DE1695303A1

DE1695303A1 - Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5'-diphosphaten und -triphosphaten sowie Mono- und Oligonucleotidylnuclesid-5'-diphosphaten und triphosphaten

Info

Publication number: DE1695303A1
Application number: DE19681695303
Authority: DE
Inventors: Yasuo Fujimoto; Masayuki Teranishi
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1967-03-14
Filing date: 1968-03-14
Publication date: 1972-04-13
Also published as: GB1180304A; US3534017A

Description

. . Offen legung

P 16 95 303-0-44 22. April 1970

Kyowa Hakko Kogyo K.K.. Tokio-to. Japan Verfahren zur Herstellung von Nucleoside'-diphoaphaten und

-triphosphaten sowie Mono- und Oligonucleotidylnucleosid-

5'-d_phoaphaten und -trlphosphaten

Nuo1βoaid-5*-d.phosphate und -trlphosphate sowie Mono- und 01Igonuoleotidylnuoleosid-5*-dlphosphate und -triphosphate besitzen für die Biosynthese von NucleinsKure Bedeutung und stellen zudem Energiequellen und PhosphorsKurequellen für enzymatisch« Zellreaktionen dar. Außerdem besitzen sie Bedeutung als Heilmittel. Pyrimidinnuoleosid-5^v-dlphoephate und -triphosphate* beispielsweise UTP, CTP und TTP, vermögen Coenzyme zu bilden« die wichtige Stoffweohselprozesse katalysieren. Adenoein-5*-trtphosphat ist bei der Behandlung von Herzkrankheiten« hohem Blutdruck usw. von Bedeutung.

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Neue Unterlagen (Art. 7 § l Abs. 2 Nr. 1 Satz 3 dee Xnderunasaex ν. 4,9.

Beispiele für Verfahren zur Herstellung von Purin-, Pyrimidin-, Pyridin- oder Imidazol-nueleosid -5'-diphosphate und -triphoephate sind s

a) das Verfahren von H.Q. Khorane et.al. in J.Am.Cherr.Soc. χ6, 5517 und 5056 (195*) sowie J,Am.Chem.Soe. 80, 1141 (1958), in dem ein Purin- oder Pyrimidin-nucleosid-5^e-monophoaphat mit Orthophosphorsäure oder einen Salz davon in Gegenwart von Dicyol ohexylearbodiiirid kondensiert wird« und

b) ein Verfahren, in den» ein Purin- oder Pyrimidin-nueleosid-5⁹-monophosphoreäurean>id mit Ortho- oder Pyrophosphorsäure oder einem Salz davon in wasserfreiem Pyridin umgesetzt wird (J.Am. Chem.Soc. 83, 649 (I96I).

Das unter a) genannte Verfahren hat den Nachteil, daß neben den gewünschten Nucleoside'-diphosphaten und -triphosphaten Nebenprodukte, beispielsweise Tetraphosphate und Dinucleosidpyrophosphate gebildet werden können und daß eine große Menge Orthophosphorsäure (mindestens 10 Mol) zur Erzielung vertretbarer Ausbeuten an Trlphosphaten eingesetzt werden mu3. Außerdem sind die Ausbeuten, bezogen auf das eingesetzte Material, sehr niedrig, weil die Abtrennung und Reinigung der Produkte verhältniemäSig schwierig ist, da durch Behandln mit Aktivkohle und Eluieren mit ammoniakaliechem Xthanol die Nebenprodukte, wie anorganische Polyphosphate, sowie die überschüssige Orthophosphorsäure entfernt werden müssen.

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Bei dem unter b) genannten Verfahren 1st es schwierig, die Ausbeuten Über einen bestimmten Wert zu erhöhen, da das als Lösungsmittel verwendete Fyridin die Zersetzung der Polyphosphate katalysiert, d.h. daß beispielsweise aus 5'-Triphosphaten 5^S-Monopho8phate, 5*-Dlphosphate und DlnucIeosidpolyphosphate usw. erhalten werden (J.G.Moffat und H.Q. Khorana et.al., J.Am.Chem.Soc. 8^, 649 (1961) und J.Am.Cheir.Soc. 87 ,2257 (1965)). Nun ist zwar aus J.Am.Chem.Soc. 86, 1254 (1964) und J.Am.Chem.Soc. 8£, 2257 und 3760 (I965) bekannt« daß einige Lösungsmittel, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid, diese Zersetzung inhibieren und Ausbeuten von 81 bis 84$ an Nucleoside 5⁹-triphosphat ermöglichen, wenn man die entsprechenden Ribo- oder Desoxyribonucleo8ld-5^c-phosphorsKuremorphollde 48 bis 72 Stunden mit Tributylammonlumpyrophosphat in trockenem Dimethylsulfoxid umsetzt (Cen.J.Chem. 42, 599 (1964)). Der Nachteil der Verwendung von Dimethylsulfat id 1st jedoch, daß dieses Lösungsmittel wegen seines verhältnismlSlg hohen Schmelzpunktes nicht bei niedrigen Temperaturen eingesetzt werden kann, daß es unangenehm riecht und durch die Haut absorbiert wird. %

Gegenstand der Erfindung 1st ein Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5°-diphosphaten und -triphosphaten sowie Mono- und 01igonucleotldyl»nucleo3ld-5^s-'dlpho8phaten und -^!phosphaten, 'as dadurch gekennzeichnet 1st, da!3 man ein Nucleosid-5^e-monophoaphorsSureamld oder ein Mono- oder Oligonucleotidyl-nucleosid-ν "mo?:ophosphorsäureamid mit Ortho- bzw. Pyrophosphorsäure oder :.nuTi ^St«^ orier SaIs davon In a«genw«irt eines organischen

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- 4 ■*■■
Triesters von Phosphorsäure umsetzt.

Die erflndungegemäß verwendeten organischen Triester der Phosphorsäure können die Formel

fs

R. O - P · O

Χμ \f — tr

besitzen» worin R₁, R₂ und R, eine Alkylgruppe, beispielsweise Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Amyl- oder Hexylgruppe; eine Arylgruppe, beispielsweise eine Phenyl-, o-Toluyl- oder m-Toluylgruppe; eine Aralkylgruppe, wie beispielsweise eine Benzylgruppej oder eine Cyoloalkylgruppe, beispielsweise eine Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppe, bedeuten.

Vorteilhafterwelse werden solche Phosphorsäureester verwendet, die bei Umgebungstemperatur flüssig sind, damit die Isolierung der Produkte erleichtert wird, jedoch kann man auch gewünschten· falls solche Phosphorsäureester verwenden, die nur bei erhöhter Temperatur flüssig sind.

Die in dem erflndungsgemäSen Verfahren verwendbare Ortho- und Pyrophosphorsäure sowie deren fister und Salze können die Formeln

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O O

ι* Il I!

