DE69229149T2 - Modifizierte, Phosphor enthaltende Zwischenprodukte zur Erzeugung von funktionalen Gruppen am 5' Ende von Oligonucleotiden - Google Patents
Modifizierte, Phosphor enthaltende Zwischenprodukte zur Erzeugung von funktionalen Gruppen am 5' Ende von OligonucleotidenInfo
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Description
- Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der Organophosphatchemie und der Festphasen-Oligonucleotidsynthese. Insbesondere betrifft sie reaktive Phosphorzwischenprodukte, welche stabil an das 5'-Ende eines Oligonucleotids angeheftet werden können und welche eine aktivierbare Einheit haben, die, wenn sie aktiviert wird, einen funktionellen Aldehyd- oder Sulfhydrylrest bereitstellt, der verwendet werden kann, um das Oligonucleotid an ein beliebiges Molekül, welches eine freie Aminogruppe hat, zu konjugieren.
- Es ist notwendig, Oligonucleotide mit einer freien funktionellen Gruppe bereitzustellen, um das Oligonucleotid an Markierungen, Liganden, feste Oberflächen, Polymere oder andere Moleküle oder Oberflächen zu koppeln.
- Ein Verfahren zur Bereitstellung von Oligonucleotiden mit einer endständigen funktionellen Gruppe beinhaltet die Synthese des gewünschten Oligonucleotids nach herkömmlichen automatisierten Festphasen-Syntheseverfahren und den Einbau der funktionellen Gruppe am 5'-Ende des Oligonucleotids über ein modifiziertes Phosphoramidit.
- Agrawal, S., et al., Nucl. Acids Res. (1986) 14: 6227-6245, beschreibt ein modifiziertes Phosphoramidit, welches an das 5'-Ende eines Oligonucleotids angeheftet werden kann, das einen aktivierbaren Rest besitzt, der durch die Entfernung einer Schutzgruppe zur Bereitstellung einer freien Aminogruppe am 5'-Ende des Oligonucleotids aktiviert werden kann. Der Abstandhalter ("linker", VIII auf Seite 6236), O-(2-(9- Fluorenylmethoxycarbonyl)-aminoethyl)-O-(2-cyanoethyl)-N-N- diisopropylphosphoramidit wird an das Ende des gewünschten Oligonucleotids unter Verwendung von Desoxynucleosid-2- cyanoethyl-N-N-diisopropylphosphoramiditen mit einem automatischen DNA-Syntheseautomaten angefügt. Von dem Addukt wird die Schutzgruppe entfernt (die 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe wird mit Ammoniak entfernt), um eine freie Aminogruppe bereitzustellen.
- Kremsky, J. N., et al., Nucl. Acids Res. (1987) 15: 2891-2909, beschreibt ein funktionalisiertes Phosphoramidit (1 auf Seite 2893), welches an das 5'-Ende eines Oligonucleotids angehängt wird und dann modifiziert wird, um eine 5'-Carboxyl- oder -Aldehydgruppe bereitzustellen, die dazu verwendet wird, das Oligonucleotid zu immobilisieren.
- Ein anderes funktionalisiertes Phosphoramidit, O-6-(4',4"- Dimethoxytriphenylmethylthio)-hexyl-O-(2-cyanoethyl)-N,N- diisopropylphosphoramidit ist kommerziell von der Firma Clontech Laboratories erhältlich. Dieses Molekül wird unter Verwendung herkömmlicher Phosphoramidit-Verfahren in das Oligonucleotid eingebaut. Die Schutzgruppe der Dimethoxytrityl-geschützten Sulfhydrylgruppe kann mit Silbernitrat entfernt werden, um am 5'-Ende der Oligonucleotidkette eine freie Sulfhydrylgruppe zu erhalten.
- Ein Hauptgegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, neue modifizierte Phosphorzwischenprodukte bereitzustellen, welche in den verschiedenen Arten von Oligonucleotid- Syntheseverfahren eingesetzt werden können und welche aktivierbare Gruppen haben, die in eine freie Aldehyd- oder Sulfhydrylgruppe umgewandelt werden können, nachdem sie an das 5'-Ende eines Oligonucleotids angefügt wurden. Die freie Aldehyd-/Sulfhydrylgruppe ist für die Kopplung oder Konjugation des Oligonucleotids an Markierungen, Liganden, Polymere oder feste Oberflächen zweckmäßig. Diese neuen Zwischenprodukte erfüllen die folgenden Kriterien: 1) Die aktivierbare Gruppe ist mit allen Schritten herkömmlicher Oligonucleotid-Syntheseverfahren vereinbar; 2) die Aktivierung wird unter Bedingungen erreicht, welche das Oligonucleotid nicht zerstören; 3) die Kopplung wird unter Bedingungen erreicht, die das Oligonucleotid oder die Einheit, an welche das Oligonucleotid gekoppelt ist, nicht zerstören.
- Die neuen Phosphor enthaltenden Verbindungen der Erfindung schließen Zwischenprodukte ein, welche in den H-Phosphonat-, Phosphotriester-, Phosphorchloridit- und Phosphoramiditverfahren zur Oligonucleotid-Synthese verwendet werden können, sowie Zwischenprodukte, die zu Modifikationen am 5'-Ende führen, welche Phosphodiesteranaloge beinhalten, wie Methylphosphonate, Methylphosphate, Phosphorothioate und Phosphoramidate.
- Diese Verbindungen haben die Formel:
- wobei X folgende Bedeutung hat:
- (i): ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, wenn X¹ eine O&supmin;-, Methyl- oder -OCH&sub3;-Gruppe ist und X² ein Wasserstoffatom oder ein RO-Rest ist, wobei R eine Schutzgruppe ist;
- (ii): ist nicht vorhanden, wenn
- (a): X¹ ein Chloratom- und X² eine Methylgruppe oder einen RO-Rest bedeutet; oder
- (b): X² einen RO-Rest und X¹ einen NR¹R²-Rest bedeutet, wobei jeder R¹- und R²- Rest jeweils einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest darstellt, oder, wenn sie verbunden sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;-cyclische Struktur mit 0 oder 1 Sauerstoff- oder Schwefelatom bilden;
- G ein C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest ist; und
- Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe ist, welche über eines der vicinalen Diol-Kohlenstoffatome an G gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, welche über eines der Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist;
- mit der Maßgabe, daß G mindestens 4 Kohlenstoffatome aufweist, wenn Z die Disulfidgruppe ist.
- Die vorstehenden Verbindungen, in denen X Sauerstoff ist, X¹ O&supmin; ist, und X² Wasserstoff ist, sind H-Phosphonate und sind an dem H-Phosphonatverfahren zur Oligonucleotidsynthese beteiligt (Sinha and Cook, NAR (1988) 16: 2659-2669). H- Phosphonate können in Phosphitdiester, Phosphorthioate oder Phosphoramidite umgewandelt werden, nachdem sie am 5'-Ende des Oligonucleotids eingebaut wurden (Miller et al., NAR (1983) 11: 5189-5204, Eckstein, Ann Rev Biochem (1985) 54: 367-402, und Froehler and Matteucci, NAR (1988) 16: 4831-4839). Entsprechend werden die vorstehenden Verbindungen, in denen X Sauerstoff ist, X¹ O&supmin; ist und X² ein RO-Rest ist, in dem Phosphotriesteransatz zur Oligonucleotidsnythese verwendet (Garegg, et al., Chemica Scripta (1985) 26 : 5). Wenn X nicht vorhanden ist und X¹ Chlor ist und X² ein RO-Rest ist, ist die resultierende Verbindung ein Phosphochloridit und wird im Phosphochloriditverfahren zur Oligonucleotidsynthese verwendet (Wada et al., J Org Chem (1991) 56: 1243-1250). Die Phosphoramidite der vorstehenden Formel werden bevorzugt. Die bevorzugten Phosphoramidite der Erfindung werden durch die nachfolgende Formel dargestellt:
- wobei R eine Methylgruppe oder eine basenempfindliche Schutzgruppe ist; jeder der Reste R¹ und R² jeweils einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-Cykloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest bedeutet, oder, wenn sie verbunden sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;- cyclische Struktur bilden, welche 0 oder 1 Sauerstoff- oder Schwefelatom hat;
- G einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest darstellt; und
- Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe bedeutet, welche über eines der vicinalen Diol-Kohlenstoffatome an G gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, welche über eines der Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist; mit der Maßgabe, daß G mindestens 4 Kohlenstoffatome aufweist, wenn Z die Disulfidgruppe ist.
- Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein am 5'-Ende modifiziertes Oligonucleotid der Formel:
- wobei (O. N.) eine Oligonucleotidkette ist;
- X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist;
- X¹ O-, eine Methyl-, -OCH&sub3;-Gruppe oder ein NR¹R²-Rest ist, wobei R¹ und R² jeweils ein Wasserstoffatom oder einen C&sub1;&submin;&sub6;- Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-Cykloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest bedeuten, oder, wenn sie verbunden sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;- cyclische Struktur bilden, welche 0 oder 1 Sauerstoff- oder Schwefelatom hat;
- G einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest bedeutet; und
- Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe darstellt, welche über eines der vicinalen Diol-Kohlenstoffatome an G gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, welche über eines der Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind die vorstehend beschriebenen modifizierten Oligonucleotide, an welchen die Hydroxy-Schutzgruppen entfernt wurden und freie Hydroxylgruppen zurückbleiben.
- Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist das vorstehend beschriebene, am 5'-Ende modifizierte Oligonucleotid, in welchem Z eine vicinale Diolgruppe ist, von der die Schutzgruppe entfernt wurde, und welche oxidiert wurde, um an dem Oligonucleotid eine endständige Aldehydgruppe auszubilden.
- Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Konjugat des vorstehend beschriebenen Oligonucleotids, welches eine endständige Aldehydgruppe hat, mit einem Trägermolekül, welches eine freie Aminogruppe enthält, wobei das Konjugat durch Umsetzung zwischen der Aldehydgruppe und der freien Aminogruppe erzeugt wird.
- Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein teilweise geschütztes Triol mit der Formel:
- wobei jeder der Reste Y¹ und Y² jeweils eine Hydroxyschutzgruppe ist, oder sie miteinander über eine Einzelatombrücke verknüpft sind, welche keine -C(=O)- Brückengruppe ist, wobei eine fünfgliedrige Ringschutzgruppe erzeugt wird, und G einen C&sub2;&submin;&sub2;&sub0; Kohlenwasserstoffrest darstellt. Vorzugsweise ist G ein Alkylenrest aus 4 bis 20 Kohlenstoffatomen.
- Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist ein Disulfid mit der Formel:
- Y³-O-G-S-S-G-OH (5)
- wobei Y³ eine Hydroxyschutzgruppe ist und G wie vorstehend beschrieben ist. Die beiden divalenten Gruppen, welche durch G dargestellt werden, können gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise sind sie gleich und machen das Disulfid dadurch symmetrisch. Vorzugsweise ist Y³ basenstabil, vorzugsweise ist G ein Alkylenrest aus 4 bis 20 Kohlenstoffatomen.
- Die Fig. 1-3 sind schematische Diagramme der Syntheseschemata, welche in den Beispielen 1 bis 3 beschrieben werden. Die Fig. 4 und 5 sind Autoradiogramme der Gele, welche in den Beispielen 5 und 6 beschrieben werden.
- Wie vorstehend beschrieben, können die Phosphoramidite der Erfindung durch nachfolgende Formel dargestellt werden:
- wobei R eine Methylgruppe oder eine basenempfindliche Schutzgruppe ist;
- jeder der Reste R¹ und R² jeweils einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;- Cykloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest bedeutet, oder, wenn sie verbunden sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;-cyclische Struktur bilden, welche 0 oder 1 Sauerstoff- oder Schwefelatom hat;
- G einen C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest darstellt; und
- Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe bedeutet, welche über eines der vicinalen Diol-Kohlenstoffatome an G gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, welche durch eines der Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist; mit der Maßgabe, daß G mindestens 4 Kohlenstoffatome besitzt, wenn Z die Disulfidgruppe ist.
- Vorzugsweise ist R eine β-Cyanoethylgruppe, R¹ und R² sind beides Isopropylgruppen und G ist -(CH&sub2;)n-, wobei n ein ganzes von 4 bis 6, einschließlich, ist. Beispiele für andere Schutzgruppen, welche durch R dargestellt werden sind eine β- Nitroethyl-, 2,2,2-Trichlorethyl-, Methyl-, 1,1-Dimethyl- 2,2,2-Trichlorethyl-, 2,2,2-Tribromethyl-, Benzyl-, o- Chlorphenyl-, p-Nitrophenylethyl-, 2-Methylsulfonylethyl- und eine 1,1-Dimethyl-2-cyanoethylgruppe. Beispiele anderer Gruppen, welche durch R¹ und R² dargestellt werden können, sind andere Alkylreste, wie eine Butyl-, Hexyl-, Nonyl-, Dodecyl- und Hexadecylgruppe, Cycloalkylreste, wie eine Cyclopropyl-, Cyclobutyl-, Cyclohexyl- und Cyclooctylgruppe, Arylreste, wie eine Phenyl-, Tolyl-, Benzyl-, Xylyl- und Naphtylgruppe, und wenn sie verbunden sind, heterocyclische Reste, wie eine Morpholino-, Piperidinyl- und Thiomorpholinogruppe. Beispiele anderer Kohlenwasserstoffreste, welche durch G dargestellt werden können, sind verzweigte Alkylenreste und Reste, welche Cycloalkylenreste (z. B. einen Cyclohexylenrest) oder Phenylenreste enthalten. Es ist erwünscht, daß G hauptsächlich als eine inerte Verknüpfungseinheit fungiert, und daß dieser Substituenten und/oder Heteroatome (z. B. O, S, N) innerhalb seiner Struktur aufweist, welche dessen Fähigkeit als inerter Spacer zu agieren, nicht beeinflußt.
- Bevorzugt sind die hydroxygeschützten vicinalen Diolgruppen, welche durch Z dargestellt werden, von der nachstehenden Formel:
- wobei R³ und R&sup4; jeweils Wasserstoff, ein Alkylrest mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen oder ein monocyclischer Arylenrest mit 6-20 Kohlenstoffatomen sind und Y¹ und Y² jeweils Hydroxyschutzgruppen sind oder miteinander verbunden sein können (dargestellt durch die gestrichelte Linie) über eine Einzelatombrücke (C, S oder Si), wobei eine Schutzgruppe aus einem fünfgliedrigen Ring gebildet wird. Y¹ und Y² sind von einer Natur, daß sie während der Addition des Moleküls an das 5'-Ende einer Oligonucleotidkette während der chemischen Synthese (z. B. herkömmliche automatische Phosphoramiditsynthese) stabil sind und danach, ohne die Oligonucleotidkette zu beschädigen, entfernt werden können. Weiterhin erlaubt die vicinale Diolstruktur der Gruppe, von der die Schutzgruppe entfernt wurde, wie nachstehend erörtert, daß sie für die Umwandlung von einem Diol in eine funktionelle Aldehylgruppe durch Oxidation "aktiviert" werden kann. Y¹ und Y² können gleich oder verschieden sein und können eine beliebige der einzelnen Hydroxyschutzgruppen sein, welche mit der herkömmlichen automatisierten Festphasenoligonucleotidchemie unter Verwendung der Phosphoramiditchemie vereinbar sind. Beispiele solcher Schutzgruppen sind eine Dimethoxytrityl- (DMT), Trityl-, Pixyl-, Benzoyl-, Acetyl-, Isobutyryl-, p-Brombenzoyl-, t-Butyldimethylsilyl- und Pivaloylgruppe. Die Schutzgruppen können durch die gleiche oder verschiedenartige Behandlungen entfernt werden. Solche vicinalen Diolgruppen, in welchen R³ und R&sup4; Wasserstoff sind und Y¹ und Y² eine Benzoyl- oder DMT-Gruppe sind, werden bevorzugt.
