DE3932471A1 - Neue phosphite und nucleosid-3'-phosphite fuer die synthese von oligonucleotiden - Google Patents

Neue phosphite und nucleosid-3'-phosphite fuer die synthese von oligonucleotiden

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Description

Die Erfindung betrifft eine Gruppe von neuen Phosphiten und Nucleosid-3′-phosphitderivaten, welche für die Synthese von Oligonucleotiden brauchbar sind sowie die Synthese von Oligonucleotiden unter Verwendung der neuen Nucleosid-3′-phosphite.
Für die chemische Synthese von Oligonucleotiden ist der Weg über Phosphoramidit wohlbekannt. Dieser Weg besitzt jedoch in mehrfacher Hinsicht Nachteile. Bei der Synthese der Phosphoramiditeinheit ist es erforderlich, Chlorphosphin oder ein Phosphit-bildendes Mittel vom Bisamidtyp unter Verwendung eines kostspieligen Azols einzusetzen. Sowohl Chlorphosphin als auch die erhaltene Phosphoramiditeinheit sind instabil. Bei dem Vielstufenprozeß ist eine Oxidationsreaktion in jeder Stufe erforderlich. Nach dem Syntheseschritt des Oligonucleotids ist eine weitere Reaktion zur Eliminierung der Phosphatschutzgruppe von dem Produkt erforderlich.
Der Nachteil des Phosphoramiditweges wird durch den H-Phosphonatweg vermieden. Bei dieser Methode ist die H-Phosphonateinheit stabil, und die Reaktionszeit ist kürzer als beim Phosphoramiditweg. Die Verwendung einer Phosphatschutzgruppe ist nicht erforderlich, und der Prozeß schließt nur eine Oxidationsreaktion ein, welche nach dem Abschluß der Kondensationsreaktion durchgeführt wird.
Jedoch gibt es immer noch einige Probleme beim H-Phosphonatweg, z. B. die Instabilität von Pivaloylchlorid, das als Kondensationsmittel bei der Kondensationsreaktion eingesetzt wird, die Bildung von Hydrochloriden während der Reaktion und das Fehlen von guten Phosphonylierungsmitteln für die Phosphonateinheit.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen Phosphiten, welche als bessere Phosphit-bildende Mittel für Nucleoside dienen, sowie die Bereitstellung von Nucleosid-3′-phosphitderivaten unter Verwendung solcher erfindungsgemäßer Phosphite, die zur Synthese von Oligonucleotiden nach einer Festphasenmethode brauchbar und vorteilhaft sind, sowie die Bereitstellung eines Verfahrens zur Synthese eines Oligonucleotids unter Verwendung von solchen erfindungsgemäßen Nucleosid-3′-phosphiten.
Die Erfindung liefert neue Phosphite der allgemeinen Formel (I):
(RO)₃P (I)
worin R folgende Bedeutung besitzt:
(CX₃) n CX m
worin
X = F, Cl, Br oder H, die gleich oder verschieden sein können, ist
n = 1, 2 oder 3 ist
m = 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß n + m = 3 ist, oder
worin
R′ = CN, NO₂, ein Halogenatom oder ein halogenierter Alkylrest, die gleich oder verschieden sein können, ist, und
k = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
In der allgemeinen Formel (I) stellt R einen Rest mit hoher Acidität dar. Bevorzugte Beispiele für den Rest R sind Fluoralkylgruppen wie (CF₃)₃C-, (CF₃)₂CH- und CF₃CH₂-, und andere gute Beispiele sind halogenierte Alkylreste und Phenylderivate.
Ein Phosphit der allgemeinen Formel (I) wird durch Umsetzung eines Alkohols der allgemeinen Formel (II):
ROH (II)
worin R die zuvor im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (I) angegebene Bedeutung besitzt, mit Phosphortrichlorid in Anwesenheit eines tertiären Amins hergestellt.
Die Phosphite der allgemeinen Formel (I) sind brauchbar als Phosphit-bildende Mittel für verschiedene Nucleoside. Im Vergleich mit konventionellen phosphitbildenden Mitteln weisen die erfindungsgemäßen Phosphite niedrigere Siedepunkte auf und können daher leicht in gereinigter Form ohne Zersetzung bei einer Destillation unter vermindertem Druck erhalten werden. Diese Phosphite weisen eine hohe Stabilität auf und können für lange Zeit gelagert werden.
