DE1620643A1 - Verfahren zur Herstellung von neuen Dinucleosidphosphaten - Google Patents

Description

Ur. Walter Beil / .;

Dr, fr^us vnr. bed

Ktchlsa: -./;i;_tc

Frankfurt a, M.-Höchst

Ädelonstraße5&-TeL312649

Unsere Numiaer: 13 015

The Upgohn Company Kalamazöo, Mich. _s USA

Verfahren ziir Herstellung von neuen Dinucleosidphosphaten

Die vorliegende Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von neuen 3',5 V- und 2» ^'-Dinucleosiäphosphaten, in welchen einer ' der Nucleosidanteile ein 9-ß-D-Ribofuranosyl-7"deajaapurin-5^l-yl-' rest ist._: *

Die neuen Verbindungen und das allgemeine Herstellungsverfahren können durch die iOrmelfolgen A und B dargestellt werden:

60 9 Ö2Ö / 1 d 2 i BAD ORIGINAL

A.

(HO)₂=P-OCH₂

TO-CH_{2 /Q}\

I Ma

INb

ORlGJNAt INSPECTED

009820/1828

16206Λ3

aus I I

-..4 - 0G9820/1B28 ; .-

ORIGINAL INSPHCTED

oder

HO-CH₂

HO-P=O

J— C H₂

0- CHa

" ⁵ - 0 09820/1821

. -5 - ^ 1820643

In äetL vorstehenden lormelii bedeuten^

R₁ und Hg Alkylreste mit ί T>is ^ Kohlenstoffatomen^ ode^r zusammen eine Allcylenlcette mit. 4 bis; 6 Kolilenstöf^tomen;

T eine Tripheiiylme-tiliyl-,, etoe Cp^etac^yp^eny^^lisiieayl-

ader eine bis(p:H!iethOxyjihenyl^

X Wasserst of£_r a-^toöxy ade^B^jnffröaqjr;

Z ■Wasserstoff, E$dmu&$_t Jüniäiö, Aö^Bamdatio (woläei ül& Acyl

gruppe 2 Ms 12: EoiLlenStöfffatomen entiiält), Aiilsoyl, Merospto oder Alteä#ffie;Eösr£tö (wofei die Alkylgrtippe α4ΐβ weiter oben "bereitsi a&g&g&bmm Bedeutung Mt};

Y Öytosiii-1-yl, Uräc£l-1-yl-, !Enyjain^i -yl- tsgf. ^-I

uracil-i-yl), Ädenjin-Q-yl (tzw. 6-^toiiiopurin^9

droxypurin-9ryl)>. 6-Mer-S-ELuorouracil-i-yX, 5-

Onloruracii-I—yl, 5-BifoiiiuraGil^i-yl, 5-Joäüraöil-i-yl, 5-2rifluormethyluracil--1--yl, Hypoxanthin^B'-yl^ ("bäzw. 6-Hydroxypurin-9-yl)» XantMn~9-yl ("bzw. 2,ö-Diiiyäroxypurin-9-yl) , 5-Methylcytosini-l -yl, ^MetiLylcytosin-i -yl,

7-Deazade]iin-9--yl» 6^

Y¹ Gruppen wie bei Y angegeben ι die aoylierbare ßübstitU'-enten, z. B. Aminogruppen, enthalten, so daß sie nach ' der Acylierung gegen Eeafction mit den Phosphatestern geschiitzt sindir Nach der Acylierung kann Y¹ z.B.

cytosin-1 -yl, -uraeil-1-yl, [-thymin-1-yl, IT -Acyladenin-

ο "■"'■"■"

9-ylV K --Acylguanin-9-yl * -6-mercaptopurin-9-yl > -uracil-

-'5-fluorouracil·-1-yl, ^^οηίοϊο^ιτβοίΐ-ΐ-οτΐ, -5-bro·

mpuracil-1-yl, -S-iodöuracil-i^yl, !~5-triflouromethylura« -hypoxanthin-9-yl^ -s:anthin-9-yl, IT -Acyl-5-

y 2-)methylcytosin^i —yl^N , § -bis(Aeylamino)purin-9-ylV IT^-Acyl-S-O-acyloxymethylcytosin^i-yl, U -Aoyl-7-deazaadenin-9-yl{ -6-mθrcapto-7-deazapurin-9'"yl·ί -7-deaza-hypoxanthin-9-yl oder -6-azauraoil-i-yl sein, wobei die Acy!gruppe die bereits.angegebene Bedeutung hat.