MO -P = O MO-P-O-P-OiL;

I Il

^0R5 ^0R5 ^0R7

II III

besitzen, worin R^, IU* Rg und R, Wasserstoff« eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe oder ein organisches oder anorganisches Kation, wie beispielsweise ein aliphatisch* aromatisch, cycloaliphatisch oder heterocyclisch substituiertes Ammonium lon, wie Trimethylammonium-, TriKthylamaonium-, TrI-propylammoniutn-, Tributylannonlun-, Triamylamtnonium-, Trihexylammonium-, Tribenzylaasnonium-, Trlphenylammonium-, Tricyclohexylammoniuai-, Pyperidinium-, Cyclohexylguanidium- oder 4-Morpholino-N,N^f-dicyolohexylcarboxyanldiniu8)lon₄ oder ein Alkaliion, wie beispielsweise Lithlua-, Natrium- oder Kaliumion, und M Wasserstoff oder ein organisches oder anorganisches Kation bedeuten«

Ee können Mono-, Di- oder Triester "von Ortho- oder Pyrophosphorsgure verwendet werdenj besonders gute Ergebnisse erzielt man bei Verwendung von Salzen organischer Amine oder von Phenyl- oder Benzylestern, die in organischen Lösungsmitteln verhKltnistnXSig leicht löslich sind.

Die in das erfindungsgemMS· Verfahren einzusetzenden Nucleosld-5^c-fflonophosphorsäureamlde und Mono- und Ollgonucleotidylnuoleosid-.5^e-monophoephorsäureamide beeitijsen die Formeln

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N-P-OC

OM

IV

HO -

O R¹

-* η

HO -

J - OCH_{2 B} 0

fl-K

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worin Rg und R_g beispielsweise Wasserstoff, eine Alkylgruppe, wie beispielsweise eine Methyl-, Äthyl-, Propyl« oder Butylgruppe, eine Cycloalkylgruppe, wie beispielsweise eine Cyclo·= hexylgruppe» eine Arylgruppe, wie beispielsweise eine Phenyl-, Toluyl- oder Naphthylgruppe, oder eine Aralky!gruppe, wie beispielsweise eine Benzylgruppe, bedeuten oder zusammen mit dem Stickstoffatom einen heterocyclischen Ring bilden, der ggfs. noch ein weiteres Heteroatom enthalten kann, wie beispielsweise eine Morpholinyl-, Thiazolyl-, Chinollnyl-, Piperidyl-, Pyridyl- oder ImidazoIy1gruppe, bedeuten; M die oben angegebene Bedeutung besitzt] η 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 1st} die Gruppen B, die gleich oder verschieden sein können, organische basische Gruppen, wie einen Purin-, Pyrlmidin-, Pyridin- oder Imidazolrest, sowie Derivate davon bedeuten und R" und R" Wasserstoff oder eine freie oder geschützte Hydroxylgruppe, beispielsweise eine 2°,3⁹-O-Alkyliden- oder 2',2'-0-Arylengruppe, wenn beide Reste R* und B" an benachbarten C-Atomen stehen, oder eine von einer niedrigmolekularen aliphatischen oder einer aromatischen Carbonsäure abgeleitete Acylojcygruppe bedeuten.

Insbesondere können die Nucleosld-5*-monophosphor8äureamic\e

und Mono- und Oligonucleotidylnucleo8id-5⁸-monophosphorsäureamide, aus denen die entsprechenden Di- oder Triphosphate hergestellt werden, die Amide der folgenden Verbindungen sein:

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Adenosin°5^f»phosphat, Guanosin=5^f-phosphat, Uridin-5'-phosphat, e-Mercaptopurin-ribonueleosid-S' -phosphat, 5-Halogenuridln»5* phosphat, Gytidin-5^f-phosphat, Nicotinamid-ribonuoleosld-5^?- phosphat, 5-Amino-4-imidazol-earboxanid-ribonuoleosld-sP-phosphat, 5~Amino«4-cyanoliHidazol-rlbonueleo8id-5·-phosphat, 2' -Desoxyadenosin-5* -phosphat, 2*-Desoxyguanosin-5' »phosphat, 2^f -Desoxy cyt idin-5' «phosphat, 2-Desoxyuridin-5 * -phosphat, 2' «1>e8oxy-5-halogenuridin-5' -phosphat, 3-Ißoadenosin-5 * -phosphat Pseudouridin-5^f -phosphat CK-Uridin-S · -phosphat), thymidyIsaures (5*«-«—£3^f) Thymidin-S*-phosphat, thymidylsaures

(5' » 3 ·) 2* ~Desoxyadenosin-5 * -phosphat ,2* »desoxycyt i-

dylsaures (5!—»3*) Thymidin-5^e-phosphat, adenylsaures (5!—*jj^f) Adenosin-5*-phosphat, adenyleaures (5^f—>3^f) Guanosin-5*-phosphat, uridylsaures (5*—^3') Adenosin-5¹-phosphat, guanylsaures (5!—^?¹) Cytidin-5'-phosphat, N-Acyladenosin-5'-phosphat, N-Acylguanosin-5¹ -phosphat, N-Acylcytidin-5'-phosphat, 6-Azauridin-5⁹-phosphat, 8-Azaguanosin-5'-phosphat, Tnymidin-5¹-phosphat, ThymidyIyI-(5*—>2')-thy~ midylyl-(5!—>3'J-thyraidin-S'-phosphat usw. sowie die durch Schützen von Kohlenhydratsauerstoffatomen erhaltenen Derivate davon.

Die für diese Umsetzung erforderlichen Amide können duroh Uasetzen eines Gemisches aus einem Nucleoside*-monophosphat oder Mono- oder Ollgonucleot idyl -nucleoside *-monophosphat und Ammoniak oder einem Amin aiit Dicyclohexylcarbodiamid gemäß

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"■· oa <*

J.Am.Chem.Soc. 8o, 5752 (1958) und J.Am« Chens»Sog. 83» 64-9 (1961) hergestellt werden.

Da jedoch die organischen PhosphorsMureamide sehr leicht mit Wasser hydrollslerbar sind, werden Reaktion*gemisch und Reaktions- ——— , ,

Ax«MrW«JI

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teilnehmer zweckmHßigerweise wasserfrei gehalten. So können die Pyrophosphate beispielsweise durch azeotropische Entfernung des Wassers mit Pyridin oder Dioxan getrocknet und das Pyridin mit Benzol entfernt werden.

Die Umsetzung kann in herkömmlicher Weise durchgeführt werden; die Reaktionsdauer beträgt in allgemeinen bei Kühlung einige Tage bis Wochen und bei Umgebungstemperatur 3 oder 4 Tage.

Das Verfahren kann jedoch gewUnsohtenfalls auch bei erhöhter Temperatur durchgeführt werden« wobei Temperaturen von 50*C und darüber angewandt werden können. Di® Reaktionsdauer bei 5O*C beträgt beispielsweise 2 bis 5 Stunden. Das Arbeiten mit einem besonderen Lösungsmittel erübrigt sich, da die organischen Triester von Phosphorsäure selbst als Lösungsmittel dienen. Man kann jedoch ein weiteres Lösungsmittel als Verdünnungsmittel zusetzen, wenn es die Umsetzung nicht wesentlich beeinträchtigt. So kann man beispielsweise Gemische eine· organischen Trieste rs der Phosphorsäure mit einem bereits früher für diese Umsetzung verwendeten Lösungsmittel, beispielsweise Acetonitril, o-' Chlorphenole Dimethylformamid, Trioresol, Diraethylsulfoxid oder Gemischen davon, verwenden.