Weiterhin werden gemäß der Erfindung Nucleosid-3′-phosphitderivate der allgemeinen Formel (III):
worin R′′ eine Schutzgruppe ist, R die zuvor im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (I) angegebene Bedeutung besitzt und B eine Base darstellt, erhalten.
Als Schutzgruppe R′′ in der Formel (III) ist die Verwendung der Dimethoxytritylgruppe, welche als Schutzgruppe bei konventionellen Verfahrensweisen überwiegt, möglich und bevorzugt.
Beispiele der Base B in der allgemeinen Formel (III) sind: N⁶,N⁶-Dibenzoyladenin, N²-Isobutyrylguanin, N⁴-Benzoylcytosin und Thymin.
Ein Nucleosid-3′-phosphit der allgemeinen Formel (III) wird durch Umsetzung eines Nucleosids der allgemeinen Formel (IV):
worin R′′ und B die zuvor im Zusammenhang mit der Formel (III) angegebenen Bedeutungen besitzen, mit einem Phosphit der allgemeinen Formel (I) in einem Lösungsmittel in Anwesenheit eines tertiären Amins hergestellt.
Nucleosid-3′-phosphite der allgemeinen Formel (III) sind für die Synthese von Oligonucleotiden nach der Festphasenmethode geeignet.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
  • (a) Durchführung einer Oligomerisierungsreaktion an einem Nucleosid-3′-phosphitderivat der allgemeinen Formel (III) aus einem festen Träger in Anwesenheit eines tertiären Amins und Behandlung des Reaktionsproduktes auf dem festen Träger mit verdünnter Trichloressigsäure,
  • (a′) mehrfache Wiederholung der Stufe (a);
  • (b) nach Durchführung der Stufe (a′) Oxidation des Reaktionsproduktes auf dem Träger mittels Jod;
  • (c) Ablösen des Reaktionsproduktes von dem Träger, und
  • (d) anschließende Entfernung der Schutzgruppe aus dem Reaktionsprodukt.
Die Hauptvorteile dieses Verfahrens liegen darin, daß eine Oxidationsreaktion nur einmal am Ende des Oligomerisierungsprozesses durchgeführt wird, daß das Produkt leicht gereinigt werden kann und daß weder ein kostspieliges Kondensationsmittel noch ein Aktivator benötigt werden.
Im folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
Zur Herstellung eines Phosphits (RO)₃P durch Reaktion von Phosphortrichlorid mit einem Alkohol ROH in Anwesenheit eines tertiären Amins ist es vorteilhaft, 3 bis 4 mol Alkohol pro mol des Phosphortrichlorids einzusetzen. Bevorzugte Beispiele für tertiäre Amine sind Triethylamin und Pyridin. Zur Gewinnung des gewünschten Phosphits mit hoher Ausbeute wird es bevorzugt, die Reaktion unter Einsatz von 3 bis 4 mol des tertiären Amins pro mol Phosphortrichlorid in einem gegenüber den Reaktionsteilnehmern inaktiven, organischen Lösungsmittel wie Ethylether, Tetrahydrofuran, Aceton oder Dichlormethan, bei einer von Zimmertemperatur nicht wesentlich verschiedenen Temperatur, nämlich bei 10 bis 35°C, durchzuführen. Üblicherweise ist die Reaktion in 2 bis 5 h abgeschlossen.
Ein Nucleosid-3′-phosphit der allgemeinen Formel (III) wird in einfacher Weise durch Umsetzung eines Phosphites, (RO)₃P, mit einem Nucleosid der allgemeinen Formel (IV) in einem gegenüber den Reaktionsteilnehmern inaktiven, organischen Lösungsmittel in Anwesenheit eines tertiären Amins erhalten. Vorteilhafterweise werden 1 bis 3 mol Phosphit und 1 bis 3 mol tertiäres Amin pro mol des Nucleosids verwendet. Die Reaktion läuft bei Zimmertemperatur glatt ab und ein geeigneter Bereich für die Reaktionstemperatur ist von 5°C bis 35°C. Beispiele für brauchbare Lösungsmittel sind Dichlormethan, Ethylether, Tetrahydrofuran, Aceton, Dioxan und Acetonitril. Beispiele von brauchbaren tertiären Aminen sind: Pyridin, Triethylamin, Dimethylaminopyridin und N-Methylimidazol. Üblicherweise ist die Reaktion in weniger als 15 min abgeschlossen. Das gewünschte Nucleosid-3′-phosphit mit 99%iger Reinheit (ermittelt durch ³¹P-NMR-Analyse) kann in effizienter Weise durch mehrmaliges Waschen der Reaktionsflüssigkeit mit Phosphorsäure-Pufferflüssigkeit (pH = 7,0), anschließendes Einengen der Flüssigkeit, Waschen der rückständigen, ölähnlichen Flüssigkeit mit n-Hexan und Einengen der gewaschenen Flüssigkeit unter vermindertem Druck erhalten werden.