^BAD

B. Herstellung dear ZwiErclieaprodulcte (X) für die Phosphorylierung in- £· ~G*-

TO-GH₂ γ

H H

H X

Vl

TO-CH₂ λ γι

HOCHa

VII

OAC

TO-CHb

ÄcO-

I H

w x

H₂

. Y¹-

3Ac

VIII

HQCH₂ H

IX

OH

BAU

009320/1Ö28

Mzm 43

In den vorstehenden Formeln l^ben ΐ, X Y und Y¹ die bereits angegebene Bedeutung, Ae ist eine Aeylgruppe der weit er oben definierten Art. X¹ kann Wasserstoff:, oc-QAcoder B-OAg sein. Bedeutet X Wasserstoff, d.h handelt es sich bei der Verbindung T um 2-Deo2yrIbofuranosiä, und kann gleichzeitig Y in der Verbindung Y nicht acyliert werden, so erhält oan die Verbindung X durch einfaches veräthern der Verbindung V mit <=inem geeigneten Triphenylhalogenmethan in der nachfolgend beschriebenen Weise > d.h. ,die Verbindungen VI und X sind gleich.

Die vertikale Wellenlinie mit Sübstituenten an beiden Edden zeigt an, daß die Substituenten sowohl in der oC-Stellung (d.h. unter der Ringebene) oder in ß-Stellung (d.h. über der Hingebene) angeordnet sein können.

Die Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung können beispielsweise -folgende Acylgruppen enthalten: Acetyl, Propionyl, Butyryl, Valeryl, Isovaleryl, Hexanoyl, Heptanoyl, Octanoyl, Honanoyl, Decanoyl, Undecanoyl, Lauroyl, Benzoyl, Phenylacetyl, Phenylpropionyl, p-ToluqpL, ß-Gyclopentylpropionyl u.a.

Die heterocyclischen Reste Y entsidien, wenn in der'Stammverbindung an der Stelle, die durch die Zahl, vor der Endung "-yl" bezeichnet ist, ein Wasserstoffatom entfernt wird. Die Reste Y entsprechen daher den folgenden Formeln:

BAD ORlGiNAL

009820/1828

8 -

NHe

Cytosin-1-yl (a)

H -

U raci 1-1-yl (b)

Th.ymin-1-yl (c) .

Adenin-9-yl (d) Guanin-9-yi (e)

>-■■■"!

flfirtj

ίΗ

-We FGa ptopu r 1 η - 9- y

Uracfi-3-yl (g)

5-riuorouracM-l-yi (h)

H-

5-ChiorouTacl1-1-yl 5-Bromouracl 1-1-(j)

5- Iodouracl 1-1-yl 5-Ϊ ri f luorome thy 1- Hypoxanirhi n-9"y 1 (k) uracf1-1-yl (m)

^anthin'9-yi (n)

5-Methy 1c/tosln-l-y1 (o)

-10- 00^20/1828

IH

CH₃-

3-Methylcytosin-l-yl

(ρ)

NH₂

CH₂OH

if-; -"Ί'

2,6-3) iami nopurin-9-yl

IH₂

S-Hydroxymethylcytosln-l-yl 7i)eazaadeiiin-9-yl (r) (s)

;h

6-Mercapto-7-cleazapurin-9-yl T^eazahypoxa (t) (u)

6-izaurac!l-l-yl (v)

- 11 -

BAD ORIGINAL

0 0982 0/1828

Die vorstehenden Verbindungen,. z.B. eier Uraoil-(b) und die sübBtituiertenUracil-Reste (e), (g),.(h), (i), (j), (k) und (1) Bind in der Ketoform dargestellt und nickt in der tautomeren Enolform. Die übrigen Reste können ebenfalls in der tautomeren Form dargestellt ■werden. Beispielsweise können die Cytosin- und substituierten Cytosin· Reste (a) und (o), die vorstehend in der Aminoform dargestellt sind, auch in der tautOmeren Iminoform dargestellt werden. Vielt der Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung stellen ein Gemisch dar, in dem die beiden möglichen Formen in Gleichgewicht vorliegen.

Durch das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung soll erreicht werdea daß die Stellen im heterocyclischen Teil und im Zuckerteil des MoIeküles,die mit Phosphorsäure oder einem Phosphorylierungsmittel reagieren können, geschützt werden, während gleichzeitig die 2'- oder 3'- und 5'-Steilungen für die Umsetzung mit dem Phosphorylierungsmittel zur Verfügung stehen. Von geringfügigen Abweichungen abgesehen, die sich aus der Art des jeweils im Einzelfall verwendeten Nucleoside ergeben, kann der Ablauf des erfindungsgemäßen Verfahrens wie folgt beschrieben werden:

Ein 9-(2' ,3^l-Di-0-isopr.opyliden-ß-D-ribofuranosyl)7-deazapurin der Formel I (Verbindung 1) wird mit; einem Pho&phorylierungsraittel, z.B. 2-Cyanoäthy!phosphat, in Gegenwart eines Kondensationsmittels und danach mit einer Base zu dem entsprechenden 5'-Phosphat der Verbinäui$ I umgesetzt. Die so gewonnene Verbindung II wird unter wasserfreien Bedingungen mit einem Eucleosid-S'-äther der Formel X in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie DiGyclohexylcarbodiimia zu einem Dinucleosiaphosphat der Formel IHa (wenn X = H ist) oder einer Mischung von iTucleosiden IiIa und Illb (wenn X » OH ist) umgesetzt.

