DE2041735A1

DE2041735A1 - Thio-pyrimidin-derivate

Info

Publication number: DE2041735A1
Application number: DE19702041735
Authority: DE
Inventors: Peter Dipl-Chem Dr Faerber; Karl-Heinz Dipl-Chem Dr Scheit
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 1970-08-22
Filing date: 1970-08-22
Publication date: 1972-02-24
Also published as: FR2103444B1; GB1348289A; BR7105458D0; YU211971A; US3804826A; NL7111262A; ZA715545B; BE771513A; ES394422A1; DK560675A; CA980277A; SE380273B; CH583747A5; RO62392A; RO68894A; IL37472A0; HU165094B; AT323902B; AU456788B2; CS167941B2

Description

Merck Patent Gesellschaft mit beschränkter Haftung Darmstadt

19, August 1970

Thio-pyrimidin-derivate

Die Erfindung betrifft neue Thio-pyrimidin-derivate der allgemeinen Formel I

H0-/P0(0H)-07 -CII

OR OH

worin

-PO(OH)-O-CH₂

I II

/K

b- oh

H,

B den Rest einer Pyrimidin-

oder Purinbase, X S oder NH,
m eine ganze Zahl zwischen

1 und 3,
η eine ganze Zahl zwischen

0 und 2000
bedeutet,

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" ²" ?0Λ1735

worin aber die Summe (m + n) mindestens gleich 2 sein muß und im gleichen Molekül verschiedene Reste B vorkommen können,

sowie deren Metall- und Ammoniumsalze und die Disulfide dieser Verbindungen.

Es wurde gefunden, daß die oben bezeichneten Substanzen in lebenden (menschlichen oder tierischen) Zellen sowohl in vitro als auch in vivo die Bildung von Interferonen auslosen.

Dementsprechend sind sie geeignet, sowohl menschliche und tierische Zellen in vitro als auch Menschen und Tiere vor Infektionen durch Viren und andere intrazellulär sich vermehrende Krankheitserreger (z.B. Erreger der Malaria, der Toxoplasmose, des Trachoms) zu schützen. Die Verbindungen sind ferner geeignet, das Wachstum maligner Zellen in vitro und in vivo zu hemmen und im Organismus bösartige Tumoren und Leukämien am Fortschreiten zu hindern bzw. zum Verschwinden zu bringen, wobei neben der Interferoninduktion andere, bisher noch ungeklärte Mechanismen (z.B. Steigerung der immunologischen Abwehr) eine Rolle spielen können.

Die Verbindungen können daher als Arzneimittel in der Humanit nd Veterinärmedizin verwendet werden. Ferner können sie als Zwischenprodukte zur Herstellung weiterer Arzneimittel verwendet werden. Beispielsweise ist es möglich, Polynucleotide der Formel I durch Entschwefelung in andere bekannte Polynucleotide umzuwandeln, die selbst eine interferon-stimulierende Wirkung zeigen. Ferner kann man mit sich selbst nicht hybridisierende Polynucleotide der Formel I mit anderen, z.B. bekannten, Polynucleotiden hybridisieren.

BAD ORIGINAL

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Gegenstand der Erfindung sind Thio-pyrimidin-Derivate der oben bezeichneten Formel I sowie solche der bevorzugten Formeln Ia bis Id, die der Formel I entsprechen, worin

¹I

jedoch

a) m 1 und η 1 bis 2000 bedeuten;

b) B 2,4-Dithiouracilyl-, 2-Thiocytosyl- oder Adenylylreste bedeutet;

c) B einen 2,4-Dithio-uracilylrest und X S bedeutet;

d) B einen 2-Thiocytosylrest und X NH bedeutet;

sowie deren Metall- und Ammoniumsalze und die Disulfide dieser Verbindungen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung von Thio-pyrimidinderivaten der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 2,4-Dithiouridin-mono-phosphat bzw. 2-Thio-cytidin-monophosphat bzw. eine Vorbindung der Formel I (m - 1) mit einem anorganischen Ortho- bzw. Pyrophosphat umsetzt, wobei einer der Ausgangsstoffe in aktivierter Form vorliegen muß, oder daß man eine sonst der Formel I entsprechende Verbindung, worin jedoch an Stelle der Gruppe XH ein durch dieselbe ersetzbarer Rest steht, mit einer Verbindung der Formel H₂X behandelt, oder daß man in einer, sonst der Formel I entsprechenden Verbindung, worin jedoch mindestens eine funktioneile Gruppe in funktionell abgewandelter Form vorliegt, diese funktioneile Gruppe durch Behandeln mit einem solvolysierenden oder reduzierenden Mittel in Freiheit setzt, und daß man gegebenenfalls auf ein so erhaltenes Thio-pyrimidinderivat ein polymerisierendes Enzym, gegebenenfalls in Gegenwart eines weiteren Nucleotids, einwirken läßt und/oder eine Verbindung der Formel I mit oxydierenden Mitteln behandelt und/oder eine in einer Verbindung derFormel I vorhandene SH-Gruppe, gegebenenfalls mehrstufig, durch Behandeln mit einem ammonolysierenden Mittel in eine NHg-Gruppe überführt.