Unter Verwendung eines Nucleosid-3′-phosphits der allgemeinen Formel (III) kann ein Oligonucleotid nach der Festphasensynthesemethode synthetisiert werden. Üblicherweise wird die Synthese in folgender Weise durchgeführt:
Ein ausgewähltes Nucleosid wird auf einen festen Träger, der unter handelsüblichen Produkten wie z. B. vernetztem Polystyrol, Kieselerdegel oder porösem Glas ausgewählt wird, fixiert. Dann wird der feste Träger in eine Reaktionssäule eingefüllt, mit Trichloressigsäure behandelt und mit Dichlormethan und Acetonitril gewaschen. Nach diesen vorbereitenden Arbeitsvorgängen wird ein Phosphitderivat der allgemeinen Formel (III) und ein tertiäres Amin, z. B. N-Methylimidazol oder Dimethylaminopyridin, das als Aktivator verwendet wird, in die Reaktionssäule zusammen mit einem geeigneten Lösungsmittel wie Acetonitril eingeführt. Die Reaktion ist in mehreren Minuten abgeschlossen. Nach der Reaktion wird die Säule mit Acetonitril und Dichlormethan gewaschen und anschließend mit Trichloressigsäure zur Entfernung der Schutzgruppe, z. B. einer Dimethoxytritylgruppe, behandelt. Diese Arbeitsvorgänge werden wiederholt, um die Kondensationsreaktion unter Verwendung von Phosphitderivaten, welche gewünschte Basen besitzen, zu wiederholen, bis eine gewünschte Basensequenz gebildet ist. Danach wird eine Oxidationsbehandlung durchgeführt. Üblicherweise wird Jod als Oxidationsmittel eingesetzt, und die Verwendung von 0,1 M Jodlösung in einer Mischung aus Tetrahydrofuran, Pyridin und Wasser ist vorteilhaft. Die Oxidationsreaktion ist in weniger als 0,5 h abgeschlossen. Als nächstes wird die Säule mit konzentriertem wäßrigen Ammoniak zur Ablösung des Reaktionsproduktes von dem festen Träger behandelt. Nach Abtrennen des festen Trägers durch Filtration wird das Filtrat eingeengt bzw. konzentriert und mit z. B. Essigsäure für die Ablösung des Schutzgruppe von den Enden behandelt. Die erhaltene Flüssigkeit wird eingeengt bzw. konzentriert und mit z. B. Wasser und Ether gewaschen und schließlich wird das Oligonucleotid durch Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie (HSLC) getrennt und gereinigt. In jeder Reaktionsstufe dieses Verfahrens erreicht die Ausbeute an gewünschtem Produkt 95% oder mehr.
Beispiel 1
Eine Lösung von 35 ml (330 mM) 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propylalkohol und 46 ml (330 mM) Triethylamin in 120 ml Ethylether wurde zu einer Lösung von 8,7 ml (100 mM) Phosphortrichlorid in 10 ml Ethylether zugesetzt, und die Mischflüssigkeit wurde bei Zimmertemperatur für 3 h gehalten, um die Reaktion zwischen Phosphortrichlorid und dem Alkohol durchzuführen. Danach wurde die Reaktionsflüssigkeit zur Entfernung der Hydrochloride filtriert. Das Filtrat wurde konzentriert und der Rückstand wurde unter vermindertem Druck destilliert, um ein Destillat bei 38-40°C/1330 Pa (10 mmHg) zu erhalten. Es wurde bestätigt, daß das Destillat aus Tris-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit bestand, es wurden 43 g (80% Ausbeute) erhalten.