Die Produkte können nacheinander mit Säure und Base oder nur mit Säure hydrolysiert werden, wobei man je nach der Art des Verwendeten. Ausgangsmateriales imd ä©r Art der Hydrolyse als Endprodukte die Verbindungen IVa, IVb, IVc oder I-Vfl erhält. Durch die Säur© werden die Äthergruppen (iDrityl- und p-ketAOxgrisutistitaierte. Sritylgstippeü) uncl die Acetalgruppen entfernt«' Durch file Bape werden der aminosubstituierten Nucleoside entfeimt«

__ia 009820/1121 ^ßÄD

Me neuen Dinucleosidphosphate der Formeln IVa, ITb, IVc unü IVd weißen in vitro eine starke cytotoxische Aktivität auf, und zwar insbesondere gegen die verschiedenen Arten von Herpes-, Coe- und Vacciniaviren. Infolgedessen kann man die Verbindungen zum Reinigen der Glas geräte und Instrumente verwenden, die zum Züchten von Gewebekultüren für die Virus- und Tumorforschung dienen. Man kann sie auch zum Waschen von ausgeschnittenem Tumorgewebe" verwenden, das in Tiere verpflanzt werden soll, um das Wachstum von KB-Tumorzellen zu verhindern, die sonst in das umgebende Gewebe oder in andere Teile des Körpers gelangen könnten. Die antivirielle Aktivität der erfindungs-

tn
ι kann auch dazu benutzt werden, um

phagozytenfreie Fungi- und Bakterienkulturen, insbesondere phagozyten Ψ freie Streptomyces-Kulturen herzustellen.

Die Verbindungen der Formeln IVa und IVb können wegen ihrer Wirkung gegen Bakterien und Fungi auch ganz allgemein zum Reinigen von Instrumenten und Glasgeräten verwendet werden, die durch Bakterien oder Fungi verunreinigt sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind darüber hinaus interessant, weil sie chemisch nahe mit dem Adenosin verwandt sind, welches einer der Bausteine der Ribonucleinsäuren ist, die ihrerseits die Proteinsynthesen und das genetische Geschehen in den Zellen steuern.

Die Ausgangsmaterialien der Formeln I und X werden nachstehend in den "Präparaten" erläutert. Man geht beispielsweise von einem 7-Deazapurinylribofuranosid aus, in welchem die Hydroxygruppe an den 2¹- und 3'-Kohlenstoffatomen durch cyclische Acetalbildung (I) geschützt ist, und phosphoryliert nach der Methode von G.M. Tener, J.Am. Ohem. Soc. 85, 159§ (1959)= Die Lösungsmittel, die für dieses Verfahren verwendet werden^ müssen wasserfrei und hydroxylgruppenfrei sein? das PhosphoryXierumgsmittel, ein Phosphatester, muß in ihnen löslich sein Geeignete Lösungsmittel sind "beispielsweise Pyridin, Picolin, lutidin

009 820/1828

• - 13 -

Auch neutrale Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid_s Tetrahydrofuran, Ν,ΙΤ-Dimethylacetainiä oder Dioxan sind geeignet, vorausgesetzt, daß' pro Mol Pnosphq^lierungsmittel ein Äquivalent eines basischen Mittels ζ.Β» Pyriäin_s zugefügt wird» Mir diesen Zweck ebenfalls geeignete Basen sind -weiterhin Picoline _t Ijutidine und Trialky!amine..

Phosphatesterj die leicht durch eine starke Base₉ Z₀B₀ ein Alkalimetallhydroxid j gespalten werden können, sind insbesondere 2-substitulierte Xthyläihydrogenphosphate der Formel

t■-.■"■"■ - - . ■. ¹^ ;

- ■ Z-OH-OH₂-O-P-QH '-■■

R OH

In dieser Formel bedeutend R Wasserstoff oder eine niedere Alkylgrup=- pe; Z einen stark elektronegativen Substituenten wie -G-R", '■ . - . - ^:

O O -...'■-■

£-j j r·? ο —v/JLo "SiJUt

s, -JO₂J'-COOR*¹ *, -HO₂ u,äc E¹¹ eine niedere Alkyl- oder Arylgruppe j R' ■' ⁸ Wasserstoff oder eine niedere Alkyl- oder Arylgruppe_o

Besonders geeignet ist 2-=Cyanoäthyldihydrogenphosphat_ö Anstelle die= ser Verbindung können auch andere.Mhydrogenphosphatester verwendet werdenj, die leicht durch eine-.Base, gespalten werden'können_o Beispielsweise sind geeignet! o- und' p-sub©tituierte Phenyldibyärogenpkospiia-be wie ο-= und p-Carttoxyphenyldinydrogenpliospliatj" o- und p^Carbämoy!phenyl dihydrogenphosphat-sowie_o~ und■p-Cyanophenyläiayärog@npho©phato

