DE1918282C3

DE1918282C3 - Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsäuren

Info

Publication number: DE1918282C3
Application number: DE1918282A
Authority: DE
Inventors: Yasuo Machida Fujimoto (Japan)
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1968-04-11
Filing date: 1969-04-10
Publication date: 1974-07-18
Also published as: DE1918282A1; US3709873A; FR2006068A1; DE1918282B2; GB1227292A

Description

r—O—Ρ — Ί O—P —O

OH

P —O —R"

/ ill τ ti

OH

(ί)

in der R und R' organische Reste mit einer Alky!-, is Cycloalkyl- oder Arylgruppe, einen Zuckerrest einschließlich Nucleosiden oder Mono- oder Oligosacchariden vom Imidazol-, Flavin-, Pyridin-, Pyrimidin- oder Purintyp, einen Aminosäurerest, einen Vitaminrest oder einen Steroidrest und m und π die ganzen Zahlen O, 1, 2, 3 bedeuten, durch Umsetzung eines Monoesters oder Monoestersalzes emes Mono- oder Oligophosphorsäureamids der allgemeinen Formel

in der R₁, R₂ und R₃ Alkyl-, Cycloalkyl- od,-r Arylreste bedeuten, und die Umsetzung bei einer Temperatur von O bis 70 C durchführt.

"> Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man als Phosphorsäuretriester Trin-propylphosphat, Tricyclohexylphosphat, Tnmethylphosphat, Tri-n-butylphosphat, Tnathylphosphat, Tribenzylphosphat oder Tn-o-cresylphosphat verwendet.

Β— Ρ

ΟΗ

Ο—Ρ

Ο —R (U)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsäuren der allgemeinen Formel

!I

R—O—Ρ

in der R und η die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und B eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe oder eine cyclische organische Base bedeutet, oder eines Diesters oder Diestersalzes einer Mono- oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

Ii ο—ρ —ο

I
OH

Il

-Ρ —Ο —R

OH

.15

R-O

Il
ρ

OH I

-Ο —ΡΟΗ

Ο —R

(UI)

40

45 in der R und R" organische Reste mit einer Alkyl-, Cycloalkyl- oder Arylgruppe, einen Zuckerrest einschließlich Nucleosiden oder Mono- oder Oligosacchariden vom Imidazol-, Flavin-, Pyridin-, Pyrimidin- oder Purintyp, einen Aminosäurerest, einen Vitaminrest oder einen Steroidrest und in und ii die ganzen Zahlen O, I, 2 und 3 bedeuten, durch Umsetzung eines Monoesters oder Monoestersalzes eines Mono- oder Oligophosphorsäureamids der allgemeinen Formel

in der FL und /i die oben angegebene Bedeutung besitzen und R' einen «-, /i- oder 7-Pyridylrest bedeutet, mil einem Monoester oder Monoestersalz der Mono- oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

Β— Ρ

ΟΗ

OH

Ο —R

(H)

HO

OH

η

OH

Ο —R" (IV)

in der R und 11 die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und B eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe oder eine cyclische organische Base bedeutet, oder eines Diesters oder Diestersalzes einer Mono-* oder Oligophosphorsäure der allgemeinen Formel

R-O

in der R" und m die oben angegebene Bedeutung besitzen, in Gegenwart eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel, dadurch gekennzeichnet, daß man als organisches Lösungs-

OH

O —R (JlI)

I»

in der R und η die oben angegebenen Bedeutungen besitzen und R' einen a-, ß- oder -/-Pyridylrest bedeutet.

91S

mil einem Miinoesier oder Monoeslerial/ der Mono- oder Oiigophosphorsäure der allgemeinen Formel

HO-P

OH

O ■- P —

OH

O R

(IVi

in der R" und m die oben angegebenen Bedeutungen besitzen, in Gegenwart eines oder mehrerer organischer Lösungsmittel.

Es ist bereits bekannt, daß Diester kondensierter Phosphorsäuren durch Kondensation von Phosphor- is siureamiden und Monoestern der Phosphorsäure hergestellt werden können (vgl. zum Beispiel H. G. Khoran? et al, »J. Am. Chem. Soc«. Bd. 80. S. 3756 [1958], Bd. 83. S. 659 [1961], A. L. Nussbau m et al. »Tetrahedron«. Bd. 20. S. 2467 [1964]. N. K. Kochetkov et al, »Tetrahedron«. Bd. 19. S. 1207 [1963], Y. Furukawa el al. »Chem. Pharm. Bull. Japan«. Bd. 13. 16 [1965], und J. G. Moffatt et al, »J. Am. Chem. Soc«. Bd. 88, S. 838 [1966]).

Die bekannten Verfahren haben jedoch die Nachteile, daß die Reaktionszeiten übermäßig lang sind und die Reaktionen nicht bis zum Ende ablaufen, wobei darüber hinaus noch große Mengen an unerwünschten Nebenprodukten gebildet werden. Da- \o durch sinken die Ausbeuten an den gewünschten Diestern, die bei den bekannten Verfahren in Abhängigkeit von dem gewünschten Produkt oder dem ' angewendeten Lösungsmittel erheblichen Schwankungen unterliegen und gewöhnlich zwischen etwa .v> 20 und etwa 80% betragen, wobei die Ausbeute an isoliertem Produkt zwischen etwa 18 und etwa 70% liegt.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung der genannten Diester kondensierter Phosphorsäuren anzugeben, mit dessen Hilfe es möglich ist, auf wirtschaftliche Weise innerhalb kürzerer Reaktionszeiten die gewünschten Diester kondensierter Phosphorsäuren mit gleichbleibend höheren Ausbeuten herzustellen.