- Wie dargestellt, können Y¹ und Y² durch eine Einzelatombrücke verbunden sein, wobei ein fünfgliedriger Ring ausgebildet wird. Geeignete Brückenatome beinhalten Silicium, Schwefel und Kohlenstoff. Bevorzugt ist die Einzelatombrücke eine Kohlenstoffbrücke. Somit ist die Diolgruppe vorzugsweise als ein Acetal oder Ketal geschützt, z. B.
- Es ist wichtig, daß das Überbrückungsatom und seine Substituenten während der nachfolgenden Reaktionen, in der Abfolge, die verwendet wird, um den Linker an das Oligonucleotid zu binden, stabil ist. Die Diolschutzgruppe muß auch die Fähigkeit besitzen, unter Bedingungen, die das Oligonucleotid im wesentlichen nicht abbauen, entfernt werden zu können. Z. B. führen sehr saure Bedingungen zur Depurinierung des Oligonucleotids. Geeignete Reste R&sup6; und R&sup7; beinhalten Aryl- und substituierte Arylreste mit 6-30 Kohlenstoffatomen, C&sub1;-C&sub2;&sub0;-Alkylreste und aromatische substituierte Alkylreste mit weniger als 30 Kohlenstoffatomen. Bevorzugt werden Phenyl- und mit C&sub1;-C&sub8;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub8;-Alkoxyresten substituierte Phenylreste; 1 bis 4 Fluor-, Chlor-, Bromatomen, Nitro- oder Phenylgruppen. Am meisten bevorzugt sind Acetalstrukturen, wobei R&sup6; eine Phenyl-, p-Butylphenyl-, p- Methoxyphenyl-, p-tert. Butylphenyl- und Biphenylgruppe ist. Es ist dem Fachmann geläufig, daß die Stabilität der Schutzgruppe für einen bestimmten Zweck durch geeignete Wahl des (der) Substituenten angepaßt werden kann.
- Die vorstehend beschriebenen Acetale und Ketale können leicht direkt in einem Schritt aus den entsprechenden Triolen hergestellt werden. Es ist ein wichtiges und unerwartetes Merkmal dieses Gegenstandes der Erfindung, daß das vicinale Diol in Anwesenheit eines anderen freien Alkohols im Molekül selektiv geschützt werden kann. Dazu wird das Triol, wobei Y¹ und Y² Wasserstoff sind, einfach mit einem Aldehyd in Kontakt gebracht, wobei das Acetal oder ein Keton erhalten wird, aus dem dann in Anwesenheit eines Säurekatalysators das Ketal erzeugt wird. Vorzugsweise findet der Kontakt unter Bedingungen statt, in welchen das Wasser, welches während der Reaktion gebildet wird, während der Reaktion entfernt wird, entweder durch Anlegen eines Vakuums oder mit einem azeotropen Lösungsmittel. Alternativ dazu können Acetale oder Ketale von niedriger-siedenden Alkoholen anstelle der Aldehyde oder Ketone in einer Acetal-Austauschreaktion in ähnlicher Weise eingesetzt werden.
- Die Phosphoramidite der vorstehend beschriebenen Acetale und Ketale werden nach den hierin beschriebenen herkömmlichen Verfahren hergestellt und werden, wie ebenso hierin beschrieben, während der Synthese an das Oligonucleotid gekoppelt. Nach der Synthese und Reinigung des freien, gekoppelten Oligonucleotids erzeugt eine sanfte saure Hydrolyse der Schutzgruppe das Diol, welches das Substrat für die Oxidationsreaktion ist, die den Aldehyd herstellt, welcher für die Konjugationsreaktion verwendet wird. Typische sanfte Hydrolysebedingungen sind 80% Essigsäure/Wasser bei 25ºC für 30 Minuten, ähnlich denjenigen, welche verwendet werden, um eine Dimethoxytritylgruppe bei der herkömmlichen Oligonucleotidsynthese zu entfernen. Bevorzugte Disulfidgruppen haben die nachfolgende Formel:
- -S-S-R&sup5;-O-Y³
- wobei R&sup5; ein Alkylenrest mit 1-20 Kohlenstoffatomen oder ein monocyclischer Arylenrest mit 6-20 Kohlenstoffatomen und Y³ eine Hydroxyschutzgruppe ist (wie vorstehend beschrieben).
- Am meisten bevorzugt ist R&sup5; ein Alkylenrest mit 4-6 Kohlenstoffatomen, -OY³ ist an das ω-Kohlenstoffatom des Alkylenrestes gebunden und Y³ ist eine Tritylgruppe. Wie nachfolgend diskutiert, erlaubt die Disulfidstruktur der Gruppe die Aktivierung durch Reduktion, wobei die Disulfidgruppe gespalten wird und eine freie Sulfhydrylgruppe entsteht.
- Diejenigen Phosphoramidite, bei welchen Z ein vicinales Diol ist, können aus einem Alkohol der Formel HC=CH-G-OH hergestellt werden. Die Hydroxylgruppe des Alkohols ist geschützt und die Doppelbindung wird oxidiert, wobei die Diolgruppe entsteht. Die Hydroxylgruppen des Diols werden dann mit einer orthogonal entfernbaren Schutzgruppe (Y² und Y³) geschützt, das heißt, die Schutzgruppe der ursprünglichen Hydroxygruppe kann entfernt werden, ohne daß dabei die Schutzgruppen des benachbarten Diols entfernt werden. Dann wird die Schutzgruppe der ursprünglichen Hydroxylgruppe entfernt und die resultierende Hydroxylgruppe, von welcher die Schutzgruppe entfernt wurde, wird mit einem geeigneten Phosphitylierungsmittel umgesetzt.
- Die Phosphoramidite, bei welchen Z eine Disulfidgruppe ist, können aus symmetrischen oder asymmetrischen Disulfiden hergestellt werden. Das allgemeine Reaktionsschema, welches symmetrische Disulfide verwendet, ist in Fig. 3 gezeigt und nachfolgend durch Beispiel 3 beispielhaft dargestellt. Asymmetrische Disulfide können nach dem Verfahren hergestellt werden, welches von Mannervi, B., und Larson, K., Meth. In Enzym. (1981) 77: 420-424, oder Mukuiyama, T., und Takahashi, K., Tet Lett (1968) 5907-59078 beschrieben ist. So kann beispielsweise eine symmetrische Disulfidgruppe (HO-G-SS-G-OH) mit Wasserstoffperoxid und Ameisensäure oxidiert werden, wobei das entsprechende Thiolsulfinat entsteht. Die Behandlung des Thiolsulfinats mit einem Mercaptan (z. B., HS-G'-OY³, wobei Y³ wie vorstehend beschrieben ist und G' unterschiedlich ist von dem G, welches in dem symmetrischen Ausgangs-Disulfid verwendet worden ist), bei einem pH-Wert, der größer als 3 ist, ergibt ein asymmetrisches Disulfid (HO-G-SS-G'-OY³). Dieses Disulfid kann mit einem Phosphitylierungsmittel umgesetzt werden, wobei das Phosphoramidat entsteht.
- Die Phosphoramidite der Erfindung können an das 5'-Ende einer Oligonucleotidkette angefügt werden, wobei das herkömmliche automatisierte Phosphoramiditverfahren zur Herstellung von Oligonucleotiden verwendet wird. Siehe Matteucci, M. D., und Caruthers, M. H., Tet Lett (1980) 521 : 719, und U. S. Patent Nr. 4.500.707. Die Oligonucleotidkette selbst kann durch das gleiche Verfahren hergestellt werden. Die Länge und Sequenz des Oligonucleotids, an welches die Phosphoramidite der Erfindung angefügt werden, hängt von der Verwendung des resultierenden 5'-funktionalisierten Oligonucleotids ab. Wird das Oligonucleotid z. B. für Zwecke verwendet, wie sie in der EPA-Veröffentlichung Nr. 0438259 beschrieben sind (d. h. die Behandlung von systemischem Lupus erythematosus (SLE)), dann wird das Oligonucleotid die Fähigkeit besitzen SLE-Antikörper zu binden. Wenn das Oligonucleotid als markierte Probe verwendet werden soll, dann wird die Länge und Sequenz derart sein, daß sie die Fähigkeit besitzt, an eine interessierende Nucleotidsequenz zu hybridisieren.