In der Lösung _v' die äs© ß-substituie-rt© Ithylflihyärogenpliosphat @ä«r o- oder" p-substituier-t® Pltenyldihyäregtnphospliat ©nthält_s- wirä is© weiter oben "bereits ©r^iJmt® gusckütit®. 2⁸ gJ^O-llkyliäeai'i'bQfmi'ano= eyl.-7-deassapurin gelöst * wob©! geg©nf©ll© auf- ©to© !©iffig-esatur zwischen HO und 5O⁰C erwärmt wird«, Sobald si oh alles 9- (2⁹;-, 3'■ '-Dl-O-

- 14 - 0 0 9020/182t

BAD ORIGINAL

alkyliäen-ß-D-ribofuranosyl)7-deazapurin gelöst hat, gibt man das Kondensationsmittel, z.B. ein alkyl- oder aryl-substituiertes Öarbodiimid, vorzugsweise Dicyclohexylcarbodiimid, zu. Außer Garbodiimiden können auch andere Verbindungen, z.B. p-Toluolsulfony !chlor iö Methoxyacetylen, Ketenimine, Trichloracetonitril, substituierte Cyanamide, a-substituierte Acetonitrile, Alkyl- und Arylis ο cyanate, öarbonsäurenhloride, Aralkylchlorearbonate u.a. verwendet werden.

Die Umsetzung wird vorzugsweise bei Temperaturen durchgeführt, die etwas über Raumtemperatur liegen, d.h. bei !Temperaturen zwischen 20 und 4O⁰C. Ggfs. ist es auch möglich, bei tieferen Temperaturen, z.B. bei etwa 5⁰O, zu arbeiten; ebenso ist es in besonders gelagerten lallen möglich, die Umsetzungstemperatur bis auf etwa 75⁰O zu erhöhen? ohne daß unerwünschte Hebenreaktionen eintreten. Bei Temperaturen zwischen 20 und 40⁰O und sinnvollen Konzentrationen sind bis zur Beendigung der Umsetzung etwa 4 bis 72 Stunden erforderlich. In vielen fällen genügt eine Umsetzungsdauer von etwa einer Stunde bis zu 8 Tagen. Je größer die Verdünnung des Reaktions· gemisches ist, umso längere Reaktionszeiten sind erforderlich.

Die Konzentration der Reaktions teilnehmer ist nicht kritisch. Bei Verwendung äquimolarer Mengen von 9-(2', 3^l-Di~■0-alkyliden-■ß-D-ribofuranQSyl)'~7-ä@az&aäenin (A), 2-substituiertem Ithy!phosphat (B) und basischem Katalysator (0) erreicht man quantitative Umwandlungen! wenn man das Reaktionsgemisch genügend lange stehen läßt. Um die Reaktionszeit abzukürzen_? verwendet man jedoch B im Überschuß über die Verbindung Aj vorzugsweise verwendet man drei bis vier Mol B pro Mol Ac Sobald die Reaktion beendet ist, setzt man eine kleine..Menge Wasser-zu₅ um das Phosphorylierungsmittel und das Konüansationsmittel su inaktivieren_a Die lösung wird dann filtrierij um unlösliches Material au entfernen; bei dem letzteren kann es sich, um (!!substituierte Harnstoffe h&näeln, die aus der Umsetzung von Carbodiimide!! mit Wasser herstammen. Das Filtrat wird dann direkt für die nächste Stufe, d.h. die Spaltung, verwendet.

-15-

00982071828

1120643

Zur Durchfü^ung eier Spaltung wircl die vorstehend erhaltene Lösung mit wäßrigem Alkalihydroxid behandelt* Vorzugsweise engt man die Lösung, aie äas 9-(2^l,3^l--I)i-Q-älkyliden-ß-I)-ribofuranosyl)--7~äea25apurim-5 · -yl-2-cyanoäthyl~phosphat enthält, zunächst auf, ein kleines- Volumen ein, am besten unter Vakuum. Sobald das Volumen soweit vermindert ist, daß beim Abkühlen ein viskoser Rückstand bleibt, setzt man eine Base, z.B. wäßriges Lithium-, Natrium- oder Kaliumhyäroxid mit einer Normalität von 0,4 bis 2 zu, so daß der pH-Wert der Lösung auf 12 bis 1J ansteigt; man arbeitet bei tiefen Temperaturen zwischen -10 und +20⁰C Wird die Reaktion unter kräftigeren Bedingungen, z.B. bei höheren Temperaturen oder bei längeren Umsetzungszeiten durchgeführt, so erhält man eine Verbindung II, in welcher der basische Substituent Z nicht acyliert ist, auch wenn er vorher aeyliert war* Nach Beendigung der Umsetzung wird die Mischung abgekühlt und filtriert. Aus dem IiI-trat wird das Produkt II in üblicher Weise, z.B. durch Extraktion, Verdampfen, Ausfällung in Form unlöslicher Phosphatsalze, Absorption und Desorption an Harzen, Umkristallisation u.a. gewonnen.

