JPH0291088A

JPH0291088A - ホスファイトおよびヌクレオシド‐３’‐ホスファイト誘導体およびこれを用いるオリゴヌクレオチドの合成法

Info

Publication number: JPH0291088A
Application number: JP63244748A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Takaku; 洋高久
Original assignee: Central Glass Co Ltd
Current assignee: Central Glass Co Ltd
Priority date: 1988-09-29
Filing date: 1988-09-29
Publication date: 1990-03-30
Also published as: US5134228A; DE3932471A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明はオリゴヌクレオチドの化学合成に有用な新規な
ホスファイトおよびヌクレオシド−ボスファイト誘導体
、さらにはこれを用いたオリゴヌクレオチドの合成法に
関するものである。

〔従来技術〕

近年、オリゴヌクレオチドの化学合成における最も効果
的な手法として、ホスホロアミダイト法とＨ−ホスホネ
ート法が知られている。しかし、ホスホロアミダイト法
ではそのホスホロアミダイトユニットの合成法において
、クロロホスフィンを用いるか、ビスアミダイト系のホ
スファイト化剤を用いるために高価なアゾールを用いな
ければならない。また、クロロホスフィン、ホスホロア
ミダイトユニットは不安定であり、また、各ステップに
酸化反応が必要となるなどの欠点がある。さらに、最終
生成物よりのリン酸保ｆｌ基の除去反応も必要となる。

そこで、この点を改良し”た方法としてＨ−ホスホネー
ト法がある。この方法ではＨ−ホスホネートユニットは
安定で、反応時間もホスホロアミダイト法より短かくて
よい、また、リン酸の保護基を必要とせず、さらには酸
化反応は最終生成物が得られた後に一回おこなえばよい
というような利点を有している。しかし、Ｈ−ホスホネ
ート法においては、縮合反応に用いる縮合剤、ピバロイ
ルクロライドの不安定性、反応中に塩酸塩が生成する点
、さらにはホスホネートユニットに対する優れたホスフ
ァイト化剤がいまだないのが実情である。

［問題点を解決するための具体的手段］本発明者らはか
かる従来法の問題点を解決するため鋭意検討の結果、新
規なホスファイト化剤、ホスファイトユニットが前記の
ホスホロアミダイト法、ｌトホスホネート法より優れた
オリゴヌクレオチド合成試薬となり、これを用いること
により効率よくオリゴヌクレオチドを得ることができる
ことを見いだし本発明に到達したものである。

すなわち本発明は一般式％式％ずれかであり、互に同じでなくてもよい、ｎは１．２．
３を、またｍは０．１．２を表わし、ｎ十ｍは３である
。Ｒ′は　ＣＮ、ＮＯ２、ハ＋：＋ゲンまたはハロゲン
化アルキルであり、互いに同じでなくてもよい。１はＯ
〜６の整数を表わす］で示されるホスファイトおよび一
般式一ホスファイト誘導体、さらにはこの誘導体を三級アミ
ンおよび溶媒の存在下、固相担体上で反応ののちトリク
ロロ酢酸処理をおこなう操作を複数回おこなったのち、
よう素により酸化し、次いで固相担体からの脱離、保護
基の脱離をおこなうことを特徴とするオリゴヌクレオチ
ドの合成法であり、（１）の化合物は一般式％式％（）（Ｒは前記と同じ）で示されるアルコール類と三塩化リ
ンを三級塩基の存在下、反応させることにより得られる
。また、（ＩＩＩ）の化合物は（１）の化合物と一般式（ただし、Ｒ″は保護基、Ｒは前記と同じ、Ｂは塩基を
表わす）で示される新規なヌクレオシド−３゜（Ｒ’、
Ｂは前記と同じ）で示されるヌクレオシドを三級アミン
の存在下、溶媒中で反応させることにより得られる。こ
こでＲ１は保護基を表わし、最もよく知られている基と
してジメトキシトリチル基があるが、本発明においても
、この基を好適に使用し得るものである。また、Ｂは塩
基であり、Ｈ６、Ｈ８−ジベンゾイルアデニン、Ｎ２−
イソブチリルグアニン、Ｈ４−ベンゾイルシトシン、チ
ミン等を示す。

