DE3637243A1 - Neue phosphorsulfidderivate von deoxynucleosiden oder deoxynucleotiden und deren verwendung - Google Patents
Neue phosphorsulfidderivate von deoxynucleosiden oder deoxynucleotiden und deren verwendungInfo
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Description
Die Erfindung betrifft neue Phosphorsulfidderivate
von Deoxynucleosiden oder Deoxynucleotiden und ihre Verwendung,
insbesondere für die Herstellung von Oligodeoxynucleotiden
im sogenannten Phosphittriesterverfahren.
Zur Herstellung von Oligodeoxynucleotiden sind zwei
Verfahren weit verbreitet, nämlich das Phosphattrieesterverfahren
und das Phosphittriesterverfahren.
Bei dem Phosphattrieesterverfahren wird eine Deoxynucleosid-
3′-phosphatverbindungder folgenden allgemeinen
Formel (A) üblicherweise als Zwischenverbindung verwendet.
Demgegenüber wird im Phosphittrieesterverfahren im allgemeinen
als Zwischenverbindung entweder eine Deoxynucleosid-
3′-phosphorchloridverbindungder allgemeinen Formel
(B) oder eine Deoxynucleosid-3′-O-phosphoramiditverbindung
der allgemeinen Formel (C) verwendet.
wobei R eine Hydroxyschutzgruppe, R′ eine Phosphat- oder
Phosphitschutzgruppe, R″ eine Alkylgruppe und B ein Basenrest,
der eine Schutzgruppe aufweisen kann, bedeuten.
Einzelheiten der Herstellung und Verwendung der Verbindungen
(A) werden in C. B. Reese, Tetrahedron, 34, 3143 (1978),
die der Verbindungen (B) in R. L. Letsinger et al, J. Am.
Chem. Soc., 97, 3278 (1975), und die der Verbindungen (C)
in M. H. Caruthers et al, Tetrahedron Lett. 22, 1859, (1981)
beschrieben, wobei die Offenbarungen in diesen Veröffentlichungen
in die vorliegende Anmeldung einbezogen sein
sollen.
Der Hauptvorteil des Phosphattrieesterverfahrens besteht
darin, daß die Verbindungen (A) gegenüber Sauerstoff
und Wasser beständig sind, so daß sie leicht herzustellen
und zu handhaben sind. Hierin wird ein wesentlicher
Grund dafür liegen, daß dieses Verfahren bevorzugt
für praktische Anwendungen herangezogen wird. Nachteilig
an dem Phosphattrieesterverfahren ist jedoch, daß die
Kondensationsreaktion einer Verbindung (A) mit einem 5′-
O-Deoxynucleosidoder einem 5′-Deoxynucleotid, die sogenannte
Internucleotid-Bildungsreaktion, nicht so schnell
wie erwünscht ist, so daß verhältnismäßig viel Zeit aufgewendet
werden muß, um die gewünschten Oligomeren zu erhalten.
Andererseits weist das Phosphittriesterverfahren,
bei dem Verbindungen (B) oder (C) verwendet werden, den
Vorteil auf, daß beide Verbindungen (B) und (C) hohe
Reaktivitäten an der alkoholischen Hydroxylgruppe von
5′-O-Deoxynucleosiden oder 5′-O-Deoxynucleotiden aufweisen,
so daß eine rasche Internucleotid-Bildungsreaktion
zu den gewünschten Oligodeoxynucleotiden erfolgt, so daß
wesentlich weniger Zeit als bei dem Phosphattrieesterverfahren
erforderlich ist. Das Phosphittrieesterverfahren
ist insbesondere wirkungsvoll anwendbar bei Festphasenverfahren
zur Herstellung von Oligodeoxynucleotiden. Die
Verbindungen (B) und (C), insbesondere die Verbindungen
(B) haben jedoch insoweit Nachteile, als ihre Herstellung
und Handhabung nicht einfach ist, weil sie unstabil gegenüber
Sauerstoff und Wasser sind, so daß Vorkehrungen
getroffen werden müssen, um ihre Zersetzung während
Lagerung und Verwendung o. ä. zu verhindern. Es ist in
der Tat bekannt, daß die Verbindungen (B) im allgemeinen so
instabil sind, daß es schwierig ist, sie aus dem Reaktionssystem
bei der Herstellung zu isolieren, und daß die Verbindungen
(C) ebenfalls soweit instabil sind, daß ihre P-N-Bindung
sogar in Gegenwart einer schwachen Säure leicht
gespalten wird.
Unter Berücksichtigung des zuvor beschriebenen Standes
der Technik wurde erfindungsgemäß die Herstellung von Oligodeoxynucleotiden
mit dem Hauptanliegen untersucht, geeignete
Zwischenverbindungen zu finden, die leicht herstellbar
sind, die beim Lagern stabil sind und leicht und schnell
in die gewünschte Oligodeoxynucleotide umgesetzt werden.
Erfindungsgemäß wurden hierbei Phosphorsulfidderivate
von Deoxynucleosiden und Deoxynucleotiden der nachfolgenden
Struktur synthetisiert, die die erfindungsgemäße Aufgabe
lösen.
Diese Aufgabe besteht zum einen darin, neue Phosphorsulfidderivate
von Deoxynucleosiden oder Deoxynucleotiden
zur Verfügung zu stellen, die als Zwischenprodukte für die
Herstellung von Oligodeoxynucleotiden geeignet sind.
Zum anderen besteht die Aufgabe darin, ein Verfahren
zur Herstellung von Oligodeoxynucleotiden vorzuschlagen,
das von den neuen Phosphorsulfidderivaten ausgeht.
Gemäß der ersten erfindungsgemäßen Teilaufgabe werden
die folgenden Phosphorsulfidderivate von Deoxynucleosiden
oder Deoxynucleotiden der allgemeinen Formel (I) zur Verfügung
gestellt:
wobei R1 eine Hydroxyschutzgruppe, R2 eine Phosphatschutzgruppe,
R3 eine Arylgruppe sind; B1 und B2 können gleich
oder verschieden sein und sind jeweils ein Basenrest, der
eine Schutzgruppe aufweisen kann; n ist Null oder eine positive
ganze Zahl, vorausgesetzt, daß, wenn n 2 oder größer
ist, die respektive B2-Gruppe gleich oder verschieden sein
kann.
Bevorzugte Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß
Erfindung sind die der allgemeinen Formeln (IA) und
(IB):
wobei R1, R2, R3, B1 und B2 die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen. Die Verbindungen der allgemeinen Formel (IA)
sind Deoxynucleosid-3′-O-phosphorsulfide, die den Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) entsprechen, wenn n = 0
ist; und die Verbindungen der allgemeinen Formel (IB) sind
Dideoxynucleotid-3′-O-phosphorsulfide, die den Verbindungen
der allgemeinen Formel (I) entsprechen, wobei n = 1 ist.
Die Beschreibung der Erfindung wird sich im wesentlichen
auf die Verbindungen der allgemeinen Formel (IA)
und (IB) beziehen; es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß
auch höhere Oligomereverbindungen der allgemeinen Formel
(I), wobei n = 2 oder größere ganze Zahlen sind, in gleicher
Weise hergestellt und verwendet werden können, wie
die, gemäß der allgemeinen Formel (I), wobei n = 0 oder
1 ist, das heißt der allgemeinen Formel (IA) und (IB).
Als Hydroxyschutzgruppe R1 in der allgemeinen Formel
(I) können grundsätzlich alle die verwendet werden, die
zum Schutz von Hydroxylgruppen geeignet sind. Üblicherweise
können die verwendet werden, deren Verwendbar keit für
diesen Zweck bei der Herstellung von Oligonucleotiden bekannt
ist, beispielsweise eine Triarylmethylgruppe wie
Triphenylmethyl, 4-Methoxytriphenylmethyl, 4,4′-Dimethoxytriphenylmethyl,
usw.; Pixyl (d. h. 9-Phenylxanthen-9-yl)
Gruppe; eine Alkoxycarbonylgruppe, eine Aryloxycarbonylgruppe,
eine Arylthioalkyloxycarbonylgruppe, und eine Trialkylsilylgruppe
wie t-Butyldimethylsilyl. Die Wahl einer
bestimmten Gruppe aus den erwähnten als Hydroxyschutzgruppe
R1 für eine bestimmte Verbindung der allgemeinen
Formel (I) ist nicht entscheidend; bevorzugt jedoch ist
eine Triarylmethylgruppe als R1, weil sie leicht in einen
Deoxynucleosid- oder Deoxynucleotidbestandteil eingeführt
und entfernt werden kann, und weil einige 5′-O-triarylmethyl-N-geschützte
Deoxynucleoside im Handel erhältlich
sind.
Als Phosphatschutzgruppe R2 in der allgemeinen Formel
(I) können grundsätzlich alle Verbindungen verwendet werden,
die als Schutzgruppe für den Phosphatbestandteil bekannt
sind. Üblicherweise werden solche verwendet, von
denen bekannt ist, daß sie diesbezüglich für die Herstellung
von Oligonucleotiden geeignet sind, beispielsweise eine
niedere Alkylgruppe mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, Allylgruppe,
eine Arylsulfonylalkylgruppe, eine Arylgruppe,
eine Haloarylgruppe usw.. Die Auswahl der jeweiligen Gruppe
aus den aufgeführten als Phosphatschutzgruppe R2 für eine
bestimmte Verbindung der allgemeinen Formel (I) ist nicht
entscheidend; bevorzugt sind jedoch Methyl-, Allyl-, β-Cyanoäthyl-
und 2-Chlorphenylgruppen, die in großem Umfang
untersucht worden sind, und sich als geeignete Phosphatschutzgruppen
zur Herstellung von Oligonucleotiden bewährt
haben.
Der Substituent R3 in den Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) kann eine Arylgruppe, beispielsweise eine Phenyl-,
2-Methylphenyl-, 4-Methylphenyl-, 2,4-Dimethylphenyl-,
2,6-Dimethylphenyl-, 2,4,6-Trimethylphenyl-, 2-Chlorphenyl-,
4-Chlorphenyl-, 3,4-Dichlorphenyl-, α-Naphthylgruppe, usw.
sein. Die zu wählende spezielle Arylgruppe als Substituent
R3 für eine bestimmte Verbindung der allgemeinen Formel (I)
hängt ab von der Natur der Phosphatschutzgruppe R2 in der
betreffenden Verbindung, im allgemeinen jedoch wird der
Substituent R3 bevorzugt ausgewählt aus o-substituierten
Arylgruppen wie 2-Methylphenyl-, 2,6-Dimethylphenyl-,
2-Chlorphenylgruppen usw.; dieses geschieht unter Berücksichtigung
leichter Herstellbarkeit und hoher Stabilität
der Verbindung der allgemeinen Formel (I) mit einem solchen
Substituenten R3.