³¹P-NMR (CDCl₃): 141,0 ppm
²H-NMR (CDCl₃): 5,3-4,4 (m, 3H, CH)
Beispiel 2
Zunächst wurden 5,00 g (9,18 mM) 5′-O-Dimethoxytritylthymidin in 43 ml Dichlormethan aufgelöst, und zu dieser Lösung wurden 2,22 ml (27,54 mM) Pyridin und 8,31 ml (27,5 mM) Tris-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit zugesetzt. Die erhaltene Mischung wurde bei Zimmertemperatur für 15 min zum Abschluß der Reaktion zwischen dem Phosphit und dem Nucleosid gerührt. Danach wurde die Reaktionsflüssigkeit mit Phosphorsäurepufferflüssigkeit (pH = 7,0) bis zur vollständigen Entfernung des Überschusses an phosphitbildendem Mittel gewaschen, und die zurückbleibende organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Der Rückstand wurde mit n-Hexan gewaschen und weiter unter vermindertem Druck konzentriert. Als Ergebnis wurden 7,18 g 5′-O-Dimethoxytritylthymidin- 3′-O-di-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit erhalten. Die Ausbeute betrug 91%.
³¹P-NMR (CDCl₃, 85% H₃PO₄): 140,1 ppm
Beispiele 3 bis 5
Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wurde mit der Ausnahme wiederholt, daß anstelle des in Beispiel 2 verwendeten Nucleosids in den Beispielen 3, 4 und 5 verwendet wurden:
5′-O-Dimethoxytrityl-N²-isobutyrylguanosin,
5′-O-Dimethoxytrityl-N⁴-benzoylcytidin,
5′-O-Dimethoxytrityl-N⁶,N⁶-dibenzoyladenosin.
Die erhaltenen Produkte waren:
Beispiel 3:
5′-O-Dimethoxytrityl-N²-isobutyrylguanosin- 3′-O-di-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit (91% Ausbeute),
³¹P-NMR (CDCl₃, 85% H₃PO₄): 141,1 ppm
Beispiel 4:
5′-O-Dimethoxytrityl-N⁴-benzoylcytidin-3′-O- di-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit (89% Ausbeute),
³¹P-NMR (CDCl₃, 85% H₃PO₄): 140,2 ppm
Beispiel 5:
5′-O-Dimethoxytrityl-N⁶,N⁶-dibenzoyladenosin- 3′-O-di-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl)-phosphit (92% Ausbeute);
³¹P-NMR (CDCl₃, 85% H₃PO₄): 141,2 ppm
Beispiel 6
Ein fester Träger aus DMTrT tragender CPG (DMTr bedeutet die Dimethoxytritylgruppe und T bedeutet Thymin) wurde in eine Glasrohrsäule gepackt. Der Träger trug 47 µM/g DMTrT und es wurden 75 mg Träger eingesetzt, so daß die DMTrT-Menge in der Säule 3,52 µM betrug. Der feste Träger im Glas wurde zuerst mit einer 3%igen Lösung von Trichloressigsäure in Dichlormethan zur Entfernung der Dimethoxytritylgruppen behandelt. Dann wurde die Säule gut mit Dichlormethan und Acetonitril gewaschen.
Getrennt wurde eine Lösung durch Auflösen von 68,7 mg (70,4 µM) 5′-O-Dimethoxytritylthymidin-3′-O-di-(1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propyl-)-phosphit (dem Produkt des Beispiels 2) in 200 ml Acetonitril hergestellt. Zu dieser Lösung wurden 25 µl (352 µM) N-Methylimidazol zugesetzt, und die Lösung wurde sofort in die Glasrohrsäule auf den festen Träger gegeben, um die Oligomerisierungsreaktion des Nucleosid-3′-phosphits durchzuführen. Nach Ablauf von 2 min wurde die Säule mit Acetonitril und Dichlormethan gewaschen und dann mit einer 3%igen Lösung von Trichloressigsäure in Dichlormethan zur Entfernung der Dimethoxytritylgruppen behandelt. Durch Wiederholung dieser Arbeitsvorgänge wurde das gewünschte d-(Tp)₁₄T gebildet. Abschließend wurde die Säule mit einer 0,1 M Jodlösung (Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser = 43/3/3 in Volumen) für 0,5 h behandelt, anschließend wurde mit Dichlormethan gewaschen.
Danach wurde der feste Träger mit konzentrierten Ammoniak zur Ablösung des Reaktionsproduktes von dem Träger behandelt. Die erhaltene Aufschlämmung wurde filtriert und das Filtrat wurde eingeengt und mit 80%iger Essigsäure für 10 min behandelt. Dann wurde die Mischflüssigkeit unter vermindertem Druck zur vollständigen Entfernung von Essigsäure konzentriert, und der Rückstand wurde in einer kleinen Menge Wasser aufgelöst und wiederholt mit Ether gewaschen. Aus der gewaschenen wäßrigen Lösung wurde das Reaktionsprodukt abgetrennt und durch HPLC unter Verwendung von TSK-Gel DEAE-2SW zur Gewinnung von gereinigtem d-(Tp)₁₄T gereinigt.