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B bedeutet bevorzugt 2,4-Dithiouracilyl oder 2-Thiocytosyl, ferner den Rest einer in den natürlichen Nucleosiden vorkommenden Base, z.B. den Rest des Adenine, Guanins, Cytosins, Uracils, Thymins, Xanthins, Hypoxanthins, aber auch den Rost des 5-Fluor-uracils, 5-Methyl-cytosins oder 5-Hydroxymethylcytosins, weiterhin den Rest eines anderen Thioderivats einer dieser Basen, z.B. den Rest des 2-Thiouracils, 4-Thiouracils, 2-Thiothymins, 2,4-Dithiothymins,

Als Salze der Verbindungen der Formel I sind bevorzugt die physiologisch unbedenklichen Alkalimetall- (z.B. Natrium-, Kalium-), Erdalkalimetall- (z.B. Calcium-, Magnesium-), Schwermetall- (z.B. Mangan-) und gegebenenfalls substituierten Ammoniumsalze (z.B. Triäthyl-, Monoäthanol-, Diäthanoi«-, Triäthanol-, Tri-n-butyl-ammoniumsalze),

Die Monophosphate des 2,4-Dithio-uridins bzw. des 2-Thiocytidins I, m = 1, η = O) sind bekannt. Die Umsetzung dieser Substanzen bzw. diejenige einer Verbindung der Formel I (m = 1) mit einem anorganischen Ortho- bzw. Pyrophosphat (z.B. mit Trialkylammonium-pliosphaten bzw. -pyrophosphaten) führt zu den entsprechenden Di- bzw. Triphosphaten (I, m = 2 bzw. 3). Einer der Ausgangsstoffe muß dabei in aktivierter Form vorliegen, z.B. a'ls Imidazolidat (erhältlich durch Reaktion mit Carbonyldiimidazol, z.B. in Dimethylformamid (DMF) bei Temperaturen zwischen O und 50°, zweckmäßig 20 und 40°), Morpholidat (erhältlich durch Reaktion mit Morpholin und einem Kondensationsmittel wie Dicyclohexyl-carbodiimid (DCC) oder einem Arylsulfonylchlorid) Anilid (erhältlich durch Reaktion mit Anilin und einem Kondensationsmittel wie DCC oder einem Arylsulfonylchlorid) oder als aktivierter Ester, z.B. als p-Nitrophenylester (erhältlich durch Reaktion mit p-Nitrophenol und einem Kondensationsmittel wie DCC oder einem Arylsulfonylchlorid) oder als 2-Pyridylester

BAD ORIGINAL

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(erhältlich durch Reaktion mit 2-IIydi*oxypyridin und einem Kondensationsmittel oder durch Reaktion mit Bis-2-pyridylcarbonat). Die Umsetzung erfolgt zweckmäßig in einem inerten Lösungsmittel wie DMF, Dimothylsulfoxid (DMSO), Pyridin, Acetonitril oder tert.-Butanol bei Temperaturen zwischen 10 und 100 , zweckmäßig bei Raumtemperatur, Die Reaktionszeiten liegen in der Regel zwischen 1 und 48 Stunden. Die Aufarbeitung muß schonend erfolgen, um solvolytische Zersetzungen zu vermeiden. Man bedient sich daher im allgemeinen chromatographischex* Methoden (z.B. an Diäthylaminoäthyl-Cellulose (DEAE-Cellulose)). Gewünschtonfalls kanu man die erhaltenen Produkte durch Um- g Setzung mit Basen oder Salzen, z.B. Natriumperchlorat in Aceton, in ihre Metall- bzw. Ammoniumsalze überführen.

Es ist ferner möglich, eine sonst der Formel I entsprechende Verbindung, worin jedoch an Stelle der Gruppe XH ein durch diese Gruppe ersetzbarer Rest steht, durch Behandeln mit Ammoniak oder Schwefelwasserstoff in eine Verbindung der Formel I zu überführen.

Durch die Gruppe XII ersetzbare Reste sind solche, die in einer nucleophilen Reaktion gute "leaving group"-Eigenschaften besitzen, z.B. niedere Alkylmercapto-reste wie Methyl-, Aethy1-, n-Propyl-, Benzylmercapto; SuIfonsäurereste und deren Salze, wie -SOoNa; Λ Sulfonsäure-alkyl- und -arylester-reste; Halogenreste wie Chlor oder Brom. Bei der Reaktion verwendet man zweckmäßig ein inertes Lösungsmittel wie einen niederen Alkohol, z.B. Methanol, Aethanol oder Isopropanol, bei Temperaturen zwischen 0 und 40 , zweckmäßig bei Raumtemperatur. Die Umsetzung mit HqS wird vorteilhaft in Gegenwart eines basischen Katalysators, z.B. Triäthylamin, Tri-n-butylamin, Tetraäthylammoniumhydroxid, vorgenommen.