Beispiele für Basenreste B1 und B2 in der allgemeinen
Formel (I) sind Thyminreste der Formel (II), die in der
3-Stellung geschützt sein können, Cytosinreste der Formel
(III), die am 4-Aminosubstituenten geschützt sein können,
Adeninreste der Formel (IV), die am 6-Aminosubstituenten
geschützt sein können, und Guaninreste der allgemeinen
Formel (V), die an der 1-Amido-, 2-Amino- und 6-Ketogruppe
geschützt sein können.
Die Art der Schutzgruppen für die Basenreste B1 und
B2 ist nicht begrenzt; bevorzugt sind im allgemeinen jedoch
solche Gruppen, die als geeignet zur Herstellung von
Oligonucleotiden beschrieben wurden, nämlich üblicherweise
Triarylmethyl-, Trialkylsilylalkyl-, Arylthioalkyl-,
Phthaloyl-, Aryloxycarbonyl-, Alkoxycarbonyl-, Dialkylcarbamoyl-,
Diarylcarbamoyl-, Arylcarbonyl, Alkylcarbonyl-
und 1,2-Dialkylcarbonyloxyäthylengruppen. Die Auswahl der
einzelnen Schutzgruppen für die Basenreste gemäß Formeln
(II) bis (V) ist vorbekannt und häufig beschrieben (beispielsweise
Tsujiaki Hata et al, J. Soc. Org. Syn. Chem., Japan,
42, 429 (1984)).
Zu geeigneten Beispielen der Verbindungen gemäß der
allgemeinen Formeln (I), wobei n = 0 ist, zählen entsprechende
allgemeine Formeln (IA):
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-chlorophenyloxy-2- methylenphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(methoxy-2-methylphenylthio) phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3-O-(2-chlorphenyloxy- 2,6-dimethylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2′-deoxycytidin -3-O-(2- chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N6-phthaloyl-2′-deoxyadenosin -3′-O-(2- chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Methoxytrityl-O6-diphenylcarbamoyl-N2-propionyl-2′- deoxyguanosin -3′-O-(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(allyloxy-2-methylphenylthio) phosphin; und
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-cyanoethyloxy-2- methylphenylthio)phosphin.
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-chlorophenyloxy-2- methylenphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(methoxy-2-methylphenylthio) phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3-O-(2-chlorphenyloxy- 2,6-dimethylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2′-deoxycytidin -3-O-(2- chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N6-phthaloyl-2′-deoxyadenosin -3′-O-(2- chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Methoxytrityl-O6-diphenylcarbamoyl-N2-propionyl-2′- deoxyguanosin -3′-O-(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(allyloxy-2-methylphenylthio) phosphin; und
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-cyanoethyloxy-2- methylphenylthio)phosphin.
Zu geeigneten Beispielen der Verbindungen der allgemeinen
Formel (I), wobei n = 1 ist, zählen entsprechende
allgemeinen Formeln (IB), die folgenden:
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytritylthymidyl-3′-O-[(2-chlorophenyloxy- 2-methylphenylthio)phosphino](3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2-deoxycytidyl-3′-O- [(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyl-2′- deoxyadenyl-3′-O-[(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino)- (3′→5′)thymidin; und
P-2-Chlorophenyl-5′-O-methoxytrityl-N2-i-butyryl-2′-deoxyguanosinyl- 3′-O-[(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)-thymidin.
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytritylthymidyl-3′-O-[(2-chlorophenyloxy- 2-methylphenylthio)phosphino](3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2-deoxycytidyl-3′-O- [(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorophenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyl-2′- deoxyadenyl-3′-O-[(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino)- (3′→5′)thymidin; und
P-2-Chlorophenyl-5′-O-methoxytrityl-N2-i-butyryl-2′-deoxyguanosinyl- 3′-O-[(2-chlorophenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)-thymidin.
Erfindungsgemäß können die Phosphorsulfidderivate von
Deoxynucleosiden oder Deoxynucleotiden der allgemeinen Formel
(I) in hoher Ausbeute durch Umsetzung eines Deoxynucleosids
oder Deoxynucleotids der allgeminen Formel (VI)
erhalten werden:
wobei R1, R2, B1, B2 und n die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen; wobei die Umsetzung mit einer 1,2,4-Triazolylphosphinverbindung
der allgemeinen Formel (VII) erfolgt:
wobei R2 und R3 die zuvor gegebene Bedeutung besitzen. Die
Reaktion kann durch das folgende Reaktionsschema wiedergegeben
werden:
Die Reaktion (1) kann vorzugsweise in einem organischen
Lösungsmittel durchgeführt werden. Zu geeigneten
organischen Lösungsmitteln zählen Chloroform, Methylenchlorid,
1,2-Dichlorethan, Benzol, Tetrahydrofuran, p-Dioxan
usw.. Das Lösungsmittel kann bevorzugt mit einem
geeigneten Trocknungsmittel soweit wie nötig dehydratisiert
und dann beispielsweise durch Destillation vor Verwendung
gereinigt werden. Das molare Verhältnis der Verbindungen
(VI) zur Verbindung (VII) kann in der Reaktion
(1) im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 10 liegen; bevorzugt liegt
es jedoch im Bereich 1 : 1 bis 1 : 2 unter Berücksichtigung
der Wirtschaftlichkeit, wobei die Verwendung von großen
Überschußmengen nicht anzuraten ist. In der Praxis wird
bevorzugt eine Lösung der Verbindung (VII) in einem der
beschriebenen organischen Lösungsmittel langsam zu einer
Lösung oder Suspension der Verbindung (VI) im gleichen
organischen Lösungsmittel zugegeben. Die Reaktion kann
bevorzugt bei Temperaturen im Bereich von 0°C bis 35°C
durchgeführt werden. Die Reaktionsdauer hängt von verschiedenen
Faktoren einschließlich dem Molverhältnis der
Verbindungen (VI) und (VII) und der Art der Schutzgruppen
R1 und R2, des Substituenten R3 und der Basenreste
B1 und B2 ab; sie beträgt normalerweise 10 Minuten bis
zwei Stunden. Die Vollständigkeit der Umsetzung sollte
bevorzugt beispielsweise durch Dünnschichtchromatographie
(TLC), 1HNMR Spektrometrie usw. festgestellt werden.
Die auf diese Weise hergestellten Verbindungen der
allgemeinen Formel (I), das sind Deoxynucleosid- oder
Deoxynucleotid-Phosphorsulfide, können ohne Abtrennung
aus der Reaktion zwischen den Verbindungen (VI) und (VII)
gemäß Reaktionsschema (1) für nachfolgende Reaktionen
verwendet werden; im allgemeinen jedoch werden sie nach
Abtrennung aus der Reaktionsmischung beispielsweise nach
den folgenden Methoden weiter verwendet. Die Reaktionslösung
kann, nachdem die Vollständigkeit der erwünschten
Reaktion festgestellt wurde, mit gesättigter wässriger
Natriumchloridlösung und ähnlichem gewaschen werden; die
organische Schicht kann über wasserfreiem Magnesiumsulfat
und ähnlichem getrocknet und dann im Vakuum destilliert
werden, um die wesentlichen Mengen organisches Lösungsmittel
zu entfernen. Die konzentrierte Lösung mit der Verbindung
(I) kann dann tropfenweise zu n-Petan oder n-Hexan
zur Ausfällung der Verbindung (I) in Form eines
freien Pulvers zugegeben werden, wobei das Pulver dann
abfiltriert und im Vakuum getrocknet werden kann. Alternativ
hierzu kann die konzentrierte Lösung der Verbindung
(I) der Silicagel-Säulenchromatographie unter Verwendung
von Chloroform, Methylenchlorid oder Äthylenacetat als
Eluierungsmittel unterworfen werden; das Eluat mit der
Verbindung (I) kann dann unter Vakuum konzentriert und
getrocknet werden, wobei die Verbindung (I) in Form eines
geschäumten Feststoffes anfällt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) gemäß
der Erfindung sind unter Lagerungsbedingungen für relativ
lange Zeit stabil. Beispielsweise kann 5′-O-Dimethoxytritylthymidin-3′-
(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin
und p-2-Chlorphenyl-5′-O-dimethoxytritylthymidyl-3′-O-
[(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio)phosphin]-(3′→5′)thymidin
fünf Monate bei -20°C ohne irgendein Anzeichen
von Zersetzung oder andere Veränderungen gelagert werden.
Deoxynucleoside der allgemeinen Formel (VI), wobei
n = 0 ist, die als Ausgangsverbindungen für die Reaktion
(1) für die Herstellung der Verbindungen der allgemeinen
Formel (I) erfindungsgemäß verwendet werden, werden durch
bekannte Verfahren hergestellt (beispielsweise nach
Tsujiaki Hata et al J. Soc. Org. Syn. Chem., Japan, 42,
429 (1984)) oder sie sind im Handel erhältlich. Es ist
empfehlenswert, vor der Verwendung diese Verbindungen so
gut wie möglich in irgendeiner Weise zu trocknen.
In gleicher Weise können Deoxynucleotide der allgemeinen
Formel (VI), wobei n eine positive ganze Zahl, üblicherweise
1 ist, und der allgemeinen Formel (6′) entsprechen,
die als Ausgangsverbindung für die Reaktion (1)
für die Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel
(I) gemäß Erfindung verwendet werden, in bekannter
Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Reaktionen,
die auf den nachfolgenden Reaktionen (2) und (3) basieren
und bei P. Cashion et al, Tetrahedron Lett., 1976, 3769
und M. S. Poonian et al, J. Org. Chem., 49, 4905 (1984)
beschrieben sind.
wobei R1, R2, B1 und B2 die vorgegebene Bedeutung besitzen;
R4 ist eine Alkylgruppe; und R5 ist eine Hydroxyschutzgruppe
wie die Levulinyl-, t-Butyldimethylsilylgruppe, usw..
Je nach Bedarf kann die Reaktion (2) oder Reakton (3)
gewählt werden; erstere erscheint jedoch aus wirtschaftlichen
Gründen vorteilhafter, weil die Anzahl der Reaktionsstufen
geringer als die bei dem letzten Prozeß ist, und
ist besonders in den Fällen geeignet, wenn R2 eine Aryl-
oder Haloarylgruppe ist.
Die anderen Reaktionspartner der Reaktion (1), 1,2,4-
Triazolylphosphinverbindungender allgemeinen Formel (VII)
sind neue Verbindungen und können auf einem der zwei folgenden
Wege, nämlich durch die Reaktionen (4) und (5),
hergestellt werden:
worin R2 und R3 die zuvor gegebene Bedeutung besitzen und
Me eine Methylgruppe ist; Einzelheiten werden in der japanischen
Patentanmeldung Nr. 1 65 546/86 vom 16. Juli 1986 offenbart
und in die vorliegende Anmeldung einbezogen.
Ob man entweder die Reaktion (4) oder (5) durchführt,
hängt zumindestens teilweise von der Verfügbarkeit der
Ausgangsverbindungen (XIII) und (XV) ab.
Die Reaktion (4) kann schnell in einem organischen
Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzol,
Toluol, usw. verlaufen. Unter Berücksichtigung des Umstands,
daß die Verbindung (VII) gegenüber Wasser nicht
sehr stabil ist, sollte das organische Lösungsmittel bevorzugt
durch ein geeignetes Trocknungsmittel getrocknet
und dann vor Verwendung durch Destillation gereinigt werden.