Die Menge des in dem erfindungsgemäBen Verfahren verwendeten, organischen Trlesters der Phosphorsäure 1st nicht von ent* soheidender Bedeutung, wenngleich bei Verwendung einer zu geringen Menge Schwierigkeiten beim Rühren des Reaktionsge-

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misches auftreten können» die jedoch durch Zusatz eines Verdünnungsmittels vermindert werden können« und andererseits ein Überschuß die Wiedergewinnung des Lösungsmittels unnötig erschwert.

Die Durchführung der Reaktion Über die vollständige Umsetzung hinaus bringt keine Vorteile und kann höchstens zur Zersetzung des gewünschten Produktes führen.

Die Reaktionsprodukte sind Nueleosid-5^e-diphosphate oder -triphosphate oder Ollgonucleotidylnuoleoeid-5^e-diphosphate oder -triphosphate bzw. Ester davon» je nachdem, welche Derivate der Ortho· oder PyrophosphorsKure verwendet wurden. Von den Estern der 5*-Di- oder -triphosphate muß man natürlich die auswählen» die sich unter milden Bedingungen» beispielsweise durch Hydrolyse oder reduktive Spaltung» bei der die P-O-P-Bindung nicht aufgespalten wird» in die freien §⁸-Dl- oder 5'-Triphosphate Überführen lassen.

Da sich somit die Ester leicht in die freien 5'-Dl- oder 5'-Triphosphate überführen lassen» können für die Reste H, R^, R₅, Kj, Rq, R₉, R* und R" beliebige, die Esterspaltung nicht störende Gruppen verwendet werden.

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Die erhaltenen Produkte können auf herkömmliche Weise« bei= spielsweise über ihre unlöslichen Salze, wie beispielsweise Calcium'-, Barium- oder Quecksilber-^salze, gereinigt und anschließend entweder in die freien Säuren oder bevorzugt in die löslichen Alkalisalze, beispielsweise Lithium» oder Natrium* salze, UbergefUhrt werden.

Alternativ kann das Umsetzungsgemisch mit oder ohne Zusatz von Wasser, beispielsweise mit Aktivkohle, Ionenaustauscherharzen, Ionenaustauschercellulose oder Sephadex behandelt werden, um daran das im Umsetzungsgemisch enthaltene 5*-Diphosphat oder -triphosphat zu adsorbieren. Das Produkt kann anschließend mit einem geeigneten Lösungsmittel elulert und in ein Salz überführt werden.

Weiterhin kann man das Uinset zunge gemisch mit Äthern, halogenierten Kohlenwasserstoffen oder Ketonen usw. behandeln, wobei man Niederschläge erhält, die in Wasser gelöst werden und In der oben beschriebenen Weise auch weiterverarbeitet werden können. Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Menge an Nucleo8id=5'-diphosphat oder -triphosphat oder Mono- oder Oligenucleotidylnucleo»id-5⁹~di- oder -triphosphat in dem Umsetzungsgemisch so hoch sein, daß nan beispielsweise mit den verhältnismäßig einfachen Methoden der Adsorption und Elution zu den hochreinen S'-Diphosphaten oder -triphosphaten gelangen kann.

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Das Verfahren der vorliegenden Erfindung führt außerdem zu verbesserten Ausbeuten, die in kürzeren Reaktionszeiten erhalten werden können, was auf den stabilisierenden Einfluß der organischen Triester der Phosphorsäure zurückzuführen ist, der es außerdem gestattet, bei höheren Umsetzungetemperaturen zu arbeiten. Weiter werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren im allgemeinen geringere Mengen an Lösungsmittel sowie an Ortho- bzw. PyrophosphorsSure oder deren Derivaten benötigt als bei den bisherigen Verfahren. Dadurch wird beispielsweise die Aufarbeitung der Produkte wesentlich vereinfacht.

Die Erfindung soll im folgenden anhand von Beispielen erläutert werden.

Beispiel I

575 mg (5 Milllmol) 85£-lge Phosphorsäure wurde zu lOO ml

Pyridin, das IO Milllmol Tri-n°butylamin enthielt, hin züge»

Im Vakuum
geben, und das Ganze wurde/zu einem Sirup eingedickt, der mit 50 ml trockenem Pyridin versetzt und eingedampft wurde. Das Eindampfen wurde 3 bis 4 Stunden bis zur Trockne fortgesetzt, und der Rest des Pyridine wurde mit trockenem Benzol entfernt. Man erhielt Bio-(tri-n~butyI ammonium)-orthophoaphat.

690 mg (I Mlllimol) des 4«Morpholin°N,N^(><=>dloyclohexylcarboxamldiniumsalzea von Uridin^^phosphorsäuremorpholid wurden zu 5 Millimol Bis-(tri-n-butylammonium)-orthophosphat gegeben, und da» Ganze wurde zur Homogenisierung mit 50 ml TriHthylphosphat

gerüttelt. 209816/1660

Die Lösung wurde 5 Stunden bei 5O⁴C gehalten, danach mit 50 ml Wasser versetzt und schließlich durch eine 5 χ 45 cm~Säule, die mit 500 ml lonenausfcauscherharz ("Dowex 2^H der Dow Chemical Cc-. USA) in seiner Cl"«Form gepackt war, geleitet. Die Anteile an Uridin-S'-mono-, -di» und «triphosphat im Produkt betrugen 5,0, 94 bzw. 2$. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen, bis die optische Absorption der Waschlösungen verschwunden war, und

gewaschen anschließe!d mit wäßriger 0,005η HCl/0,04m NaCl-Lösung, worauf sie schließlich mit wäßriger 0,005η HCl/0,lm NaCl=Losung eluiert wurde. Man erhielt dabei 42 ml einer Fraktion aus Uridin-5¹-d!phosphat von einer Konzentration von 9,0 mg pro Milliliter, berechnet als freies Phosphat, und vom pH 2,0. Uridin~5^e«mono- und -triphosphat wurden nicht gefunden. Das Eluat wurde mit 1On Natronlauge auf den pH-Wert 5,0 gebracht und mit einer Ge« schwlndlgkeit von 0,15 ml/nin durch eine mit 10 ml hochporösem, achwach basischem Anionaustauscherharz (Duolite A-7 der Chemical Process Co., USA) in seiner Cl"-Form gepackte Säule geleitet.

Das Harz wurde mit In NaOH eluiert und das Eluat mit konzentrierter Salzsäure auf den pH 4,5 gebracht. Anschließend wurde es allmählich mit Methanol versetzt, bis der Methanolgehalt etwa 80 Volum~£ betrug. Die überstehende Flüssigkeit wurde dekantiert und der Rückstand zentrifugiert. Der aus rohem Uridin=5"~dipfcoi§phat bestehende ZentrifugenrUckstand wurde in 5 ml Wasser gelöst und erneut mit Methanol gefällt, wonach man 420 mg mehr als 98,5# reines Dinatriumsalz des ürldin-5'-

diphosphats (E₂O) erhielt.