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Vorbindungen der Formel I sind ferner erhältlich, indem man in einer sonst der Formel I entsprechenden Verbindung, worin jedoch mindestens eine funktioneile Gruppe (z.B. OH, SII oder NH₀) in funktionell abgewandelter Form vorliegt (z.B. als

Ester, Aether, Acetal, Orthoester, Thioester, Amid) diese funktioneile Gruppe durch Behandeln mit einem solvolysierenden (vorzugsweise hydrolysierenden) Mittel in Freiheit setzt. Im einzelnen seien als funktionell abgewandelte OH-Gruppen beispielsweise genannt: Acyloxy mit vorzugsweise bis zu 8 C-Atomen, wie Formyloxy, Acetoxy, Propionyloxy, Butyryloxy, Isobutyryloxy oder Benzoyloxy, ferner Benzyloxy oder Triphenylmethoxy; als funktionell abgewandelte SH-Gruppen: Acy!mercapto mit vorzugsweise bis zu 8 C-Atomen, wie Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Isobutyryl- oder Benzoylmercapto; als funktionell abgewandelte NTU-Gruppen: Acylamido mit vorzugsweise bis zu 8 C-Atomen, wie Acetamido, Propionamido, Benzamido. Weiterhin können benachbarte OH-Gruppen in acetalartiger, ketalartiger oder orthoesterartiger Form funktionell abgewandelt sein, z.B. als gegebenenfalls substituierte Benzylidendioxy-, Isopropylidendioxy- oder .Alkoxymethylendioxy-, z.B. Aethoxymethylendioxy-reste.

Eine solvolytische Spaltung funktionell abgewandelter Gruppen erfolgt zweckmäßig in alkalischem oder schwach saurem Medium, da im stärker sauren Reaktionsmedium die C-N-Bindung zv;ischen dem Zucker und dem Basenrest angegriffen werden kann. Man verwendet daher vorzugsweise Alkalimetall-, (z.B. Natrium- oder Kalium-) oder Erdalkalimetall- (z.B. Calcium- oder Barium-) -hydroxide, -carbonate oder -bicarbonate oder quartäre Ammoniumhydroxide, oder wässerige Essigsäure, wobei man in der Regel in einem Temperaturbereich zwischen -10 und + 100 , insbesondere bei Raumtemperatur arbeitet. Eine Solvolyse mit sehr verdünnter (z.B. 0,01 M) Salzsäure oder mit 1 %iger Trifluoressxgsäure in einem inerten Lösungsmittel bei niedrigen Temperaturen (z.B. -10 bis +10, vorzugsweise 0°) ist ebenfalls möglich. Die Solvolyse wird in der Regel in wässerigem Medium

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durchgeführt, wobei man, falls erwünscht, zur wässerigen Losung auch noch ein oder mehrere inerte organische Lösungsmittel zusetzen kann. Als solche seien genannt: Alkohole, z.B. Methanol, Ae.thanol oder Isopropanol, Ketone, z.B. Aceton oder Butanon, Amine, z.B. Pyridin oder Triäthylamin, Amide, z.B. DMF, Sulfoxide, z.B. DMSO.

Reduzierbare funktionell abgewandelte Gruppen, z.B. Benzyloxy-, Triphenylmethoxy-, Nitro- oder Azido-reste, können auch durch Behandeln mit reduzierenden Mitteln in freie OH- oder NIU-Grup-

pen umgewandelt werden. So lassen sich z.B. Nitro- oder ™

Azido-reste mit Zinkstaub in wässeriger, vorzugsweise 80 %iger Essigsäure bei Temperaturen zwischen 0 und 40, vorzugsweise 15 und 30° zu Aminogruppen reduzieren.

Gegebenenfalls können erfindungsgemäß erhältlicte Thio-pyrimidin-derivate, insbesondere die Mononucleotide I ( m <=■ 2 oder 3, η = 0), durch Einwirkung polymerisierender Enzyme polymerisiert werden.Im Normalfall,,wenn man dabei kein weiteres Nucleotid zusetzt, erhält man dabei Oligo- bzw. Polynucleotide der Formel I (n >1), in denen nur gleiche Reste B = 2,4-Dithiouracilyl (Formel Ic) oder 2-Thio-cytosyl (Formel Id) vorkommen.

Setzt man zur Polymerisation ein weiteres Nucleotid zu (z.B. Adenosindi- oder -triphosphat, Uridindi- oder-triphosphat, Cytidindi- oder -triphosphat, Guanosindi- oder -triphosphat, Inosindi- oder -triphosphat, Thymidindi- oder -triphosphat, Xanthosindi- oder -triphosphat), so kann dieses mit in das Polynucleotid eingebaut werden. In diesem Fall erhält man Oligo- bzw. Polynucleotide I, in denen im gledchn Molekül verschiedene Reste B vorkommen (z.B. 2,4-Dithio-uracilyl und Adenylyl). Geeignete Enzyme für die enzymatische Synthese solcher Polynucleotide, insbesondere für die Polymerisation

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der Mo no nucleotide I ( m - 2, η =» O), sind die Polynucleotidphosphorylasen E.C.2.7.7.8 (z.B. aus Escherichia coli).