Das Molverhältnis von Verbindung (XIII) zu Verbindung
(XIV) kann im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 5, vorzugsweise
im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 1,5 unter Berücksichtigung der
Wirtschaftlichkeit liegen, wobei die Verwendung von großen
Überschußmengen nicht empfehlenswert ist. Die Reaktionstemperatur
kann üblicherweise im Bereich von 0°C bis 35°C
liegen. Die benötigte Reaktionszeit kann abhängen von
verschiedenen Faktoren, einschließlich dem Molverhältnis
der Verbindungen (XIII) und (XIV) und der Art der organischen
Gruppen R2 und R3; sie beträgt im allgemeinen fünf
bis dreißig Minuten. Bevorzugt sollte die Vollständigkeit
der Reaktion in üblicher Weise beispielsweise durch
1HNMR Spektrometrie festgestellt werden.
Die Verbindungen (XIII), die als Ausgangsverbindung
für die Reaktion (4) verwendet werden, können in an sich
bekannter Weise beispielsweise gemäß G. M. Kosolapoff et
al, "Organic Phosphorus Compounds", Band 5, veröffentlicht
von John Wiley & Sons (New York) von 1973 und
die darin zitierten Quellen) gemäß Reaktion (6) hergestellt
werden:
wobei R2 und R3 die vorgegebene Bedeutung besitzen, und wobei
"Base" eine organische Base von Triäthylamin und/oder
Pyridin ist.
Die Verbindung (XIV), die als die andere Ausgangsverbindung
für die Reaktion (4) verwendet wird, kann in
bekannter Weise beispielsweise gemäß L. Birkhofer et al,
Chem. Ber., 93, 2804 (1960) und den darin zitierten Quellen
gemäß Reaktion (7) hergestellt werden:
Normalerweise sind die Verbindungen (XIV) im Handel
erhältlich.
Die Reaktion (5) verläuft glatt in einem organischen
Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzol,
Toluol, usw., das vorzugsweise vor Verwendung getrocknet
und wie beschrieben, gereinigt wird. Das molare Verhältnis
von Verbindungen (XV) zu (XVI) kann vorzugsweise im Bereich
von 1 : 1 bis 1 : 1,1 liegen. Die Reaktionstemperatur liegt
vorzugsweise im Bereich von 0°C bis 35°C. Die benötigte
Reaktionsdauer kann von verschiedenen Faktoren einschließlich
der Art der organischen Gruppen R2 und R3 abhängen
und liegt im allgemeinen im Bereich von 30 Minuten bis 3 Stunden.
Vorzugsweise wird die Vollständigkeit der Reaktion
in üblicher Weise beispielsweise durch 1HNMR Spektrometrie
bestimmt.
Verbindungen (XV), die als Ausgangsverbindung für die
Reaktion (5) verwendet werden, können in an sich bekannter
Weise beispielsweise nach J. Fourrey et al, Tetrahydron
Lett., 25, 4511 (1984) und den angegebenen Quellen gemäß
der Reaktion (8) hergestellt werden:
1,2,4-Triazolylphosphinverbindungen der allgemeinen Formel
(VII), die nach einer der Reaktionen (4) und (5) hergestellt
wurden, sind gegenüber Hitze und Wasser, Reinigung
und Isolierung durch Chromatographie oder Destillation
nicht so stabil; tatsächlich jedoch werden die Verbindungen
(VII) im wesentlichen reiner Form und im wesentlichen
quantitativer Ausbeute durch die Reaktion (4) oder (5) erhalten,
was durch die folgenden Punkte (a) und (b) bestätigt
wird:
(a) Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das verwendete organische Lösungsmittel und das Nebenprodukt unter vermindertem Druck abdestilliert; das 1HNMR Spektrum des Rückstands zeigte Signale, entsprechend den R2 und R3-Gruppen und der Triazolylgruppe der Verbindung (VII).
(b) Der wie in (a) erhaltene Rückstand wurde in einem organischen Lösungsmittel, üblicherweise Chloroform, gelöst, und ein Alkohol, typischerweise Methanol, wurde der gebildeten Lösung in äquimolaren Anteilen zugesetzt, wodurch Alkoholyse erfolgte, die ein Diorganoxy-organothiophosphin und 1,2,4-Triazol in hohen Ausbeuten gemäß der Reaktionsgleichung (9) ergab: wobei R2 und R3 dioe zuvor gegebene Bedeutung besitzen und R6 eine Alkylgruppe ist.
(a) Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das verwendete organische Lösungsmittel und das Nebenprodukt unter vermindertem Druck abdestilliert; das 1HNMR Spektrum des Rückstands zeigte Signale, entsprechend den R2 und R3-Gruppen und der Triazolylgruppe der Verbindung (VII).
(b) Der wie in (a) erhaltene Rückstand wurde in einem organischen Lösungsmittel, üblicherweise Chloroform, gelöst, und ein Alkohol, typischerweise Methanol, wurde der gebildeten Lösung in äquimolaren Anteilen zugesetzt, wodurch Alkoholyse erfolgte, die ein Diorganoxy-organothiophosphin und 1,2,4-Triazol in hohen Ausbeuten gemäß der Reaktionsgleichung (9) ergab: wobei R2 und R3 dioe zuvor gegebene Bedeutung besitzen und R6 eine Alkylgruppe ist.
Die Phosphorsulfidderivate von Deoxynucleosiden oder
Deoxynucleotiden der allgemeinen Formel (I) gemäß Erfindung
sind vorteilhafterweise als Zwischenprodukte zur Herstellung
von Oligodeoxynucleotiden geeignet, weil sie aufgrund ihrer
hohen Stabilität leicht zu lagern und zu handhaben sind,
gleichzeitig erlauben sie eine befriedigend hohe Reaktionsgeschwindigkeit
bei der Herstellung der gewünschten Produkte.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird demnach
die Verwendung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
gemäß Erfindung als Zwischenprodukt zur Herstellung von Oligodeoxynucleotiden
vorgeschlagen; das heißt, daß ein Verfahren
für die Herstellung eines Oligodeoxynucleotiden der
allgemeinen Formel (XXIV) vorgeschlagen wird:
wobei R1 eine Hydroxyschutzgruppe, R2 eine Phosphatschutzgruppe,
R7 eine Hydroxyschutzgruppe ist, die einen Polymerträger
enthalten kann; B1, B2, B3 und B4 können gleich oder
verschieden sein und sind jeweils ein Basenrest, der eine
Schutzgruppe aufweisen kann. n ist null oder eine positive
ganze Zahl, m ist null oder eine positive Zahl, vorausgesetzt,
daß, wenn n und/oder m 2 oder größer sind, jeweils
B2 und/oder B4 gleich oder verschieden sind, wobei man ein
Phosphorsulfidderivat eines Deoxynucleosids oder Deoxynucleotids
der allgemeinen Formel (I) umsetzt:
wobei R1, R2, B1, B2 und n die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen und R3 eine Arylgruppe ist, wobei die Umsetzung mit
einem Deoxynucleosid oder einem Deoxynucleotid der allgemeinen
Formel (XXV) erfolgt:
wobei R2, R7, B3, B4 und m die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen, wobei in Gegenwart einer Trialkylstannylazolverbindung
der allgemeinen Formel (XXVI) und einer Base der allgemeinen
Formel (XXVII) arbeitet:
wobei R8 eine Alkylgruppe, R9 Wasserstoff oder eine Alkyl-
oder Arylgruppe, R10 eine Alkylgruppe oder bei R10-Gruppen
zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom eine heterocyklische
Gruppe bilden, die ein oder zwei zusätzliche Heteroatome
wie Stickstoff, Sauerstoff und/oder Schwefel enthält;
und X ist eine Azolylgruppe; nachfolgend wird dann das gebildete
Reaktionsprodukt oxidiert.
Demnach kann die Reaktion zur beschriebenen Herstellung
durch die folgende Reaktionsgleichung 10 beschrieben
werden:
Die Reaktion (10) gemäß Erfindung beinhaltet im allgemeinen
eine Kupplungsreaktion zwischen den Verbindungen
(I) und (XXV) in Gegenwart der Verbindungen (XXVI) und
(XXVII) sowie eine nachfolgende Oxidation des Phosphoratoms
des gebildeten Produkts. Die Kupplungsreaktion zwischen den
Verbindungen (I) und (XXV) verläuft glatt in einem organischen
Lösungsmittel wie beispielsweise Methylenchlorid,
Chloroform, 1,1-Dichloräthan, 1,2-Dichloräthan, Tetrahydrofuran,
p-Dioxan, Benzol und/oder Toluol. Das Lösungsmittel
sollte vor Verwendung durch ein geeignetes Trocknungsmittel
getrocknet und dann beispielsweise durch Destillieren gereinigt
werden. Die Reaktion kann bei Temperaturen von 0
bis 35°C und üblicherweise bei Zimmertemperatur durchgeführt
werden. Die molaren Verhältnisse der Verbindungen
(I), (XXV), (XXVI) und (XXVII) betragen im allgemeinen 1
bis 40 Äquivalente der Verbindungen (I), 1 bis 100 Äquivalente
der Verbindung (XXVI) und 1 bis 200 Äquivalente der
Verbindung (XXVII), bezogen auf ein Äquivalent der Verbindung
(XXV). Diese Reaktion kann im allgemeinen innerhalb
einer Stunde abgeschlossen werden; bevorzugt wird die Vollständigkeit
der Reaktion jedoch in üblicher Weise beispielsweise
durch TLC oder 1HNMR Spektroskopie festgestellt,
insbesondere, wenn die Reaktion in flüssiger Phase geführt
ist, nämlich dann, wenn die Hydroxyschutzgruppe R7 der
Verbindung (XXV) die Acetyl-, Benzoyl-, Levulinyl-, oder
t-Butyldimethylsilylgruppe ist, bevor die nachfolgende Oxidation
begonnen wird. Andererseits kann die Vollständigkeit
der Reaktion nicht durch TLC, 1HNMR Spektroskopie usw.
festgestellt werden, wenn die Gruppe R7 eine organische
Gruppe der allgemeinen Formel (XXVIII) ist, die einen Polymerträger
aufweist. In diesen Fällen kann die Zeit bis zur
vollständigen Umsetzung im allgemeinen dadurch bestimmt
werden, daß die Kupplungsreaktion für eine vorbestimmte
Zeit durchgeführt wird, daß dann Oxidation durchgeführt
wird, wobei die Hydroxyschutzgruppe R1 von dem gebildeten
Produkt der allgemeinen Formel (XXIV) entfernt
wird und indem man die Menge der entschützten R1-Gruppe
analysiert. In diesem Fall, wenn die Gruppe R1 ein Triarylmethylderivat
wie Dimethoxytrityl oder Monomethoxitrityl
ist, kann die Bestimmung der Zeit zur vollständigen Umsetzung
leicht durch Messung der Absorbanz des Tritylkations
gemessen werden, das von der Entfernung der Schutzgruppe
R1 durch die Einwirkung einer Säure entsteht (der sogenannte
Tritylkationentest, wobei das Dimethoxitritylkation bei
498 nm und das Monomethoxitritylkation bei 475 nm festgestellt
wird).