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Beispiel 2

Das Verfahren von Beispiel 1 wurde wiederholt mit der Abweichung« daß man als Ausgangsmaterial das 4-Morpholln-N,N"-dicyclohexylcarboxamidiniumsalz des Adenosln-5*-phosphorsäuremorpholids als Ausgangsmaterial verwendete. Man erhielt das Natriumsalz von Adenosin-diphosphat (2H₂O) in 90£-lger Ausbeute neben 5$ Adenosinmonophosphat, 2# Adenosintrlphosphat und 3$ Ausgangsmaterial im Eluat.

Beispiel 3

Beispiel 1 wurde mit der Abweichung wiederholt» daß als Ausgangsmaterial die in Tabelle I angegebenen Nucleosid-5*-phosphor-8guremorpholide eingesetzt wurden, die Reaktionsgemische mit den ebenfalls in Tabelle I angegebenen Zusammensetzungen ergaben. Aus den Reaktionsgemischen wurden die Nucleoside*-dlphosphate in herkömmlicher Weise in den in der letzten Spalte angegebenen Ausbeuten isoliert.

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T a b e 11 β I

Nucleosides * -monophosphoamid	Zusammensetzung des Reak« tionsgemisches, % Phos phat	Di-	Tri-	Ausbeute,
	Mono-	94,0	2,0
Uridine-5^f -phosphojnorpholid	3,0	89,0	5,3	90
Cyt idin-5⁹ -phosphomorpholid	5,4	90	4,1	85
Tnymidin-5' -phosphomorpholid	5,7	92,5	1,5	87
Nicotlnamld-ribonucleosid-5 *- phosphomorpholid	6,0	91,0 90,0	4,0 3,0	90
Guanos in~5* -phosphonic rphol ld 2" -Desoxyadenosin-5* -phospho morpholid	4,9 6,5	87,5	3,5	87 85
2 *-Deeoxycytidin-5'-phospho morphol id	8,8	91 ,5	2,1	82
6-Azauridin-5 ° -phosphomorpho- Hd	4,9	92,0	3,0	89
2°,3-O-Diacetyladenosln-S- phosphomorpholid	4,0	90,0	2,5	86
5-Amlno-4»iaidazoloarboxanid- ribonuoleosld-5"-phospho morpholid	6,0	92,0	2,1	87
2*-Desoxy«3°-O-bensoylndeno- sin-5^β -phospheBsorphol id	5,8	93,2	2,8	86
2^C,3®-O^lsopropylidenadenosin- 5--phosphomorpholid	3,4	88

Beispiel 4

544 ag (1 Millimol) des gut gttrookneten Dioyclohexylguenidinium= •alzes von Thymidin-5^e-phoaphoreäureamid sowie 2,2 g (8 Millimol) Tri-n-butylatamoniumorthophoaphat wurden zu einem Oemieoh aus 10,0 al Dimethylsulfoxid und 10 al Tri-n»butylphoephat hinzuge« geben. Das Gänse wurde 10 Stunden auf 35 bis 4θΐ erwKrnt und

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anschließend mit 100 ml Wasser verdünnt uti über eine Säule (3#5 x 45 cm) mit DEAE-Cellulose in der HCOJ⁹ «Form laufen ge ■■ lassen. Unter Verwendung von 6 1 0,4m sauren Triäthy!ammoniumcarbonat und 6 1 Wasser erzielte man eine Eluierung mit linearem

im Vakuum

Gradienten. Die Diphosphat-Fraktion wurde/eingedampft, in Äthalm Vakuum
nol aufgenommen und erneut/eingedampft, um das saure Carbonat zu entfernen. Diese Behandlung wurde wiederholt, wonach der Rückstand in etwa 20 ml Methanol gelöst und unter Verwendung von 5 ml in Natriumjodid/Aoeton-Löeung in herkömmlicher Welse In das Natriumsalz überführt wurde. Man erhielt 425 mg Thymidln-5¹-dlphosphat in Form des Dlnatrlumsalzes (2HgO) von 97£-iger Reinheit.

Beispiel 5

370mg gut getrocknetes ThyBldln-S'-phosphorsKureimidazolid und 2,2 g Triieotoutylamoniunorthophosphat wurden zu 30 al TrI-n-propylDhosphat hinzugegeben und das Ganze in fest verschlösse-

3 Tage
nsn Qefxe bei Raumtemperatur stehengelassen. Der ausgefallene

niederschlag wurde abgetrennt und mit Dimethylformamid gewaschen.

Das Filtrat wurde mit dem gleichen Volumen Methanol vermischt und im Vakuum
/zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit 50 Ml Wasser versetzt und durch sine DBAE-Cellulose-SIule (4x50 cm) laufen gelassen. Mach Behandlung_/ wie in Beispiel 4 beschrieben, erhielt «an 400 ag des Dinatriumaalxes Ton Thyaldln-5'-<liphosphat (2H₂O) von 97#5J*-ieer Reinheit.

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Beispiel 6

570 mg des gut getrockneten Dicyclohexylguanidi niumsalzes von 3 -S -D-Ri bofuranosy ladenln-5 · -phosphorsgureamid (3-Isoadenosin-5^B-phosphorsäureamid) und 3*2 g gut getrocknetes Bis-(trln-but yl ammonium)-ort hophoephat wurden zu 20 ml Trimethy!.phosphat hinzugegeben und das Ganze 4 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde das Gemisch zu 50nl Wasser hinzugegeben und dreimal mit 50 ml Äther extrahiert. Die wäßrige Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf den pH 8 gebracht und Über eine SSuIe (2,5 χ 30 cm)« die mit dem Ionenaustauscherharz ^KDowex 2 - X8^N der Dow Chemical Co., USA in seiner Cl"-Form beschickt war« laufen gelassen. Das Harz wurde mit Wasser gewaschen und mit einem Gemisch aus 0,003n HCl und 0,01n LiCl wurde eine geringe Menge einer Monophosphat»Fraktion eluiert. Die 5^e-Diphosphat-Fraktion wurde mit 0,005n HC1/0,05n LiCl eluiert. Etwa 2 1 der das 5*-Diphosphat enthaltenden Fraktion wurden mit LiOH neu« tralisiert und im Vakuum unterhalb 30U t J ein Volumen von etwa 20 ml konzentriert. Nach Zugabe von 200 ml Aceton erhielt man einen Niederschlag, der zu 40 ml Methanol gegeben wurde. Der nach Zusatz von 500 ml Aceton erhaltene Niederschlag wurde zentrifugiert und der ZentrlfugenrUokstand im Vakuum bei 50*C gut getrocknet. Man erhielt 425 g J-fl-D-Riboftiranosyladenin-ö*- dipfeosphat in For« des Dilitniuesalze· (2H₂O).