Erfolgt die enzymatische Polymerisation der Mononucleotide I (m = 2 oder 3, η - 0) durch matrizenabhängige Polymerasen, so wird die Zusammensetzung und Sequenz der Polynucleotide durch diejenige der Matrize bestimmt. Bei Verwendung von PoIydesoxyribo-adenylyl-thymidin als Matrize erhält man z.B. Oligo- bzw. Polynucleotide I, in denen im gleichen Molekül in alternierender Sequenz die Reste B « 2,4-Dithiouracilyl und Adenylyl vorkommen. Geeignete Enzyme für die Synthese derartiger Polynucleotide sind die RNA-Polymerasen E.C.2.7.7.6 (z.B. aus Escherichia coli), insbesondere für die Polymerisation der Mononucleotide I (m =· 3, η = 0).

Die Enzyme können auch in Form von Rohextrakten verwendet werden. Es ist zweckmäßig, zur Vermeidung der Disulfid-Bildung bei der Polymerisation einen Inhibitor, z.B. Dithiothreitol oder Dithioerythritol (threo- oder erythro-2,3-Dihydroxy-butan-l,4-dithiol; "Clelands Reagens")oder 2-Mercaptoäthanol zuzusetzen. Man polymerisiert in der Regel in wässerigem Medium bei pH-Werten zwischen 5,5 und 9,5, vorzugsweise zwischen 8 und 9,bei Temperaturen zwischen 0 und 80°, vorzugsweise zwischen 20 und 45°_f insbesondere bei ca. 37 , wobei man zweckmäßig Puffersubstanzen zusetzt, z.B. Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan ("Tris"), Ammoniumcarbonat oder Natrium-cacodylat. Ferner ist es günstig, bei der Polymerisation anorganische Salze zuzusetzen, z.B. Magnesiumchlorid, Mangan(II)-chlorid oder Calciumchlorid. Die Polymerisation ist in der Regel nach 1-72 Stunden beendet.

Die erhaltenen Polymerisate können Mehrfachstränge, z.B. Doppelstränge (Doppelhelices) bilden, Z.B. bildet Poly-2,4-dithiouridylsäure (I, X = S, B = 2,4-Dithiouracilyl, η ■=» ca. 1000) mit sich selbst eine stabile Doppelhelix,

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Mono-, Oligo- oder Polynucleotide der Formel I (X = S) können mit Oxydationsmitteln wie Jod (vorzugsweise in wässerigen Phosphatpuffer-Lösungen bei pH-Werten zwischen 5 und 9, insbesondere um 7 - 7,5, und bei Temperaturen zwischen -10 und +40 , insbesondere zwischen 0 und 10 ) zu den entsprechenden Disulfiden oxydiert werden. Bei den Oligo- und Polynucleotiden kann die Oxydation so geleitet werden, daß nicht alle, sondern nur einige der im Molekül vorhandenen SII-Gruppen oxydiert werden. Die Bildung von -S-S-Brücken innerhalb eines Doppelstranges hat möglicherweise einen stabilisierenden Effekt, z.B. gegen Nucleasen.

Weiterhin ist es möglich, eine in einer Verbindung der Formel I vorhandene SH-Gruppe in eine NI^-Gruppe zu überführen. Das kann beispielsweise durch Behandeln der Trialkylammoniumsalze von I (X =» S) mit gasförmigem Ammoniak in Lösungsmitteln wie Alkoholen, DMF oder DMSO bei 50 -100 erfolgen. Vorteilhafter ist eine mehrstufige Ammonolyse, bei der man die Verbindung I (X « S) zunächst durch Umsetzung mit Luft oder Sauerstoff in Gegenwart von Natriumsulfit/Natriumbisulfit in wässeriger Lösung, vorzugsweise bei pH ca. 7, bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 40°, vorzugsweise bei Raumtemperatur, und bei Reaktionszeiten von ca. 0,5 bis 8 Stunden in das entsprechende SuIfonat (entsprechend I, S0,,Na an Stelle von XII) umwandelt. Behandeln desselben mit Ammoniumsalzen, z.B. mit NH₄Cl, in wässeriger Lösung bei pH-Worten zwischen etwa 7 und 10, vorzugsweise bei pH ca. 8,5, und bei Temperaturen zwischen etwa 0 und 40°, vorzugsweise '
Aminoverbindungen I (X = NH).

etwa 0 und 40°, vorzugsweise bei Raumtemperatur, liefert die

Die neuen Verbindungen können im Gemisch mit festen, flüssigen und/oder halbflüssigen Arzneimittelträgern als Arzneimittel in der Human- oder Veterinärmedizin verwendet werden. Als Trägersubstanzen kommen solche organischen oder

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anorganischen Stoffe in Frage, die für die parenterale, enterale oder topikale Applikation geeignet sind und die mit den neuen Verbindungen nicht in Reaktion treten, wie beispielsweise Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Polyäthylenglykole, Gelatine, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline, Cholesterin. Zur parenteralen Applikation dienen insbesondere Lösungen, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen, sowie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate. Für die enterale Applikation eignen sich Tabletten, Dragees, Kapseln, Sirupe, Säfte oder Suppositorien, für die topikale Anwendung Salben, Cremes oder Puder. Die angegeboien Zubereitungen können gegebenenfalls sterilisiert oder mit Hilfsstoffen, wie Gleit-, Konservierungs-, Stabilisierungs- oder Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Puffersubstanzen, Färb-, Geschmacks- und/oder Aromastoffen versetzt werden.