Das so gewonnene 9-(2',3'-0-Alkyllden-ß-D-ribofuranosyl)^7-deazapurin-5¹TPhOSPhAt (II) wird anschließend mit einem Furanosy 1-5'-äther der Formel X kondensiert. Vorzugsweise wird die !Condensation mit äquimolaren Mengen, der Verbindungen II use X-in wasserfreiem Pyridin in Gegenwart eines Kondensationsmittels wie Dlcycloh^xyXearbodiimid bei Raumtemperatur, z.B. bei etwa 25⁰C» durchgeführt. Anstelle von Pyridin können auch alkyl-substituierte Pyridine als Lösungsmittel verwendet werden, z.B. oc-, ß- oder7"-Methylpyridin_s disubstituierte Alkylpyridinej trisubstituierte Alkylpyridine, Dimethylformamid₉ Diäthylformamid u„ä. Die Umsetzung kann bei Temperaturen zwischen 0 und 115⁰C, am besten bei Raumtemperatur zwischen 20 und 30⁰G'-durchgeführt werden_o Die Esaktionsdauer liegt zwischen 4 Stunden imd 10 Sagen. Andere Dialkylcarbodiimide lmd Dicyeloalkylcarboäiimiä© wie Dimethyl-, Diäthyl-₉ Dlfeityl-, Dicyclopentylcarbodiiaia© falls' für die Kondensation geeignet. Als Endprodukt.©Ehält man ein 3¹ ,S'-Dimicleoeidphosphat ö©r formel HIa (wenn X Wasserstoff ist) oder eine Mischung von 2'.5^S« unä 3-iJ^-DinucleoBiäphospfesten der Formel IHa und HIb, */enn_::X;in formel (X) OH let. die" Produkte können in Üblicher W©ls® aufg@arb@it@t weise extrahiert man Verunreinigungen mit*. LSsiuagsmit'teXtte äl9 mit Wasser nicht mischbar sind, z.B. mit Petroläthe;r₈ Banaolj »Skalljsolw

009820/1121

-A⁶ ""■ BADORiQiNAt

oder B" (techn. Hexane), Tetrachlorkohlenstoff, Methylenchlorid >v iither und durch Lyophilisieren der verbleibenden wäßrigen Reaktionsmischung. Extraktion und Lyophilisation werden so oft wiederholt, bis die wäßrige Reaktionsmischung frei von flüchtigen Nebenprodukten ist. Die Produkte IHa und IHb können voneinander in üblicher und bekannter Weise getrennt werden, insbesondere durch Chromatographieren an Ionenaustauscherharzen, Lösungsmittelextraktion in Craig-Apparaturen oder durch kontinuierliche Elektrophorese; durch Umkristallisieren, PapierChromatographie oder Hochspannungselektrophorese können sie noch weiter gereinigt werden.

Die so gewonnenen Produkte IHa und IHb können für sich allein oder im Gemisch mit einer wäßrigen Säure hydrolysiert werden, um die Isopropylidengruppe und die 5^I-Trityläthergruppe zu entfernen. Bei der Säure kann es sich um eine Mineralsäure, z.B. wäßrige, verdünnte Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Jodwasserstoff sjmpe oder andere Säuren dieser Art handeln sowie um organische Säurenjs Ameisensäure, wäßrige Ameisensäure, wäßrige Essigsäure, Propionsäure u.a. oder auch um saure Ionenaustauscherharze. Wird eine wäßrige Mineralsäure verwendet, so sind brauchbare Lösungsmittel sowohl für das Produkt als auch für die Säure, Äthanol, Methanol, Aceton, Dioxan u.a. bevorzugt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet man wäßrige Essigsäure im Gemisch mit Wasser, und zwar im Verhältnis von etwa 80$ Essigsäure und 20$ Wasser.

Zusätzlich zu der sauren Hydrolyse, und zwar entweder vorher oder nachher, kann eine basische Hydrolyse durchgeführt werden, um alle Acylgruppen zu entfernen, die sich an den Aminogruppen des N-heterocyclischen TeilesXbetreffenden Nucleosides befinden. Pur die basische Hydrolyse verwendet man Lithium, Natrium, Kalium-oder Bariumhydroxid, vorzugsweise in methanolischer oder äthanolischer Lösung. Man kann auch eine mit Ammoniak gesättigte Alcholinlösung verwenden. Die Einzelheiten bezüglich dieser Hydrolysemethoden sind in den nachfolgenden Beispielen angeführt. Auf diese Weise erhält man die Endprodukte IVa und IVb, die, falls sie im Gemisch Vorliegen, in üblicher Weise voneinander getrennt werden können, wobei auf die vorstehend bei der Trennung der Verbindungen IHa und IHb angeführten Methoden verwiesen wird.

BAD _ ₁₇ _ 009820/1828

16206k3

Die nachfolgend "beschriebenen Präparate -und Beispiele dienen der weiteren Erläuteruiig der vorliegenden lärfinäung.