Gegenstand der Erfindung ist demzufolge ein Ver fahren zur Herstellung von Diestern kondensierte Phosphorsäuren der eingangs genannten Art. das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als organisches Lösungsmittel einen oder mehrere Phosphorsäuretriester der allgemeinen Formel

R₁-O-P-O-R₂
O

(V)

verwendet, in der R₁, R₂ und R₁ Alkyl-. Cycloalkyl- oder Arylreste bedeuten, und die Umsetzung bei einer Temperatur von 0 bis 7(FC durchführt.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, die bei derartigen Verfahren bisher auftretenden Schwierigkeiten, beispielsweise das Problem der Schwerlöslichkeit der Ausgangsmatcrialien, das Erfordernis einer langen Reaktionszeil (da die Umsetzung bei höheren Temperaturen stürmisch vei läuft, wurden die bisher bekannten Venahren bei Raumtemperatur durchgeführt, die zur Erzielung annehmbarer Ausbeuten etwa 3 bis etwa 4 Tage dauerten), die Bildung unerwünschter Nebenprodukte selbst bei Raumtemperatur und die Erzielung zu geringer Ausbeuten zu umgehen. Die Ausgangsmaterialien weisen in den erfindungsgemäß eingesetzten Phosphorsäuretriestern eine bessere Löslichkeit auf und das eingesetzte Lösungsmittel verhindert die Zersetzung des nach der Umsetzung erhaltenen Phosphorsäurediesters. Dabei hat sich gezeigt. dv.Ü nach dem erfindungsgemäßen Verfahren schon nach 2 bis 5 Stunden der gewünschte kondensierte Phosphorsäureester in einer Ausbeute von etwa 90% und mehr erhalten werden kann, wenn die Umsetzung bei etwa 50 C durchgeführt wird.

Nach der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das dabei erhaltene Reaktionsgemisch, das eine Lösung oder Suspension darstellen kann, gegebenenfalls unter Zugabe von Wasser auf übliche Weise aufgetrennt und gereinigt.

Besonders günstige Ergebnisse werden dann erzielt, wenn in dem erfindungsgemäßen Verfahren als Phosphorsäuretriester Tri-n-propylphosphat. Tricyclohexylphosphat, Trimethylphosphat. Tri-n-butylphosphat, Triäthylphosphat, Tribenzylphosphat oder Trio-creSjilphosphat verwendet wird.

Als Ausgangsmaterialien können in dem erfindungsgemäßen Verfahren sämtliche Ester von Mono- oder Oligophosphorsäureamiden, Ester von Pyridyl-mono- oder -oligophosphaten und Monoester von Morio- oder Oiigophosphorsäure verwendet werden, d. h„ R und R" können Mono- oder Oligophosphorreste. die einen Alkyl-. Cycloalkyl- oder Arylrest enthalten, oder Reste, die einen oder mehrere Zuckerreste im Molekül enthalten, wie Ribonucleosid- oder Desoxyribonucleosidreste vom Imidazol-, Pyridin-, Pyrimidin-. Flavin- und Purin-Typ sowie verschiedene Pentosyl-, Desoxypentosyl-, Hexosyl-, Desoxyhexosyl- und Heptosylnucleosidreste der obigen fünf Arten oder Reste von deren Derivaten oder Zuckerreste, wie Pentose, Desoxypentose, Hexose, Desoxyhexose, Heptose. Desoxyheptose und Oligosaccharose oder Reste von deren Derivaten (solche, in dem:n eine Phosphorgruppe mit einem OH-Rest in einer beliebigen Stellung in den Zuckern verbunden ist), Aminosäurereste, z. B. N-substituierte Serine, N-substituierte Threonine, N-substituierte Homoserine, N-substituierte /i-Hydroxyglutaminsäuren, N-substituierte /i-Hydroxyasparaginsäuren, N-substituiertes ^-Hydroxyprolin und N-substituierte ;'-Hydroxylysine, oder Reste von Vitaminderivaten, z. B. Pyridoxin, Pyridoxal, Pyridoxamin, Thiamin, Pantethrn, Pantothensäure, Pantothensäurenitril, Pantethein und Derivate davon, oder Reste von Steroidderivaten, z. B. Testosteron. Prednisolon, Pregnenolon, östriol, östradiol und Cholesterol, bedeuten.

Als Phosphorsäurepyridyldiester können solche verwendet werden, in denen der Wasserstoff einer der freien Hydroxylgruppen in dem Phosphorsäuierest durch einen Pyridylrest und dessen Derivate ersetzt ist und die in der «-, /i-, oder ^/-Stellung de^ Pyridylrestes gebunden sind.

Es können auch anorganische oder organise ic Salze der obigen Derivate der Phosphorsäure verwendet werden. Zu diesen Salzen gehören beispielsweise das Lithiumsalz, Ammoniumsalz, Natriumsaiz,

Kaliumsalz, Trimethylaminsalz, Triäthylamin.?alz. Tri-n-propylaminsalz (einschließlich des isomeicn Aminsalzes), Tri-n-butylaminsalz (einschließlich dessen isomerer Aminsalze), Cyclohexylaminsalz. Piperidinsalz. Pyridinsalz. Dicyclohexylguanidinsalz und 4- Morpholino - N.N' -dicyclohexylcarboxamidinsalz. Gewöhnlich ist es jedoch zweckmäßig, ein organisches Aminsalz zu verwenden, da dessen Löslichkeit höher ist.

