invento podem ser representadas pela fórmula:
R-O-P-O-G-Z
(2)
em que R é um grupo protector metilo ou de base lábil,
2
R e R são individualmente alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, eicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou arilo de 6 a 20 átomos de carbono, ou estão juntos de modo a formar com o átomo —r
I de nitrogénio uma estrutura ciclica de 4 a 7 átomos de carbonoe a 1 átomos de calcogénio anulares de número atómico 8 a16 inclusivé (0 ou S), G é um grupo hidrocarbileno com 1 a 20 átomos de carbono e Z é um grupo diol vicinal hídroxi-protegido ligado covalentemente a G por um dos átomos de carbono vicinais ouum grupo disulfureto, ligado a G covalentemente por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto, com a condição de que G tem pelo menos 4 átomos de carbono quando Z é o dito grupo disulfureto.
2
De preferência, R é β-cianoetil, R e R são ambos isopropil, e G é -(CH2)n_ que n é um inteiro de 4 a 6, inclusivé. Exemplos de outros grupos protectores representados por R são β-nitroetil, 2,2,2-tricloroetil, metil, 1,1-dimetil-
2,2,2-tricloroetil, 2,2,2-tribromoetil, benzil, o-clorofenil, pnitrofeniletil, 2-metilsulfoniletil, e 1,l-dimetil-2-cianoetil. Exemplos de outros grupos em que R e R podem representar, são outros grupos alquilo tal como butil, hexil, nonil, dodecil, e hexadecil, grupos cicloalquilo como ciclopropil, ciclobutil, ciclohexil e ciclooctil, grupos arilo como fenilo, tolil, benzil, xilil e naftil, e, quando juntos, grupos heterocicilicos tal como morfolino, piperidinil e tiomorfolino, Exemplos de outros radicais hidrocarbileno que G pode representar são alquilenos ramificados, e grupos contendo cicloalquilenos (por exemplo, ciclohexileno) ou fenileno. De notar que G funciona primeiro como uma metade espaçadora inerte e depois pode ter substituintes e/ou heteroátomos (por exemplo, 0, S, N) na sua estrutura, que não afectam a sua capacidade para agir como um espaçador inerte.
Grupos diol vicinais hidroxi-protegidos preferidos representados por Z, são os da seguinte fórmula:
Υχ-0 0-Υ2
-C-C-R4 ι '3
Η RJ
4 em que R e R são individualmente hidrogénio, alquilo de 1 a 20 átomos de carbono ou arilenos monocíclicos de 6 a 20
2 átomos de carbono, e Y e Y são individualmente grupos hidroxiprotegidos ou podem ser juntos (designados pela linha a tracejado) por uma ponte de um único átomo (C, S ou Si) para
2 formar um grupo protector em anel de cinco membros. Y e Y são de uma natureza tal que são estáveis durante a adição da molécula à extremidade 5' da cadeia de um oligonucleótido durante a síntese quimica (por exemplo, sintese convencional automatizada de fosforamidite) e pode ser depois removido sem danificar a cadeia de oligonucleótido, além disso, como descrito a seguir, a estrutura do diol vicinal do grupo desprotegido permite que este seja activado por oxidação, convertendo-o de diol a um grupo
2 funcional aldeido. Y e Y podem sér os mesmos ou diferentes e podem ser qualquer dos grupos hidroxi-protectores individuais que são compatíveis com a quimica convencional automatizada de estado sólido de oligonucleótidos, usando a quimica da fosforamidite. Exemplos de tais grupos bloqueadores são dimetoxitritil (DMT), tritil, pixil, benzoil, acetil, isobutinil, p-bromobenzoil, tbutildimetilsilil e pivaloil. Os grupos protectores podem ser removidos com os mesmos ou diferentes tratamentos. Tais grupos
4 12 diol vicinais nos quais R e R são hidrogénio e Y e Y são benzoil ou DMT são particularmente preferidos.
2 1 Como indicado, Y e Y podem estar ligados por uma ponte de um átomo, formando assim um anel com cinco membros.
Átomos apropriados para a formação da ponte incluem sílica, enxofre e carbono. E preferível que uma ponte de um átomo seja uma ponte de carbono. Assim, o grupo diol é preferido para ser protegido como um acetal ou cetal, i.e,,
0
I I
H-C-CI I
Η H
Acetal
0
H-C-CI I
Η H
Cetal
E importante que o átomo formador da ponte e os seus substituintes sejam estáveis para a subsequnte reacção na sequência, usada para adicionar o linker ao oligonucleótido. 0 grupo protector diol tem também de ser capaz de ser removido sob condições brandas, que não degradam substancialmente o oligonucleótido. Por exemplo, condições muito acidicas conduzirão
7 à depurinação do oligonucleótido. Grupos apropriados R° e R incluem grupos arilo e arilo substituídos de 6 a 30 átomos de carbono, grupos alquilo Ci-C20f ® grupos alquilo aromáticos substituídos com menos de 30 átomos de carbono. Os preferidos são o fenil e fenil substituído com alquilo de Ci-Cg, alcoxi Cj-Cg; 1 a 4 átomos de flúor, cloro, bromo, nitro ou fenil. De preferência β são estruturas acetálicas em que R é fenil, p-butilfenil, pmetoxifenil, p-terbutilfenil e bifenil. Os especialistas no ramo saberão que a estabilidade do grupo protector pode ser ajustada para um uso particular através de uma escolha adequada do(s) substituinte(s).
Os acetais e cetais acima descritos são facilmente preparados directamente a partir dos correspondentes triois em uma etapa. E um importante e inesperado aspecto desta configuração do presente invento que o diol vicinal é selectivamente protegido na presença de outro alcoól livre na
2 molécula. Assim, o triol em que Y e Y são H é simplesmente posto em contacto com o aldeido de forma a obter um acetal ou uma cetona para conseguir o cetal na presença de um ácido catalítico. E preferível que o contacto aconteça sob condições em que a água formada durante a reacção é removida durante a reacção, quer pela aplicação de vácuo ou por solventes azeotrópicos, Alternativamente, acetais ou cetais de alcoóis de baixo ponto de ebulição podem ser igualmente utilizados em lugar do aldeido ou cetona numa reacção de troca de acetal.