Die Substanzen werden vorzugsweise in einer Dosierung von 0,1 bis 100 mg pro Dosierungseinheit verabreicht.

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-U-

In den nachstehenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsius-Graden angegeben. "Phosphatanalyse" = Verhältnis Nucleosid: Phosphat , bestimmt nach Can. J. Biochem.Physiol., Band 41, Seite 469 (1963). Die S_0n -Werte werden erhalten durch Sedimentationsgcschwindigkeits-Analyse mit einer analytischen Ultrazentrifuge.

Beispiel 1

a) 1 mMol Bis~triäthylammonium-2,4-dithiouridin-5'-phosphat in 10 ml DMF wird mit 2 mMol Carbonyldiimidazol bei Temperaturen zwischen 20 und 40° zum Imidazolidat umgesetzt. Nach 20 Minuten gibt man 5 mMol Tris-(tri-n-butylammonium)-phosphat in 5 ml DMSO zu und läßt über Nacht stehen. Die Lösungsmittel werden unter vermindertem Druck teilweise entfernt und der Rückstand mit 800 ml Wasser versetzt. Man gibt die wässerige Lösung auf eine DEAE-Cellulose-Säule (50 χ 2,5 cm),eluiert mit einem linearen Gradienten an Triäthylammoniumhydrogencarbonat von 0-0,5 M, vereinigt die Fi'aktionen, die das 2,4-Dithiouridin-5'-diphosphat enthalten, und dampft bei 15° unter vermindertem Druck zur Trockne ein. Man nimmt den Rückstand in wenig Methanol auf, gibt 2 Aequivalente Natriumperchlorat in wenig Aceton hinzu und fällt durch Zugabe von Aceton. Nach Abzentrifugieren und mehrmaligem Waschen mit Aceton trocknet man das erhaltene amorphe Dinatriumsalz des 2,4-Dithiouridin-5'-diphosphats bei 15 Torr. UV-Spektrum (in Wasser, pH 5,5): 2SO und 340 nm. Phosphatanalyse 1 : 2,2.

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Verwendet man als Ausgangsmaterial Bis-triäthylammonitim-2-thio-cytidin-5'-phosphat, so erhält man analog das Dinatriumsalz des 2-Thio-cytidin-5'-diphosphats. UV-Spektrum (in Wasser, pH 7,O):A_max 247, Schulter bei 272 nm, Λ _24?/' 1,23. Phosphatanalyse 1:1,90.

Analog erhält man mit Tetrakis-(tri-n-butylammonium)-pyrophosphat das Trinatriumsalz des 2,4-Dithio-uridin-5'-triphosphats (UV-Spektrum in Wasser, pH 5,5:Λ _max 280 und 340 nm; A₂₈₀ZAo₄₀=³ 1,85; Phosphatanalyse 1:2,90) bzw. das Trinatrium— salz des 2-Thio-cytidin-5'-triphosphats. (UV-Spektrum in Wasser, pH ⁷>0'-^_mViX 247, Schulter bei 272 nm; ^47/^72 ⁼ ^l>³⁰> Phosphatanalyse 1:2,95).

b) 4 ml eines wässerigen Gemischs (pH 8,3), enthaltend 0,4 mMol Tris.HCl-Puffer, 0,008 mMol MgCl₃, 0,04 mMol Dinatriumsalz des 2,4-Dithiouridin-5'-diphosphats, 0,04 mMol Dithiothreitol und 10 Enzymeinheiten Polynucleotidphosphoryläse (spezifische Aktivität 0,165 mMol UDP/Stunde χ mg Protein bei 37°) wird 4 Stunden bei 37° inkubiert. Das Protein wii'd danach durch wiederholte Extraktion mit Chloroform-Isoamylalkohol (25:2, Volumenteile) entfernt. Die wässerige Phase wird bei 15 auf ein Volumen von ca. 1,5 ml eingeengt und in einer Dialysekammer 48 Stunden bei 3° gegen 0,01 M Tris«HCl (pH 7,0) dialysiert. Der Puffer wird 4mal gewechselt. Man erhält Poly-2,4-dithio-uridin-5'-phosphat (Poly-2,4-dithio-uridylsäure, Poly S²S⁴U). S_{20 w}-Wert: 12 S. UV-Spektrum (in Wasser, pH 7): ^Amax ²⁷° ^{nm (£}p " ³⁵⁰⁰⁾; ^A28O^/A34O ~ ⁵'⁴> PK-*ert: *>* (durch spektrophotometrische Titration ermittelt). Im UV-Spektrum in 0,05 M Natriumcacodylat (pH 7,0) zeigt sich ein Helix-Coil-Uebergang mit einem T_m~Wert von 81°.