Die folgende Oxidationsreaktion kann durchgeführt
werden, indem man ein Jod-Wassersystem, m-Chlorbenzoesäure,
Jodbenzoldiacetat, Stickoxid, usw. verwendet. Die Wahl des
jeweiligen Oxidationsmittels für den jeweiligen Fall ist
nicht begrenzt; die Verwendung des Jod-Wassersystems ist
jedoch am bevorzugtesten, weil sie leicht durchführbar
und kostengünstig ist. Wird das Jodwassersystem verwendet,
kann die Oxidation mit der 1 bis 200-fachen stoichometrischen
Menge des Oxidationsmittels, die für die Reaktion
nötig ist, durchgeführt werden, wenn die Reaktion nur 1
bis 5 Minuten bei einer Temperatur von -78°C bis 35°C
dauern soll.
In den Trialkylstannylazolverbindungen der Formel (XXVI),
die für die Reaktion (10) verwendet werden, kann R8 irgendeine
Alkylgruppe einschließlich primärer, sekundärer oder
tertiärer Alkylgruppen sein, wie Methyl-, Äthyl-, n-Propyl-,
n-Butyl-, i.-Propyl-, sec-Butyl, tert-Butylgruppen usw.
Die Wahl von bestimmten Alkylgruppen im Einzelfall ist nicht
kritisch; sie kann jedoch von der Herstellbarkeit der Verbindungen
(XXIV), deren Stabilität und anderen Eigenschaften
abhängig sein. Zu bevorzugten Alkylgruppen R8 zählen
Äthyl-, n-Propyl- und n-Butylgruppen. Als Azolylgruppe X
sind beispielsweise verwendebar: Imidazolyl-, 3-Nitroimidazolyl-,
Benzimidazolyl-, 1,2,3-Triazolyl-, 1,2,4-Triazolyl-,
3-Nitro-1,2,4-triazolyl-, Benzotriazolyl, 5-Chlorbenzotriazolyl-,
5-Nitrobenzotriazolyl, Tetrazolylgruppen usw.
Die Wahl der jeweiligen Azolylgruppe im Einzelfall ist nicht
beschränkt; sie kann jedoch an der leichten Herstellbarkeit
der Verbindungen (XXVI) und ihre Wirkungsweise bei der gewählten
Reaktion abhängen. Zu bevorzugten Azolylgruppen als
X zählen Imidazolyl-, 1,2,3-Triazolyl-, 1,2,4-Triazolyl-,
Benzotriazolyl und Tetrazolylgruppen.
Die Trialkylstannylazolverbindungen der allgemeinen
Formel (XXVI) können vorteilhafterweise durch ein Verfahren
nach der japanischen Patentanmeldung Nr. 1 65 858/85 vom
01. August 1985 nach folgender Reaktion (11) hergestellt
werden:
wobei R8 und X die vorgegebene Bedeutung besitzen und t-Bu
die tert-Butylgruppe ist. Nach diesem Verfahren kann die
gewünschte Verbindung (XXVI) in quantitativer Ausbeute durch
einfaches Mischen der Verbindung (XXIX) mit der Verbindung
(XXX) erhalten werden, wobei vorzugsweise in einem organischen
Lösungsmittel wie Methylenchlorid oder Chloroform im
Temperaturbereich von 0 bis 35°C, normalerweise jedoch
bei Zimmertemperatur, gearbeitet wird. Das Molverhältnis
der Verbindungen (XXIX) bis (XXX) liegt im allgemeinen bei
1 : 1 bis 2 : 1 Die Reaktion (11) verläuft sehr schnell und
dauert normalerweise nur 5 bis 10 Minuten.
Verbindungen der allgemeinen Formel (XXIV) für die
Reaktion (11) können leicht in an sich bekannter Weise hergestellt
werden, beispielsweise gemäß US-Patent Nr.
27 45 820 (G. P. Mack), die die Reaktion (12) zwischen einem
Trialkylzinnchlorid (XXXI) und einem Alkalimetall-t-butoxid
(XXXII) betrifft.
wobei R8 und t-Bu die zuvor gegebene Bedeutung besitzen
und M ein Alkalimetall ist.
Azole der allgemeinen Formel (XXX) für die Reaktion
(11) können natürlich in Abhängigkeit von der Verbindung
(XXVI) gewählt werden. Sie können einfach in an sich bekannter
Weise hergestellt werden oder sind im Handel erhältlich;
sie werden vor Verwendung so vollständig wie möglich getrocknet.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (XXVI), die gemäß
der Reaktion (11) hergestellt wurde, kann für die nachfolgende
Reaktion ohne Isolieren aus der Reaktionslösung
verwendet werden; sie wird jedoch normalerweise beispielsweise
durch Zugabe von Äther oder Azeton zur gebildeten
Reaktionslösung isoliert, wobei sich Kristalle bilden,
oder durch Abdestillieren des verwendeten organischen Lösungsmittels
und t-Butanols unter vermindertem Druck.
Verbindungen der allgemeinen Formel (XXVI) können
ebenfalls in an sich bekannter Weise beispielsweise gemäß
Luÿten et al., Rec. Trav. Chim., 82, 1181 (1963) und Dou
Henri et al., französische Patentanmeldung Nr. 23 42 728,
wobei diese Offenbarung in die vorliegende Erfindung
einbezogen ist.
Zu Basenverbindungen der allgemeinen Formel (XXVII)
für die Reaktion (10) zählen auch solche, bei denen R9
Wasserstoff, eine Alkyl- (beispielsweise Methyl-, Ethyl-,
n-Propyl-, i-Propyl-, n-Butylgruppen usw.) Gruppe, oder
eine Arlygruppe (beispielsweise Phenyl, 4-Methylphenyl,
usw.) und jede R10-Gruppe eine Alkylgruppe (beispielsweise
Methyl, Äthyl, n-Propyl, i-Propyl, n-Butyl usw.) sind, oder
wobei zwei R10-Gruppen zusammen mit dem benachbarten Stickstoff
eine heterocyklische Gruppe bilden, die ein oder zwei
weitere Heteroatome enthält, wie Stickstoff, Sauerstoff
oder Schwefel (beispielsweise Piperidino-, 2,6-Dimethylpiperidino-,
Pyrrolyl-, Morpholino-, Thiomorpholino-,
Imidazolyl-, 2-Methylimidazolyl-, Benzimidazolyl-, 1,2,4-Triazolyl,
3-Methyl-1,2,4-Triazolyl usw.) und solche,
bei denen R9 und zwei R10-Gruppen zusammen mit dem benachbarten
Stickstoffatom einer heterocyklische Gruppe bilden,
die ein oder zwei weitere Heteroatome wie Stickstoff, Sauerstoff
und/oder Schwefel enthält, wie Pyridin, 2,6-Dimethylpyridin,
4-Dimethylaminopyridin, Oxazol, Thiazol, Pyrimidin,
Pyrazin, Quinolin, S-Triazin usw. Die Wahl der jeweiligen
Verbindung der allgemeinen Formel (XXVII) im Einzelfall
ist nicht begrenzt; Verbindungen mit einem pKa-Wert von 5
bis 12 sind jedoch bevorzugt.
Bei den Deoxynucleosid- oder Deoxynucleotidverbindungen
der allgemeinen Formel (XXV) für die Reaktion (10) gemäß
Erfindung, entspricht R2 der Definition und den Beispielen,
wie sie zur allgemeinen Formel (I) gemacht wurden,
während B3 und B4 entsprechend der allgemeinen Formel
(XXIV) gilt, und B1 und B2 haben die gleiche Bedeutung wie
sie gemäß der allgemeinen Formel (I) aufgezeigt wurde.
Die Hydroxyschutzgruppe R7 kann im Grunde irgendeine
3′-Hydroxyschutzgruppe sein, von der bekannt ist, daß sie
für die Herstellung von Oligodeoxynucleotiden geeignet ist.
Hierbei handelt es sich vor allem um Acetyl-, Benzoyl-,
Levulinyl-, t-butyldimethylsilyl oder eine organische
Gruppe mit einem Polymerträger gemäß allgemeiner Formel
(XXXIII):
wobei ein Polymerträger und Y1 und Y2 gleich oder
verschieden sind und jeweils eine Organogruppe ist, die sich
mit dem benachbarten Polymerträger, Amidgruppe oder Carbonylgruppe
durch covalente Bindungen verbinden kann.
Zu geeigneten Polymerträgerbeispielen zählen Silicagel
und Polystyrol. Y1 und Y2 können häufig eine Alkylengruppe
mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen sein, obwohl sie hierauf
nicht begrenzt sind. Die Wahl der Schutzgruppe R7 kann
von der Art der Reaktion (10) abhängen. Wird demnach eine
homogene Flüssigphasenreaktion durchgeführt, ist die Verwendung
von Acetyl-, Benzoyl-, t-Butyldimethylsilylgruppen
usw. bevorzugt, während die Verwendung von Organogruppen
der allgemeinen Formel (XXXIII) bei heterogener Festphasenreaktion
geeignet ist.
In den Verbindungen (XXV) kann m von der Kettenlänge
des gewünschten Produkts gemäß der allgemeinen Formel
(XXIV) abhängen. m ist im allgemeinen 0 bis 30 bei Verwendung
in einer Flüssigphasenreaktion und 0 bis 200 bei
Verwendung in einer Festphasenreaktion.
Erfindungsgemäß können Oligodeoxynucleotide verschiedener
Kettenlänge nach Bedarf über die Reaktion (10) hergestellt
werden, in dem die Werte von n und m bei den Ausgangsverbindungen
der allgemeinen Formel (I) und (XXV)
variiert werden. In den Fällen, bei denen Oligodeoxynucleotide
der allgemeinen Formel (XXIV) mit relativ langen
Ketten gewünscht werden, kann die Oligodeoxynucleotid
bildende Reaktion (10) bewirkt werden, in dem man sie
durch Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel
(XXXIV) anstelle der der allgemeinen Formel (XXV) ändert.
wobei R2, R7, B1, B2, B3 und B4 die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen und n′ und m′ jeweils eine positive ganze Zahl sind.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (XXXIV) können leicht
erhalten werden aus den Verbindungen der allgemeinen Formel
(XXIV), die gemäß Reaktionsgleichung (10) durch selektive
Entfernung der Hydroxyschutzgruppe R1 der Verbindungen (XXIV)
in an sich bekannter Weise erhältlich sind, hergestellt werden.
So sind in den Fällen, in denen die Gruppe R1 eine Triarylmethylgruppe
wie Dimethoxytrityl oder Monomethoxytrityl
ist, häufig eine Protonensäure wie Benzosulfonsäure, Dichloressigsäure
und/oder Trichloressigsäure und eine Lewissäure
wie Zinkbromid geeignet.