Beispiel 7 Beispiel 4 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß man 974 mg

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gut getrocknetes 2⁸-Desoxycytidyl-(5^f —j 2^β) desoxyadenylsaures (5« —^y) Thymidin^'-phosphorsltureimidazolid, 2,8 g Ble-(tri= äthylammonium)-orthophosphat und 50 ml Triäthylphosphat ein» setzte und 920 mg 2ⁱ-Desoxyeytidyl--(5^f —> J'Hhyinidin-S«« diphosphat in Form des Dinatrlumaalzes (5HgO) erhielt,

Beispiel 8

O»57 g gut getrocknetes Dicyclohexylguanldlumsalz von Adenosin« 5^Ί-phosphorsäure arc id und 2,0 g Bis-Ctri-n-propylamBsoniuoi)-orthophosphat wurden zu 50 nl Tricyelohexylphosphat hinzugegeben, und das Ganze wurde bei (K gerührt, bis das PhosphorsKureamid verschwunden war, und 4 Tage stehen gelassen. Das Gemisch wurde zn *so ml Wasser gegeben und dreimal alt 50 ml Äther extrahiert. Die wäSriga Phase wurde zur Adsorption des Produktes mit Aktiv kohle behandelt. Meete Eiuieren mit 50£-igem äthanolisahem Ammoniakp Verdampfen des Eluats mxv Trockne iss Vakuum unter KUislen und Zusatz von 50 ml Wasser erhielt man eine Lösung, die Über eins mit 50 ml ionenaustausch«r&arz "Doweχ 2" in der Cl" Form gepackte Säule gegeben wurde. Nach Aufarbeiten gemäfl dem In Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhielt man 450 mg des Disiatriumaalsse« voik Adenosin=5^e°d!phosphat (2HgO) von 98 lger Reinheit.

■ i si 9

..τ fri TjL-it^ izylphospfeat wurden mit 0,55 g gut getrocknetem DicyolohexylfTuanidiniumsalz von 2"«Desoxyoytidin-5*-phosphor·= säurearrid und 1,7 g Dibenzyl-orthophosphat versetzt und

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ά&Β Gänse 3 Stunden auf 5O⁰C erhitzt. Das He akt ions gemisch wurde zu 50 ml Wa«eer hinzugegeben und 5 anal mit 50 ml Kther extrahiert. Di« wäßrige Phase wurde zur Entfernung dea Äthers im Vakuum QIngedampft. Dig Lösung wurde daraufhin an Palladium katalytisch hydriert. Der Katalysator mxra® abfiltriert, mit a feTMioniakhaltlgem Äthanol gewaschen, und Fi It rat und

wurden vereinigt und im Vakuum eingedampft* Nach gemäB der in Baispiel 4 besoi^debenen Methode erhielt m-m\ 4SO mg 2^§ »Desoxyoytidin-S^diphosphat in Form des Natriumealzes (K^O).

Beispiel iO

50 al TrI -&-' otcluy!phosphat wurden mit 0,45 g gut getrockneten; CyclohexyXiiffliBOJSlufasslz von Adenosin-5^f ^phosphoreSureamid und 2*5 g BiE«{tribenzylammoitlum)-orthophoephat versetzt und das Ganze analog der Vorschrift von Beispiel 8 behandelt _t wonach man *00 mg dea Matriumsalzes von Adenoein-5⁹-diphosphat (2HgO) erhielt,

Beispiel Ii

20 ml Trlhexy!phosphat wurden mit ?10 mg des gut getrockneten Dlcyclohexylguanidlniumsalzes von Pseudourldln-5'-Phosphorsäure« anld und 2,5 g Bi8°*(tri»n<-propylaemonlum)->orthophosphat Tersetzt, and Jas Ganze wurde gem&S der Vorschrift von Beispiel 4 behandelt, worauf man 220 mg des Natriumsalzes von Pseudouridin-5"«dlphosphat erhielt.

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--2Θ -

Beispiel 12

50 ml Trläthylphosphat wurden mit 0,67 g gut getrocknetem thymldylsaurem (5* —Ό¹) Thymldin->5*-phosphorsäureImldazol Id und 2,8 g Bis-(trlhexy!ammonium)-orthophosphat versetzt, und das Ganze wurde gemäß der Vorschrift von Beispiel 4 behandelt« wonach man 580 mg des Natriumsalzes von thymidy!saurem (5* —-* 3*) Thymldln-S'-diphosphat erhielt.

Beispiel 15

2>25 g (5 Nillinol) Tetranatrlumpyrophosphat s 10 HgO wurden in 100 ml Wasser gelSst und über eine mit 100 ml des Ionenaustauscherharzes *Dowex 5QW" der Döw Che&loal Co. USA In seiner H⁺-Foras beschickte Säule gegeben. Bus Harz wurde «it 200 el Wasser gewaschen und die vereinigten Waeshlusungen und

Bluate zu 500 »1 10 Milllnc»! Tri-n-butylaain en^h&lt«tden Pyrldln

im Vakuum gegeben. Eindampfen dieser Lösung/ergab einen Sirup» der zu 100 ml trocken·« Pyrldln hinzugegeben wurde» wonach das Ganze eingedampft wurde. Danach wurden 3 bis 4 «eitere derartige SntwXsserungsvorginge durchgeführt und der Rest an Pyrldln «it trockenen Benzol entfernt. Man erhielt so Bis»(tri-n-butylaeroniuaO-pypophosphat.

Das ^-Morpholin-NflP-dlcyclohexyloarboxaBidiniunsals von Uzldln-S'-phosphomäurenorpholid wurde nach der in J.A«.Chen.S00. §2« 655 (I96I) beschriebenen Methode hergestellt und 3 Stunden Über P₂Oe in Vakuu« bei 1OW get reimet. 690 «g (1 Milllaol) davon wurden zu 5 Milllaol Bis-(tri-n-butylan«oniun)-pyrophosphat

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hinzugegeben, und das Gemisch wurde zu 50 ml Triäthy!phosphat hinzugefügt und das Oanze bis zur Aufissung geschüttelt.

Die Lösung wurde 3 Stunden bei 50"C gehalten und danach zu 50 ml Wasser gegeben und das Oanze durch eine alt 300 ml Ionenauetausoherharz *Dowex 2* der Dow Chemical Co. USA in seiner Cl""-Form gefüllte SKuIe (3 χ 45 cn) laufen gelassen. Das Harz wurde daraufhin mit Wasser gewaschen« bis die optische Absorption der Waschlösung verschwunden war, und anschließend unter Anwendung der Methode des linearen Gradienten eiuiert, wobei 10 1 0ß>3n HCl und weitere 10 1 eines Gemisches aus 0,4n LiCl und 0,03n HCl verwendet wurden. Es wurden Fraktionen von je 50 ml gesammelt und von ihnen die optische Absorption bei 260 αμ be« stimmt. Kan erhielt zuerst Urit!in-5^f-monophosphat (2,19#), anschließend Uridln-5¹-«phosphat (5,9OJi) und schließlich Uridin-5^ü-triphoaphat (92,0£). Die Urldln-5'-triphosphat-Fraktion wurde mit Lithiumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht, zur Trockne eingedampft und mit 50 ml Methanol versetzt. Das Ganze wurde gut geschüttelt und mit 500 ml Aceton versetzt, worauf man einen weißen Miederschlag erhielt, der abzentrlfugiert und zur Entfernung von LiCl zwei weiteren analogen Behandlungen unterworfen wurde· Nach Trocknen bei Raumtemperatur über P₂O₅ erhielt man 505 ag (90£ d.Th.) des Lithiunsalzes von üridin-S'-triphoaphat (2H₂O) von 980-iger Reinheit. Die Verbindung wurde anhand ihres Rf-Wertes bei (br Papierohromatographie sowie ihrer OV- und IR-Spektren identifiziert.