As fosforamidites dos acetais e cetais acima descritos são preparadas pelos métodos convencionais aqui descritos, e são acopladas ao oligonucleótido durante a síntese, como também é aqui · descrito. A seguir à síntese e purificação de oligonucleótidos livres e acoplados, a hidrólise ácida fraca do grupo protector origina o diol que é o substrato para a reacção de oxidação que produz o aldeido usado para a reacção de conjugação. Condições típicas de hidrólise fraca são ácido acético 80%/água a 25°C durante 30 minutos, semelhante ás condições usadas para remover o grupo dimetoxitritil na síntese convencional de oligonucleótidos.
Os grupos disulfureto preferidos representados têm a fórmula:
-S-S-R5-O-Y3 υ · em que R é um grupo alquileno com 1 a 20 átomos de carbono ou um grupo arileno monociclico com 6 a 20 átomos de carbono, e Y é um grupo hidroxi-protector (como descrito acima).
De preferência, R é uma alquileno de 4 a 6 átomos de
3 carbono, -0Y está ligado ao carbono w do grupo alquileno e Y é tritil. Como descrito a seguir, a estrutura disulfureto do grupo permite que este seja activado por redução para quebrar a ponte disulfureto e produzir um grupo sulfidrilo livre.
As fosforamidites em que Z representa um diol vicinal podem ser preparadas a partir de um alcoól de fórmula HC=CH-GOH. O grupo hidroxilo do alcoól é protegido e a dupla ligação é oxidada para formar o grupo diol. Os hidroxilos do diol são depois protegidos com um grupo protector removível ortogonalmente
3 (Y e Y ), í.e., o grupo protector no hidroxi original pode ser removido sem remover os grupos protectores no diol vicinal. O grupo protector no hidroxi original é depois removido e o resultante hidroxi desprotegido reage com um agente fosforilador apropriado.
As fosforamidites em que Z representa um disulfureto | podem ser preparadas a partir de disulfuretos simétricos ou assimétricos. O esquema geral da reacção utilizando disulfuretos simétricos está ilustrado na Figura 3 e exemplificado no Exemplo 3, a seguir. Disulfuretos assimétricos podem ser preparados como descrito por Mannervik, B., e Larson, K., Meth. in Enzym. (1981) 77;420-424, ou Mukuiyama, T., e Takahashi, K., Tet. Lett. (1968)
5907-5908. A titulo de exemplo, um disulfureto simétrico (HO-GSS-G-OH) é oxidado com peróxido de hidrogénio e ácido fórmico para fornecer o correspondente tiosulfinato. O tratamento do
3 trosulfinato com mercaptano (por exemplo, HS-G'-OY , em que Y é como descrito acima e G' é um G diferente do que no disulfureto simétrico inicial), a um pH maior do que 3, consegue-se um dissulfureto assimétrico (HO-G-SS-G'-OY ). Este disulfureto pode reagir com um agente fosforilador de modo a obter um fosforamidato.
As fosforamidites do invento podem ser adicionadas à extremidade 5' de uma cadeia de oligonucleÓtido usando o método convencional automatizado da fosforamidite usado para preparar oligonucleótidos. Ver Matteucci, M.D., e Caruthers, M.H., Tet Lett (1980) 521;719, e a patente norte americana com o No 4.500.707. A própria cadeia de oligonucleÓtido pode ser produzida pelo mesmo método. O comprimento é sequência do oligonucleÓtido, ao qual a fosforamidite do invento é adicionada, dependerá da utilização do resultante oligonucleÓtido 5' funcional. por exemplo, se o oligonucleÓtido se destina a ser utilizado para os propósitos descritos na publicação EPA No 0438259 (i.e., tratamento de lúpus eritematoso sistémico (LES)), então o oligonucleotido terá a capacidade de ligar anticorpos LES. Se o oligonucleÓtido se destina a ser usado como sonda marcada, então o seu comprimento e sequência serão tais que permitam a sua hibridização com a sequência de nucleótidos de interesse.
Como indicado acima, o resultante oligonucleÓtido modificado pode ser representado pela seguinte fórmula;
X1 (O.N.)-5'-O-P-O-G-Z
X em que (O.N.) representa uma cadeia oligonucleotidica e á*··
X, χ\ G e Ζ são definidos previamente. A designação 5' indica que o grupo modificado está ligado à extremidade 5r da cadeia oligonucleotidica. A cadeia terá tipicamente um comprimento de 10 a 200 nucleótidos, mais usualmente um comprimento de 20 a 60 nucleótidos.
Após a adição da fosforamidite à extremidade 5' de
2 cadeia oligonucleotidica, os grupos protectores (Y , Y , uma
Y°) podem ser removidos através de tratamentos apropriados (por exemplo, tratamento básico ou ácido) para conseguir grupos hidroxi livres. No caso de um diol vicinal, o grupo diol é oxidado com, por exemplo, periodato, para formar um grupo aldeido
| terminal. | No | caso |
| reduzido | com | um |
| mercaptano | tal | como |
de um grupo disulfureto, o disulfureto é agente redutor apropriado, por exemplo, o ditiotreitol ou 2-mercaptoetanol ou hidreto de boro, para quebrar as pontes disulfureto para formar um grupo sulfidrilo terminal.
* 0 oligonucleótido 5' modificado resultante pode ser acoplado por via do grupo aldeido a marcadores, transportadores, ou outras moléculas possuindo grupos amina livres ou por via do grupo sulfidrilo a um centro electrofilico tal como maleimida ou grupos α-haloacetil ou outros aceitadores de Michael apropriados, tal como acrilatos ou acrilamidas. Exemplos de tais transportadores são polímeros de aminoácidos tal como copolimeros de D-lisina e D-ácido glutâmico, ou imunoglobulina, ou outros polímeros que foram inerentemente derivatizados para incluir grupos como os descritos acima.
Exemplos
Os seguintes exemplos destinam-se a ilustrar o invento um pouco melhor. Estes não pretendem limitar o invento em nenhum sentido. Nos exemplo, Et=etil, Ac=acetil e THF=tetrahidrofurano.
Exemplo 1
Preparação_____de_____0- (5,6-(bis-O-benzoiloxi) -hexil) -0- (2cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite
A Figura descreve esquematicamente o esquema do invento utilizado para produzir esta fosforamidite. Os detalhes deste esquema são descritos a seguir.