Wird die Verbindung (XXXIV) wie zuvor beschrieben in
Flüssigphase hergestellt, kann die Verbindung im allgemeinen
isoliert und beispielsweise durch Silicagel-Chromatographie
vor der Verwendung in einer derart modifizierten Reaktion
(10) gereinigt werden. Andererseits, wenn die Verbindung
(XXXIV), wie zuvor beschrieben, in einer Festkörperphase
hergestellt wird, ist es unmöglich, die Verbindung zu isolieren
und zu reinigen. In einem solchen Fall muß Vorsorge
für eine freie Hydroxylgruppe in der 5′-Position der Verbindung
(XXV) getroffen werden, die in der Festphase unumgesetzt
bleibt. Es ist deshalb nötig, vor Entfernung der
R1 Gruppe der Verbindung (XXIV) zur Verbindung (XXXIV) in
geeigneter Weise die 5′-OH-Gruppe der Verbindung (XXV) geschützt
werden. Diese Schutzreaktion kann im Grunde eine
solche sein, bei der eine stabile chemische Bindung zwischen
der 5′-OH-Gruppe der Verbindung (XXV) hergestellt wird.
Meistens kann eine Veresterung unter Verwendung von Essigsäureanhydrid-Base
(Pyridin oder eine Kombination von 2,6-Dimethylpyridin
und 4-Dimethylaminopyridin) durchgeführt
werden.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Figuren näher
erläutert.
Die Fig. 1, 2, 3 und 4 sind Eluierungskurven des
endgeschützten Produkts der gewünschten Endverbindungen,
Oligodeoxynucleotide, die erfindungsgemäß gemäß den Beispielen
19, 20, 21 und 22 hergestellt wurden. In diesen
Figuren ist dT Thymidin, d(TpT) ist Thymidindimer, d(CpT)
ist das Dimere von Deoxycytidin-thymidin, dApT ist das
Dimere von Deoxyadenosin-thymidin und d(Tp)8T ist das
Thymidinnonamer.
Desweiteren wird die Erfindung anhand der folgenden
Beispiele näher erläutert, wobei die Beispiele 1 bis 9
die Herstellung von Deoxynucleosidophosphorsulfiden der
allgemeinen Formel (I), wenn n = 0 ist, das heißt, gemäß
der allgemeinen Formel (IA) beschrieben; die Beispiele 10
bis 13 zeigen die Herstellung von Deoxynucleotido-phosphorsulfiden
der allgemeinen Formel (I), wobei n = 1, das
heißt gemäß der allgemeinen Formel (IB); und die Beispiele
14 bis 22 beschreiben die Herstellung von Oligodeoxynucleotiden
der allgemeinen Formel (XXIV). Darüber hinaus wird
die Herstellung von 1,2,4-Triazolylphosphinverbindungen der
allgemeinen Formel (XXVI) als Vergleichsbeispiele 1 bis 5
und die Herstellung von Trialkylstannylazolverbindungen
der allgemeinen Formel (XXVII) als Vergleichsbeispiele 6
bis 8 beschrieben.
In den Beispielen und Vergleichsbeispielen werden die
folgenden Abkürzungen benutzt:
Et:Äthylgruppe; n-Pr: n-Propylgruppe;
i-Pr: i-Propylgruppe; n-Bu: n-Butylgruppe
Bz:Benzoylgruppe
MMTr:Monomethoxytritylgruppe
DMTr:Dimethoxytritylgruppe
TBDMS:t-Butyldimethylsilylgruppe
T:Thyminrest
Eine Lösung von 2-Chlorphenyloxy-2-methylphenylthio-
1,2,4-triazolylphosphin(VII) in Deuterochloroform (1 ml),
das gemäß Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurde, wurde
langsam zu einer Suspension von 5′-O-Dimethoxytritylthymidin
(VI) (0,163 g, 0,3 mmol) in Deuterochloroform (0,5 ml) bei
0°C zugegeben. Nach der Zugabe wurde die Temperatur der gebildeten
Mischung zurück auf Zimmertemperatur gebracht und
1 1/2 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Rf-Werte und
1HNMR-Spektrum dieser Lösung wurden wie folgt vermessen:
Rf(CHCl3: MeOH = 80:1) = 0.30
1HNMR (CDCl3, TMS)δ; 1.46 (s, 3H, 5-CH 3), 2.20- 2.85 (m, 5H, with a singlet at 2.28 and 2.38 ppm, 2′ and CH 3C6H4S-), 3.35-3.65 (m, 2H, 5′), 3.69 (s, 3H, CH 3OC6H4-), 3.70 (s, 3H, CH 3OC6H4-), 4.25-4.50 (m, 1H, 4′), 5.45- 5.80 (m, 1H, 3′), 6.49 (t, 1H, J = 7.0 Hz, 1′), 6.65- 6.90 (m, 4H, ph), 6.90-7.75 (m, 18H, ph and 6), 8.16 (s, 2H, HNC2 H 2N2), 10.3 (s, 1H, NH), 12.8 (s, 1H, HNC2H2N2) ppm.
1HNMR (CDCl3, TMS)δ; 1.46 (s, 3H, 5-CH 3), 2.20- 2.85 (m, 5H, with a singlet at 2.28 and 2.38 ppm, 2′ and CH 3C6H4S-), 3.35-3.65 (m, 2H, 5′), 3.69 (s, 3H, CH 3OC6H4-), 3.70 (s, 3H, CH 3OC6H4-), 4.25-4.50 (m, 1H, 4′), 5.45- 5.80 (m, 1H, 3′), 6.49 (t, 1H, J = 7.0 Hz, 1′), 6.65- 6.90 (m, 4H, ph), 6.90-7.75 (m, 18H, ph and 6), 8.16 (s, 2H, HNC2 H 2N2), 10.3 (s, 1H, NH), 12.8 (s, 1H, HNC2H2N2) ppm.
Dann wurde dieser Lösung Chloroform (50 ml) zugesetzt;
die Chloroformlösung wurde mit einer gesättigten wässrigen
Natriumchloridlösung gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet. Das meiste des Chloroforms wurde
unter Vakuum abdestilliert; der Rückstand (etwa 2 ml) wurde
tropfenweise zu gerührtem n-Pentan (200 ml) bei 0°C zugegeben;
es ergab eine sofortige Ausfällung eines weißen Pulvers. Nach
30-minütigem fortgesetzten Rühren unter diesen Bedingungen
wurde das Pulver durch Filtrieren gewonnen und 8 Stunden im
Vakuum bei Zimmertemperatur getrocknet; es wurde die erwünschte
Verbindung (I) erhalten (0,235 g; Ausbeute 95%).
Rf(CHCl3: MeOH = 80 : 1) = 0,30.
Rf(CHCl3: MeOH = 80 : 1) = 0,30.
Verschiedene Deoxynucleoside (VI) und 1,2,4-Triazolylphosphinverbindungen
(VII) gemäß Tabelle 1 wurden in Deutochloroform
in solchen molaren Verhältnissen und über so
lange Reaktionszeit umgesetzt, wie es in Tabelle 1 angegeben
wird, und zwar in gleicher Weise als im Beispiel 1;
die gebildete Reaktionsmischung wurde gemäß Beispiel 1
nachbehandelt, so daß sich verschiedene Deoxynucleosidphosphorsulfidverbindungen
(I) gemäß Tabelle 1 erhalten wurden.
Zu einer Lösung von p-2-Chlorphenyl-5′-O-dimethoxytritylthymidyl-
(3′→5′)-thymidin(VI) 0,480 g; 0,5 mmol)
in Chloroform (1,5 ml) wurden bei 0°C eine Chloroformlösung
(1 ml) 2-Chlorphenyloxy-2-methylphenylthio-1,2,4-triazolylphosphin
(VII) zugesetzt, das durch Umsetzung von 2-Chlorphenyloxy-
2-methylphenylthio-chlorphosphin(0,222 g; 0,7 mmol)
mit Trimethylsilyl-1,2,4-triazol (0,104 g; 0,735 mmol) gemäß
Vergleichsbeispiel 1 hergestellt wurde. Die gebildete
Mischung wurde auf Zimmertemperatur gebracht und eine Stunde
bei dieser Temperatur gerührt; durch Dünnschichtchromatographie
(TLC) der Reaktionslösung wurde sichergestellt, daß
der Fleck der Ausgangsverbindung (VI) (Rf = 0,29;
CHCl3 : MeOH = 20 : 1) verschwunden war. Dann wurden 100 ml Chloroform
der Reaktionslösung zugesetzt; die abgetrennte Chloroformschicht
wurde mit einer gesättigten wässrigen Natriumchloridlösung
(50 ml × 3) gewaschen und dann über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet. Das meiste des Chloroforms
wurde unter Vakuum abdestilliert; der Rückstand (etwa
2 ml) wurde tropfenweise zu gerührtem n-Pentan (300 ml) bei
0°C zugesetzt; ein weißes Pulver schied sich umgehend ab.
Nach 30-minütigen fortgesetztem Rühren wurde das Pulver
durch Filtrieren gewonnen und unter Vakuum bei Zimmertemperatur
über 8 Stunden getrocknet; hierdurch wurde die gewünschte
Verbindung (1,054 g; Ausbeute 85%) erhalten.
Rf (CHCl3 : MeOH = 20 : 1) = 0,56
1HNMR (CDCl3, TMS) δ; 1.35 (s, 3H, 5-CH 3), 1.84 (s, 3H, 5-CH 3), 1.90-2.85 (m, 7H, with a singlet at 2.34, o-CH 3C6H4S- and 2 × 2′), 2.85-3.65 (m, 2H, 5′), 3.73 (s. 6H, 2 × CH 3OC6H4-), 3.95-4.70 (m, 4H, 2 × 4′ and 5′), 5.05-5.65 (m, 2H, 2 × 3′), 6.05-6.55 (m, 2H, 2 × 1′), 6.60-6.85 (m, 4H, ph), 6.85-7.60 (m, 23H, ph and 2 × 6), 9.28 (s, 1H, NH), 9.36 (s, 1H, NH) ppm.
1HNMR (CDCl3, TMS) δ; 1.35 (s, 3H, 5-CH 3), 1.84 (s, 3H, 5-CH 3), 1.90-2.85 (m, 7H, with a singlet at 2.34, o-CH 3C6H4S- and 2 × 2′), 2.85-3.65 (m, 2H, 5′), 3.73 (s. 6H, 2 × CH 3OC6H4-), 3.95-4.70 (m, 4H, 2 × 4′ and 5′), 5.05-5.65 (m, 2H, 2 × 3′), 6.05-6.55 (m, 2H, 2 × 1′), 6.60-6.85 (m, 4H, ph), 6.85-7.60 (m, 23H, ph and 2 × 6), 9.28 (s, 1H, NH), 9.36 (s, 1H, NH) ppm.