Als organische Phosphorsäuretriester können in den erfindungsgemäßen Verfahren nicht nur aliphatische Triester der Phosphorsäure, wie Trimethylphosphat. Triäthylphosphat, Tri-n-propylphosphat oder dessen Isomeres, Tri-n-butylphosphat oder dessen Isomere, Tri-n-amylphosphat oder dessen Isomere und Trihexylphosphat. sondern auch aromatische Triester der Phosphorsäure, wie Tri-o-cresylphosphat. Tri-m-cresylphosphat und Tribenzylphosphat, oder alicyclische Triester der Phosphorsäure, wie Tricyclohexylphosphat und Tricyclopentylphosphat. verwendet werden. Bevorzugt werden solche Triester verwendet, die bei Raumtemperatur flüssig sind, so daß nach Beendigung der Reaktion eine leichte Behandlung möglich ist, es können aber auch Phosphate verwendet werden, die beim Erhitzen flüssig werden.

Die Reaktionszeit kann durch Erhitzen auf bis zu etwa 70 C wesentlich verkürzt werden. So kann bei 50 C die Reaktion in etwa 1 bis 5 Stunden beendet sein. Wenn die Reaktionsteilnehmer und Produkte längere Zeit nachdem die Reaktion beendet ist. miteinander in Berührung bleiben, treten leicht Nebenreaktionen auf. Es ist daher zweckmäßig, die Reaktion nicht länger als notwendig durchzuführen und das gewünschte Produkt von dem nicht umgesetzten Ausgangsmaterial sobald als möglich abzutrennen.

Es ist notwendig, andere Lösungsmittel zuzugeben. Andererseits ist aber eine Zugabe verschiedener Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel, die für die Reaktion unschädlich sind, durchaus zulässig. Beispielsweise können Lösungsmittel, wie sie bisher schon verwendet wurden, zugesetzt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren können nach üblichen Methoden gereinigt werden. Es ist vorteilhaft, das gewünschte Produkt in Form eines Alkalisalzes abzutrennen, es ist jedoch auch möglich, das Endprodukt als relativ unlösliches Salz, beispielsweise als Calciumsalz, Bariumsalz oder Quecksilbersalz, zu isolieren und das Salz in die freie Säure oder ein lösliches Alkalisalz zu überfuhren. Der Diester kann auch gereinigt, isoliert und in ein Salz übergeführt werden, indem man das Reaktionsgemisch mit Aktivkohle, Ionenaustauscherharzen oder lonenaustauschercellulosederivaten behandelt, um die in dem Reaktionsgemisch enthaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren zu adsorbieren und zu eluieren und dann nach üblichen Verfahren zu behandeln. Die Adsorptionsbehandlung kann direkt mit dem Reaktionsgemisch erfolgen, mit einem Gemisch aus Reaktionsgemisch und Wasser oder mit einer wäßrigen Lösung, die durch Vermischen von Wasser mit einem durch Zusatz von Äther, halogeniertcn Kohlenwasserstoffen oder Ketonen zu dem Reaktionsgemisch erhaltenen Niederschlag hergestellt wurde. Da die Menge an Dicstern, die in dem erfindungsgemäß hergestellten Reaktionsgemisch vorliegt, äußerst hoch ist. kann eine große Ausbeute an hochreinem Pro-

dukt bei nur einmaliger Durchführung der oh,n beschriebenen Adsorptions- und Elutionsbehandluny erhalten werden.

Die erfinduneseemäß erhaltenen Diester kondensierter Phosphorsäuren können als Coenzyme Λγ/ρ,-ι-inittel oder biochemische Reagenzien verwendet werden.

Beispiel 1

Zu 180 msi KUmMoIl N-N' - Di -cyclohcxylcariioxyarnidiniumadenosin-5-phosphoramidat und einein Tri - η - butylammoniumribofiavin - 5' - phosphat, das oesondert aus 575 mti Pyridiniumriboflavin-5'-pho>phat nach einem Verfahren hergestellt worden war. bei dem VO mti (2 mMol) Tri-n-butylamin enthaltendes wasserfreies Benzol zu einem Pyridiniumsal/ zugesehen und anschließend Pyndin durch wicdeiholte' azeotrope Verdampfung unter vermindertc:ii Druck mit wasserfreiem Benzol abgetrennt wurde, wurden 30 ml Tri-n-propylphosphat zugesetzt. Nach 1'äojoem Stehenlassen des Gemisches an einem dunklen Ylatz wurde es mit 50 ml Wasser vermischt und dreimal mit je 50 ml Chloroform extrahiert. Dc pH-Wert der wäßrigen Schicht wurde auf etwa 7 eingestellt und die wäßrige Losung durch eine Kolonne von 4 χ 15 cm aus DEAE-Cellulosc vom Cl-Typ gegeben. Nach dem Waschen der Ccllulosekolonne mit Wasser wurde eine 0,005 n-HCl 0.015 n-LiCl-Lösung hindurchgegeben, um Mononucleotidc zu entfernen, und anschließend wurde während eines mÖElichst kurzen Zeitraums eine 0,005 n-HCl 0.035 n-LiCI-Lösunti hindurchgeleitet, um eine Flavinadenindinuclcotid"(FAD)-Fraktion zu eluieren. Die Fraktion wurde mit Triäthylamin neutralisiert, im Vakuum eingeengt, mit 20 ml Methanol vermischt und dann mit 400 ml Aceton und 40 m! Äther vermischt, wobei ein Niederschlag ausfiel. Zu dem auf diese Weise erhaltenen orangefarbenen Niederschlag wurden 4 ml Methanol unter Rühren zugesetzt, und dann wurden 40 ml Aceton und 4 ml Äther zum Auswaschen zugegeben. Schließlich wurde der Niederschlag in Wasser gelöst, und die Lösung wurde gefriergetrocknet, wobei 122 mg eines Lithiumsalzes des FAD (Li₂FAD) erhalten wurden. Das dabei erhaltene Material zeigte als Spektraleigcnschaften Verhältnisse der optischen Dichte bei 260450 m;x von 3,28 und bei 375,450 ΐτίμ von 0,82 bei pH 7.