In jeder Stufe der zuvor beschriebenen Verfahrensweise betrug die Ausbeute an gewünschter Substanz mehr als 95%.

Claims (15)

1. Phosphit der folgenden allgemeinen Formel (I): (RO)₃P (I)worin R folgende Bedeutung besitzt:(CX₃) n CX m worin
X = F, Cl, Br oder H, die gleich oder verschieden sein können, ist
n = 1, 2 oder 3 ist
m = 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß n + m = 3 ist, oder worin
R′ = CN, NO₂, ein Halogenatom oder ein halogenierter Alkylrest, die gleich oder verschieden sein können, ist, und
k = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
2. Phosphit nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R in der allgemeinen Formel (I) ein Fluoralkylrest ist.
3. Phosphit nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoralkylrest aus der aus (CF₃)₃C-, (CF₃)₂CH- und CF₃CH₂-, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
4. Verfahren zur Herstellung eines Phosphits nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein durch die allgemeine Formel (II) wiedergegebener Alkohol: ROH (II)worin R die zuvor im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (I) angegebene Bedeutung besitzt, mit Phosphortrichlorid in Anwesenheit eines tertiären Amins umgesetzt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß als tertiäres Amin Triethylamin oder Pyridin verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem organischen Lösungsmittel bei einer Temperatur im Bereich von etwa 10°C bis etwa 35°C durchgeführt wird.
7. Nucleosid-3′-phosphitderivat der allgemeinen Formel (III): worin:
R′′ eine Schutzgruppe ist,
B eine Base darstellt, und
R folgende Bedeutung besitzt:(CX₃) n CX m worin
X = F, Cl, Br oder H, die gleich oder verschieden sein können, ist
n = 1, 2 oder 3 ist
m = 0, 1 oder 2 ist, mit der Maßgabe, daß n + m = 3 ist, oder worin
R′ = CN, NO₂, ein Halogenatom oder ein halogenierter Alkylrest, die gleich oder verschieden sein können, ist, und
k = 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.
8. Nucleosid-3′-phosphitderivat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß R in der allgemeinen Formel (III) ein Fluoralkylrest ist.
9. Nucleosid-3′-phosphitderivat nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Fluoralkylrest aus der aus (CF₃)₃C-, (CF₃)₂CH- und CF₃CH₂- bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
10. Nucleosid-3′-phosphitderivat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Schutzgruppe die Dimethoxytritylgruppe ist.
11. Nucleosid-3′-phosphitderivat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Base aus der aus N⁶,N⁶-Dibenzoyladenin, N²-Isobutyrylguanin, N⁴-Benzoylcytosin und Thymin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
12. Verfahren zur Herstellung eines Nucleosid-3′-phosphitderivats nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nucleosid der folgenden allgemeinen Formel (IV): worin R′′ und B die zuvor im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (III) angegebenen Bedeutungen besitzen, mit einem Phosphit der folgenden allgemeinen Formel (I):(RO)₃P (I)worin R die zuvor im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (III) angegebene Bedeutung besitzt, in einem Lösungsmittel in Anwesenheit eines tertiären Amins umgesetzt wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß ein tertiäres Amin verwendet wird, das aus der aus Pyridin, Triethylamin, Dimethylaminopyridin und N-Methylimidazol bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von etwa 5°C bis etwa 35°C durchgeführt wird.
15. Verfahren zur Synthese eines Oligonucleotids unter Verwendung eines Nucleosid-3′-phosphitderivats nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es folgende Stufen umfaßt:
  • (a) Durchführung einer Oligomerisierungsreaktion des Nucleosid-3′-phosphitderivates auf einem festen Träger in Anwesenheit eines tertiären Amins und Behandeln des Reaktionsproduktes auf dem festen Träger mit verdünnter Trichloressigsäure,
  • (a′) mehrfache Wiederholung der Stufe (a);
  • (b) nach Durchführung der Stufe (a′) Oxidation des Reaktionsproduktes auf dem festen Träger durch Jod;
  • (c) Ablösen des oxidierten Reaktionsproduktes von dem festen Träger; und
  • (d) Entfernung der Schutzgruppe von dem in Stufe (c) gewonnenen Reaktionsprodukt.
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