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895303

Weiters Umsetzungen vmrcfen unter abweichenden. Rsaktionsbedingungen durchgeführt; und fMivt^n zu den in äusanunengegtellten

ΙΪ

	f abi Ia	e	Il	Ausbeute an Phosphat, %	Di-	Tri-
				Mono-	16,0	36,0
Lösungsmittel		mi		47,6	22,2	36,6
Pyridin	-10		84	4i₃ig	16,0	36,0
Pyrldin/AöftonltriX	-1©		84	46,6	68*0	20,2
Pyridin	-10		84	11,7	36,4	47,15
	»25		48	16,59	6,68	77,0
Pyridin	0		192	16.3	5,0	92,3
Diinet hyleul,f oxid	20		96	2,61	13*6	80,1
Trittb^lpho«ia»t	20		96	6,3?	5,90	92,0
DlmetUylsulfoxld * TriEtlsy!phosphat Ci	ti) so		96	2,29	3,93	86,7
Triäthy !phosphat	5G		3
TriSt 1$ !phosphat	50
Beispiel i4

Beispiel 13 wurde mit der Abweichung wiederholt., daS öas 4-Morpho·-· lln-KjN^diGyclohezylcarboxaisiifiinlujasalsE von Adenosin~5 * * püosphorsiiurensorpholid eingesetzt wurde und man das LithSumsalz vcn Ad4*nosin-5*-triphosphat in 91|i-iger Austeeut« und Reinheit nelven 0,8j 't erhielt.

Belsplel 15

Beispiel 13 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß man die in der folgenden Tabelle III angegebenen Nueleosld-5¹-phosphorsäure morpho Ii de einsetzte und Reaktionsgemische mit den ebenfalls in Tabelle III angegebenen Zusammensetzungen erhielt.

Aus den Reaktionsgemischen isolierte man mit herkömmlichen Methoden die entsprechenden Nucleosld-S'-trlphosphate in den ebenfalls in Tabelle III angegebenen Ausbeuten.

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OB»	AT	III	Di-	Tri-	1695303
T a b e	11 e		5,90	92,0
Nucleoside' -mono«			6,0	92,5	Tr!phosphat- Ausbeute,
phosphoamid	Zusammensetzung des Reaktionsgemische8, % Phosphat	5,4	92,0
Uridin-5¹-phosphomor pholid	Mono-	5,5	92,6	90
Cytidin-5'-phospho- morpholid	2,19	6,0	92,5	89
Thymidin-5'-phospho morpholid	1,5	6,5	90,0	90
Nioot Inamld-ribonucleo- sid-5⁹-phosphonorpholid	2,2	4,7	92,3	91
Guanosin-5*-phosphomor pholid	1,9	4,9	91,9	90
2⁹-Deeoxyadenosin-5 * - phosphomorpholid	1,5	5,3	92,5	85
2*-Desoxycytidin-5¹- phosphomorpholid	3,0	5,6	91,9	89
6-Azaurldin-5* -phos- phomorpholid	2,0	89
2,3'-O-Diacetyladeno- sln-5 -phosphoBorphol id.	2,1	86
5-Amino-4-lmldazol-carb- oxamld-ribonucleosid-5^v- phosphomorpholid	2,0	88
2,3

2* -Deeoxy-3' -0-benzoyladenoeln-5* -phosphamorpholid

2,2 5,7

91,8

Beispiel 16

544 mg (1 Millimol) gut getrocknetes Dicyolohexylguanidiuasalz

von Thymidin-S'-Phosphorsäureamid und 1,45 g (4 Millimol)

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Tributylaromoniumpyrophosphat wurden zu einem Gemisch aus 10,0 ml Dimethylsulfoxid und 20,0 tail Tributylphosphat hinzugegeben. Das Ganze wurde 2-3 Tage bei Raumtemperatur stehen gelassen danach mit 120 ml Wasser verdünnt und über eine Säule (3,5 χ 45 cm) aus DEAE»Cellulose in der HCO,"-Form gegeben. Man erhielt eine EIu ie rung mit linearem Gradienten durch Verwendung von 6 0,4m Triäthy!ammoniumbicarbonat und 6 1 Wasser. Die Triphosphat-

lm Vakuum
Fraktion wurde/zur Trockne eingedampft» in Methanol gelöst und zur Entfernung von Bioarbonat verdampft. Diese Behandlung wurde viermal wiederholt. Der Rückstand wurde in etwa 20 ml Methanol gelöst und in: üblicher Weise unter Verwendung von 5ml Im NaJ in Aceton in das Natriumsalz überführt. Man erhielt 540 mg Thymidin=5^e-trlphosphat in Form des Tetranatriumsalzes (2H₂O) von 97#-iger Reinheit.

Beispiel 17

370 mg gut getrocknetes Thymidin-S'-phosphorsHureimidazolid^ hergestellt »maß J.Am.Chem.Soo. 8£, 1785 (1965)» und 1,28 g

Tributylammoniumpyrophosphat, hergestellt gemäß der Vorschrift

in derselben Literaturstelle, wurden zu 20 ml Tri-n-propylphosphat hinzugegeben. Das fest verschlossene Gefäß wurde 2 Tage lang stehen gelassen. Der Niederschlag wurde abgetrennt und mit

Dimethylformamid gewaschen. Mit dem FiItrat wurde das gleiche

im Vakuum

Volumen Methanol versetzt und das Ganze/zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit wenig Wasser gelöst und über eine mit DEAE-Cellulose gefüllte Säule (4 χ 50 cm) ge

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geben und mit 10 1 0,4m wäßrigem Trtgthylammoniumhydrogencarbonat nach der Methode des linearen Gradienten eluiert. Die

in Vakuum

Triphosphatfraktion wurde/zur Trockne eingedampft, mit Äthanol aufgenommen und zur Entfernung Überschüssigen Tri&thylammoniumh>drogencarbonats erneut eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol zu einer annähernd 0,05jw Triphosphat lösung gelöst und mit dem 5fachen Volumen 0,15m Natriumperohiorat in Aceton versetzt. Das ausgefüllte Natriumsalz wurde abgetrennt, 4 mal mit 1 ml Aceton gewaschen und im Vakuum über ^P2°5 e^e^trocknet. Man erhielt 490 mg Thymidin-5^e-triphosphat in Form des Trinatriumsalzes (HgO) von 9&%»iger Reinheit.