0-(tert-butildimetilsilil)-5-hexenol, 5. A uma solução de 12,47 ml (10,4 g, 104 mmol), de 5-hexeno-l-ol em 104 ml de DMF, foram adicionados 15,66 g (230 mmol) de imidazole e 20,0 g (130 mmol) de cloreto de tert-butildimetil-silil (TBDMSC1). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas e dividida entre 200 ml de EtOAc e 100 ml de solução saturada de NaHCO3· A camada de EtOAc foi lavada com 100 ml de solução saturada de NaHCO3, 100 ml de solução saturada de NaCl, seca (MgSO4), filtrada e concentrada para um volume de aproximadamente 100 ml. A destilação em vácuo forneceu 70,07 g de 5: pb 130-143°C @ 100 mmHg; 1H NMR (CDCI3) 0,11 (s, 6H), 0,95 (s, 9H), 1,48 (m,
2H), 1,57 (m, 2H), 2,11 (dt, 2H), 3,66 (t, 2H), 5,03 (m, 2H),
5,86 (m, 1H); 13C NMR (CDCI3) -5,25; 18,40; 25,21; 26,01; 32,35;
33,60; 63,09; 114,40; 138,92.
l-0-(tert-butildimetilsilil)-l,5,6-hexaxotriol, 6. A uma solução de 9,86 g (46,0 mmol) de 5 em 92 ml de acetona foi
ζ* *
adicionada uma solução de 6,46 g (55,2 mmol) de óxido de Nmetilmorfolina (NMMO) em 23 ml de H2O. A mistura foram adicionados 443 μΐ de uma solução 2,5% de 0s04 em alcoól tertbutil (360 mg de solução, 9,0 mg de 0s04, 35 μπιοί) e 50 μΐ de H2O2 30%. A mistura foi agitada durante 16 horas e foi adicionada uma solução de 474 mg de ditionito de sódio em 14 ml de H2O. Após outra 0,5 hora a mistura foi filtrada através de celite. O filtrado foi seco com MgSO4 e filtrado através de 1'' de silica gel num funil de Buchner de 150 ml, usando porções de 250 ml de EtOAc para eluir. As fracções contendo produto foram concentradas para fornecer 11,0 g de 6i como um óleo viscoso: TLC Rf 0,2 (1:1 hexano/EtOAc); NMR (CDCI3) 0,05 (s, 6H), 0,89 (s, 9H), 1,25 (m, 4H), 1,55 (m, 2H), 3,41 (dd, 2H), 3,62 (t, 2H), 3,71 (m, 1H); 13C NMR (CDCI3 - 5,23; 18,42; 21,91; 26,02; 32,68; 32,81; 63,16; 66,74; 72,24.
5,6-(bis-O-benzoil)-1-0-(tert-butildimetilsilil)-1,5,6hexanotriol, 7. A uma solução de 5,29 g (21,3 mmol) de 6, em 106 ml de piridina, foram adicionados 6,18 ml (7,48 g, 53,2 mmol) de cloreto de benzoil. A mistura foi agitada durante 18 horas e concentrada num evaporador rotativo. A mistura foi dividida entre 100 ml de HC1 IN gelado e 100 ml de EtOAc. O pH da camada aquosa foi verificado para garantir que era ácido. A camada de EtOAc foi lavada sucessivamente com 100 ml de H2O e 100 ml de NaCl saturado, seca (MgSO4), filtrada e concentrada, de modo a fornecer 10, 33 g de 2 como um óleo viscoso amarelo; TLC Rf 0,45 (1:4 EtOAc/hexanos); 1H NMR (CDCI3) 0,05 (s, 6H), 0,88 (s, 9H), 1,59 (m, 4H), 1,85 (m, 2H), 3,14 (t, 2H), 4,49 (dd, 1H), 4,59 (dd, 1H), 5,54 (m, 1H), 7,45 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H) .
5,6-bis-O-benzoiI)-1,5, 6-hexanotriol, 8. A uma solução de 2,62 g (5,36 mmol) de J_ em 10,9 ml de THF foram adicionados 10,7 ml (10,7 mmol) de uma solução IN de fluoreto de tetrabutilamónio (CTBAF) em THF. A mistura ficou em agitação durante 16 horas. A mistura foi dividida entre 25 ml de solução saturada de NaHC03 e 3 x 25 ml de EtOAc. Os extratos combinados de EtOAc foram lavados com solução saturada de NaCl, secos (MgSOzj.), filtrados e concentrados até se obter um óleo viscoso que foi purificado por cromatografia em silica gel (1:1 hexano/EtOAc), para fornecer 823 mg de 8 como um óleo viscoso; Rf 0,14 (1:1 hexano/EtOAc); 1H NMR (CDC13) 1,58 (m, 2H), 1,68 (m,
2H), 1,88 (m, 2H), 3,68 (t, 2H), 4,52 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H),
5,56 (m, 1H), 7,46 (m, 4H), 7,58 (m, 2H), 8,05 (m, 4H); 13C NMR (CDCI3) 22,08; 31,20; 31,30; 32,88; 62,92; 66,17; 72,63; 128,93;
130,19; 130,57; 133,62; 166,72; 166,86.
O-(5-6-(bis-O-benzoiloxi)-hexil)-O-(2-cianoetil)-N,Ndiisopropilfosforamidite, 9. A uma solução de 1,02 g (2,98 mmol) de .8 e 255 mg (1,49 mg) de diisopropilamónio tetrazólio (DIPAT, preparado pela mistura de soluções de acetonitrilo de diisopropilamina e tetrazólio, a uma razão molar de 1:1 e concentrado para um sólido branco), em 14,9 ml de CH2CI2, foi adicionada muma solução de 989 mg (3,28 mmol) de O-cianoetilΝ,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropilfosforamidite em 2,0 ml de CH2CI2. A mistura foi agitada durante 4 horas e dividida entre 25 ml de CH2CI2 θ 25 ml de uma solução de NaHCO3 saturado fresco. A camada de CH2CI2 foi lavada com solução de NaCl saturada, seca (Na2SO4), filtrada e concentrada. Purificação por filtração numa cavilha 2'' de alumina básica numa coluna de 25 mm, eluida com 9:1
ΕΐΟΑσ/ΕίβΝ fornecendo 1,5 g de 2 como um óleo viscoso: 1H NMR (CDCI3) 1,19 (m, 12H), 1,62 (m, 2H), 1,73 (m, 2H), 1,90 (m, 2H), 2,62 (dd, 2H), 3,53-3,92 (m, 6H), 4,53 (dd, 1H), 4,62 (dd, 1H), 5,58 (m, 1H), 7,48 (m, 4H), 7,6(m, 2H), 8,09 (m, 4H); 31P NMR (CDCI3 com H3PO4 15% normalizado internamente) 148,2; HRMS (FAB, MH+), calculado para C29H4QO5N2P1 543,2624, encontrado 543,2619.