- Wie vorstehend angegeben kann das resultierende modifizierte Oligonucleotid durch die folgende Formel dargestellt werden:
- wobei (O. N.) eine Oligonucleotidkette ist und X, X¹, G und Z wie vorstehend definiert sind. Die Bezeichnung "5'" gibt an, daß die modifizierende Gruppe an das 5'-Ende der Oligonucleotidkette angeheftet ist. Die Kette wird gewöhnlich eine Länge von 10-200 Nucleotiden, üblicher eine Länge von 20- 60 Nucleotiden haben.
- Nachdem das Phosphoramidit an das 5'-Ende der Oligonucleotidkette angeheftet worden ist, können die Schutzgruppen (Y¹, Y², Y³) durch eine geeignete Behandlung (z. B. Base- oder Säurebehandlung) entfernt werden, wobei freie Hydroxylgruppen entstehen. Im Falle des vicinalen Diols wird die Diolgruppe oxidiert, z. B. mit Periodat, wobei eine endständige Aldehydgruppe entsteht. Im Falle der Disulfidgruppe wird das Disulfid mit einem geeigneten Reduktionsmittel reduziert, z. B. einem Mercaptan, wie Dithiothreit oder 2-Mercaptoethanol oder Borhydrid, um die Disulfidbrücke aufzuspalten, wobei eine endständige Sulfhydrylgruppe gebildet wird. Das resultierende 5'- modifizierte Oligonucleotid kann über die Aldehydgruppe an Markierungen, Träger oder andere Moleküle, welche eine freie Aminogruppe haben, gekoppelt werden oder über die Sulfhydrylgruppe an ein elektrophiles Zentrum, wie Maleimid oder Haloacetylgruppen oder andere geeignete Michael- Akzeptoren, wie Acrylate oder Acrylamide. Beispiele solcher Träger sind Aminosäurepolymere, wie Copolymere von D-Lysin und D-Glutaminsäure, oder Immunglobulin, oder andere Polymere, welche intrinsisch derivatisiert wurden, um solche Gruppen wie vorstehend zitiert zu beinhalten.
- Die nachfolgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter. Es ist nicht beabsichtigt, daß diese Beispiele die Erfindung in irgendeiner Weise eingrenzen. In den Beispielen ist Et = Ethyl, Ac = Acetyl, und THF = Tetrahydrofuran.
- Fig. 1 zeigt schematisch das Erfindungsschema, welches verwendet wird, um diese Phosphoramidite herzustellen. Details dieses Schemas werden nachfolgend beschrieben.
- Zu einer Lösung von 12,47 ml (10, 4 g, 104 mmol) 5-Ketten-1-ol in 104 ml DMF wurden 15,66 g (230 mmol) Imidazol und 20,0 g (130 mmol) tert.Butyldimethylsilylchlorid (TBDMSC1) zugegeben. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden gerührt und zwischen 200 ml EtOAc und 100 ml gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt. Die EtOAc-Schicht wurde mit 100 ml gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung, 100 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und auf ein Volumen von etwa 100 ml konzentriert. Die Destillation im Vakuum ergab 70,07 g von 5: Sdp. 130-143ºC, bei 100 mmHg; ¹H NMR (CDCl&sub3;) 0,11 (s, 6H), 0,95 (s, 9H), 1,48 (m, 2H), 1,57 (m, 2H), 2,11 (dt, 2H), 3,66 (t, 2H), 5,03 (m, 2H), 5,86 (m, 1H); ¹³C NMR (CDCl&sub3;) -5,25, 18,40 25,21, 26.01, 32.35, 33.60, 63.09, 114.40, 138.92.
- Zu einer Lösung von 9,86 g (46,0 mmol) von 5 in 92 ml Aceton wurde eine Lösung von 6,46 g (655.2 mmol) N- Methylmorpholinoxid (NMMO) in 23 ml Wasser zugegeben. Zu dem Gemisch wurden 443 ul einer 2,5%igen Lösung von OsO&sub4; in tert.Butylalkohol (360 mg Lösung, 9,0 mg OsO&sub4;, 35 umol) und 50 ul 30%iges H&sub2;O&sub2; zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden gerührt und eine Lösung von 474 mg Natriumdithionit in 14 ml H&sub2;O wurde zugegeben. Nach einer weiteren halben Stunde wurde das Gemisch durch Celite filtriert. Das Filtrat wurde mit MgSO&sub4; getrocknet und durch 1' eines Silicagels in einem 150 ml-Büchner-Trichter filtriert, wobei zur Elution 250 ml-Portionen EtOAc verwendet wurden. Die Fraktionen, welche das Produkt enthielten, wurden konzentriert und ergaben 11,0 g von 6 als ein viskoses Öl: DC Rf 0.2 (1 : 1 Hexan/EtOAc); ¹H NMR (CDCl&sub3;) 0.05 (s. 6H), 0.89 (s. 9H), 1.25 (m. 4H), 1.55 (m. 2H), 3.41 (dd, 2H), 3.62 (t, 2H), 3.71 (m, 1H); ¹³C NMR (CDCl&sub3;) -5.23, 18.42, 21.91, 26.02, 32.68, 32.81, 63.16, 66.74, 72.24.
- Zu einer Lösung von 5,29 g (21,3 mmol) von 6 in 106 ml Pyridin wurden 6,18 ml (7,48 g, 53,2 mmol) Benzoylchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt und am Rotationsverdampfer konzentriert. Das Gemisch wurde zwischen 100 ml kalter 1 N HCl und 100 ml EtOAc ausgeschüttelt. Der pK- Wert der wässrigen Schicht wurde überprüft, um sicher zu stellen, daß er sauer war. Die EtOAc-Schicht wurde nacheinander mit 100 ml H&sub2;O und 100 ml gesättigter NaCl gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und konzentriert, wobei 10,33 g von 7 als ein viskoses gelbes Öl erhalten wurden; DC Rf 0.45 (1 : 4 EtOAc/Hexan): ¹H NMR (CDCl&sub3;) 0.05 (s. 6H), 0,88 (s. 9H), 1.59 (m, 4H), 1.85 (m, 2H), 3.14 (t, 2H), 4.49 (dd, 1H) 4.59 (dd, 1H), 5.54 (m, 1H), 7.45 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H).
- Zu einer Lösung von 2,62 g (5,36 mmol) 7 in 10,9 ml THF wurden 10,7 ml (10,7 mmol) einer 1 N Lösung Tetrabutylammoniumfluorid (CTBAF) in THF zugegeben. Das Gemisch wurde 16 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde zwischen 25 ml gesättigter NaHCO&sub3;- Lösung und 3 · 25 ml EtOAc ausgeschüttelt. Die kombinierten EtOAc-Extrakte wurden mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;), filtriert und zu einem viskosen Öl konzentriert, welches durch Silicagel-Chromatographie gereinigt wurde (1 : 1 Hexan/EtOAc), wobei 823 mg 8 als ein viskoses Öl erhalten wurden; Rf 0.14 /1 : 1 Hexan/EtOAc); ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.58 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 3.68 (t, 2H), 4.52 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.56 (m, 4H), 7.46 (m, 4H), 7.58 (m, 2H), 8.05 (m, 4H); ¹³C NMR (CDCl&sub3;) 22.08, 31.20, 31.30, 32.88, 62.92, 66.17, 72.63, 128.93, 130.19, 130.57, 133.62, 166.72, 166.86.