本発明の新規化合物である一般式（１）の化合物におい
てＲは酸性度の高い基であり、（ＣＦ３　）　３Ｃ−５
（ＣＦ３　）　２　ＣＨ−、ＣＦ３　Ｃ）＋２−等の含
フツ素アルキル基が最も代表的である。このほかにその
他のハロゲン化アルキル基、フェノール誘導体基等が例
として挙げられる。

これらのアルコール類に３塩化リンを作用させて反応を
おこなうものであるが、この反応において３塩化リンに
対して３〜４当量のアルコール類を加え、トリエチルア
ミン、ピリジン等の三級塩基３〜４当量の存在下、エー
テル、ＴＨＦ、アセトン、ジクロロメタン等の反応化合
物に不活性な溶媒中で室温（１０〜３５℃）で２〜５時
間反応をおこなうことにより目的のホスファイトが高収
率で得られる。

本化合？ｌ（＋）は従来公知の他のホスファイト化剤に
くらべて低沸点の化合物であるために減圧蒸留中に分解
することなく得られるものであり、また、安定性が高く
、長期間の保存が可能である。

本発明におけるオリゴヌクレオチドの合成に用いられる
出発原料となるホスファイトユニット（■）はホスファ
イト（りに対して１〜３当量のヌクレオシドを、１〜３
当量の三級アミンの存在下、溶媒中で、室温にて反応さ
せると、容易に目的物（Ｉ［［）が得られる０反応終了
後、１５分程度経過ののち反応混合液をリン酸緩衝液（
ρ）１７．０＞で数回洗浄し、さらに濃縮したのち、ｎ
−ヘキサンでオイル状物質を洗浄したのち、減圧濃縮す
ると、Ｐ−ＮＭＲから９９％の純度のホスファイトユニ
ット（Ｉ［［）が効率よく得られる。この反応で用いる
溶媒としては反応化合物に対して不活性であればよく、
ジクロロメタン、エーテル、ＴＨＦ、アセトン、ジオキ
サン、アセトニトリル等が挙げられる。

また、塩基としてはピリジン、トリエチルアミン、ジメ
チルアミノピリジン、Ｎ−メチルイミダゾール等が具体
的に挙げられる０反応点度は５〜３５゛Ｃの範囲が適当
である。ここで得られた（ＩＩＩ）はオリゴヌクレオチ
ドの合成原料となる。

合成法は固相合成法を用い、一般に市販されている架橋
ポリスチレンやシリカゲルあるいは多孔質ガラス等に各
種ヌクレオシドを固定した固相担体を反応カラムに入れ
、トリクロロ酢酸処理ののち、ジクロロメタン、アセト
ニトリルでよく洗浄し、（Ｉ［［）のホスファイト誘導
体をＮ−メチルイミダゾール、ジメチルアミノピリジン
等の第三級塩基を活性剤とし、アセトニトリル等の溶媒
とともにカラムに導入し、反応をおこなう、この反応は
数分間で終了する。反応終了後、アセトニトリルとジク
ロロメタンで洗浄ののち、トリクロロ酢酸で処理するこ
とにより、ジメトキシトリチル基等の保護基を除去する
。この操作を繰り返し、所望の塩基を有するホスファイ
ト誘導体を用いて縮合反応をおこない、目的の塩基配列
のシーケンスを合成し、最後に酸化をおこなう、この酸
化剤としては、よう素がもっとも一般的であり、０．１
　Ｍ　（テトラヒドロフラン−ピリジン−水）ン容液と
して使用する。この酸化反応は１時間程度で十分である
０次いで、濃アンモニア水で処理し、反応生成物を固相
担体から切断し、この固相担体を分離除去して得た溶液
を濃縮し、末端の保護基を酢酸等により、脱離する。し
かるのち、′ａ縮、水洗、エーテル洗浄等により精製し
したのち、ＨＰＬＣにより、分離精製される。