Exemplo 2
Preparação de 0-5-benziloxi-6-0-(4', 4f'-dimetoxitritilhexil -0(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite
A Figura 2 descreve esquematicamente o esquema de reacção para produzir esta fosforamidite. Os detalhes do esquema estão descritos a seguir.
-0- (4',4'' -dimetoxitrifenilmetil) -1-0- (tert- butildimetilsilil)-l,5,6-hexanotriol, 10. A uma solução de 1,11 g (4,47 mmol) de 6 e 891 μΐ (683 mg, 6,30 mmol) de Et3N em 22 ml de piridina foram adicionados 1,81 g (5,33 mmol) de cloreto de 4,4'dimetoxitrifenilmetil. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas, concentrada e purificada por cromatografia em sílica gel (29:70:1 EtOAc/hexano/Et3N) para fornecer 2,06 g de 10 como um óleo viscoso; Rf da TLC 0,35 (39:60:1 EtOAc/hexano/Et3N).
5-0-benzoil-6-0-(4 ', 4 ' '-dimetoxitrifenilmetil)-1-0(tert-butildimetilsilil)-l,5,6-hexanotriol, 11. A uma solução de 2,06 g (3,8 mmol) de 10 em 19 ml de piridina foram adicionados 532 ml (644 mg, 4,58 mmol) de cloreto de benzoil, e a mistura foi agitada durante 20 horas e concentrada num evaporador rotativo para remover a maior parte de piridina, mantendo a temperatura do 18 banho abaixo dos 30 °C. A mistura foi dividida entre 50 ml de
EtOAc e 50 ml de uma solução saturada de ΝβΗΟΟβ. A camadade
EtOAc foi lavada com 50 ml de solução saturada de NaHCOg, 25ml de solução saturada de NaCl, seca (Nâ2SO4), filtradae concentrada. Purificação por cromatografia em silica gel (10:89:1 EtOAc/hexano/Et3N) forneceu 1,66 g de 11 como um óleo viscoso: Rf de TLC 0,27 (1:9 EtOAc/hexano); NMR (CDCI3) 0,5 (s, 6H), 0,87 (s, 9H), 1,40 (m, 2H), 1,56 (m, 2H), 1,82 (m, 2H) , 3,28 (dd, 2H), 3,60 (t, 2H), 3,80 (s, 6H), 5,38 (m,lH), 6,79 (m, 4H), 7,17-7,65 (m, 12H), 8,11 (d, 2H).
5-0-benzoil-6-0-(4',4'f-dimetoxotrifenilmetil)-1,5,6hexanotriol, 12. A uma solução de 1,66 g (2,56 mmol) de 11, em 5,2 ml de THF numa atmosfera de N2, foram adicionados 5,12 ml (5,12 mmol) de uma solução 1M de fluoreto de tetrabutilamónia em THF. A mistura foi agitada durante 3 horas à temperatura ambiente e concentrada num evaporador rotativo. Purificação por cromatografia em silica gel (1:1 EtOAc/hexano) forneceu 1,18 g de 12 como óleo viscoso. Melhor purificação foi possível através de HPLC preparativa (12 ml/min, 9:1 Me0H/H20, 22,4 mm Cjg): Rf de TLC 0,14 (1:1 hexano/ EtOAc); 1H NMR (CDCI3) 1,37 )m, 2H), 1,57 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 3,29 (dd, 2H), 3,60 (t, 2H), 3,75 (s, 6H), 5,36 (m, 1H), 6,80 (m, 4H), 7,17-7,60 (m, 12 H), 8,12 (d, 2H).
0-5-benzoiloxi-6-0-(4',4''-dimetoxitrifenilmetil) hexil-0-(2'-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite, 13. A uma solução de 681 mg (1,26 mmol) de 12 e 111 mg (0,65 mmol) de diisopropilamónio tetrazólio em 6,5 ml de CH2CI2 foi adicionada uma solução de 417 mg (1,38 mmol) de 0-cianoetil-N,N,N',N'tetraisopropilfosforamidite em 1,0 ml de CH2CI2. A mistura foi agitada durante 2 horas e dividida entre 25 ml de CH2CI2 e 25 ml de solução saturada fresca de ΝβΗΟΟβ. A camada de CH2CI2 foi lavada com solução saturada de NaCl, seca (Na2SC>4), filtrada e concentrada. Purificação por filtração através de cavilha 2'' de alumina básica numa coluna de 25 mm, eluida com 9:1 CH2C12/Et3N forneceu 798 mg de 13 como um óleo viscoso: H NMR (CDCI3) 1,19 (m, 12H), 1,42 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,81 (m, 2H), 2,69 (m, 2H), 3,28 (dd, 2H), 3,57 (m, 4H), 3,78 (s, 6H), (subjacente a m, 2H),
5.40 (m, 1H), 6,79 (dd, 4H), 7,27-7,64 (m, 12H), 8,17 (d, 2H);
P NMR (CDCI3), H3PO4 15% normalizado internamente) 148,0; HRMS (FAB, MH+), calculado para C43H54O7N2P1 741,3669, encontrado 741, 3678.
Exemplo 3
Preparação de 0-(14-(4', 4 ''-dimetoxitrifenilmetoxi)-7,8ditiotetracecil)-0-(2-cianoetil)-N-N-diisopropilfosforamidite
A Figura 3 representa esquematicamente o esquema de reacção para esta fosforamidite. Os detalhes do esquema estão descritos a seguir.