Beispiel 2

Zu 383 mg (1 mMol) Adenosin-5'-phosphat (2H₂O) wurden 10 ml wasserfreies Pyridin und 706 mg (2 mMol) Tri-n-octylamin zugegeben. Das Gemisch wurde im Vakuum verdampft, und anschließend wurden Wasser und Pyridin durch wiederholte Entwässerung durch dreimalige Zugabe und Verdampfen des Pyridins und Entfernen des f'yridins durch azeotrope Verdampfung unter Anwendung von wasserfreienBenzol daraus entfernt. Zu dem auf diese Weise ι, hallenen Produkt wurden 430 mg (0,5 mMol) gut getrocknetes Prednisolon-2"l-phosphorsäuremorpholid zugegeben und den 50 ml Tricyclohexylphosphat. die 0.5 mMoi Tri-n-octylamin enthielten, zugesetzt. Das Gemisch wurde etwa 5 bis 10 Stunden auf 60 C erhitzt, gekühlt und dreimal mit je 50 ml Wasser und 50 ml Äther extrahiert. Die wäßrigen Schichten wurden gesammelt und im Vakuum auf etwa 15 ml eingeengt. Nach Einstellung des pH-Wertes

des Konzentrats auf etwa 7,5 wurde das Konzentrat durch eine Kolonne von 2 χ 30 cm aus DEAL-Cellulose vom [HCOj]"-Typ gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann durch lonenaustauschchromatographie nach einer Lincargradicnt- s Methode unter Verwendung von 5 1 Wasser und 5 1 0,15-m Triäthylammoniumhydrogencarbonal mit einem pH-Wert von etwa 7,5 eluiert. Die das gewünschte Dinucleotid enthaltenden Fraktionen wurden gesammelt und im Vakuum zur Trockene ver- m dampft, wobei 350 mg pulverförmiges Prednisolonadenosindiphosphat [P¹ -(Prednisolon-21)-P²-(adenosin-5')pyrophosphat] erhalten wurden. Das Produkt zeigte bei der Papierchromatographie unter Anwendung von Isopropanol-NH, — H₂O (7:1:2) einen einzelnen Fleck mit einem R_f-Wert von 0,59.

Beispiel 3

Zu 492 mg (2 mMol) gut getrocknetem Pyridoxal-5-phosphat wurden 1,42 g Tri-n-octylamin zugegeben. ^ Zu dem auf diese Weise hergestellten Gemisch wurden 50 ml Tri-methylphosphat und 374 mg (1 mMol) Adenosin-5'-phosphorsäureäthylamid zugesetzt und 8 Stunden bei 40 C gehalten. Nach Zusatz von 50 ml Wasser zu dem Reaktionsgemisch wurde dieses dreimal jeweils mit 50 ml Äther an einem dunklen Platz extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Kolonne von 2 χ 7 cm aus DFAE-Ccllulose vom Cl~-Typ gegeben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen, und es wurden 0,003 n-HCl \<j 0.015 n-LiCl hindurchgeleitet, um die Mononucleotide zu entfernen. Anschließend wurde die gewünschte Hauptfraktion mit 0,005 n-HCI'0,05 n-LiCl eluiert. Die Fraktion wurde im Vakuum eingeengt, und HX) ml Methanol, Aceton (2:5) wutden zu dem restiichen Konzentrat zugesetzt, wobei das hellgelbe Lithiumsalz des Pyridoxaldenosindiphosphat [P¹-(Pyridoxal-5)-P²-(adenosin-5')-pyrophosphat] ausfiel. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und getrocknet, wobei 328 mg Kristalle erhalten wurden.

Analyse Tür C_1MH₂₀N„O₁₂P₂Li₂:

Berechnet:

C 36.76. H 3.43. N 14.29. P !0.53¹O:

gefunden:

N 14.25. P 10.45".,.