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Analog erhält man aus dem Dinatriumsalz des 2-Thiocytidin-5*-diphosphats das Poly-2-thio-cytidin-5'-phosphat (Poly-2-thiocytidylsäure, Poly s C). S₃₀ -Wert: 5 S. UV-Spektrum

(Wasser,pH 7,0):A _ 244, Schulter bei 270 nm; A_o../A_o„ 1,25.

c) 2,5 ml eines Inkubationsgemisches enthaltend 0,003 rllol Adenosintriphosphat, 0,003 mMol Trinatriumsalz des 2,4-Dithio-uridin-5'-triphosphats, 0,003 mMol Dithiothreitol, 0,075 mMol MgCl₂, 0,6 A₂₍,₀-Einheiten (ca. 0,0001 mMol) Poly-desoxy-ribo-adenylylthymidin und 3G0 Enzymeinheiten ΠΝΑ-Polymerase (definiert nach "Procedures in Nucleic Acid Research", G.L. Cantoni and D.R. Davies, Ed. Harper and Row, New York and London, 1966, Band I, Seite 323) wird 6 Stunden bei 37° inkubiert, danach mit 0, 7 ml 4 %iger Natriumdodecylsulfat-Lösung verdünnt und das Protein durch wiederholte Extraktion mit Chloroform-Isoamylalkohol (5:2) entfernt. Die wässerige Phase wird bei 15 auf ca. 1 ml ein-» geengt und in einer Dialyse-Kammer 48 Stunden bei 3° gegen eine 0,01 molare Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) dialysiert. Danach enthält die Kammer Poly-ribo-adenylyl-2,4-dithiouridylsäure /Poly r(A-s²s⁴U27. S₂₀ -Wert: 12 S. UV-Spektrum (in Wasser, pH 7,0):A_max ²⁸° ^und 340 nm, A_28Q/A - 1,90. Im UV-Spektrüm läßt sich zwischen 0 und 100 kein thermischer Uebergang von der Helix- in die Coil-Form nachweisen. Das Polynucleotid liegt daher wahrscheinlich in der Coil-Form vor.

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d) 0,001 mMol (21 A^-Einheiten) Poly S²S⁴U in 1 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pll 7,4) wird bei 3° mit 0,001 mMol J₂ (0,01 ml einer 0,1 η wässerigen J„-Lösung) versetzt. Nach 2 Stunden bei 3 wird die Reaktionslösung in einer Dialysekammer 15 Stunden bei 3° gegen 0,05 M Tris.IICl (pH 7,0) dialysiert. Man erhält das Disulfid von Poly S²S⁴U. S_{2Q w}-Wert: 17 S. UV-Spektrum (in Wasser, pH 5,5):λ _Μαν 288 nm (έ - 30000)

nie* λ ρ

und 340 nm (6 = 2800).

Analog erhält man aus Poly r (A-s s U) das entsprechende Disulfid. S₂₀ .,-Wert: 16 S. UV-Spektrum (in Wasser, pH 5,5):

λ ^_n 288 nm (g - 15000) und 340 nm (g - 1400). max ρ ρ

e) Zu 2 ml einer wässerigen Lösung von 5 mMol des Dinatriumsalzes von 2,4-Dithio-uridin-5*-diphosphat werden 0,02 ml eines 3:1 (Volumenteile)-Gemisches von 1 M Na_oS0„-Lösung und 1 M NaHSO„-Losung gegeben. Man saugt Luft durch die Reaktionslösung und gibt in Zwischenräumen von je 30 Minuten viermal je weitere 0,02 ml des Sulfit-Reagenzes zu. Der Verlauf der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt. Nach 2,5 Stunden wird die Reaktionslösung, die das Natriumsalz des 2-Tliio-uridin-4-sulfonat-5'-diphosphats enthält, mit 1 ml 0,2 M NII.Cl-Lösung (pH 8,5) versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur belassen. Man arbeitet auf und erhält das Dinatriumsalz des 2-Thio-cytidin-5'-diphosphats.

Analog erhält man aus Poly-2,4-dithio-uridin-5'-phosphat (Poly S²S⁴U) das Poly^-thio-cytidin-ö'-phosphat (Poly S²C).

Beispiel 2

Eine Lösung von 0,1 mMol Triäthylammoniumsalz des 4-Methylthio-2-thio-uridin-5^f-diphosphats (UV-Spektrum in Wasser, pH 5,5:

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λ 236 und 340 nm; A_OQJA„._n = 11; Phosphatanalyse: 1:1,95;

max ^Zöt> «J^iU

erhältlich aus dem Triäthylammoniumsalz des 4-Methylthio-2-thiouridin-5'-phosphats analog Beispiel 1) in 10 ml CHoOH und 1 ml Triethylamin wird bei Raumtemperatur mit H₃S gesättigt und 15 Stunden stehen gelassen. Danach wird die Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand in 1 ml CH₀OH gelöst und zu 10 ml einer 1 %igen Lösung von NaClO₄ in Aceton gegeben. Das ausgefallene Dinatriumsalz des 2,4-Dithio-uridin-5'-diphosphats wird abzentrifugiert und bei 15 Torr getrocknet.