- Zu einer Lösung von 1,02 (2, 98 mmol) 8 und 255 mg (1,49 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid (DIPAT, hergestellt durch Vermischen von Acetonitrillösungen von Diisopropylamin und Tetrazol in einem 1 : 1-molaren Verhältnis und Konzentration zu einem weißen Feststoff) in 14,9 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurde eine Lösung von 989 mg (3,28 mmol) O-Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphordiamidit in 2,0 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden gerührt und zwischen 25 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 25 ml gekühlter gesättigter NaHCO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Schicht wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert. Die Reinigung durch Filtration über einen 2"-Pfropfen aus basischem Aluminiumoxid in einer 25 mm-Säule, wobei die Elution mit 9 : 1 EtOAc/Et&sub3;N erfolgte, ergab 1,5 g (93%) von 9 als ein viskoses Öl:
- ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.19 (m, 12H), 1.62 (m, 2H), 1.73 (m, 2H), 1.90 (m, 2H), 2.62 (dd, 2H), 3.53-3.92 (m, 6H), 4.53 (dd, 1H), 4.62 (dd, 1H), 5.58 (m, 1H), 7.48 (m, 4H), 7.60 (m, 2H), 8.09 (m, 4H), ³¹P NMR (CDCl&sub3; mit 15% H&sub3;PO&sub4; interner Standard) 148.2; HRMS (FAB, MH+), berechnet für C&sub2;&sub9;H&sub4;&sub0;O&sub6;N&sub2;P&sub1; 543.2624, gefunden 543.2619.
- Fig. 2 zeigt schematisch das Reaktionsschema zur Herstellung dieses Phosphoramidites. Die Einzelheiten des Schemas sind nachfolgend beschrieben.
- Zu einer Lösung aus 1,11 g (4,47 mmol) 6 und 891 ul (638 mg, 6,30 mmol) Et&sub3;N in 22 ml Pyridin wurden 1,81 g (5,33 mmol) 4,4' -Dimethoxytriphenylmethylchlorid zugegeben. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 16 Stunden gerührt, konzentriert und über Silicagel-Chromatographie (29 : 70 : 1 EtOAc/Hexan/Et&sub3;N) gereinigt, wobei 2,06 g (85%) von 10 als ein viskoses Öl erhalten wurden; DC Rf 0.35 (39 : 60 : 1 EtOAc/Hexan/Et&sub3;N).
- Zu einer Lösung von 2,06 g (3,8 mmol) 10 in 19 ml Pyridin wurden 532 ml (644 mg, 4,58 mmol) Benzoylchlorid zugegeben und das Gemisch wurde 20 Stunden gerührt und an einem Rotationsverdampfer konzentriert, wobei die Badtemperatur unterhalb von 30ºC gehalten wurde, um das meiste des Pyridins zu entfernen. Das Gemisch wurde zwischen 50 ml EtOAc und 50 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt. Die EtOAc- Schicht wurde mit 50 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung, 25 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub2;), filtriert und konzentriert. Die Reinigung über Silicagel- Chromatographie (10 : 89 : 1 EtOAc/Hexan/Et&sub3;N) ergab 1,66 g von 11 als ein viskoses Öl: DC Rf 0.27 (1 : 9 EtOAc/Hexan); ¹H NMR (CDCl&sub3;) 0.5 (s, 6H), 0.87 (s, 9H), 1.40 (m, 2H), 1.56 (m, 2H), 1.82 (m, 2H), 3.28 (dd, 2H), 3.60 (t, 2H), 3.80 (s, 6H), 5.38 (m, 1H), 6.79 (m, 4H), 7.17-7,65 (m, 12H), 8.11 (d, 2H).
- Zu einer Lösung von 1,66 g (2,56 mmol) 11 in 5,2 ml THF unter einer N&sub2;-Atmosphäre wurden 5,12 ml (5,12 mmol) einer 1 M- Lösung Tetrabutylammoniumfluorid in THF zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und an einem Rotationsverdampfer konzentriert. Nach Reinigung über Silicagel-Chromatographie (1 : 1 EtOAc/Hexan) erhielt man 1,18 g (86%) 12 als ein viskoses Öl. Eine weitere Aufreinigung war durch präparative HPLC möglich (12 ml/min, 9 : 1 MeOH/H&sub2;O, 22.4 mm C&sub1;&sub8;): TLC Rf 0.14 (1 : 1 Hexan/EtOAc); ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.37 (m, 2H), 1.57 (m, 2H), 1.79 (m, 2H), 3.29 (dd, 2H), -3,60 (t, 2H), 3.75 (s, 6H), 5.36 (m, 1H), 6.80 (m, 4H), 7.17-7.60 (m, 12H), 8.12 (d, 2H).
- Zu einer Lösung aus 681 mg (1,26 mmol) 12 und 111 mg (0,65 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid in 6,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; wurde eine Lösung von 417 mg (1,38 mmol) O-Cyanoethyl-N,N,N',N'- tetraisopropylphosphordiamidit in 1,0 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden gerührt und zwischen 25 ml CH&sub2;Cl&sub2; und 25 ml einer gekühlten gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung ausgeschüttelt. Die CH&sub2;Cl&sub2;-Schicht wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und konzentriert. Nach Reinigung durch Filtration über einen 2"-Pfropf basisches Aluminiumoxid in einer 25 ml-Säule und Elution mit 9 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/Et&sub3;N erhielt man 798 mg von 13 als ein viskoses Öl: ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.19 (m, 12H), 1.42 (m, 2H), 1.65 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 2.69 (m, 2H), 3,28 (dd, 2H), 3.57 (m, 4H), 3.78 (s, 6H), darunterliegendes m, 2H), 5.40 (m, 1H), 6.79 (dd, 4H), 7.27-7.64 (m, 12H), 8.17 (d, 2H); ³¹P NMR (CDCl&sub3;, 15% H&sub3;PO&sub4; interner Standard) 148.0; HRMS (FAB, MH+), berechnet für C&sub4;&sub3;H&sub5;&sub4;O&sub7;N&sub2;P&sub1; 741.3669, gefunden 741.3678.
- Fig. 3 zeigt schematisch das Reaktionsschema für dieses Phosphoramidit. Die Einzelheiten des Schemas sind nachfolgend beschrieben.
- Zu einer Lösung von 16,6 ml (20,0 g, 146 mmol) 6- Chlorhexanol in 49 ml Ethanol wurden 11,1 g (146 mmol) Thioharnstoff zugegeben und das Gemisch wurde 24 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde auf 0ºC abgekühlt und das Produkt kristallisiert. Die Kristalle wurden durch Vakuumfiltration gesammelt und getrocknet, wobei 28,4 g (92%) von 14 als ein weißer Feststoff erhalten wurden: Smp. 122- 124ºC, ¹H NMR (DMSO) 1.40(m, 4H), 1.65 (m, 2H), 3.21 (t, 2H), 3.41 (t, 2H), 9.27 und 9.33 (überlappende breite Singletts, 4H).
- Zu einer Lösung aus 17,8 mg (83,6 mmol) 14 in 120 ml H&sub2;O und 120 ml EtOH wurden 9,25 g NaOH-Pillen zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Gemisch wurde vorsichtig auf etwa 75 ml konzentriert und das Konzentrat wurde durch Vakuumdestillation gereinigt, wobei 7,4 g (66%) 15 erhalten wurden: Sdp. 95-105ºC bei 5 mm Hg; ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.41 (m, 9H) 2.59 (dt, 2H), 3.69 (t mit darunterliegendem breiten s, 3H).
- Zu einer Lösung von 4,26 g (31,7 mmol) 15 in 10 ml MeOH und 13,7 ml (9, 97 g, 98,5 mmol) ET&sub3;N unter einer N&sub2;-Atmosphäre und gekühlt in einem Eisbad wurde tropfenweise über einen Zeitraum von 10 Minuten eine Lösung von 4,02 g (15,8 mmol) I in 90 ml MeOH zugegeben. Das Kühlbad wurde entfernt und das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 4 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde an einem Rotationsverdampfer konzentriert und über Silicagel-Chromatographie gereinigt (1 : 1 Hexan/EtOAc), wobei 3,12 g (73%) von 16 als ein blaßgelber Feststoff erhalten wurden: DC Rf 0.18 (1 : 1 Hexan/EtOAc); Smp. 38-48ºC; ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.15-2.20 (m, 16H), 2,73 (t, 4H), 3.70 (t, 4H).