Beispiel 4

221 mg eines gut getrockneten 4-Morphoün- ·,<> N.N'-dicyclohexylcarboxamidinium-adcnosin-S'-'i-pyridylphosphat-«-pyridylcslers und 445 mg Tri-n-butylammonium-'i-D-glucose-l-phosphat wurden zu 10 ml Tri-n-butylphosphat zugesetzt. Man ließ das Gemisch einen Tag bei 40 C stehen. Nach Zugabe von ^ 10 TiI Wasser, die 120 mg Lithiumacelat enthielten, wurde das Gemisch dreimal mit Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Kolonne von 1,5 χ 10 cm aus einem Ionenaustauscher vom Cl -Typ gegeben und die Kolonne mit Wasser gewaschen. </- η-Glucose-1 -phosphat. AMP und P'.P² - Di(adcnosin - 5) - diphosphat wurden mit 0.0075 n-HCl eluiert. Anschließend wurde das aewünschtc Produkt (ADPG) mit 0.01 n-HC'l O.O25V LiCl-Lösung eluiert. Die ADPG-Fraktion wurde mit LiOH neutralisiert, im Vakuum eingeengt, und anschließend wurden 25 ml Methanol und 120 ml Aceton dem Konzentrat zuiicfüiit. wobei ein Niederschlag erhalten wurde. Der so erhaltene Niederschlag wurde mit Methanol/Aceton gewaschen und getrocknet. Man erhielt 151 mg eines Lithiumsalzes von P¹ -(Adenosin-5')-P²-("-')-glucose- l)pyrophosphat (Li₂ADPG -5H₂O).

Analyse Tür C₁₆H₂₂N₅O₁₅P₂Li₂ · 5H₂O:

lircchnet:

C 27,84, H 4.67. N 10,14, P 8,97%;
gefunden:

C 27.78. H 4.63, N 10,10. P 8.90%.

Beispiel 5

213 mg eines gut getrockneten 4-Morpholin-N,N' - dicyclohexylcarboxamidinium - uridin - 5' - phosphat-ii-pyridylesters und 445 mg Tri-n-butylammonium-rj-D-glucose-1-phosphat wurden zu 10 ml Triäthylphosphat zugesetzt. Man ließ das so hergestellte Gemisch 2 bis 3 Tage bei 30" C stehen, 10 ml Wasser wurden zugesetzt und dreimal mit Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Kolonne von 2 χ IO cm aus DEAE-Cellulose vom Cl "-Typ gegeben und die Kolonne mit Wasser gewaschen. Nachdem UMP mit 0,003n-HCl 0,02n-LiCl eluiert worden war. wurde die UDPG-Fraktion mit 0.003n-HCl,0,06n-LiCl eluiert. Die erhaltene UDPG-Fraktion wurde mit LiOH auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt, im Vakuum zur Trockene eingedampft, in 5 ml Methanol gelöst und dann mit einer gemischten Lösung aus 35 ml Aceton und 5 ml Äther versetzt, wobei ein weißer Niederschlag erhalten wurde. Der erhaltene Niederschlag wurde in 3 ml Methanol wieder gelöst und mit einer Mischung aus 30 ml Aceton und 5 ml Äther versetzt, wobei ein weiterer Niederschlag erhalten wurde Der zweite Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und im Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet, wobei 15S mg eines Lithiumsalzes von P'-(Uridin-5')-P^:-('/-n-glucosc-l I-pyrophosp'nat (Li₂UDPG ■ 61I₂O) erhalten wurden.

Analyse für C₁₅H₂₂H₂O₁₇P₂ Li₂ 6Ii₂O:

Berechnet:

P 9.00. Phosphor zu Undin /u Glucose = 2:1:1: gefunden:

P 8.90, Phosphor zu Uridin zu Glucose

= 1.98:1,00:0.97.

Beispiel 6

520 mg Dicyclohcxylguanidinium-cytidin-S'-phosphorsäurcamid und 150mg O-Phosphoryl-N-carbobenzoxy-i -serin wurden zu 50 ml Tribcnzylphosphat gegeben. Das so hergestellte Gemisch lieft man einen Tag bei 40 C stehen. Nach Zugabe von 50 ml Wasser wurde das Reaklionsgcmisch dreimal mi! jeweils 50 ml Äther extrahiert. Die erhaltene wäßrige Schicht wurde durch eine Ionenaustauscher-Kolonne in der HCC)O -Form «cuehcri. das Harz mit Wasser und dann mit 3 1 1 n-HCOOH 0.2-m IK(K)NH₄ gewaschen. Nachdem die UV-Absorption des ausströmenden Gutes verschwunden war. wurden etwa 21 2 n-HCOOH 0.2™ IK (X)NH₄ durch die Kolonne gegeben, um CDP-N-Cjrbobenzoxy-i-serin zu eluicren. Die so erhaltene Fraktion wurde durch eine mit 1 g Aktivkohle beschickte Kolonne gegeben, um das gewünschte Produkt zu adsorbieren, die Kohle wurde mit Wasser gewaschen und mit konzentriertem NH₄OH H_:O VlOH (0.5: 50: 50) eluiert. Das