Cloreto de S-(6-hidroxihexil)isotiuronio, 14. A uma solução de 16,6 ml (20,0 g, 146 mmol), de 6-clorohexanol em 49 ml de etanol, foram adicionados 11,1 g (146 mmol) de tioureia, e a mistura foi agitada em refluxo durante 24 horas. A mistura foi arrefecida a 0°C, e o produto foi cristalizado. Os cristais foram recolhidos por filtração em vácuo e secos de forma a originar 28,4 g de 14 como um sólido branco: pf 122-124°C; NMR (DMSO)
1.40 (m, 4H), 1,65 (m, 2H), 3,21 (t, 2H), 3,41 (t, 2H), 9,27 e
«
9,33 (sobreposição dos singletos de fronteira, 4H).
6-Mercaptohexan-l-ol, 15. A uma solução de 17,8 mg (83,6 mmol) de 14 em 120 ml de H2O e 120 ml de EtOH foram adicionados 9,25 g de pellets de NaOH. A mistura foi agitada em refluxo durante 4 horas. A mistura foi cuidadosamente concentrada até aproximadamente 75 ml, e o concentrado foi purificado por destilação em vácuo para fornecer 7,4 g de 15: p.e. 95-105°C @ 5 mm Hg; 1H NMR (CDCI3) 1,41 (m, 9H), 2,59 (dt, 2H), 3,69 (t com subjacente aos singletos de fronteira, 3H).
Bis-(6-hidroxihexil)disulfureto, 16. A uma solução de 4,26 g (31,7 mmol) de 15 em 10 ml de MeOH e 13,7 ml (9,97 g, 98,5 mmol) de ΕΐβΝ, sobre uma atmosfera de N2, e arrefecido num banho de gelo, foi adicionada em gotas durante 10 minutos, uma solução de 4,02 g (15,8 mmol) de I2 em 90 ml de MeOH. Foi retirado o banho de arrefecimento, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. A mistura foi concentrada num evaporador rotativo e purificada por cromatografia em sílica gel (1:1 hexano/EtOAc) para fornecer 3,12 g de 16 como um sólido amarelo pálido: Rf de TLC 0,18 (1:1 hexano/EtOAc); p.f. 38-48°C; 1H NMR (CDCL3) 1,15.2,20 (m, 16 H), 2,73 (t, 4H), 3,70 (t, 4H).
Mono-O-(4 ', 4''-dimetoxitrifenilmetil)-bis-(6hidroxihexil)disulfureto, 17. A uma solução de 3,12 g (11,7 mmol) de 16 e 45 ml de piridina foram adicionados 3,97 g (11,7 mmol) de cloreto de 4,4'-dimetoxitrifenilmetil, e a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A maior parte da piridina foi removida num evaporador rotativo, e o residuo foi dividido entre 100 ml de uma solução saturada de NaHCO3 e 100 ml de EtOAc. A camada de EtOAc foi lavada com 50 ml de uma solução saturada de
NaCl, seca, (Na2SC>4), e filtrada e concentrada para um óleo. Purificação por cromatografia em silica gel (9:1 CH2C12/EtOAc) conseguindo-se 2,84 g de 17 como um óleo viscoso: Rf de TLC 0,35 (9:1 Ch2C12)/EtOAc); XH NMR (CDC13) 1,41 (m, 8H), 1,65 (m, 8H), 2,70 (dois tripletes sobrepostos, 4H), 3,08 (t, 2H), 3,65 (t,
2H), 3,81 (s, 6H), 6,85 (d, 4H), 7,32 (m, 7H), 7,47 (d, 2H).
O - (14-(4',4'' - dimetoxitrifenilmetoxi) - 7,8 ditiotetradecil)-0-(2-cianoetil)-N,N-diisopropilfosforamidite,18. A uma solução de 771 mg (1,36 mmol) de 17 e 116 mg (0,68 mmol) de diisopropilamónio tetrazólio em 6,8 ml de CH2CI2 sob atmosfera N2 foi adicionada uma solução de 458 mg (1,52 mmol) de O-cianoetilΝ,Ν,Ν',Ν'-tetraisopropilfosforamidite em 0,5 ml de CH2CI2. A mistura foi agitada durante 4 horas e dividida entre 25 ml de ΝβΗΟΟβ e 3x25 ml de CH2C12· As camadas combinadas de CH2C12 foram lavadas com solução saturada de NaCl, secas (Na2CO3), filtradas e concentradas para um óleo. Purificação por filtração através de uma cavilha 2' ' de alumina básica numa coluna de 25 mm, eluida com 9:1 CH2C12/Et3N fornecendo 831 mg de 18 como um óleo viscoso; 1H NMR (CDCI3) 1,25 (m, 12 H), 1,45 (m, 8H), 1,70 (m, 8H), 2,72 (m, 6H), 3,09 (t, 2H), 3,65 (m, 4H), 3,87 (s, 6H), 3,91 (m, 2H),
6,89 (d, 4H), 7,35 (m, 7H), 7,49 (d, 2H); 31P NMR (CDCI3) com H3PO4 15% normalizado internamente) 147,69; HRMS (FAB, MH+) calculado para C42Hg2N2O5PfS2 769,3839, encontrado 769,3853.
Exemplo 4
Adição da Fosforamidite do Exemplo 1 ao Oligonucleótido
Um excesso molar de cinco vezes (760 mg) de fosforamidite do Exemplo 1 foi acoplado à extremidade 5' de um oligonucleótido que estava ligado a 10 g (300 gmoles) de suporte CPG (vidro de poros controlados). Esta sintese foi realizada num sintetizador de DNA Milligen 8800 usando os protocolos de manufacturação para a sintese de DNA.
Noutra circunstância, numa reacção à escala de Ιμιηοΐ num sintetizador de DNA da Pharmacia Gene-Assembler, a eficiência de junção foi determinada para 96% por libertação de tritil. Para esta determinação foi usada a fosforamidite do Exemplo 3.
Após a reacção, o CPG foi suspenso em 100 ml de amónia concentrada e mantido a 55°C durante a noite. Após filtração, o oligonucleótido desprotegido foi purificado por um gradiente de cloreto de sódio e cromatografia de troca iónica.