Gemäß Tabelle 2-A wurden verschiedene Dideoxynucleotide
(VI) mit 2-Chlorphenyloxy-2-methylphenylthio-1,2,4-triazolylphosphin
(VII) in Chloroform in molaren Verhältnissen
und mit Reaktionsdauer gemäß Tabelle 2-A umgesetzt; die
gebildete Reaktionsmischung wurde gemäß Beispiel 10 aufgearbeitet,
wobei verschiedene Deoxynucleotidphosphorsulfidverbindungen
(I) gemäß Tabelle 2-B erhalten.
5′-O-Dimethoxytritylthymidin-3′-O-(2-chlorphenyloxy-2-
methylphenylthio)phosphin (I) (5,78 g; 7 mmol), Triäthylstannyl-
1,2,4-triazol(XXVI) (4,11 g; 12 mmol) und 1,2-Dichloräthan
(50 ml) wurden nach und nach zu 3′-O-Benzoylthymidin
(XXV) (1,73 g; 5 mmol) zugegeben. Unmittelbar darauf
wurde Pyridin (4,0 ml; 50 mmol) zugegeben; die gebildete
Mischung wurde 5 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt.
Dann wurde eine Lösung von Jod (6,35 g, 25 mmol) in einer
Mischung von Tetrahydrofuran (100 ml), Pyridin (5,5 ml) und
Wasser (5,5 ml) zur gerührten Mischung zugegeben; Bei
Zimmertemperatur wurde eine Minute weitergerührt. Die Reaktionsmischung
wurde mit gesättigter wässriger Natriumhydrogencarbonatlösung
50 ml × 3) gewaschen und über wasserfreiem
Magnesiumsulfat getrocknet. Nach dem Filtrieren wurde das
Filtrat unter Vakuum konzentriert und der Rückstand unter
Verwendung einer Mischung von Chloroform-Methanol (10 : 1)
als Eluierungsmittel über eine Silicagelsäule gegeben. Das
Eluat wurde zum Trocknen eingeengt; es ergab sich ein geschäumter
fester Rückstand, der dann im Vakuum getrocknet
wurde und die gewünschte Titelverbindung ergab (4,84 g;
Ausbeute 91%).
Rf(CHCl3 : MeOH = 10 : 1) = 0.57
1HNMR (CDCl3, TMS); δ 1.40 (s, 3H, 5-CH 3), 1.82 (s, 3H, 5-CH 3), 2.10-2.90 (m, 4H, 2 × 2′), 3.10-3.65 (m, 2H, 5′), 3.66 (s. 6H, 2 × CH 3O-), 4.05-4.70 (m, 4H, 2 × 4′ and 5′), 5.20-5.60 (m, 2H, 2 × 3′), 6.38 (t, 2H, J = 7.0 Hz, 2 × 1′), 6.60-6.90 (m, 4H, ph), 6.90-8.00 (m, 20H, 2 × 6 and ph) and 9.88 (s, 2H, NH) ppm.
1HNMR (CDCl3, TMS); δ 1.40 (s, 3H, 5-CH 3), 1.82 (s, 3H, 5-CH 3), 2.10-2.90 (m, 4H, 2 × 2′), 3.10-3.65 (m, 2H, 5′), 3.66 (s. 6H, 2 × CH 3O-), 4.05-4.70 (m, 4H, 2 × 4′ and 5′), 5.20-5.60 (m, 2H, 2 × 3′), 6.38 (t, 2H, J = 7.0 Hz, 2 × 1′), 6.60-6.90 (m, 4H, ph), 6.90-8.00 (m, 20H, 2 × 6 and ph) and 9.88 (s, 2H, NH) ppm.
In jeden dieser Beispiele wurde das Verfahren gemäß
Beispiel 14 mit dem Unterschied wiederholt, daß Deoxynucleosid-
oder Deoxynucleotidphosphorsulfidverbindung
(I), Trialkylstannylazolverbindung (XXVI), Base (XXVII)
und Deoxynucleosidverbindung (XXV) gemäß Tabelle 3-A verwendet.
Die Ergebnisse werden in der Tabelle 3-B wiedergegeben.
Die folgenden Beispiele 19 bis 22 sind Beispiele zur
Herstellung von verschiedenen Oligodeoxynucleotiden auf
Polystyrol als Polymerträger .
Eine Lösung von Triäthylstanylimidazol (XXVI) (10 mg;
36 µmol) und Diisopropylamin (XXVII) (3,64 mg, 36 µmol) in
1,2-Dichloräthan (0,2 ml) wurden zu Thymidin, gebunden an
Polystyrolharz (XXV) (10 mg; 1,2 µmol) zugegeben. Letzeres
wurde hergestellt durch Umsetzung von 5′-O-Dimethoxytritylthymidin
an Polystyrol () (einem handelsüblichen Produkt,
versehen mit 120 µmol Thymidin je Gramm Harz) mit einer
5%igen Trichloressigsäurelösung in 1,2-Dichloräthan. Unmittelbar
darauf wurden zur gebildeten Mischung eine Lösung
von 5′-O-Dimethoxytritylthymidin-3′-O-(2-chlorphenyloxy-2-
methylphenylthio)phosphin (I) (20 mg; 24 µmol) in 1,2-Dichloräthan
(0,15 ml) zugesetzt.
Die Reaktionsmischung wurde bei Zimmertemperatur vier Minuten
geschüttelt, dann durch ein G4-Glasfilter zur Entfernung
von 1,2-Dichloroethan und den Überschußmengen
der Verbindungen (I), (XXVI) und (XXVII) filtriert. Das
verbleibende Polystyrolharz wurde mit Methanol (3 ml) und
Pyridin (3 ml) gewaschen; dann wurde Jod (30 mg, 120 µ mol)
in einer Mischung von Tetrahydrofuran/Pyridine/Wasser
(0,45 ml/0,025 ml/0,025 ml) zugegeben und die gebildete
Mischung zwei Minuten zur Erzeugung der Oxidationsreaktion
geschüttelt. Also zwei Minuten mal Raumtemperatur. Nach
dem Filtrieren durch ein G-4 Glasfilter zur Entfernung
von Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser mit dem enthaltenen
Überschußjod wurde das verbleibende Polystyrolharz mit
Pyridin (5 ml × 2) und dann mit 1,2-Dichloroethan (5 ml)
gewaschen. Eine geringe Menge des Harzes wurde dem Tritylcationentest
unterworfen (ein Test zur Bestimmung der Absorbtion
bei 498 nm; Einzelheiten dieses Versuchs werden
beispielsweise in H. G. Gassen et al., "Chemical and
Enzymatic Synthesis of Gene Fragments" veröffentlicht
durch Verlag Chemie (Weinheim), 1982 mit Zitaten) wodurch
der Umsatz mit 98% bestimmt wurde. Diese Ausbeute wurde
bestätigt durch Entfernung der Schutzgruppen des Produkts
durch die nachfolgend beschriebene Methode und durch Analyse
des entschützten Produkts durch Hochdruckflüssigchromatographie
(HPLC). Demnach wurde zu dem haltenden
Harz eine Lösung von Syn-4-Nitrobenzaldoxim (50 mg,
300 µ mol) und 1,1,3,3-Tetramethylguanidin (34,5 mg,
300 µ mol) in einer Mischung von p-Dioxan (0,3 ml) und
Wasser (0,3 ml) zugegeben; die gebildete Mischung wurde
10 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Dann wurde die
Reaktionsmischung filtriert und das Filtrat konzentriert.
Zu dem Rückstand wurde eine 80%ige wässrige Essigsäure
(1,5 ml) zugesetzt; die Mischung wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur
belassen.
Die verbleibende Essigsäure und Wasser wurde unter
Vakuum abdestilliert; Wasser (1 ml) und Ethyläther (5 ml)
wurden zu dem Rückstand zum Extrahieren des entschützten
Produkts in die wässrige Phase zugesetzt. Die wässrige
Phase wurde mit Ethyläther (5 ml × 4) gewaschen und dann
mittels HPLC analysiert. Hierbei zeigte sich die Bildung
von Thymidindimären (dTpT) und Thymidin (dT) in Anteilen
von etwa 98 : 2 gemäß Fig. 1. Das Ergebnis gemäß Fig. 1
und die gemäß den Fig. 2 bis 4, die im folgenden erklärt
werden, wurden erhalten, indem eine Säule UNISIL
PACK (Type 5C18-250A von Gaschro Industry Co., Japan) erhalten,
wobei das Eloieren durch Gradienteluierung mit
5-25% Konzentrationen von Acetonitril in 0,1 M Triethylammoniumacetat
bei einem pH-Wert gleich 7 durchgeführt
wurde.
Eine Lösung von tri-n- Butylstannyl-1-2,4-Triazol
(XXVI) (34,4 mg; 96 µ mol) und 2-Methylimidazol (XXVII)
(9,85 mg; 120 µ mol) in 1,2-Dichloroethan (0,20 ml) wurde
zu ein Polystyrolharz gebundenes Thymidin (XXV) (10 mg;
1,2 µ mol) zugegeben, daß gemäß Beispiel 18 hergestellt
wurde. Unmittelbar darauf wurde zu der gebildeten Mischung
eine Lösung von N4-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityldeoxycytidin-3′-O-
(2- chlorphenyloxy-2-methylphenylthio) Phosphin
(I) (22 mg; 24 µ mol) in 1,2-Dichloroethan (0,15 ml)
zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 4 Minuten bei Zimmertemperatur
geschüttelt und dann durch ein G-4 Glasfilter
zur Entfernung von 1,2-Dichloroethan und den Überschußmengen
der Verbindungen (I), (XXVI) und (XXVII) filtriert.
Das verbleibende Polystyrolharz wurde mit Methanol
(3 ml) und Pyridin (3 ml) gewaschen; dann wurde Jod (30 mg,
120 µ mol) in einer Mischung von Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser
(0,45 ml/0,025 mol/0,025 ml) zugesetzt, die gebildete
Mischung wurde 2 Minuten bei Zimmertemperatur
geschüttelt. Nach Filtrieren durch ein G-4 Glasfilter
zur Entfernung der Mischung von Tetrahydrofuran/Pyridin/Wasser
mit Gehalt an überschüssigem Jod wurde das verbleibende
Polystyrolharz mit Pyridin (5 ml × 2) und dann
mit 1,2-Dichloroethan (5 ml) gewaschen. Ein kleiner Teil
des Harzes wurde dem Tritylcationentest gemäß Beispel 18
unterzogen. Hierbei zeigt es sich, daß die Ausbeute
der beschriebenen Reaktion 98% betrug. Diese Ausbeute
wurde bestätigt durch die Entfernung der Schutzgruppen
auf dem Produkt gemäß der nachfolgend beschriebenen Methoden
und durch Analyse des entschützten Produkts mittels
Hochdruckflüssigchromatography (HPLC). Demnach wurde
zu der erhaltenen Harzmasse eine Lösung von syn-4-Nitrobenzaldoxim
(50 mg; 300 µ mol) und 1,1,3,3-Tetramethylguanidin
(34,5 mg; 300 µ mol) in einer Mischung
von p-Dioxan (0,3 ml) und Wasser (0,3 ml) zugesetzt; die
gebildete Mischung wurde für 10 Stunden zur Weiterführung
der Reaktion bei Zimmertemperatur belassen. Dann
wurde 28%iges wässriges Ammoniak (1 ml) der Mischung
zugesetzt; die Reaktion wurde über 5 Stunden bei 60°C
durchgeführt. Die gebildete Reaktionsmischung wurde filtriert
und das Filtrat konzentriert. Es wurde eine 80%ige
wässrige Essigsäure (1,5 ml) dem Rückstand zugesetzt und
die Mischung 30 Minuten zur Fortführung der Reaktion bei
Zimmertemperatur belassen. Die verbleibende Essigsäure
und Wasser wurden unter Vakuum abdestilliert und Wasser
(1 ml) und Ethyläther (5 ml) zu dem Rückstand zum Extrahieren
des entschützten Produkts in die wässrige Phase
zugesetzt. Die wässrige Lösung wurde mit Ethyläther
(5 ml × 4) gewaschen und dann mittels HPLC analysiert,
wobei sich zeigte, daß das Dimer von Deoxycytidin und
Thymidin (d(CpT), (XXIV′)) und Thymidin (dT) in ungefähren
Anteilen von 98 : 2 gemäß Fig. 2 gebildet wurde.