Präparat 1

N -Benzoy1-2',3'-O-isopropylidentubercidin

NHC

Xl

H H

O O

IT -Benzoyl-9-^' ,J'-O-isopropyliden-ß-B-ri'bofuranoayll-T-äoazaadenin

A) Herstellung von Sparsomycin A (lubercidin) durch Fermentierung: Eine Schrägbodenkulturvon Streptomyces sparsoges war. spärsogenes, NRRL· 2940 wurde verwendet, um eine Reihe von 500 ml Erlenmeyer-Korben zu inokulieren, von denen jeder 100 ml eines Nährmediums aus den folgenden Bestandteilen enthielt?

Glucosmonohydrat 25 g ,'

Pharmamedia* V 25 g -

Leitungswasser ad 1 1

•^Pharmamedia ist ein Baumwollsamenmehl mit technischem Reinheitsgrad, welches von der Pirma iCraders Oil Mill Co., Port Worth, {Cexas, USA hergestellt wird. ~~ ■ ■

....._, 009820/1828. _{ßAD 0R)Q},_NAL

Der pH-Wert des Nährmediums lag vor dem Sterilisieren bei 7,2. Man ließ die Kultur zwei Sage bei 28⁰C auf einer Gump-Drehschüttelvorrichtung mit 250 TJpM wachsen. . . . .

Eine Schutt elf las ehe mit der darin enthaltenen Kultur (100 ml) wurde dazverwendet, um einen 20 1 Tank, der 15 1 des vorstehend angeführten sterilen Nährmediums ( S-1) plus 1 ml/1 Schweineöl enthielt, zu inokulieren.' Die Züchtung in dem Tank wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 28⁰O, einer Belüftungsgeschwindigkeit von 10 l/Min und einer Bewegung von 400 UpM fortgesetzt. .

Der Inhalt des Tankes wurde schließlich dazu verwendet, ein 380 1 Gefäß zu inokulieren, welches 250 1 des" folgenden sterilen Mediums enthielt:

Glucosemonohydrat 10 g/l

Dextrin 15 g/l

Pharmamedi'a 20 g/l

Wilson's Pepton-Flüssigkeit Ho. 159* 5 g/l
Schweineöl ■ 2 ml/1

Leitungswasser Restmenge

^Wilsons's Pepton-Flüssigkeit Uo. 159 ist ein Präparat, welches aus hydrolysierten Proteinen tierischen Ursprungs besteht.

Man ließ die Fermentierung dann Ί13 Stunden fortschreiten und hielt während dieser Zeit eine Temperatur von 28⁰G ein; filtrierte Luft wurde mit einer Geschwindigkeit von 100 l/Min zugeführt; die Bewegung lag bei 28 UpM. Während des Verlaufes der Fermentierung wurden 1850 ml Schwineöl als Antischaummittel zugefügt.

B) Abtrennung von Sparsomyein A

-#ür Jiie gesamte auf die vorstehend beschriebene Weise erhaltene Gärbrühe wurde durch Zugabe von 350 ml konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,4 gebracht (der Anfangs-pH-Wert lag bei 7»1)> die angesäuerte " Gärbrühe wurde filtriert, wobei 3»6$ DiatomeeneiJde als FiItrierhilf smittel verwendet wurden.,Der Filterlaichen wurde mit 0,2 Volumenteilen entionisiertem Wasser gewaschen; die klare Brühe plus Waschwasser (Volumen gleioh 280 1) wurden mit 300 ml 50$iger wäßriger Natriumhydroxi lösung auf einen pH-Wert von 7»35 gebracht und über Nacht bei 10⁰O abgestellt. Die klare Brühe wurde dann durch Zugabe von 50 ml einer 50$igen

009820/1828

~"¹⁹ BAD ORIGINAL

" ¹⁹~ 1820643

wäßrigen Fatriimaibjäroxidlösung auf einen pH-Wert von 8 gebracht und eine Stunde mit Tjf Järfcfärbeköhle und 3°/<> "Diatomite" gerührt. Die Mischung vrurde filtriert; der Kohlenstoffkuchen wurde mit 0,2 Volumenteilen 20^igem wäßrigen Aceton gewaschen. Der gewaschene Kohlenstoffkuchen wurde zweimal mit 0,4- Volumenteilen einer 50$igen wäßrigen Acetonlösung eluiert; man säuerte mit leonzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 an und vereinigte die Eluate. Die vereinigten Aceton-Eluate_i72 1) wurden.durch Zugabe von 30 ml einer 5Obigen wäßrigen HatriüSfl-ösung auf einen pH-Wert von 6,4 gebracht und zu einer wäßrigen Lösung eingeengt (40 1). Der pH-Wert des Konzentrates wurde auf 5,9 eingestellt; danach wurde das Konzentrat der Gefriertroclaiung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 447 g eines Tyophilisierten Materiales. " I

Weitere 1126 g wurden erhalten, indem man die vorstehend beschriebene Fermentierung und Aufarbeitung zweimal wiederholte. Das vereinigte lyophilisierte feterial (1573 g) wurde in 10 1 Methanol bei 40⁰G eine Stunde aufgeschlämmt. Bas unlösliche Material wurde abfiltriert und dreimal mit 500 ml warmem Methanol (40⁰C) gewaschen. Die Methanolextrakte und die Waschwässer wurden vereinigt (11,5 1) und im Vakuum zur Trockne eingeengt. Es fielen 321 g eines trocknen Präparates an (lIrV-25,3) mit 1,25 Proteus vulgaris Bioeinheiten/mg.