- Zu einer Lösung von 3,12 g (11,7 mmol) 16 und 45 ml Pyridin wurden 3,97 g (11,7 mmol) 4,4'-Dimethoxytriphenylmethylchlorid zugegeben und das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur 16 Stunden gerührt. Das meiste Pyridin wurde am Rotationsverdampfer entfernt und der Rest wurde zwischen 100 ml einer gesättigten NaHCO&sub3;-Lösung und 100 ml EtOAc ausgeschüttelt. Die EtOAc-Schicht wurde mit 50 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;SO&sub4;), filtriert und zu einem Öl konzentriert. Die Reinigung über Silicagel-Chromatographie (9 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc) ergab 2,84 g (43%) von 17 als ein viskoses Öl: DC Rf 0.35 (9 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/EtOAc); ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.41 (m, 8H), 1.65 (t, 2H), 2.70 (zwei überlappende Triplets, 4H), 3.08 (t, 2H), 3.65 (t, 2H), 3.81 (s, 6H), 6.85, (d, 4H), 7.32 (m, 7H), 7.47 (d, 2H).
- Zu einer Lösung von 771 mg (1,36 mmol) 17 und 116 mg (0,68 mmol) Diisopropylammoniumtetrazolid in 6,8 ml CH&sub2;Cl&sub2; unter einer N&sub2;-Atmosphäre wurde eine Lösung von 458 mg (1,52 mmol) O- Cyanoethyl-N,N,N',N'-tetraisopropylphosphoramidit in 0,5 ml CH&sub2;Cl&sub2; zugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden gerührt und zwischen 25 ml NaHCO&sub3; und 3 · 25 ml CH&sub2;Cl&sub2; ausgeschüttelt. Die kombinierten CH&sub2;Cl&sub2;-Schichten wurden mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, getrocknet (Na&sub2;CO&sub3;), filtriert und zu einem Öl konzentriert. Reinigung durch Filtration über einen 2"-Pfropfen basisches Aluminiumoxid in einer 25 mm-Säule ergab nach Elution mit 9 : 1 CH&sub2;Cl&sub2;/Et&sub3;N 831 mg (80%) von 18 als ein viskoses Öl; ¹H NMR (CDCl&sub3;) 1.25 (m, 12H), 1.45 (m, 8H), 1.70 (m, 8H), 2.72 (m, 6H), 3.09 (t, 2H), 3.65 (m, 4H), 3.87 (s, 6H), 3.91 (m, 2H), 6.89 (d, 4H), 7.35 (m, 7H), 7.49 (d, 2H); ³¹P NMR (CDCl&sub3; mit 15% H&sub3;PO&sub4; interner Standard) 147.69; HRMS (FAB, MH+) berechnet für C&sub4;&sub2;H&sub6;&sub2;N&sub2;O&sub5;P&sub1;S&sub2; 769.3839, gefunden 769.3853.
- Ein fünffacher molarer Überschuß (760 mg) des Phosphoramidites aus Beispiel 1 wurde an das 5'-Ende eines Oligonucleotids gekoppelt, welches an 10 g (300 umol) CPG ("control pore glass", Glasporenkontrolle)-Träger angeheftet war. Diese Synthese wurde mit einem Milligen 8800 DNA- Syntheseautomaten unter Verwendung der Protokolle zur DNA- Synthese des Herstellers durchgeführt.
- In einem getrennten Ansatz wurde in einer Umsetzung im 1 umol- Maßstab mit einem Pharmacia Gene-Assembler DNA- Syntheseautomaten durch Tritylfreisetzung die Kopplungseffizienz mit 96% bestimmt. Für diese Bestimmung wurde das Phosphoramidit aus Beispiel 3 verwendet.
- Nach der Reaktion wurde das CPG in 100 ml konzentriertem Ammoniak suspendiert und über Nacht bei 55ºC gehalten. Nach Filtration wurde das Oligonucleotid, von welchem die Schutzgruppe entfernt worden war, über einen Natriumchloridgradienten und Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
- Die Fraktionen wurden durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und die das Produkt enthaltenden Fraktionen vereint, mit 3 M NaCl-Lösung auf 0,3 M NaCl eingestellt und durch die Zugabe eines gleichen Volumens von kaltem Isopropanol gefällt. Das Produkt wurde durch Zentrifugation gesammelt und im Vakuum getrocknet.
- Das Pellet wurde dann in 40 ml Wasser gelöst und durch Behandlung mit einem Stachen molaren Überschuß an Natriummetaperiodat (83,6 mg für 2 g gereinigtes Oligonucleotid in diesem Beispiel) 30 Minuten bei 0ºC oxidiert. Die Losung wurde wiederum auf 0,3 M NaCl eingestellt und wie vorstehend ausgefällt, um das Formaldehyd, welches während dieser Umsetzung produziert wurde, zu entfernen. Nach Zentrifugation und Trocknen wurde dieses Material im nächsten Schritt verwendet.
- 100 mg oxidiertes Oligonucleotid (2,5 umol) wurden in 1,33 ml einer 100 mM NaBO&sub3;-Lösung, pH 8,0 gelöst. Dann wurden 2,5 mg DEK (0,25 umol, MW 10.000, Gewichtsverhältnis von D- Glutaminsäure zu D-Lysin 60 : 40) und 0,79 mg NaCNBH&sub3; (12,5 umol) zugegeben. Das Gemisch (2,0 ml) wurde 3 Tage bei 37ºC inkubiert. Das Kondensationsprodukt wurde über S-200 (Pharmacia, Uppsala, Schweden)-Chromatographie gereinigt. Die Fraktionen wurden mit alpha ³²P-ddATP und terminaler Transferase markiert und auf einem Standard-8% DNA- Sequenzierungs-Polyacrylamidgel betrachtet. Die verschiedenen radioaktiv markierten Fraktionen wurden durch Elektrophorese und Autoradiographie sichtbar gemacht wie in Fig. 4 dargestellt. Die mit "2" markierten Bahnen enthalten unkonjugiertes Oligonucleotid der vollständigen Länge und der Pfeil gibt die Position des 50-mer's an. Die Bahnen, welche mit "1" markiert sind enthalten Konjugate mit abnehmendem Molekulargewicht. Die Fraktionen, welche das höher substituierte Oligo-DEK-Konjugat enthalten (Region A) wurden für ein nachfolgendes "annealing" an den komplementären Oligonucleotidstrang vereint, um ein doppelsträngiges DNA-DEK- Konjugat zu konstruieren.
- 100 mg ungereinigtes oxidiertes Oligonucleotid (2,5 umol) wurden in 1,33 ml einer 50 mM NaBO&sub3;-Lösung, pH 8,0, gelöst. Dann wurden 31,3 mg KLH (0,208 umol) und 2,0 mg NaCNBH&sub3; (31,8 umol) zugegeben. Das Gemisch (2,0 ml) wurde bei 37ºC 3 Tage inkubiert. Das Kondensationsprodukt wurde über S-200- Chromatographie gereinigt. Die verschiedenen Fraktionen wurden unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie vorstehend für die D-EK beschrieben radioaktiv markiert und wurden dann nach Elektrophorese und Autoradiographie, wie in Fig. 5 dargestellt, sichtbar gemacht. Die Bahnen, welche mit "1" markiert sind, sind Hochmolekulargewichtkonjugate, die Bahnen, welche mit "2" markiert sind, enthalten größtenteils unkonjugiertes Oligo und der Pfeil gibt die Position des 50mer's an. Modifikationen der vorstehend beschriebenen Möglichkeiten zur Durchführung der Erfindung, welche dem Fachmann aus dem Gebiet der organischen Chemie, und insbesondere der Oligonucleotidsynthese und Derivatisierung offensichtlich sind, sollen innerhalb des Schutzumfanges der nachfolgenden Ansprüche liegen. Die Fraktionen, welche das Oligo-KLH-Konjugat enthielten, wurden für ein nachfolgendes "annealing" an den komplementären Oligonucleotidstrang vereint, um ein doppelsträngiges DNA-KLH-Konjugat zu konstruieren.