Analog erhält man aus dem Triäthylammoniumsalz des 4-Methylthio- g 2-thio-uridin-5'-triphosphats das Trinatriumsalz dos 2,4-Dithiouridin-5'-tr!phosphats.

Beispiel 3

Eine Lösung von 0,1 mMol Triäthylammoniumsalz des 4-Methylthio-2-thiouridin-5'-diphosphats in 10 ml CH₃OH wird bei Raumtemperatur mit NIU gesättigt und 15 Stunden stehengelassen. Danach dampft man zur Trockne ein, löst den Rückstand in 0,5 ml CH₃OH und gibt die Lösung zu 10 ml einer 1 %igen Lösung von NaClO₄ in Aceton. Das ausgefallene Dinatriumsalz des 2-Thio-cytidin-5'-diphosphats wird abzentrifugiert und getrocknet.

Analog erhält man aus dem Triäthylammoniumsalz des 4-Methylthio-2-thio-uridin-5'-triphosphats das Trinatriumsalz des 2-Thio-cytidin-5'-triphosphats.

Beispiel 4

Zu 0,2 mMol Bis-triäthylammonium-2,4-dithiouridin-5'-phosphat in 1 ml Pyridin werden 145 mg (O, 44 mMol) Cyclohexylammonium-(2-Cyan-äthyl)-a-pyridyl-phosphat gegeben und die Mischung 3 Tage

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im Dunkeln bei 30° geschüttelt. Danach wird mit 3 ml 2n NHLOH verdünnt und zur Trockne eingeengt. Der Sirup wird bei 0° in 3 ml 2n NaOH gelöst, die Lösung 30 Minuten bei 0 gehalten, anschließend mit 3 ml Wasser verdünnt und mit saurem Ionenaustauscher neutralisiert. Der Ionenaustauscher wird abfiltriert, gründlich mit Wasser gewaschen und die wässerigen Lösungen auf ein kleines Volumen eingeengt. Die Isolierung des 2,4-Dithiouridin-5'-diphosphats erfolgt wie in Beispiel la) beschrieben.

Bei der Umsetzung von 0,2 mMol Bis-triäthylammonium-2,4-dithio-

1 2 uridin-5'-phosphat mit 0,8 mMol (0,3 g) P P -(2)-Cyanäthylpyrophosphorsäureimidazolidat (Dicyclohexylammoniumsalz) in 5 ml DMF erhält man in analoger Weise amorphes Trinatriumsalz des 2,4-Dithiouridin-5'-triphosphats.

Beispiel 5

0,5 mMol 3' ,2'-O-Diacetyl^^-dithiouridin-S'-diphosphat, Di-natriumsalz, werden in 50 ml konzentriei'tem wässerigen Ammoniak gelöst. Nach 2 Stunden bei 20° wird bei 15° unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mehrmals mit wasserfreiem Aethanol digeriert, das Aethanol abdekantiert und verworfen, der äthanolfeuchte Rückstand in Aceton suspendiert und abzentrifugiert. Das erhaltene amorphe Dinatriumsalz des 2,4-Dithiouridin-5'-diphosphats wird bei 15 Torr getrocknet.

Verwendet man als Ausgangsmaterial das Dinatriumsalz des

4
N -Acetyl-2-thiocytidin-5'-diphosphats, so erhält man analog das Dinatriumsalz des 2-Thiocytidin-5'-diphosphats.

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Beispiel 6

0,5 mMol 3',2^f-0-Aethoxymethylen-2,4-dithiouridin-5'-diphosphat, Dinatriumsalz, werden in 50 ml 80 %iger Essigsäure gelöst. Nach fünfstündigem Stehen bei 20° wird bei 25° unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 50 ml Aceton suspendiert, das amorphe Dinatriumsalz des 2,4-Dithiouridin-5^f-diphosphats abzentrifugiert und bei 15 Torr getrocknet.

Beispiel 7

1 mMol Dinatriumsalz des 4-Azido-2-thio-pyrimidyl~(l^tß_JD_:ribose)· 5'-diphosphats wird in 50 ml 80 %iger Essigsäure gelöst, 0,5g Zinkstaub zugegeben und die Suspension 2 Stunden bei 20° geschüttelt. Danach wird vom Zink abfiltriert und dis Filtrat bei 15° unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 100 ml 2η NH.OII aufgenommen und H₃S eingeleitet. Vom ausgefallenen ZnS wird abfiltriert und das Filtrat schonend zur Trockne eingedampft. Das Dinatriumsalz des 2-Thiocytidin-S'-diphosphats wird isoliert wie unter Beispiel la) beschrieben.