Eluat wurde im Vakuum zur Trockene eingeengt. Man erhielt DCP-N-Carbobcnzoxy-i.-scrin in einer Ausbeute von 80%. berechnet auf das ι.-Serin. Zu diesem Produkt wurden 50 ml 30%ige MeOH und 100 mg IO%ige Palladiumkohle zugegeben, und s 8 Stunden eine katalytischc Reduktion durchgeführt. Nach dem Filtrieren wurden 20 ml konzentrierter NH₄OH-H₂O--LtOH (0.5:50:50) zu dem Rückstandskuchen zugegeben, um das gewünschte Produkt zu eluieren. Das Filtrat und Eluat wurden gesammelt und konzentriert. Nachdem die konzentrierte Lösung durch eine 10 ml Kolonne eines Ionenaustauschers vom [HCOO] "-Typ geleitet worden war, wurde das Harz mit Wasser gewaschen und dann mit 0,1 n-HCOOH (etwa 100ml) eluiert. Die das CDP-L-Serin enthaltende Fraktion wurde gesammelt, an 1 g Aktivkohle adsorbiert, mit Wasser gewaschen und dann mit 100 ml konzentriertem NH₄OH-H₂O-EtOH (0,5:50:50) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum konzentriert und mit 100 mg Bariumacetat-Monohydrat versetzt. Nachdem das Bariumacetat gelöst war, wurde Äthanol zugegeben, wobei etwa 200 mg Bariumsalz des CDP-I.-Serins (C₁₂H₁₈O₃N₄P₂Ba · C₂H₅OH · H₂O) ausgefällt wurden.

Analyse für C₁₂H₁₈O₁₃N₄P₂Ba · C₂H₅OH ■ H₂O:

Berechnet:

C 24,42, H 3,81, N 8,13. P 8,99%;
gefunden:

C 24,95, H 4,20, N 7,95. P 8.74%.

[.<]? +T (C = 1,0; H₂O).

Beispiel 7

0.5 g Dicyclohexylguanidinium -T- desoxycytidin-5'-phosphorsäureamid und 150 mg O-Phosphoryl-N-carbobenzoxy-i.-serin wurden zu 50 ml Triäthylphosphat gegeben, das Gemisch 1 bis 2 Tage bei 40^C stehengelassen, und dann wie im Beispiel 7 beschrieben behandelt, wobei sich eine Ausbeute von 150 mg Bariumsalz des 2'-Desoxycytidin-5'-diphosphat - l - serin (DCDP - ι. - Serin) (1 2 Äthanol -5H₂O) ergab.

Analyse für C₁₂H₁₈O₁₂N₄P₂Ba · 12C₂H₅OH -5H₂O:

Berechnet ... N 7,76. P 8,57%;
gefunden .... N 7,89, P 8,45%.

[«]? +9° (C = 1.0; H₂O).

Beispiel X

117 g (0.1 mMol) Di - (4 - morpholin - N.N' - dicyclohexykarboxamidinium) - salz des P'-(Guanosin - 5') - P² - (4 - morpholin) - pyrophosphat (GDP-Morpholidat) (4 Moleküle Kristallwasser) wurden durch eine azeotrope Destillation im Vakuum dehydratisiert. Die azeotrope Vakuumdestillation wurde dreimal unter Verwendung von Pyridin und zweimal unter Verwendung von wasserfreiem Benzol durchgeführt. Getrennt wurden 293 mg (0.4 mMol) Tnbutylammoniumguanosin-5'-phosphat unter Verwendung des gleichen Dehydratisierungsverfahrens getrocknet.

40

45 Die beiden getrockneten Verbindungen wurden zu 20 ml Triäthylphosphat gegeben und einige Tage bei Raumtemperatur (etwa 25 C) stehengelassen. Nach Zugabe von 25 ml Wasser wurde das Gemisch in eine Kolonne von 2 χ 35 cm mit DEAE-CcIIuIose vom HCO₃~-Typ gegeben, gründlich mit Wasser gewaschen und dann nach einer Lincargradient-Mcthode unter Anwendung von 3.5 I Triäthylammoniumhydrogencarbonat (0.005 bis 0.5 Mol) eluiert Es wurden Fraktionen, die GDP-Morpholidat und GMP als erste Spitze, GDP als die zweite Spitze und GP₃G als die dritte Spitze enthielten, erhallen; Ausbeute 82%.

Die dritte Fraktion wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft. 25 ml Methanol wurden zu dem Rückstand zugegeben und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Die Eindampfung wurde viermal durchgeführt. Schließlich wurde das so erhaltene Produkt in 5 ml Methanol gelöst und mit einer Acctonlösung die 1 Mol Natriumjodid in einer Menge 2fach äquivalent zu den phosphorhaltigen Resten enthielt, vermischt. Es wurden weitere 25 ml Aceton /u tierr Gemisch gegeben und der erhaltene weiße Niederschlag mit Aceton gewaschen und im Vakuum cetrocknet, wobei das Natriumsah? des P'.P³-Di-(gu:.nosin-5')-triphosphats erhalten wurde. Das Produkt zeigte einen einzelnen Fleck mit einem R_r-Wcrt vor 0.32 bei der Papierchromatographie unter Verwendung von Isobuttersäure 1 Mol Ammoniuinhydroxyd — 0.1 Mol Tetranatriumälhylendiaminkuaessigsäure (100:60:1,6).