Beispiel 18 Beispiel 17 wurde mit der Abweichung wiederholt, daß man 974 mg

gut getrocknetes 2⁹ -desoxycytidyl-(5'——> 2')-desoxyadenylsaures (5« —► j») Thymidin-5°-phosphorsäureimidazolid, 1,52 g gut getrocknetes Bis-(triäthylammonium)-pyrophosphat und 50 ml

Triäthylphosphat einsetzte und 1,1 g S'-desoxycytidylCS* —► 3⁸)-

deeoxyadenylsaures(5' —* 5⁹) Thymldln-5*-triphosphat in Form des Hexanatriumsalzes (8H₂O) erhielt.

Beispiel 19

500 mg gut getrocknetes: Dlcyclohexylguanldlnlumsalz von 3-8 =-D-Rlbofuranosyladenin-5 * -phosphorsKureamid (5-Ieoadenosin-5*-phoephorsKureamld) und 1,25 g gut getrocknetes Tributylammonium-pyrophosphat wurden zu 15 ml Trimethylphosphat hinzugegeben und das Ganze bei Raumtemperatur 3 bis 4 Tage gerührt. Das Gemisch wurde zu 50 ml Wasser gegeben und dreimal mit 50 ml Äthttr

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extrahlert. Die wäßrige Lösung wurde mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8 gebracht und über eine mit "Dowex 1-X8", einem Ionenaustausch«rharz der Dow Chemical Co., USA, in seiner Cl~-Form beschickten Säule (2,5 χ 30 cm) gegeben. Das Ionenaustauscherharz wurde mit Wasser gewaschen. Sine geringe Menge einer Mono- und Diphosphatfraktion wurde mit 2 1 einer Lösung aus 0,005n HCl/O,O5n LiCl eluiert. Mit O,OO5a HCl/O,l_n LlCl eluierte man eine 5¹ -Triphosphatfraktion. Etwa 1,5 bis 2 1 der das 5"-Tr!phosphat enthaltenden Fraktion wurden mit LiOH neutralisiert und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Nach Aufnehmen mit 80 ml Methanol und Zugabe von 600 ml Aceton erhielt man einen Niederschlag, der im Vakuum bei 1005! getrocknet wurde. Man erhielt 591 mg 3~fl-D-Ribofuranosyladenln-5^e -triphosphat in Form des Tetralithiumsalzes.

Beispiel 20

0,57 g gut getrocknetes Dloyolohexylguanidlniumsalz von Adenosin-5^a monophosphorsäureamld und 2,0 g Bis-(trl-n-propylammonlum)-pyrophosphat wurden zu 20 ml Tricyolohexyl phosphat hinzugegeben und das Ganze bei (K gerührt, bis das Phosphorsäureamid aufgelöst war.

Das Oemisoh wurde zu 50 ml Wasser hinzugegeben und dreimal mit 50 ml Xther extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Adsorption des gewünschten Produktes mit Aktivkohle versetzt. Blutlon mit 50£-lgem ammoniakallschem Äthanol, Verdampfen des Eluates im Vakuum zur Trockne und Verdünnen des Rückstandes mit

Wasser auf 50 ml ergaben eine Lösung, die mit HCl auf den pH-Wert

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2,5 gebracht und über eine mit 3 ml eines herkömmlichen lonenaustauscherharzes beschickte Säule (0*6 χ 10 on) gegeben wurde» bis der Ionenaustauscher völlig mit Triphosphat ge» sättigt war. Das 5'-Triphosphat, das» ohne adsorbiert zu werden, durch die Säule lief, wurde unter Verwendung einer zweiten gleichen Säule gewonnen. Die Ausbeute an 5'-Triphosphat betrug

Der mit 5°-Triphosphat gesättigte Ionenaustauscher wurde mit In NaOH eluiert, und die 5'"Triphosphat-Fraktionen wurden vereinigt und mit Aceton versetzt, worauf man einen Niederschlag aub 5'-Triphosphat erhielt. Dieser wurde mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet: Man erhielt 0,585 g Adenosin-5¹-tr!phosphat in Form seines Trinatriumsalses (6H₂O) von 97£»iger Reinheit.

Beispiel 21

0,5 g des gut getrockneten Cyclohexylguanldlumsalzes von 2^e-Desoxycytidin-5^e-phosphorsäureamid und 1,7 g Tribenzylpyrophosphat wurden zu 15 ml Tribenzylphosphat hinzugegeben und das Ganze J5 Stunden auf 50⁰C erhitzt. Das Reaktiongemisch wude zu 50 ml Wasser gegeben und fünfmal mit 50 ml Äther extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Entfernung des Äthers im Vakuum eln-

^j gedampft. Die Lösung wurde daraufhin j5 Stunden über Palladium

co auf Aktivkohle katalytisch hydriert. Nach Abfiltrieren, des

-* Katalysators und Waschen mit 50£-igem ammoniakalischem Xthanol

^ wurden FiItrat und Waechlösung vereinigt und im Vakuum elnge-

CD dampft. Man erhielt 0,48 g 2*»Desoxycytidin-5"»triphosphat ο

in Form seines Tetranatriumsalzes (2HgO) durch Isolierung gemäß der in Beispiel 17 beschriebenen Methode.

Beispiel 22

Of45 g gut getrocknetes Cyclohexylammoniumealz von Adenosin-5¹" phosphorsKureanid und 2,5 g Bis-(trib€nzylammonlum)-pyropho5phat wurden zu 50 ml Tri-o-toluylphoephat hinzugegeben und das Ganze gemäß der in Beispiel 20 beschriebenen Methode behandelt. Man erhielt 0,59 g Adenosln-S'-triphosphat in Form seines Trlnatriumsalzes (6H₂O).

Beispiel 23

Beispiel 16 wurde mit 310 ng gut getrockneten Dlcyclohexylguanldlniumsalz von P8«udouridin<-5^e-phosphoreäureanld und 1,1 g Bis-(tri-n-propylamnonium)-pyrophosphat wiederholt, die zu 20 nl Trihexylphosphat gegeben wurden. Man erhielt 290 ng Pseudouridin<-3*-trlphosphat in Porn des Tetranatrlunsalzes

Beispiel 24

0*67 g gut getrocknetes thymldylsaures (5¹——* 3⁹) Thymidln-5¹-phosphorsKureinidazolid und 2,5 g Bis-(trihexylammonltun)-pyrophosphat wurdenzu 50 ml TrIKthylphosphat hinzugegeben und das

Ganze gemäß Beispiel 17 behandelt. Man erhielt 0,85 g thymidyl-

saures (5' —t 3^f) Thymidyl°5^f-triphoephat in Form des

Pentanatriumsalzes

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Claims

P ε t ent ansp rüche

1. Verfahren zur Herstellung von Nucleosid-5⁹-diphosphaten und -triphosphaten sowie Mono- und Oligonucleotldyl-nueleosid-5¹-diphosphaten und'triphosphaten« dadurch gekenn·» ze lehnet, daß man ein Nucleosid-5¹-monophoephoreäureamid oder ein Mono- oder 01igonucleotidyl-nucleosid-5^fHnonophosphorsäureamid mit Ortho- bzw. Pyrophosphorsäure oder einem Ester oder Salz davon in Gegenwart eines organischen Trieaters von Phosphorsäure umsetzt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Nucleoside® «monophosphorsäureamid eine Verbindung der Formel

worin Rg und Rq Wasserstoff, eine Alkyl-, Cycloalkyl=, Aryl- oder Aralkylgruppe oder zusammen mit dem Stickstoffatom und ggfs. ülnem weiteren Stickstoff-, Schwefel" oder Sauerstoff