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Claims

Patentansprüche:

\l Thlo-pyrimidin-dorivate der allgemeinen Formel I

H0-/P0(0H)-07 -CEr

OH

worin

-PO(OH)-O-CH₂ B

O- OH

B den Rest einer Pyrimidin- oder

Purinbase,
X S oder NII,
m eine ganze Zahl zwischen 1 und

3,

η eine ganze Zahl zwischen 0 und

2000

bedeutet,

worin aber die Summe (m + n) mindestens gleich 2 sein muß und im gleichen Molekül verschiedene Reste B vorkommen können,

sowie deren Metall- und Ammoniumsalze und die Disulfide dieser Verbindungen.

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2. Thio-pyrimidin-derivate nach Anspruch 1, worin m 1 und η 1 bis 2000 bedeuten.
3. Thio-pyrimidin-derivate nach Anspruch 2, worin B 2,4-Dithio-uracilyl-, 2-Thiocytosyl- oder Adenylylreste bedeutet.
4. Thio-pyrimidin-derivate nach Anspruch 3, worin B einen 2,4-Dithio-uracilylrest und X S bedeutet.
5. Thio-pyrimidin-derivate nach Anspruch 3, worin B einen 2-Thiocytosylrest und X NH bedeutet.
6. 2,4-Dithio-uridin-5'-di-phosphat und dessen Metall- und Ammoniumsalze. λ
7. 2,4-Dithio-uridin-5'-tri-phosphat und dessen Metall- und Ammoniumsalze.
8. 2-Thio-cytidin-5'-di-phosphat und dessen Metall- und

Ammoniumsalze.
9. 2-Thio-cytidin-5'-tri-phosphat und dessen Metall- und Ammoniumsalze.
10. Poly-2,4-dithio-uridylsäure.
11. Poly-2-thiocytidylsäure.
12. Poly-adenylyl-2,4-dithio-uridylsäure.

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13. Verfahren zur Herstellung von Thio-pyrimidinderivaten der allgemeinen Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 2,4-Dithio-uridin-mono-phosphat bzw. 2-Thio-cytidin-monophosphat bzw. eine Verbindung der Formel I (m = 1) mit einem anorganischen Ortho- bzw. Pyrophosphat umsetzt, wobei einer der Ausgangsstoffe in aktivierter Form vorliegen muß, oder daß man eine sonst der Formel I entsprechende Verbindung, worin jedoch an Stelle der Gruppe XH ein durch dieselbe ersetzbarer Rest steht, mit einer Verbindung der Formel H₀X behandelt, oder daß man in einer

^m' sonst der Formel I entsprechenden Verbindung, worin jedoch mindestens eine funktioneile Gruppe in funktionell abgewandelter Form vorliegt, diese funktionelle Gruppe durch Behandeln mit einem solvolysierenden oder reduzierenden Mittel in Freiheit setzt, und daß man gegebenenfalls auf ein so erhaltenes Thio-pyrimidinderivat ein polymerisierendes Enzym, gegebenenfalls in Gegenwart eines weiteren Nucleotids, einwirken läßt und/oder eine Verbindung der Formel I mit oxydierenden Mitteln behandelt und/oder eine in einer Verbindung der Formel I vorhandene SH-Gruppe, gegebenenfalls mehrstufig durch Behandeln mit einem ammonolysierenden Mittel in eine NH_O-Gruppe überführt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Thio-cytidin- bzw. 2,4-Dithio-uridin-5'-diphosphat mit einer Polynucleotidphosphorylase, vorzugsweise einer aus E. coli erhaltenen Polynucleotidphosphorylase Nr. E.G. 2.7.7.8 behandelt.
15. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man 2-Thio-cytidin-5'-triphosphat bzw. 2,4-Dithio-uridin-5'-triphosphat mit einer RNS-Polymerase (E.C.2.7.7,6) behandelt.
16. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man auf 2,4-Dithiouridin-di- oder -triphosphat ein polymerisierendes Enzym in Gegenwart von Adenosin-di- oder -triphosphat einwirken läßt.

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17. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel I oder ein Metall- oder Ammoniumsalz derselben, gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem festen, flüssigen oder halbflüssigen Hilfs- oder Trägerstoff und gegebenenfalls zusammen mit mindestens einem weiteren Wirkstoff in eine geeignete Dosierungsform bringt.
18. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine wirksame Dosis einer Verbindung der Formel I oder eines Metallöder Ammoniumsalzes derselben neben mindestens einem festen, flüssigen oder halbflüssigen Träger- oder Zusatzstoff.
19. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend 0,1 bis 100 mg einer Verbindung der Formel I oder eines Metall- oder Ammoniumsalzes derselben neben mindestens einem festen, flüssigen oder halbflüssigen Träger- oder Zusatzstoff.
20. Verfahren zur/€rzielung einer anjfciviralenJJ£e*Kri5ng in Lebewesen-/Oadurcn gekennzeichnet! daßjpßn eine wirksame Dosis eyJfner VerbitidunGj^fer Forme!» Ijmlev e ine &f Met a H-oder/Ämmoniumsalzes derselben verdfbreicht«,

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