Beispiel 9

830mg Bis-(tri-n-octylammonium)-i>-maiiP,. -^ «-!-phosphat und 320 mg 4-Morpholin-N.N'-dk·. :■■'■ hexylcarboxyamidiniumguanosin - 5' - phosphors;", u:. morphohd wurden zu 25 ml Tri-o-cresylphosphai ugesetzt und die Reaktion 3 bis 4 Tage'bei Raurni··^- peratur durchgeführt. Nachdem das Reaktion- -■ misch wie im Beispiel 2 behandelt worden war wu< i. die erhaltene wäßrige Schicht durch eine Kohv.u von 3 χ 30 cm mit DEAE-Cellulose vom H(O Typ gegeben, die Kolonne wurde mit Wasser -ι waschen und dann nach einer Lineargradient-Vl·.-thode unter Anwendung von 3 1 0.005-m Triälh-J ammoniumhydrogencarbonat vom pH-Wert 7.5 upa! 3 1 0.15-m Triäthylammoniumhydrogencarbonat \< -m pH-Wert 7..-» eluiert. Die erhaltene Hauptfraktu-n wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft mui in 10 ml Wasser gelöst. Die erhaltene Lösun" win,:.. im Vakuum zur Trockene eingedampft IXm Im dampfungsvorgang wurde nochmals wiederhol Nachdem der Rückstand in einer Heringen Men-, Wasser gelost worden war. wurde die Lösunu ;;n einer Kolonne von 2 χ 15 cm mit einem Ionenaustauscher vom Cl "-Typ adsorbiert und nach emc. Lineargradient-Methode unter Anwendung von ^ I 0.003 n-HCl und 3 1 einer 0.003 n-HCl 0 \5 n-L iCi-Losung eluiert. Die gewünschte Fraktion wurde au! einen pH-Wert von etwa 5.0 mit LiOH eingestellt und im Vakuum zur Trockene eingedampft.

Das Rückstandsprodukt wurde in einer ccriiveii Menge Wasser gelöst und Methanol Aceton zu der Losung zugegeben, wobei ein Niederschlag erhallen wurde. Der Niederschlag wurde mit Äther gewaschen und dann getrocknet, und man erhielt 231 mg eines

Lithiumsalzes des P'-(Guanosin-5')-P²-(<.-i>-mannose-l)-pyrophosphals (Li₂GDPM -6H₂O).

Analyse für C₁₁₁H₂₁N₅O₁₁₁P₂Li₂ ■ 6H₂O:

Berechnet:

P 8.50. P zu Guanosin zu Mannose = 2:1:1;
gefunden:

P 8,01. P zu Guanosin zu Mannose

= 1,89:1,0:1.01.

Beispiel 10

221mg (0,2mMol) Bis - (4 - morpholin - N.N'-dicyclohexylcarboxamidinium) - adenosin - 2.3' - cyclophosphat-5'-phosphorsäuremorpholid wurden durch azeotrope Destillation im Vakuum mit wasserfreiem Pyridin durch azeotrope Destillation im Vakuum unter Anwendung von wasserfreiem Benzol stark dehydratisiert. Gesondert wurden 368 mg (0.6 mMol) des Bariumsalzes des ( + )-Pantethein-4'-phosphals · (6H₂O) durch ein lonenaustauschverfahren unter Anwendung eines Ionenaustauschers vom H⁺-Typ entsalzt, mit 1,2 mMol Tri-n-butylamin versetzt und dann azeotrop mit wasserfreiem Pyridin und Benzol dehydratisiert. Beide auf die vorstehende Weise hergestellten Verbindungen wurden in 10 ml Triüthylphosphat gelöst. Man ließ die Lösung einen Tag bei Raumtemperatur (etwa 25 C) stehen und engte anschließend die Lösung im Vakuum ein. Nach Zusatz von 10 ml Wasser wurde die Lösung dreimal jeweils mit 10 ml Äther extrahiert, die erhaltene wäßrige Schicht im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nachdem der so getrocknete Rückstand in 10 ml 0.1 n-HCl gelöst war. ließ man die Lösung etwa 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Die Lösung wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft, 5 ml Methanol zu dem Rückstand gegeben und das Gemisch wiederum im Vakuum zur Trockene eingedampft. Nach zweimaliger Wiederholung dieses Verfahrens wurde der Rückstand in 3 ml Wasser gelöst, die Lösung mit NH₄OH auf einen pH-Wert von etwa 6.0 eingestellt, und es wurden 4 ml 2-Mercaptoäthanol zu der Lösung zugegeben. Man ließ das Gemisch über Nacht stehen. Das Gemisch wurde mit etwa 50 ml Wasser verdünnt und durch eine Kolonne von ? χ 30 cm mit DEAE-Cellulose vom Cl~-Typ gegeben. Nach dem Waschen mit Wasser wurde eine Lineargra·· dientenelution durchgeführt unter Anwendung von 1.5 1 0.003 n-HCl und 1,5 1 0,003 n-HCl/0,15 n-LiCl.

Die die dritte Spitze aufweisende Fraktion (enthaltend CoA und Iso-CoA; Ausbeute etwa 80%) wurde gesammelt, auf einen pH-Wert von etwa 4,3 mit LiOH eingestellt und anschließend im Vakuum zur Trockene eingedampft. 5 ml Methanol und 50 ml Aceton wurden zu dem Rückstand gegeben und da⁽·