An Polystyrol gebundenes Thymidin P (XXV) (10 mg;
1,2 µ mol), tri-n-Butylstannylbenzotriazol (XXVI) (39 mg;
96 µ mol), 1- Methylimidazol (XXVII) (9,85 mg; 120 µ mol)
und N6-Benzoyl-5′-O-dimethoxytrityldeoxyadenosin-3′-O-(2-
chlorphenyloxy-2-methylphenylthio) Phosphin (I) (23 mg;
24 µ mol) wurden gemäß Beispiel 20 umgesetzt. Die nachfolgende
Oxidation und die Entfernung der Schutzgruppe
erfolgt ebenfalls gemäß Beispiel 20. Die Ergebnisse des
Tritylcationentests und der HPLC Analyse, die gemäß Beispiel 19
durchgeführt wurden, ergab eine Ausbeute von
99%; der Gehalt an Dimären von Deoxyadenosin und Thymidin
betrug 99% im entschützten Produkt (siehe Fig. 3).
Thymidin an Polystyrol (XXV, wobei m = 0)
(10 mg; 1,2 µ mol), tri-n-Propylstannylbenzotriazol
(XXVI) (35 mg; 96 µ mol), 1-Methylimidazole (XXVII)
(9,85 mg; 120 µ mol) und 5′-O-Dimethoxytritylthymidin-3′-O-(2-
chlorphenyloxy-2-methylphenylthio) phosphin (I)
(20 mg; 24 µ mol) wurden gemäß Beispiel 19 umgesetzt.
Die nachfolgende Oxidation mit einer Mischung von Tetrahydrofuran/
Pyridin/Wasser (0,45 ml/0,025 ml/0,025 ml)
mit Gehalt an Jod (30 mg; 120 µ mol) wurde gemäß Beispiel 19
durchgeführt. Die flüssige Mischung mit überschüssigem
Jod wurde durch ein G-4 Glasfilter filtriert;
das verbleibende Polystyrolharz wurde mit Pyridin (5 ml × 2)
gewaschen. Dann wurde eine Mischung von Essigsäureanhydrid
(0,18 ml) und Pyridin (1,2 ml) mit Gehalt an
4-Dimethylaminopyridin (12,2 mg; 100 µ mol) dem Polystyrol
zugegeben; die Mischung wurde 2 Minuten bei Zimmertemperatur
geschüttelt, umd die Schutzreaktion auf der
5′-OH-Gruppe zu bewirken. Der Überschuß der flüssigen Mischung
wurde durch Filtern entfernt; das verbleibende
Harz wurde mit 1,2-Dichloroethan (5 ml) gewaschen. Dann
wurde ein 5%ige Trichloressigsäure (2 ml) in 1,2-Dichloroethan
zu dem Harz zugegeben; die Mischung wurde eine
Minute bei Zimmertemperatur geschüttelt, um die 5′-Dimethoxytritylgruppe
zu entfernen. Der Überschuß an verwendetem
Reagenz wurde durch Filtern durch einen G-4 Glasfilter
entfernt; das verbleibende Harz wurde mit Pyridin
(5 ml) und dann mit 1,2-Dichloroethan (5 ml) gewaschen.
Zu diesem Harz (XXV, wobei m = 1) wurden die Verbindungen
(I), (XXVI) und (XXVII) alle in gleichen Mengen wie im
ersten Teil dieses Beispiels zugesetzt, so daß in gleicher
Weise die vermischte Kupplungsreaktion erfolgte. Die nachfolgende
Oxidation und die Schutzreaktion wurden ebenfalls
in beschriebener Weise durchgeführt. Das gebildete Harz
wurde mit 1,2-Dichloroethan (5 ml) gewaschen, worauf die
Dimethoxytritylschutzgruppe mit einer 5%igen Trichloressigsäure
in 1,2-Dichloroethan entfernt, wobei das Thymidintrimäre
auf Polystyrolharz gemäß Formel (XXV, wobei
m = 2) erhalten wurde. Diese Operation wurde weitere fünf
Male durchgeführt (d. h. bis m = 7 in (XXV) war), um das
Thymidinoctamer zu erhalten.
Das Thymidinoctamer auf Polystyrolharz wurde als
Ausgangsverbindung (XXV) für die beabsichtigte Kupplungsreaktion
unter Verwendung von (I), (XXVI) und (XXVII)
alle in den gleichen jeweiligen Mengen wie zuvor verwendet;
die nachfolgende Oxidationsreaktion wurde unter Verwendung
von Jod in ebenfalls den beschriebenen Mengen
durchgeführt. Das gebildete Harz wurde mit Pyridin (5 ml × 2)
und dann mit 1,2-Dichloroethan (5 ml) gewaschen und
dem Tritylcationentest gemäß Beispiel 19 unterworfen, der
ergab, daß die Gesamtausbeute von Verbindung (XXIV) wobei
m = 7 ist, 85% betrug. Dann wurde die Entfernung der
Schutzgruppen gemäß Beispiel 19 unter Verwendung einer
Mischung von p-Dioxan (0,9 ml) und Wasser (0,9 ml) mit
Gehalt an syn-4-Nitrobenzaldoxim (150 mg; 900 µ mol) und
1,1,3,3-Tetramethylguanidin (103,5 mg; 900 µ mol) und
einer 80%igen wässrigen Essigsäure (2 ml) bewirkt. Die
HPLC Analyse des Rohprodukts bestätigte die Anwesenheit
des Thymidinnonameren (siehe Fig. 4).
Eine Toluollösung (3 ml) mit Gehalt an Trimethylsilyl-
1,2,4-Triazol (XIV) (0,046 g; 0,33 mmol) wurden zu
einer Toluollösung (2 ml) mit Gehalt an 2-Chlorphenyloxy-
2-methylphenylthiochlorphosphin(XIII) (0,095 g; 0,3 mmol)
bei 0°C zugesetzt; die Mischung wurde 10 Minuten bei Zimmertemperatur
gerührt. Dann wurde eine niedrig siedende
Fraktion bei -78°C unter vermindertem Druck in der Kühlfalle
gewonnen und ergab die Titelverbindung (VII) als
Rückstand. Die auf diese Weise gewonnene niedrig siedende
Fraktion wurde fraktionierter Destillation unterworfen
und ergab Trimethylchlorsilan. Das Ergebnis wird in Tabelle 4
wiedergegeben.
Die Verfahrensweise gemäß Vergleichsbeispiel 1 wurde
jeweils in den Vergleichsbeispielen 2 bis 5 mit dem Unterschied
wiederholt, daß andere Chlorphosphinverbindungen
(XIII) verwendet wurden. Die Art der Ausgangsverbindungen
und die erhaltenen Ergebnisse gemäß Vergleichsbeispielen
werden ebenfalls in Tabelle 4 wiedergegeben.
o-Toluolthiol (XVI) (0,621 g; 5 mmol) wurden bei
0°C zu einer Lösung in Chloroform (25 ml) von 2-Propenyloxybis(1,2,4-
triazolyl)phosphin (XV) (1,21 g; 5 mmol)
zugesetzt, das hergestellt wurde durch Umsetzung von 2-
Propenyloxydichlorophosphinmit Trimethylsilyl-1,2,4-
trizol in ansich bekannter Weise. Die gebildete Mischung
wurde 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt und dann
30 Minuten bei 0°C belassen, wobei das gebildete 1H-1,2,4-Triazol
sich als sich in Form von weißen Kristlalen abschiebt.
Die Kristalle wurden abfiltriert und das Filtrat
unter Vakuum zur Gewinnung des gewünschten Produktes (VII)
als Rückstand konzentriert. Das 1HNMR Spektrum des Produkts
bestätigte die Struktur 2-Propenyloxy-2-methylphenylthio-
1,2,4-triazolylphosphin(VII). Ausbeute: 1,33 g; entsprechend
95%.
1HNMR (CDCl3, TMS) δ : 2.43 (s, 3H, o-CH 3C6H4S-),
4.30-4.95 (m, 2H, CH2 = CH-CH 2O-), 5.05-5.45
(m, 2H, CH 2 = CH-CH2O-), 5.60-6.05 (m, 1H, CH2 =
CH - CH2O-), 6.95-7.55 (m, 4H, o-CH3C6 H 4S-),
8.18 (s, 1H, 1,2,4-Triazolyl, 3-Position), 8.46
(s, 1H, 1,2,4-Triazolyl, 5-Position) ppm.
Das in Form von weißen Kristallen gewonnen 1H-1,2,4-Triazol
wog 0,321 g (Ausbeute 93%), Schmelzpunkt 119-120°C.
1HNMR ((CD3)2SO, TMS) δ; 8.26 (s, 2H, 3- and 5-Positions), 13.5 (s, 1H, 1-Position) ppm.
1HNMR ((CD3)2SO, TMS) δ; 8.26 (s, 2H, 3- and 5-Positions), 13.5 (s, 1H, 1-Position) ppm.
Das Verfahren gemäß Vergleichsbeispiel 4 wurde mit
dem Unterschied wiederholt, daß als Ausgangsverbindungen
β-Cyanoäthoxybis(1,2,4-Triazolyl) Phosphin (XV) (1,186 g;
5 mmol) und o-Toluolthiol (XVI) verwendet wurden. Die Verbindung
(XV) wurde in ansich bekannter Weise durch Umsetzung
von β-Cyanoäthoxydichlorophosphin mit Trimethylsilyl-
1,2,4-Triazol hergestellt. Das gewünschte Produkt, β-
Cyanoäthoxy-2-methylphenylthio-1,2,4-triazolylphosphin
(VII) wurde in Mengen von 1,39 g (Ausbeute 95%) gewonnen.