- Ein Gemisch aus 1,2,6-Trihydroxyhexan (2,58 g) und Benzaldehyddimethylacetal (3,18 g) wird mit Toluolsulfonsäurehydrat (2,08 g) behandelt. Das Gemisch wird 60 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wird dann zwischen einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung (50 ml) und Methylenchlorid (20 ml) ausgeschüttelt. Die Schichten werden getrennt, die wässrige Schicht wird mit Methylenchlorid reextrahiert, die organischen Schichten werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Öl konzentriert (2,66 g), welches über Säulenchromatographie gereinigt wird (Silicagel, Ethylacetat/Hexan 1 : 1). Nach Vereinigung und Konzentrierung der geeigneten Fraktionen erhält man die Titelverbindung als ein Öl (1,19 g): DC Rf = 0,18 (Silica, 1 : 1 Ethylacetat/Hexan); ¹H NMR (CDCl&sub3;), δ 1.62 (m, 6H), 3.67 (m, 3H), 3.25 (m, 2H), 6.37 (s, 0,6H), 6.50 (s, 0,4H), 8.04 (br. s, 5H).
- Auf ähnliche Weise, jedoch beginnend mit Benzaldehyd anstelle von Benzaldehyddimethylacetal, kann die Titelverbindung ebenfalls erhalten werden.
- Eine Lösung des vorstehenden Dioxolans (1,19 g) und Diisopropylamin (2,0 ml) in Methylenchlorid (22 ml) wird mit Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit (0,92 ml) behandelt und bei 24ºC 1,5 Stunden gerührt. Das Gemisch wird zwischen einer gesättigten wässrigen Natriumbicarbonatlösung (25 ml) und Methylenchlorid (25 ml) ausgeschüttelt. Die Schichten werden getrennt, die wässrige Schicht wird mit Methylenchlorid reextrahiert, die organischen Schichten werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zu einem Öl konzentriert (2,13 g), welches über Säulenchromatographie (basisches Aluminiumoxid, 1 : 1 Methylenchlorid/Hexan, 1% Triethylamin) gereinigt. Nach Vereinigung und Konzentrierung der geeigneten Fraktionen erhält man die Titelverbindung als ein Öl (1,28 g): ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ, 1.13 (12H), 1.5-1.9 (m, 8H), 2.58 (q, 2H), 3.5-3.8 (m, 8H), 4.0-4.3 (m, 2H), 5.8 (s, 0,6H), 5.92 (s, 0,4H), 7.3-7.5 (m, 5H).
- Auf ähnliche Weise werden die folgenden Phosphoramidite hergestellt:
- (4-(2-Methoxyphenyl-1,3-dioxyl-4-yl)-butyl)-O-(2-cyanoethyl)- N-N-diisopropylphosphoramidit; (4-(2-p-Butylphenyl-1,3-dioxol- 4-yl)-butyl-O-(2-cyanoethyl)-N-N-diisopropylphosphoramidit; (4-(2-p-Biphenyl-1,3-dioxol-4-yl)-butyl-O-(2-cyanoethyl)-N-N- diisopropylphosphoramidit; (4-(2-p-Methyl-2-phenyl-1,3-dioxol- 4-yl)-butyl-O-(2-cyanoethyl)-N-N-diisoprogylphosphoramidit
- Auf die Art wie in Beispiel 4 wird das Phosphoramidit aus Beispiel 7 an das Oligonucleotid gekoppelt. Nach Reinigung wird die Acetalschutzgruppe mit 80% Essigsäure/Wasser für 40 Minuten entfernt. Das Fortschreiten der Umsetzung wird über HPLC beobachtet, wobei eine Gen Pak Fax -Säule (Waters Association) mit 0,5 M Natriumphosphat bei pH 7,5, mit einem 1,0 M Natriumchlorid-/10% Methanolgradienten verwendet wird. Das Ausgangsacetal eluiert nach 20,1 Minuten und das hydrolysierte Diol eluiert nach 18,9 Minuten.
- Modifikationen der vorstehend beschriebenen Arten zur Durchführung der Erfindung, die dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen Phosphorchemie, Nucleotidchemie, Oligonucleotidsynthese oder verwandter Bereichen offensichtlich sind, sollen im Schutzumfang der nachfolgenden Ansprüche enthalten sein.
Claims (32)
1. Verbindung der Formel:
in der X die folgende Bedeutung hat:
(i) ein Sauerstoff- oder Schwefelatom, wenn X¹ die Gruppe
O&supmin; Methyl oder -OCH&sub3; darstellt und X² ein
Wasserstoffatom oder den Rest RO- bedeutet, wobei R eine
Schutzgruppe darstellt;
(ii) es ist nicht vorhanden, wenn
(a) X¹ ein Chloratom darstellt und X² eine
Methylgruppe oder den Rest RO- bedeutet; oder
(b) X den Rest RO- bedeutet und X¹ den Rest NR¹R²
darstellt, wobei jeder der Reste R¹ und R² einzeln
einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;
&sub2;&sub0;-Arylrest darstellt oder, wenn sie verbunden
sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;-cyclische
Struktur bilden mit 0 oder 1 Sauerstoff- oder
Schwefelatom;
G einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest darstellt; und
Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe bedeutet, die
über eines der vicinalen Diolkohlenstoffatome an G
gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, die über eines der
Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist;
mit der Maßgabe, daß G mindestens 4 Kohlenstoffatome
aufweist, wenn Z die Disulfidgruppe bedeutet.
2. Verbindung der Formel
in der R eine Methylgruppe oder eine basenempfindliche
Schutzgruppe darstellt;
jeder der Reste R¹ und R einzeln einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-
Cycloalkyl- oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest bedeutet, oder, wenn
sie verbunden sind, mit dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;-
cyclische Struktur bilden mit 0 oder 1 Sauerstoff- oder
Schwefelatom,
G einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest darstellt; und
Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe bedeutet, die
über eines der vicinalen Diolkohlenstoffatome an G
gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, die über eines der
Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist;
mit der Maßgabe, daß G mindestens 4 Kohlenstoffatome
aufweist, wenn Z die Disulfidgruppe darstellt.
3. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Z die Formel hat
in der jeder der Reste R³ und R&sup4; einzeln ein
Wasserstoffatom, einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-monocyclischen Arylrest
darstellt und jeder der Reste Y¹ und Y² einzeln eine
Hydroxyschutzgruppe darstellt oder zusammen über eine
Ein
zelatombrücke verbunden eine 5-gliedrige Ringschutzgruppe
bilden;
oder Z den Rest
-S-S-R&sup5;-O-Y³
darstellt,
wobei R&sup5; einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylenrest oder einen
C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-monocyclischen Arylenrest darstellt und Y³ eine
Hydroxyschutzgruppe ist.
4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei R&sup5; einen C&sub4;&submin;&sub6;-Alkylenrest
darstellt, -OY³ an das ω-Atom des Alkylenrests gebunden
ist und Y³ eine Tritylgruppe bedeutet.
5. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
X¹ den Rest NR¹R² darstellt und R¹ und R² jeweils
Isopropylgruppen sind.
6. Verbindung nach Anspruch 3 oder 5, wobei R³ und R&sup4; beide
Wasserstoffatome sind, R&sup5; eine -(CH&sub2;)&sub6;-Gruppe ist und Y¹,
Y² und Y³ alle Benzoyl- oder Dimethoxytritylgruppen
bedeuten.
7. Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei
X¹ den Rest NR¹R² darstellt und R¹ und R² jeweils
Isopropylgruppen sind, G eine -(CH&sub2;)&sub4;-Gruppe bedeutet und
entweder R eine β-Cyanoethylgruppe bedeutet oder Z die
Formel hat:
in der Y¹ und Y² jeweils Benzoylgruppen darstellen oder Y¹
eine Benzoylgruppe und Y² eine Dimethoxytritylgruppe ist.
8. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei Z eine
hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe der Formel bedeutet:
in der jeder der Reste R&sup6; und R&sup7; einzeln ein
Wasserstoffatom, einen C&sub6;&submin;&sub3;&sub0;-Aryl- oder substituierten Aryl-,
C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder einen aromatisch substituierten Alkylrest von
weniger als 30 Kohlenstoffatomen darstellt,
mit der Maßgabe, daß R&sup6; und R&sup7; nicht beide
Wasserstoffatome sein können.