この一連の各ステップの反応収率はいずれも９５％以上
の高収率である。

以下、実施例により本発明の詳細な説明する。

実施例１３塩化リン（８，７ｍ　Ａ、１００ｍＭ）を１０ｍ　ｌ
のエーテルに溶解し、１，１，１，３．３．３−へキサ
フルオロ２−プロピルアルコール（３５ｍ　１　、３３
０　ｍＭ）とトリエチルアミン４６ｍ　ｌ　（３３０ｍ
　Ｍ　）をエーテル１２０ｍｊ！に溶解した液を加えた
後、室温で３時間反応をおこなった０反応溶液をろ過し
て塩酸塩を除去し、ろ液を濃縮した。残渣を減圧ｆｉｍ
Ｌ、、ｂ、９３８−４０°Ｃ／　１０ｍｍＨｇの留分を
集め、トリ　（１，１，１，３゜３．３−へキサフルオ
ロ−２−プロピリル）ホスファイトが４３ｇ（収率８０
％）得られた。

”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　　１４１．０　ｐｐ＋＊
’Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣ１３）　　５．３〜４．４（鳳、
３Ｈ，Ｃ）Ｉ）実施例２５°−０−ジメトキシトリチルチミジン（５，００ｇ、
９、１８ｍ　Ｍ　）をジクロロメタン（４３ｍ　ｉ　）
に溶解し、ピリジン（２，２２ｍ　ｌ、２７．５４　ｍ
　Ｍ　）とトリ（１，１゜１．３，３．３−ヘキサフル
オロ−２−プロピリル）ホスファイト（８，３１ｍ　ｊ
！、２７．５ｍ　Ｍ　）を加え、室温で１５分間攪拌し
た。反応溶液をリン酸緩衝液（ｐＨ７゜０）で過剰のホ
スファイト化剤を完全に除去するまで洗浄した。有機層
を硫酸ナトリウムで乾燥し、ｉｆｆ、、た、残渣をｎ−
ヘキサンで洗浄したのち、減圧ｆｉ！Ｉして純粋な５″
−〇−ジメトキシトリチルチミジンー３°−０−ジ（１
，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロピル
）ホスファイトが７．１８ｇ　（収率９１％）得られた
。

”’Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３．８５％Ｈ３ｐｏ４）１
４０．１９６　　ｐｐｍ実施例３実施例３原料のホスファイト誘導体の塩基部分を５″−〇−ジメ
トキシトリチルーＮ２−インブチリルグアノシン、５°
−０−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイルシチジン
、５′−０−ジメトキシトリチル−８８、Ｎｅ　−ジベ
ンゾイルアデノシンどする以外は実施例２と同様にして
反応をおこない、５″−〇−ジメトキシトリチルーＮ２
−イソブチリルグアノシン−３′−〇−ジ（１、ｌ、　
１，３，３．３−ヘキサフルオロ−２−プロピル）ホス
ファイト［”Ｐ　　ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，８５％Ｈ３Ｐ
　Ｏａ　）　１４１．１３９９Ｐ■］　、５’−０−ジ
メトキシトリチル−Ｎ４ベンゾイルシチジン−３゛−０
−ジ（１，１，１，３，３，３−へキサフルオロ−２−
プロピル）ホスファイト［”Ｐ−ＮＭＲ（ＣＤＣＩ３．
８５％ＨｊＰＯ４）１４０．２６４　ｐｐｍ　］　、］
５°−０−ジメトキシトリチルーＮ６Ｎ６ジベンゾイル
アデノシンー３°−〇−ジ（１，１，１，３３，３−へ
キサフルオロ−２−プロピル）ホスファイト［”Ｐ　　
ＮＭＲ（ＣＤＣ１３，８５％Ｈ３Ｐ０．）１４１．２０
６　Ｐｐ園］をそれぞれ、９１．８９．９２％の収率で
得た。