As fracções foram analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida e as fracções contendo produto foram armazenadas, ajustadas para
NaCl 0,3 M com solução de
NaCl 3M, e precipitadas pela adição de um volume igual de isopropanol gelado.
O produto foi recolhido por centrifugação e seco em vácuo.
oxidado pellet foi pelo tratamento depois dissolvido em 40 ml de água com um excesso molar de cinco vezes de metaperiodato de sódio (83, 6 mg para 2 g de oligonucleótido purificado, neste exemplo) a 0°C durante 30 minutos. A solução foi novamentte ajustada para NaCl 0,3 M e precipitada como acima para remover o formaldeido formado nesta reacção. Após centrifugação e secagem, este material foi usado na etapa seguinte.
Exemplo 5
Conjugação do Oligonucieótido do Exemplo 4 com Polímero de D-ácido glutâmico, D-lisina (DEK)
100 mg de oligonucieótido oxidado (2,5 μπιοίβε) foram dissolvidos em 1,33 ml de 100 mM de NaBC>3, pH 8,0. Depois, foram adicionadas 2,5 mg de DEK (0,25 gmoles, PM 10000, 60:40 em razão de peso de D-ácido glutâmico e D-lisina) e 0,79 mg de NaCNBH3 (12,5 gmoles). A mistura (2 ml) foi incubada a 37°C durante 3 dias. 0 produto da condensação foi purificado por cromatografia S-200 (Pharmacia, Upsala, Suécia).
As fracções foram marcadas com P ddATP alfa e transferase terminal para visualização num gel de poliacrilamida 8% de sequênciação de DNA standard.
As várias fracções marcadas radioactivamente foram visualizadas por electroforese e autoradiografia como apresentado na Figura 4. As bandas marcadas como 2 continham oligonucieótido no total comprimento não conjugado e a seta indica a posição de 50-mer. As bandas marcadas como 1 contêm conjugados de peso molecular decrescente. As fracções que contêm o substituto mais elevado (região A) conjugado oligo-DEK foram armazenadas para subsequente hibridação com a cadeia de oligonucieótido complementar para construir o conjugado DNA-DEK de dupla cadeia.
Exemplo 6
Conjugação do Oligonucleótido do Exemplo 4 com Hemocianina do Orifício de Lapa (KLH)
100 mg de oligonucleótido oxidado em bruto (2,5 gmoles) foram dissolvidos em 1,33 ml de ΝβΒΟβ 50 mM, pH 8,0. De seguida, foram adicionados 31,3 mg de KLH (0,208 gmoles) e 2,0 mg de NaCNBHg (31,8 gmoles). A mistura (2,0 ml) foi incubada a 37°C durante 3 dias. O produto de condensação foi purificado por cromatografia S-200. As várias fracções foram marcadas radioactivamente usando o mesmo processo que o descrito acima para D-EK e foram depois visualizadas após electroforese e autoradiografia como apresentada na Figura 5. As bandas marcadas como 1 são conjugados de elevado peso molecular, as bandas marcadas como 2 contêm principalmente oligonucleótidos não conjugados e a seta indica a posição de 50-mer. Modificações dos modos de realização do invento acima descritos, que são óbvias para os especialistas no campo da química orgânica e particularmente na sintese de oligonucleótidos, e derivação entendem-se como dentro do espirito das reivindicações que se seguem. As fracções que contêm o conjugado oligo-KLH foram armazenadas para subsequente hibridação com cadeia oligonucleotidica complementar para construir o conjugado de dupla cadeia DNA-KLH.
Exemplo 7
Preparação de acetal-protegido diol fosforamidite 4-(4hidroxi-l-butil)-2-fenil-l,3 dioxolano.
Uma mistura de 1,2,6-trihidroxihexano (2,58 g) e benzaldeido dimetil acetal (3,18 g) é tratada com ácido sulfónico de tolueno hidratado (2,08 g). A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 60 horas, e depois é dividida entre bicarbonato de sódio aquoso saturado (50 ml) e cloreto de metileno (20 ml). As camadas são separadas, a camada aquosa é novamente extraida com cloreto de metileno, as camadas orgânicas são secas com sulfato de sódio anidroso, filtradas e concentradas a um óleo (2,66 g), que é purificado por cromatografia e coluna (silica gel, 1:1 acetato de etil/hexanos). 0 armazenamento e concentração das fracções apropriadas origina o composto do titulo como um óleo (1,19 g): Rf do TLA = 0,18 (silica, 1:1 acetato de etil/hexanos); XH NMR (CDCI3), S, 1,62 (m, 6H), 3,67 (m, 3H),
3,25 (m, 2H), 6,37 (s, 0,6H), 6,50 (s, 0,4 H), 8,04 (s.fr., 5H).
De um modo semelhante, mas começando com benzaldeido em lugar de acetal dimetil benzaldeido, é também obtido o composto do titulo.
(4-(2-fenil-l,3-dioxol-4-il)butil-O-(2-cianoetil)-N-Ndiisopropilfosforamidite♦ Uma solução do dioxolano acima (1,19 g), e diisopropilamina (2,0 ml), em cloreto de metileno (22 ml), é tratada com cianoetildiisopropilclorofosforamidite (0,92 ml) e agitada a 24°C durante 1,5 horas. A mistura é dividida entre bicarbonato de sódio aquoso saturado (25 ml) e cloreto de metileno (25 ml). As camadas são separadas, a camada aquosa é novamente extraida com cloreto de metileno, as camadas orgânicas
são secas com sulfato de sódio anidroso, filtradas e concentradas a um óleo (2,13 g), que é purificado por cromatografia e coluna (alumina básica, lsl cloreto de metileno/hexanos, trietilamina origina (CDCL3) (m, 8H) armazenamento e o composto do δ, 1,13 (12H), concentração das fracções titulo como um óleo (1,28 apropriadas
NMR
1,5-1,9 (m, 8H), 2,58 (q, 2H),
3,5-3,8
4,0-4,3 (m, 2H), 5,8 (s, 0,6H), 5,92 (s, 0,4H=,
7,3-7,5 (m, 5H)
De forma semelhante são preparadas as fosforamidites:
(4- (2-metoxifenil-l,3-dioxol-4-il) butil) seguintes
-0- (2cianoetil) -N-N- diisopropilfosforamidite;
(4-(2-p-butilfenil-l,3-dioxol-4-il)butil-O-(2-cianoetil
-N-N-diisopropilfosforamidite;
(4-(2-bifenil-l,3-dioxol-4-il) butil-O-(2-cianoetil-NN-diisopropilfosforamidite;
(4- (2-metil-2-fenil-l,3-dioxol-4-il) butil-O- (2c ianoetil -N-N-diisopropilfos foramidite;
Exemplo 8
Adição da Fosforamidite do Exemplo 7 a um Oligonucleótido
Pelo modo do Exemplo 4, a fosforamidite do Exemplo 7 é acoplada ao oligonucleótido. A seguir à purificação, o grupo protector acetal é removido com ácido acético 80%/água durante 40 minutos. O decorrer da reacção é visualizado por HPLC usando uma coluna Gen Pak Fax (Waters Associates), usando fosfato de sódio 0,5 M a pH 7,5, com um gradiente de cloreto de sódio 1,0 M/ metanol 10%. 0 acetal inicial elui a 20,1 minutos, e o diol hidrolizado elui a 18,9 minutos.