ίο Gemisch gut gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde gesammelt und wieder mit Methanol/Aceton behandelt. Das Auswaschen mit Methanol/Aceton wurde wiederholt, bis keine Cl-Ionen mehr in der überstehenden Flüssigkeit festgestellt wurden. Der

is Niederschlag wurde getrocknet. Er wurde dann in 50%igem wäßrigem 2-Mercaptoäthanol gelöst und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Lösung wurde durch eine Kolonne von 3,5 χ 50 crn mit Ionenaustauscher-Cellulose vom Cl"-Typ gc:- geben. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und dann nach einer Lineargradient-Methode unter Anwendung von 2,5 1 0,03 n-LiCl/0,003 n-HCl und 0,10 n-LiCI/0,003 n-HCl eluiert. Die Spitze A (Iso-CoA) und Spitze B (CoA) wurden getrennt auf einen pH-Wert von etwa 4,5 mit LiOH eingestellt und beide Fraktionen getrennt mit Methanol/Aceton versetzt, wobei sich ein Niederschlag bildete. Auf diese Weise wurden 39 mg eines Lithiumsalzes des CoA-(Coenzym A) bzw. 35 mg eines Lithiumsalzes des Iso-CoA erhalten. Das Verhältnis von Phosphor zu Adenosin betrug 2,97.

Analyse für C₂₁H₃₃N₇O₁₆P₃SLi₃ · 6H₂O:

Berechnet:
C 28.84, H 5,08, N 10,98%;

gefunden (nach Trocknung bei 100 C):
C 28.54, H 4,98, N 9,85%.

Vergleichs versuche:

Zum Nachweis der technischen Überlegenheit de;

erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den bi;· kannten Verfahren wurden Vergleichsversuche durch geführt, deren wesentliche Daten und Ergebnisse ir der folgenden Tabelle zusammengefaßt sind.

\ crtithrcn	F'roiluki	Ausgangsmaterial	Verwendete«.	Rcaktinns-	Reakiions-	Ausbeute
			Losungsmittel	temperatur	7CIl
Beispiel 1	FADLi,	N.N -DilacIo-	Tri-n-prop\l-	Raum	4 Taue	51.0%
		hcxjlcarb-	phosphai	temperatur		(Isolierung
		oxamidium-
		adenosin-
		5-phosphor-
		saureamid
Literatur I	FADLi,	desgl.	o-Chlor-	Raum	4 Tage	40.0%
			phenolpjridin	temperatur		(Isolierung)
Beispiel 2	P'-lPredniso-	Prcdnisolon-	Tricydohexyl-	60 C	5 bis lOStd.	90.8%
	lon-21).	21-phosphor-	phosphat			(Isolierung)
	P^:-(Adenosin-5'l-	säuremorpholid
	pyrophosphai
Literatur 2	desül.	desgl.	P\ridin j	60 C	16 Std.	30.0" η

13

Verfahren

Beispiel 6

Literatur 3

Beispiel 7

Literatur 3

Beispiel 8

Literatur 4

Beispiel

CDP-N-Carbobenzox\-i.-serin

desgl.

d-CDP-L-serin

desgl.

GP₃G

GDPM

Literatur 5 ι CiDPM

Beispiel 10 I CoA & iso-CoA

Fortsetzung ...,,ι I Verwendete* 14

Literatur 5 , CoA & Iso-CoA

Dii:yclohex\lguanidiniumcytidin-5'-phosphorsiiureamid

desgl.

Dicyclohexyl-

guanidinium-

2'-desoxycytidin-

5'-phosphor-

sa'ureamid

desgl.

GDP-Morpholid

4-Morpholin-N.N'-dicyclohcxylcarboxamidiniumguanosin-5-phosphormorpholid desgl.

Bis-(4-morpho-

lin-N.N-di-

cyclohexvl-

carbiv\ymidi-

niumi-.ulcno-

sin-2.

Phosphat-

5-phosphor-

morpholid

dcsul.

Trihen/oylphnsphal

o-C'hlorpheiiol

Trial In I phosphat

o-Chlorplienol

Triäthylphospiuit

DMSO

Tri-o-cresylphosphat

l'yridin

Tri.ithylphdsphai

'\ridin

l.iieniiur 1: H Ci K h«riiiii cl;il: ".I Am I hem Sue·· W. "5'Ml¹J^ Literatur Γ: Λ. t- N u ^ s b λ u ni ct;il. --Tctriihciirtni" 2U. 24ii" I I9f>4i l.iicriiiur 3: Y. \ u r u k u « ;i el .il: »Cliem l'h.irm Huil-Jnpii»" I?. l'> l.iieniiur 4. J.G. M ο I I ;i 1 t etiil:».! Am (hem So_c .. SS. iv'X ! im.f \ l.iieniliir 5: H. G K h κ r ;ι η ii et ;il. -J. Am ('hem .Sue ·· S3. fö'M I¹X-I C

C
C

C

Raumtemperatur

Tag

Tage
bis 2 Tagu

Tage

mehrere
Tage

Tage

bis 4 Taue

Raum- ' 4 Tage

temperatur j

Raum- 1 Tag

temperatur

Raum- ! 15 Std.
temperatur ι

Λιι·. heule

80% (Reaktionsausbeuie)

19% (Reaktionsausbeute!

i. /,0 /d

(Isolierung)

4,3%
(Isolierung)

8">o ■
i. /n

(Isolierung)

23%
(Isolierung)

69,1%
(Isolierung)

63.0" „
(Isolierung)

80.0% (RcaklioiisausbcuK

j 55.4% (Rcak i lionsausbcuti

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Diestern kondensierter Phosphorsäuren der allgemeinen Formel

mittel einen oder mehrere Phosphorsäuretriesier der allgemeinen Formel verwendet