1HNMR (CDCl3, TMS) δ; 2.45 (s, 3H, 0-CH 3C6H4S-),
2.64 (t, J = 6.0 Hz, 2H, NCCH 2CH2O-), 3.90-4.75 (m,
2H, NCCH2CH 2O-), 6.90-7.60 (m, 4H, o-CH3C6 H 4S-),
8.18 (s, 1H, 1,2,4-Triazolyl, 3-Position), 8.48
(s, 1H, 1,2,4-Triazolyl, 5-Position) ppm.
Triethyl(t-Butoxy)Stannane (XXIV) 0,098 g; 0,35 mmol)
wurden bei Zimmertemperatur zu einer Suspension
von 1H-1,2,4-Triazol (XXX) (0,024 g; 0,35 mmol) in Deuterochloroform
(3,5 ml) zugesetzt; die Mischung wurde 5 Minuten
bei dieser Temperatur gerührt. Das 1HNMR Spektrum zeigte
quanitative Bildung von Tri-äthylstannyl-1,2,4-Triazol
(XXVI) und t-Butanol.
1HNMR (CDCl3, TMS) δ; 0,40-2,10 (m, mit einem Singlet
bei 1,26 ppm, 24H,m (C2 H 5)3Sn und (CH 3)3C), 3,52
(s, 1H, Me3COH), 7,96 (s, 2H, 1,2,4-Triazolyl, 3-
und 5-Positionen) ppm.
Die Zugabe von Aceton (20 ml) zu dieser Lösung
führte zur Abscheidung von Triethylstannyl-1,2,4-triazol
(XXVI) in Form weißer Kristalle (0,095 g; Ausbeute 99%.)
Tri-t-Butyl(t-butoxy)stannan (XXIV) (0,127 g; 0,35 mmol)
wurden bei Zimmertemperatur zu einer Suspension von 1H-1,2,4-Triazol
(XXX) (0,024 g; 0,35 mmol) in Deuterochloroform
(3,5 ml) zugegeben; die Mischung wurde 5 Minuten bei
dieser Temperatur gerührt. Die Destillation unter Vakuum
der Reaktionsmischung zur Entfernung des Chloroforms und
des t-Butanol ergab t-n-Butylstannyl-1,2,4-triazol (XXVI)
als weißen festen Rückstand (0,125 g; Ausbeute 100%).
1HNMR (CDC13, TMS) δ; 0,55-2,05 (m, 27H, (C4 H 9)3Sn),
7,78 (s, 2H, 1,2,4-Triazolyl, 3- und 5-Positionen)
ppm.
Triethyl(t-butoxy)stannan (XXIV) (0,098 g; 0,35 mmol)
wurde bei Zimmertemperatur zu einer Suspension von Imidazol
(XXX) (0,024 g; 0,35 mmol) in Chloroform (0,5 ml) zugegeben;
die Mischung wurde 5 Minuten bei dieser Temperatur
gerührt. Dann wurde der Reaktionsmischung Ethyläther
(10 ml) zugesetzt, wodurch eine sofortige Abscheidung
weißer Kristalle erfolgte, die als Triethylstannylimidazol
(XXVI) (0,095 g; Ausbeute 99%) identifiziert wurden.
1HNMR (CDC13, TMS) δ; 0,60-2,10 (m, 15H,
(C2 H 5)3Sn), 6,70-7,00 (m, 2H, Imidazolyl, 4-
und 5 Positionen), 7,20-7,40 (m, 1H, Imidazolyl,
2-Position) ppm.
Claims (13)
1. Phosphorsulfidderivat eines Deoxynucleosids oder
Deoxynucleotids der allgemeinen Formel (I):
wobei R1 eine Hydroxyschutzgruppe, R2 eine Phosphatschutzgruppe,
R3 eine Arylgruppe, B1 und B2 gleich oder verschieden
und jeweils ein Basenrest sind, der eine Schutzgruppe
aufweisen kann; und n ist null oder eine positive ganze
Zahl, vorausgesetzt, daß, wenn n 2 oder größer ist, das
jeweilige B2 gleich oder verschieden sein kann.
2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei n null ist, nämlich
ein Deoxynucleosidphosphorsulfid der allgemeinen Formel
(IA):
wobei R1, R2, R3 und B1 die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen.
3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei n gleich 1 ist,
nämlich ein Dideoxynucleotidphosphorsulfid der allgemeinen
Formel (IB):
wobei R1, R2, R3, B1 und B2 die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen.
4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
R1 eine Triarylmethyl-, Pixyl-, Alkoxycarbonyl-, Aryloxycarbonyl-,
Arylthioalkyloxycarbonyl- oder Trialkylsilylgruppe
ist.
5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
R2 eine Alkyl-, Allyl-, Cyanalkyl-, Halogenalkyl, Arylsulfonylalkyl-,
Aryl- oder Halogenarylgruppe ist, wobei der
Alkylbestandteil bis zu 5 Kohlenstoffatome aufweist.
6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
R3 eine Phenyl-, 2-Methylphenyl-, 4-Methylphenyl-, 2,4-Dimethylphenyl-,
2,6-Dimethylphenyl-, 2,4,6-Trimethylphenyl-,
2-Chlorphenyl-, 4-Chlorphenyl-, 3,4-Dichlorphenyl- oder
eine α-Naphthylgruppe ist.
7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei
B1 und B2 jeweils Thyminreste, ggf. in der 3-Stellung geschützt,
Cytosinrest, ggf. an der 4-Aminogruppe geschützt,
Adeninrest, ggf. an der 6-Aminogruppe geschützt, oder Guaninrest,
ggf. an der 1-Amido-, 2-Amino- und/oder 6-Ketogruppe
geschützt.
8. Verbindung nach Anspruch 7, wobei die ggf. vorhandenen
Schutzgruppen Triarylmethyl-, Trialkylsilylalkyl-,
Arylthioalkyl-, Phthaloyl-, Aryloxycarbonyl-, Alkoxycarbonyl-,
Dialkylcarbamoyl-, Diarylcarbamoyl-, Arylcarbonyl-,
Alkylcarbonyl- und/oder 1,2-Dialkylcarbonyloxyäthylengruppen
sind.
9. Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, nämlich
5′-O-Dimethyloxytritylthymidin -3′-O-(2-chlorphenyloxy- 2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(methoxy-2- methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthiymidin -3′-O-(2-chlorphenyloxy-2,6- dimethylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2′-deoxycytidin -3′-O-(2- chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N6-phthaloyl-2′-deoxyadenosin -3′-O-(2- chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Methoxytrityl-O-6-diphenylcarbamoyl-N2-propionyl-2′- deoxyguanosin -3′-O-(2-chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(allyloxy-2-methylphenylthio)phosphin; und
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-cyanoethyloxy-2-methylphenylthio) phosphin.
5′-O-Dimethyloxytritylthymidin -3′-O-(2-chlorphenyloxy- 2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(methoxy-2- methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthiymidin -3′-O-(2-chlorphenyloxy-2,6- dimethylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N4-benzoyl-2′-deoxycytidin -3′-O-(2- chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytrityl-N6-phthaloyl-2′-deoxyadenosin -3′-O-(2- chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Methoxytrityl-O-6-diphenylcarbamoyl-N2-propionyl-2′- deoxyguanosin -3′-O-(2-chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphin;
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(allyloxy-2-methylphenylthio)phosphin; und
5′-O-Dimethoxytritylthymidin -3′-O-(2-cyanoethyloxy-2-methylphenylthio) phosphin.
10. Verbindung nach Anspruch 1 oder 3, nämlich:
P-2-Chlorphenyl -5′-O-dimethoxytritylthymidyl- 3′-O-[(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorphenyl -5′-O-dimethoxytrityl-N4-benzoyl- 2-deoxycytidyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorphenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyl- 2′-deoxyadenyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio) phosphino]-(3′→5′)thymidin; und
P-2-Chlorphenyl -5′-O-methoxytrityl-N2-i-butyryl- 2-deoxyguanosinyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy -2- methylphenylthio)phosphino]-(3′→5′)thymidin.
P-2-Chlorphenyl -5′-O-dimethoxytritylthymidyl- 3′-O-[(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorphenyl -5′-O-dimethoxytrityl-N4-benzoyl- 2-deoxycytidyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy -2-methylphenylthio)phosphino]- (3′→5′)thymidin;
P-2-Chlorphenyl-5′-O-dimethoxytrityl-N6-benzoyl- 2′-deoxyadenyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy-2-methylphenylthio) phosphino]-(3′→5′)thymidin; und
P-2-Chlorphenyl -5′-O-methoxytrityl-N2-i-butyryl- 2-deoxyguanosinyl-3′-O-[(2-chlorphenyloxy -2- methylphenylthio)phosphino]-(3′→5′)thymidin.
11. Verfahren zur Herstellung von Deoxynucleotiden
oder Oligodeoxynucleotiden der allgemeinen Formel (XXIV):
wobei R1 eine Hydroxyschutzgruppe, R2 eine Phosphatschutzgruppe,
R7 eine Hydroxyschutzgruppe ist, die einen Polymerträger
enthalten kann; wobei B1, B2, B3 und B4 gleich oder
verschieden und jeweils ein Basenrest ist, der eine Schutzgruppe
aufweisen kann; wobei n null oder eine positive ganze
Zahl und m null oder eine positive ganze Zahl sind, vorausgesetzt,
daß, wenn n und/oder m 2 oder größer ist, jeweils
B2 und/oder B4 gleich oder verschieden sein können,
wobei ein Phosphorsulfidderivat eines Deoxynucleosids oder
Deoxynucleotids der allgemeinen Formel (I):
wobei R1, R2, B1 und B2 und n die vorgegebene Bedeutung
besitzen und R3 eine Arylgruppe ist, mit einer Deoxynucleosid-
oder Deoxynucleotidverbindung der allgemeinen Formel
(XXV) umgesetzt wird:
wobei R2, R7, B3, B4 und m die zuvor gegebene Bedeutung
besitzen, wobei in Gegenwart einer Trialkylstannylazolverbindung
der allgemeinen Formel (XXVI) und einer Base der
allgemeinen Formel (XXVII):
gearbeitet wird, wobei R8 eine Alkylgruppe, R9 Wasserstoff
oder eine Alkyl- oder Arylgruppe, R10 eine Alkylgruppe sind,
oder beide R10-Gruppen zusammen mit dem benachbarten Stickstoffatom
eine heterocyklische Gruppe bilden, die ein oder
zwei zusätzliche Heteroatome, wie Stickstoff, Sauerstoff
und/oder Schwefel enthält, bilden, und X eine Azolylgruppe
ist; worauf das gebildete Reaktionsprodukt oxidiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Ausgangsverbindung
der allgemeinen Formel (I) ein Deoxynucleosidphosphorsulfid
der allgemeinen Formel (IA) ist:
wodurch die Verbindung der allgemeinen Formel (XXIV), bei
der n gleich null ist, gebildet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Ausgangsverbindung
der allgemeinen Formel (I) ein Dideoxynucleotidphosphorsulfid
der allgemeinen Formel (IB) ist:
wobei die Verbindung der allgemeinen Formel (XXIV), in der
n gleich 1 ist, gebildet wird.
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Also Published As
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