Modificações dos modos de realização do invento acima descritos que são óbvios para os especialistas nos campos da quimica orgânica do fósforo, quimica nucleotidica, sintese oligonucleotidica, ou campos relacionados entendem-se como estando dentro do espirito das seguintes reivindicações.
Claims (35)
1- Um composto da fórmula:
X
2 11 x2-p-o-g-z caracterizado pelo facto de X:
1 2 (í) ser oxigénio quando X é 0 , e X ser hidrogénio ou RO-” quando R é um grupo protector;
(ii) não estar presente quando:
(a) X é cloro e X é metilo ou RO- , ou (b) X2 é R0-” e X1 é NR^R2 quando R1 e R2 são, individualmente, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, ou arilo de 6 a 20 átomos de carbono, ou estão unidos para formar, com o átomo de nitrogénio, uma estrutura ciclica de 4-7 átomos de carbono, e de 0 a 1 átomos calcogénios anulares com um número atómico de 8 a 16 inclusivé (O ou S);
G é um grupo hidrocarbileno de 1 a 20 átomos de carbono; e
Z é um grupo diol vicinal hidroxi protegido, ligado a G por um dos átomos de carbono diois vicinais ou um grupo disulfureto, ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto com a condição de G ter, pelo menos, 4 átomos de carbono quando Z é o referido grupo disulfureto.
2- Uma fosforamidite com a fórmula: r-O-P-O-G-Z caracterizada pelo facto de R ser um grupo protector de base
1 2
-lábil, R e R são, individualmente, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono, arilo de 6 a 20 átomos de carbono, ou estando unidos para formar, com o átomo de nitrogénio, uma estrutura cíclica de 4-7 átomos de carbono, e 0 a 1 átomos calcogénios anulares, com um número atómico de 8 a 16, inclusivé, sendo G um grupo hidrocarbileno de 1 a 20 átomos de carbono, e sendo Z um grupo diol vicinal hidroxi-protegido ligado a G por um dos átomos de carbono diois vicinais, ou um grupo disulfureto e estando ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto, com a condição de G ter, pelo menos, 4 átomos de carbono quando Z é o referido grupo disulfureto.
3- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
2, caracterizada pelo facto de Z ser '
Y1-0 0Ύ2
H R3
3 4 quando R e R são, individualmente, hidrogénio, alquilo de
1 a 20 átomos de carbono, ou arilo monocíclico de 6 a 20 átomos
1 2 de carbono, e Y e Y são grupos hidroxi-protectores individuais, ou estão unidos por uma ponte de átomo único para formar um grupo protector de anel de cinco membros, ou
-s-s-r5-o-y3 em que R é um grupo alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, ou um grupo arilo monocíclico de 6 a 20 átomos de carbono, Y é um grupo protector hidroxi.
4- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
1 2
3, caracterizada pelo facto de R e R serem isopropilo.
5- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
3 4 5
4, caracterizada pelo facto de R e R serem hidrogénio, R ser
12 3
-(CH2)6, e Y , Y e Y são benzoilo ou dimetoxitritilo.
6- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
1 2
2, caracterizada pelo facto de R e R serem isopropilo, G ser
-(CH2)4r e Z ser γ1.0 ο.γ2
I I
-C-C-H
I I
Η H
1 2 em que Y e Y são benzoilo.
7- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
1 2
2, caracterizada pelo facto de R e R serem isopropilo, G ser (CIÍ2)4-< e z ser Y1^ 0-Y2
I I
-C-C-H
I I
Η H »
1 2 em que Y é benzoilo e Y é dimetoxitritilo.
8- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação
2, caracterizada pelo facto de Z ser um grupo diol vicinal hidroxi protegido, da fórmula:
Â
0 0
I I
-C-C-H
I I ,H H
6 7 em que R e R são, individualmente, hidrogénio, arilo, ou arilo substituído de 6 a 30 átomos de carbono, alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, ou alquilo aromático-substituido com menos de
6 7
30 átomos de carbono, com a condição de R e R não serem hidrogénio.
9- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação fi 7
8, caracterizada pelo facto de R° e R' serem, individualmente, hidrogénio ou um fenil facultativamente substituído com alquilo com 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo com 1 a 8 átomos de carbono, 1 a 4 átomos de halogénio com um número atómico de 9 a
6 7
35, nitro ou fenil, com a condição de ambos, R e R não serem hidrogénio.
10- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na reivindicação 8, caracterizada pelo facto de ser hidrogénio e
R ser fenil, p-butilfenil, p-metoxi fenil, p-t-butilfenil ou bifenil.
11- Uma fosforamidite, conforme reivindicado na
1 2 reivindicação 2, caracterizada pelo facto de R e R serem isopropil, sendo G -(CH2)6, e sendo Z
-S’S-R5-O-Y3
5 3 , em que R é -(CH2)6~/ θ Y é dimetoxitritil.