C) Reinigung von Sparsomycin A

Verteilungskolonne ,

300 g des vorstehenden Präparates (HRV-25,3) wurden auf eine Verteilungskolonne gebraelrfc, die wie fplgt hergestellt worden war. Man stellte zunächst aus gleichen Volumenteilen (350 1) Mcllvaine's-pHöjO-Puffei und Methylethylketon ein Lgsungsmittelgemisch her. Eine Aufschlämmung, die 9,6 kg "Diatomite" in 60 1 der oberen Phase und 4*8 1 der unteren Phase des vorstehend beschriebenen Lösungsmittelgemisches wurden in eine 12" Kolonne gegossen und unter einem Stickstoff druck von 0,28 kg/ cm gepackt. Das auf die Kolonne aufzubringende Material wurde in 3 der unteren Phase gelöst, in der auch 1920 g "Diatomiite" auf geschlämmt wurden; schließlich wurdg_e|oviel der oberen Phase zugesetzt, daß das Gemisch beweglich war. DieVGemisch wurde sorgfältig am oberen Ende der Kolonne, welche mit einer Seesandschicht bedeckt war, zugegeben.

BAD ORIGINAL

_ 20 - 009820/1820

Die Kolonne wurde mit der oberen Phase als Lösungsmittel eluiert, und zwar mit einer Geschwindigkeit von 2jl/Min. Man fing 4 1/Fraktionen auf; am Anfang und am Ende der Kolonne wurden jedoch 20 1-Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen wurden eingeengt und die Bioaktivität an P. vulgaris-Platten geprüft. An diesem Punkt des Verfahrens wurde die Trennung von Sparsomycin und Sparsomycin A durchgeführt. Durch weitere Behandlung können beide Komponenten gereinigt und schließlich in kristalline Materialien umgewandelt werden.

Die Fraktionen 24 bis 34 in der obigen Yerteilungskolonne enthielten das Sparsomycin (9-ß~D-Ribofuranosyl-7-äeazaaäenin).

Reinigung von Sparsomycin A

Das Sparsomycin A wurde wie folgt getfreinigt und in kristallines Material umgewandelt: die Fraktionen 11 bis 20 aus der vorstehenden VerteilungsChromatographie enthielten das Sparsomycin A. Die Fraktionen wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt, wobei 7,2 g eines kristallinen Materiales gewonnen werden konnten. Diese Kristalle wurden in 400 ml Wasser und 50 ml 0,1n HOl gelöst. Das Gemisch wurde schwach erwärmt, um die Lösung zu erleichtern; die Lösung wurde filtriert. Die klare Lösung wurde durch Zugabe von 5O$iger wäßriger Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht und im Kühlschrank fünf Stunden abgekühlt. Die gebildeten Kristalle wurden abfiltriert, mit Wasser gewaschen und getrocknet; auf diese ¥eise erhielt man 5,65 g des Präparates ADA-102,1. 2 g dieses Präparates wurden in 75 ml Wasser und 20 ml 0,1 η HCl gelöst. Die klare Lösung wurde mit 50$iger wäßriger Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 9,0 gebracht. Die Kristallisation setzte sofort ein. Man ließ die Lösung 7 Stunden bei 25⁰O stehen und trennte dann die gebildeten Kristalle ab; die Kristalle wurden mit 25 ml Wasser gewaschen und getrocknet; danach betrug die Ausbeute an Präparat ADA-105,1 1,52 g; das Präparat wies einen Schmelz^punlct von 247 »8 bis 25O⁰O, eine optische Drehungen ocjp -62° (c=0,718 in 0,1 η HCl), ein Äquivalentgewicht von 269 und einen pKa¹ von 5,07 in Wasser auf. Das Ultfaviolett-Absorptionsspektrum zeigte folgende Werte:

- 21 -

009820/1828

in Wasser 270 muf a =44,14

in 0,01 η H_pS0 227 mu, a = 85,28

* 271 mu, a = 40,82

0,01 η KOH '■_■ 270 mu, a = 43,50 %ru.==MiXXimikron

■ —1 das IR-Absorptionsspektrum wies - ausgedrückt in cm - foXgende Frequenzen auf:

3350	(S)	1475	(M)	(oiX)	1160	(W)	903	(M)
3250	(S)	1458	(S)	(Sh)	1134	(M)	867	(M)
31.45	(S)	1445	(M)		1120	(M)	852	(W)
3095	(S) (ah)"	1426	(M)	(öx)	1093 ■	(M)	842)	(W)
2880	(S) (OX)	1370	(M)		1080	(W)	799	(W)
2810	(S) (ÖX)	1351	(M)		1055	(M)	715	(W)
1895	(W)	1306	(M)		1042	(S)	704	(S)
1640	(S)	1276	(W)		1017	(S)	675	(M)
1592	(S)	1255	(S)		992	(S)	658	(M)
1552	(M)	1241	(M)		953	(W)
1502	(M)	1198	(W)	912	(W)

Bei der EXementaranaXyse erhieXt man foXgende Werte:

berechnet für O₁₁H₁₄N₄O₄: 0, 49,62; H,5,30; H, 21,04 gefunden: 0, 49,81; H, 5,20; N, 20,91.