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atom einen heterocyclischen Ring, r» ujyj r" wasser« stoff oder eine freie oder . geschützte Hydroxylgruppe und B den Rest einer organischen Base bedeuten» eingesetzt wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch !,dadurch gekennzeichnet« daß ale Mono« oder Oligonucleotldyl-nucleosid« 5*-!monophosphorsMurearald eine Verbindung der Formel

Hr" r'

eingesetzt wird, worin Rg und R- Wasserstoff, eine Alkyl-

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Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe oder zusammen mit dem Stickstoffatom und ggfs. einem weiteren Stickstoff-, Schwefel- oder Sauerstoffatom einen heterocyclisohen Ring bedeuten; η 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist; R* und R" Wasserstoff oder eine freie oder geschützte Hydroxylgruppe und die Reste B Reste organischer Basen bedeuten.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2 oder }, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß einer der oben ange- m gebenen Formeln eingesetzt wird, worin der oder die Reste B einen Purin-, Pyrimidine Pyridin- oder Xmldazolrest bedeuten.

5· Verfahren gemäß einen der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß einer der oben angegebenen Formel eingesetzt wird, worin mindestens einer der Reste R⁹ und R" eine Acyloxygruppe, insbesondere eine von einer niedrigaolekularen aliphatischen oder einer aromatischen Carbonsäure abgeleitete Aoyloxygruppe bedeutet.

6. Verfahren gemXS einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemlS einer der oben genannten Formeln eingesetzt wird, worin die beiden Reste R* und R" an benachbarten Kohlenstoffatomen stehen und zusammen eine 2^l,3^l-0-Alkyliden- oder 2*,3^t-0-Arylidengruppe bedeuten.

7. Verfahren gemäß einen der Ansprüche 2 bis 6, d a d ur cn gekennzeichnet, daß eine Verbindung gemäß einer

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der oben angegebenen Formeln eingesetzt wird« worin Rg und Hg Wasserstoff, eine Alkyl-, Insbesondere Methyl-, Äthyl-, Propy1- oder Butylgruppe, eine Cycloalkyl-, insbesondere Cyclohexylgruppe, eine Aryl-, insbesondere Phenyl-, Toluyl- oder Naphthylgruppe, oder eine Aralkyl-, insbesondere Benzylgruppe, oder zusammen mit dem Stickstoffatom und ggfs. einem weiteren Stickstoff-, Schwefel- oder Sauerstoffatom einen Morpholin-, Thiazol-, Chinolin-, Piperidin-, Py rid in- oder Zmidazolrlng bedeuten.

8. Verfahren gemäß einem der iorhergehenden Ansprüche, d a d u r ch gekennzeichnet, daß als organischer Trieste r der Phosphorsäure eine Verbindung der Formel

OR₂
R₁O-P -

eingesetzt wird, worin R-, Rg und E. «ine Alkyl-, insbesondere Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Butyl-, Amyl- oder Hexylgruppe, eine Cycloalkyl-, insbesondere Cyciopentyl- oder Cyolohexylgruppe, eine Aryl-, insbesondere Phenyl-, o-Toluyl- oder m-Toluylgruppe, oder eine Aralkyl-, insbesondere Benzylgruppe, bedeuten.

9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, d adurch gekennzeichnet, daß das Monophosphor-

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säureamid mit Orthophosphorsäure oder einem Ester oder Salz davon gemäß Formel

OR₄

MO - P = 0

OR₅ . II

umgesetzt wird, worin R₄ und FU Wasserstoff oder eine Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe oder ein organisches oder -norheinisches Kation und M Wasserstoff oder ein organisches oder anorganisches Kation bedeuten.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, d a d u r c h gekennzeichnet, daß das Monophosphorsäureamid mit Orthophosphorsäure oder einem Ester oder Salz davon gemäß der Formel in Anspruch 9 umgesetzt wird, worin mindestens einer der Reste Rjj und R- eine Phenyl- oder Benzylgruppe oder ein substituiertes AmIn- oder. Amid-kation, insbesondere ein Trlmethylammonium-, Triäthylammonlum-, Tripropylammonium-, Tributylammonium-, Trihexylammonium-, Tribenzylammonium-, Triphenylaomonium-, Tricyolohexylammonlum-, Piperidinium-, Cyolohexylguanidinium- oder 4->Morpholin-N,N*-dicyclohexylcarboxamidlniumion, bedeutet oder worin mindestens einer der Reste M, R^ und Rc ein Alkalikation, insbesondere ein Lithium=-, Natriumoder Kaliumion, bedeutet.

9 8 1 6 / 1 6 S 0

11. Verfahren gemäß einen der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennze lehnet, daß das MonophosphorsKureamld mit PyrophosphorsKure oder einem Ester oder Salz davon der Formel

O O

Il Il

-P-O-P-

MO-P-O-P-OR* _TTT

OR₅ OR₇

umgesetzt wird, worin Rc, Rg und R-. Wasserstoff oder eine P Alkyl-, Cycloalkyl-, Aryl- oder Aralkylgruppe oder ein organisches oder anorganisches Kation und M Wasserstoff oder ein organisches oder anorganisches Kation bedeuten.

12. Verfahren gemMS Anspruch 11, daduroh gekennzelchnet, daS das Nonophosphorsttureanid mit PyrophosphorsKure oder einem Ester oder Salz davon gemXfi der in Anspruch angegebenen Formel umgesetzt wird, worin mindestens einer der Reste Rc, Rg und R- eine Phenyl- oder Benzylgruppe oder ein S| substituiertes AmIn- oder < tald-kation, insbesondere Trimethyl-, TrlKthyl-, Tripropyl«, Tributyl-, Triamyl-, Trlhexyl-, Tribenzyl-, Triphenyl- oder Trloyo lohexy laamonium-, ein Plperldinium-, Cyolohexylguanldinium- oder ^-Morpholin-Ν,Μ¹-dicyolohexyioarboxamldlnlumlon, oder in dem mindestens einer der Reste M, Re, R^ und R₇ ein Alkalikation, Insbesondere ein Lithium-,

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Natriiiin- oder Kaliumion, bedeutet.

13· Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei einer Temperatur zwischen Umgebungstemperatur und 10O¹C durchgeführt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dafi die Umsetzung in Gegenwart noch eines Verdünnungsmittels, wie von Acetonitril, ο-Chlorphenol, Dimethylformamid, Trloresol oder Dimethylaulfoxid, durchgeführt wird.

Neue Unterlagen ,«7,, «^ _w., _s,_tt, _{dM ÄM}

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