12- Um oligonucleótido 5' modificado com a fórmula:
X1
I (O.N.)-5'-O-P-O-G-Z
II x
caracterizada pelo facto de (O.N.) representar uma cadeia oligonucleotídica, sendo X um átomo calcogénio de número atómico
1 - 12 1 de 8 a 16, inclusivé, X é 0 , metilo, -OCH3, ou NR R , em que R e R são, individualmente, hidrogénio ou alquilo de-l a 6 átomos de carbono, G é um grupo hidrocarbileno de 1 a 20 átomos de carbono, e Z é um grupo diol vicinal hidroxi-protegido, ligado a G por um dos átomos de carbono diois vicinais, ou um grupo disulfureto ligado a G por um dos átomos de enxofre do grupo disulfureto.
13- Um oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na de ou reivindicação 12, caracterizado pelo facto de Z ser t ' γχ-0 0-YZ
-Ç-C-R4
I >334 H R em que R e R são, individualmente, hidrogénio, alquilo de a 20 átomos de carbono, ou arilo monocíclico de 6 a 20 átomos
1 2 carbono, e Y e Y são grupos hidroxi protectores individuais, estão unidos por uma ponte de átomo único para formar um grupo protector de anel de cinco membros, ou
-s-s-r5-o-y3 em que R é um grupo alquilo de 4 a 20 átomos de carbono, ou
3 um grupo arilo monocíclico de 6 a 20 átomos de carbono, e Y é um grupo hidroxi protector.
14- Um oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizadç pelo facto de Z ser f \
Y-L-O O-Y2 1 1 4
-C-C-R4
I l3 H RJ
1 2 e sendo Y e Y removidos para deixar grupos hidroxi livres.
15- Um oligonucleÓtido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de G ser “(CH2)4~, e sendo Z
Yx-0 0-Y2
I I
-C-C-H
H H
1 2 em que Y e Y são benzoilo.
16- Um oligonucleÓtido 5' modificado, conforme reivindicado
1 2 na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de Y e Y serem removidos para deixar grupos hidroxilo livres.
17- Um oligonucleÓtido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de G ser -(CH2)4-, e sendo Z ) γ!-0 0-Y2
K»
1 2 em que Y é benzoilo e Y é dimetoxitritilo.
18- Um oligonucleÓtido 5' modificado, conforme na reivindicação 14, caracterizado pelo de Y^
19- Um oligonucleÓtido 5' modificado, conforme reivindicado e Y serem reivindicado removidos para deixar grupos hidroxilo livres.
na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de Z ser /\ ο ο , -C-C-H
Η Η
6 7 e sendo R e R , individualmente, hidrogénio, arilo ou arilo substituído de 6 a 30 átomos de carbono, alquilo de 1 a 20 átomos de carbono, ou alquilo aromático substituído com menos do que 30 g 7 átomos de carbono, com a condição de ambos, R e R não serem hidrogénio.
20- Um oligonucieótido 5' modificado, conforme reivindicado
6 7 na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de R e R serem, individualmente, hidrogénio ou fenil facultativamente substituído com alquilo de 1 a 8 átomos de carbono, alcoxilo de 1 a 8 átomos de carbono, 1 a 4 átomos de halogénio de número atómico de 9 a
6 7
35, nitro ou fenil, com a condição de ambos, R e R não serem hidrogénio.
21- Um oligonucieótido 5' modificado, conforme reivindicado g
na reivindicação 19, caracterizado pelo facto de R° ser 7 hidrogénio e sendo R um fenil, p-butilfenil, p-metoxifenil, p-tbutilfenil ou bifenil.
22- Um oligonucieótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto de G ser -(CH2)6“r e sendo Z
-s-s-r5-o-y3
5 3 em que R é -(CH2)g-, e Y é dimetoxitritilo.
23- Um oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 14, caracterizado pelo facto de Z ser oxidado para formar um grupo aldeido terminal no oligonucleótido.
24- Um oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 18, caracterizado pelo facto de Z ser oxidado para formar um grupo aldeido terminal no oligonucleótido.
25- Um oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizado pelo facto de Z ser reduzido para formar um grupo tiol terminal no oligonucleótido,
26- Um conjugado de uma molécula transportadora contendo um grupo amino e o oligonucleótido 5' modificado, conforme reivindicado na reivindicação 23, caracterizado pelo facto de o conjugado ser formado por reacção entre o referido grupo amino e o referido grupo aldeido terminal.
27- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 26, caracterizado pelo facto de a molécula transportadora ser um polímero.
28- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 27, caracterizado pelo facto de o polímero ser um polímero aminoacídico.
29- Um conjugado de uma molécula transportadora tendo um grupo funcional e o oligonucleótido 5' modificado da reivindicação 25, caracterizado pelo facto de o conjugado ser formado por reacção entre o referido grupo e o referido grupo tiol terminal.
30- Um conjugado, conforme reivindicado na reivindicação 29, caracterizado pelo facto de o transportador ser um polímero.
31- Um álcool parcialmente protegido, caracterizado pelo facto de ter a seguinte fórmula ' γ1_0 0-Y2
I I
H-C-C-G-OH
I I
Η H
1 2 em que Y e Y são grupos protectores hidroxi individuais, ou estão unidos por uma ponte de átomo único para formar um grupo protector de anel de cinco membros, e sendo G um grupo hidrocarbileno de 1 a 20 átomos de carbono.
32- Um álcool, conforme reivindicado na reivindicação 31, caracterizado pelo
1 2 facto de Y e Y serem benzoilo e sendo G butileno.
33- Um álcool, conforme reivindicado na reivindicação 31,
1 2 caracterizado pelo facto de Y ser dimetoxitritilo, de Y ser benzoilo e de G ser butileno.
34- Um álcool, conforme reivindicado na reivindicação 31,
1 2 caracterizado pelo facto de Y e Y representarem r 7 em que R e R são, individualmente, hidrogénio, arilo ou arilo substituído de 6 a 30 átomos de carbono, alquilo de 1 a átomos de carbono, ou alquilo aromático substituído com menos do 6 7 que 30 átomos de carbono, com a condição de ambos, R° e R , não serem hidrogénio.
35, caracterizado pelo facto de Y ser dimetoxitritilo e sendo G um hexileno.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19930421 |
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| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19990316 |
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| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
Free format text: LAPSE DUE TO NON-PAYMENT OF FEES Effective date: 20100916 |