実施例４固相担体（ＤＭＴｒＴＡＩＡ／ＣＰＧ）　（ＤＭＴｒは
ジメトキシトリチル基、Ｔはチミンを示す）（７５ｍｇ
、４７μＭ／ｇ）　　（３，５２μＭ）をガラスカラム
管に入れ、３％トリクロロ酢酸のジクロロメタン溶液で
処理してジメトキシトリチル基を除去する。カラム管を
ジクロロメタンとアセトニトリルでよく洗浄したのち、
実施例２で得られた５°−０−ジメトキシトリチルチミ
ジン−３゛−〇−ジ（１，１，１，３，３，３−ヘキサ
フルオロ−２−プロピル）ホスファイト（６８，７ｍ　
ｇ、７０゜４μＭ）をアセトニトリル（２００μｍ）に
溶解し、Ｎ−メチルイミダゾール（３５２μＭ１２５μ
ｌ）を加え、ただちに反応管に加えた０反応を２分間お
こない、アセトニトリルとジクロロメタンで洗浄したの
ち、３％トリクロロ酢酸で処理し、ジメトキシトリチル
基を除去する。この操作を繰り返し、目的のｄ−（Ｔ　
Ｐ　）、、Ｔが得られた。

最後に０．１Ｍよう素（ＴＨＦ−ピリジン−水、４３：
３：３、Ｖ／Ｖ　）で１時間処理したのちに、ジクロロ
メタンで洗浄した。固相担体を濃アンモのち、ろ液を濃
縮し、８０％酢酸で１０分間処理した。

次いで減圧濃縮することで酢酸分を完全に除去し、少量
の水に溶解し、エーテルで数回洗浄した。

この水溶液をＨＰ、ＬＣ，ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−２
ＳＷで分離精製し、目的のｄ−（Ｔｐ）１今Ｔが得られ
た。

各ステップの収率は９５％以上であった。

［発明の効果コ本発明の新規なホスファイトを用いて得られるヌクレオ
シド−３′−ホスファイト誘導体は、固相合成法による
オリゴヌクレオチド合成に有用であり、従来の合成法に
くらべて、酸化反応工程は最後に一度だけでよい点、精
製が容易な点、高価な縮合剤および活性化剤を使用する
必要のない点等の利点を有するものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）一般式（ＲＯ）＿３Ｐ（ I ）［Ｒは（ＣＸ＿３）＿ｎＣＸ＿ｍまたは▲数式、化学式
、表等があります▼で表わされ、ＸはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、
Ｈのうちのいずれかであり、互に同じでなくてもよい。ｎは１、２、３を、またｍは０、１、２を表わし、ｎ＋
ｍは３である。Ｒ′はＣＮ、ＮＯ＿２、ハロゲンまたは
ハロゲン化アルキルであり、互いに同じでなくてもよい
。１は０〜６の整数を表わす］で示されるホスファイト。
（２）一般式ＲＯＨ（II）（Ｒは前記と同じ）で示されるアルコール類と三塩化リ
ンを三級塩基の存在下、反応させることを特徴とする一
般式（ I ）で示されるホスファイトの製造法。
（３）一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼（III）（だだし、Ｒ″は保護基、Ｒは前記と同じ、Ｂは塩基を
表わす）で示される新規なヌクレオシド−３′−ホスフ
ァイト誘導体。
（４）一般式（ I ）で示されるホスファイトと一般式
▲数式、化学式、表等があります▼（IV）（Ｒ″、Ｂは前記と同じ）で示されるヌクレオシドを三
級アミンの存在下、溶媒中で反応させることを特徴とす
る一般式（III）で示される新規なヌクレオシド−３′
−ホスファイト誘導体の製造法。
（５）一般式（III）で示されるヌクレオシド−３′−
ホスファイト誘導体を三級塩基および溶媒の存在下、固
相担体上で反応ののちトリクロロ酢酸処理をおこなう操
作を複数回おこなったのち、よう素により酸化し、次い
で固相担体からの脱離、保護基の脱離をおこなうことを
特徴とするオリゴヌクレオチドの合成法。