9. Verbindung nach Anspruch 8, wobei jeder der Reste R&sup6; und
R&sup7; einzeln ein Wasserstoffatom oder eine Phenylgruppe
darstellt, die gegebenenfalls mit C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-,
C&sub1;&submin;&sub8;-Alkoxyresten, 1 bis 4 Halogenatomen, die jeweils eine Atomzahl
von 9 bis 35 haben, Nitro- oder Phenylgruppen substituiert
ist, mit der Maßgabe, daß R&sup6; und R&sup7; nicht beide
Wasserstoffatome sein können.
10. Verbindung nach Anspruch 8 oder 9, wobei R&sup6; ein
Wasserstoffatom darstellt und R&sup7; eine Phenyl-, p-Butylphenyl-,
p-Methoxyphenyl-, p-t-Butylphenyl- oder Biphenylgruppe
bedeutet.
11. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei X¹ den Rest NR¹R²
darstellt und beide Reste R¹ und R² Isopropylgruppen sind,
G eine -(CH&sub2;)&sub6;-Gruppe bedeutet und Z die folgende Formel
hat:
-S-S-R&sup5;-O-Y³
in der R&sup5; eine -(CH&sub2;)&sub6;-Gruppe bedeutet und Y³ eine
Dimethoxytritylgruppe ist.
12. 5'-modifiziertes Oligonucleotid der Formel
in der (O. N.) eine Oligonucleotidkette darstellt,
X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist,
X¹ einen O&supmin;-, Methyl-, -OCH&sub3;- oder NR¹R²-Rest darstellt,
wobei jeder der Reste R¹ und R² einzeln ein
Wasserstoffatom oder einen C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl-, C&sub3;&submin;&sub8;-Cycloalkyl- oder
C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-Arylrest bedeutet, oder, wenn sie verbunden sind, mit
dem Stickstoffatom eine C&sub4;&submin;&sub7;-cyclische Struktur bilden, die
keines oder ein Sauerstoff- oder Schwefelatom enthält, G
einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest bedeutet, und
Z eine hydroxygeschützte vicinale Diolgruppe darstellt,
die über eines der vicinalen Diolkohlenstoffatome an G
gebunden ist, oder eine Disulfidgruppe, die über eines der
Schwefelatome der Disulfidgruppe an G gebunden ist.
13. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 12, wobei Z
die Formel hat:
in der jeder der Reste R³ und R&sup4; einzeln ein
Wasserstoffatom, einen C&sub4;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-monocyclischen Arylrest
bedeutet und jeder der Reste Y¹ und Y² einzeln eine
Hydroxyschutzgruppe bedeutet oder zusammen über eine
Einzelatombrücke verbunden eine 5-gliedrige Ringschutzgruppe
bilden, oder den Rest
-S-S-R&sup5;-O-Y³,
bedeutet, wobei R&sup5; einen C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkylenrest oder einen C&sub6;&submin;&sub2;&sub0;-
monocyclischen Arylenrest darstellt und Y³ eine
Hydroxyschutzgruppe ist.
14. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 13, wobei Y¹
und Y² entfernt sind, so daß freie Hydroxylgruppen
zurückbleiben.
15. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 13, wobei G
eine -(CH&sub2;)&sub4;-Gruppe ist und Z die folgende Formel hat:
in der Y¹ und Y² beide Benzoylgruppen sind oder Y¹ eine
Benzoylgruppe und Y² eine Dimethoxytritylgruppe ist.
16. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 15, wobei Y¹
und Y² entfernt sind, so daß freie Hydroxylgruppen
zurückbleiben.
17. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 12 oder 13,
wobei Z die folgende Formel hat:
in der jeder der Reste R&sup6; und R&sup7; einzeln ein
Wasserstoffatom, einen C&sub6;&submin;&sub3;&sub0;-Aryl- oder substituierten Aryl-,
C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder aromatisch substituierten Alkylrest von weniger
als 30 Kohlenstoffatomen bedeutet,
mit der Maßgabe, daß R&sup6; und R&sup7; nicht beide
Wasserstoffatome sein können.
18. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 17, wobei
jeder der Reste R&sup6; und R&sup7; einzeln ein Wasserstoffatom oder
eine Phenylgruppe bedeutet, die gegebenenfalls mit einem
C&sub1;&submin;&sub8;-Alkyl-, C&sub1;&submin;&sub8;-Alkoxy-, 1 bis 4 Halogenatomen, jeweils
mit einer Atomzahl von 9 bis 35, einer Nitro- oder
Phenylgruppe substituiert ist, mit der Maßgabe, daß R&sup6; und R&sup7;
nicht beide Wasserstoffatome sein können.
19. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 17 oder 18,
wobei R&sup6; ein Wasserstoffatom bedeutet und R&sub7; eine Phenyl-,
p-Butylphenyl-, p-Methoxyphenyl-, p-t-Butylphenyl- oder
Biphenylgruppe darstellt.
20. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 12 oder 13,
wobei G eine -(CH&sub2;)&sub6;-Gruppe ist und Z die folgende Formel
hat:
-S-S-R&sup5;-O-Y³
in der R&sup5; eine -(CH&sub2;)&sub6;-Gruppe ist und Y³ eine
Dimethoxytritylgruppe darstellt.
21. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 14 oder 16,
wobei Z oxidiert wurde, so daß eine terminale
Aldehydgruppe am Oligonucleotid erzeugt wurde.
22. 5'-modifiziertes Oligonucleotid nach Anspruch 20, wobei Z
reduziert wurde, so daß eine terminale Thiolgruppe am
Oligonucleotid erzeugt wurde.
23. Konjugat eines Aminogruppen tragenden Trägermoleküls und
eines 5'-modifizierten Oligonucleotids nach Anspruch 21,
wobei das Konjugat durch Umsetzung der Aminogruppe und der
terminalen Aldehydgruppe erzeugt wurde.
24. Konjugat eines Trägermoleküls mit einer funktionellen
Gruppe und eines 5'-modifizierten Oligonucleotids nach
Anspruch 22, wobei das Konjugat durch Umsetzung der
funktionellen Gruppe und der terminalen Thiolgruppe erzeugt
wurde.
25. Konjugat nach Anspruch 23 oder 24, wobei das Trägermolekül
ein Polymer ist.
26. Konjugat nach Anspruch 25, wobei das Polymer ein
Aminosäurepolymer ist.
27. Partiell geschützter Alkohol der Formel
in der jeder der Reste Y¹ und Y² einzeln eine
Hydroxyschutzgruppe bedeutet oder miteinander über eine
Einzelatombrücke verbunden sind, die keine -C(=O)-Brückengruppe
ist, wobei eine 5-gliedrige Ringschutzgruppe erzeugt wird,
und G einen C&sub2;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest bedeutet.
28. Alkohol nach Anspruch 27, wobei Y¹ und und Y² beide
Benzoylgruppen sind und G eine Butylengruppe ist.
29. Alkohol nach Anspruch 27, wobei Y¹ eine
Dimethoxytritylgruppe, Y² eine Benzoylgruppe und G eine Butylengruppe
ist.
30. Alkohol nach Anspruch 27, wobei jeder der Reste Y¹ und Y²
einzeln den folgenden Rest bedeutet:
in dem jeder der Reste R&sup6; und R&sup7; einzeln ein
Wasserstoffatom, einen C&sub6;&submin;&sub3;&sub0;-Aryl- oder substituierten Aryl-,
C&sub1;&submin;&sub2;&sub0;-Alkyl- oder einen aromatisch substituierten Alkylrest von
weniger als 30 Kohlenstoffatomen bedeutet, mit der
Maßgabe, daß R&sup6; und R&sup7; nicht beide Wasserstoffatome sein
können.
31. Disulfid der Formel
Y³-O-G-S-S-G-OH
in der G einen C&sub4;&submin;&sub2;&sub0;-Kohlenwasserstoffrest und Y³ eine
Hydroxylschutzgruppe bedeutet.
32. Disulfid nach Anspruch 31, wobei Y³ eine
Dimethoxytritylgruppe und G eine Hexylengruppe ist.
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