9-ß-D-~RibofuranosyX-7-deazaaäenin (Sparsomycin A) wurde ebenfaXXs aus der Gärbrühe abgetrennt und gereinigt, jedoch in anderer Weise. Die Permentierung wurde in der unter A beschriebenen Weise durchgeführt. Die gesamte Gärbrühe (AJW-63) wurde durch Zugabe von .365 mX konzentrierter SchwefeXsäure auf einen pH-Wert von 2*5 'eingesteXXt und unter Verwendung von 6$ Diatomeneräe aXs FiXtrierhiXfsmitteX fiXtriert. Der PiXterkuchen wurde mit 0,1 VoXumenteiXen entionisiertem Wasser gewaschen; das Waschwasser wurde mit der kXaren Brühe vereinigt. Die kXare Brühe wurde danach durch Zugabe von 400 mi SO^iger wäßriger NatriumhydroxidXÖsung auf einen pH-Wert von 8,0 eingesteXXt und eine Stunde mit 1$ EntfärbekohXe und yfo »Diatomite" gerührt. ■Die Mischung wurde fiXtriert; der KohXenstoffkuchen, wurde mit 0,1

VoXumenteiXen ent ionisiertem Wasser und anschließend mit 0,2 VoXumen-

-22 - 009820/ 1 Ö2Ö

BAD ORIGtNAL

16206A3

teilen 2O$iger wäßriger Acetonlösung gewaschen. Der gewaschene ICohlenstoffkuchen wurde zweimal mit 0,4 Yolumenteilen einer 4O$igen wäßrigen Acetonlösung, die mit kpnzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert worden war, gewaschen; die Eluate wurden vereinigt. Die vereinigten Acetoneluate wurden durch Zugabe von 53 ml einer 5O^iga wäßrigen Fatriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 4,8 eingestellt, zu einer wäßrigen Lösung eingedampft und der Gefriertrocknung unterworfen. Man erhielt auf diese Weise 284 g des Präparates WMH-32,6, welches in Gewebekulturen eine Aktivität von 9KB u/mg aufwies. 10Og dieses Präparates wurden dann in 600 ml Methanol gelöst; die Lösung wurde mit 4 Volumenteilen Äther versetzt, um das inaktive Material auszufällen. Aus der überstehenden Methanol-Äther-Lösung wurden zwei jßrnten an kristallinem Material gewonnen, indem man das Lösungsmittel langsam verdampfen ließ. Die beiden Präparate wurden vereinigt und in 35

Stnl

Wasser undvO,1 η Chlorwasserstoffsäure wieder aufgelöst. Die Lösung wurde filtriert; das Filtrat wurde mit 50$iger wäßriger Katriumhydroxic lösung auf einen pH-Wert von 9,4 eingestellt. Das Sparsomycin A, welches sich in kristalliner form abschied, wurde gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet; man erhielt auf diese Weise 480 mg des Präparates ADA-104,1 mit einem Schmelzpunkt von 247,8-250,8⁰O, einer

^⁵

optischen Drehung von a^⁵ -61° (c=0,908 in 0,1 η Hol), eins^mÄq.uivalentgewicht von 17QSpKa¹ von 5,05 in Wasser.Das,Ultraviolett-Absorptions-Spektrum zeigte folgende Werte:

in Wasser 269,5 mu, a = 44,27 '

in 0,01 η H₂SO. 227 mu, a= 86,06 in 0,01 η KOH ' 270 mu, a = 43,61

Das IR-Abs ο rp ti ons-Spektrum zeigte folgende charakteristische i"requenzen in cm :

3400	(S)	(Öl)	1526	(S)	(Öl)	1200	(M)	-	870	(S)
3310	(S)	(Öl)	1510	(M)		1164	(M)	852	(W)
3240	(S)	(Öl)	1480	(S)	(Öl)	1137	(S)	843	(W)n
3220	(S)		1462	(S)		1125	(M)	800	(M)
3140	(S)	1425	(S)		1092	(S)	715	(S)
2950	(S)	1370	(M)		1084	(M)	702	(S)
2920	(S)	1355	(S)	1057	(M)
2850	(S)	1342	(M)	1045	(S)		SAD ORiGJNAL
				- 23	009820	/18 2 8

2620 (M) 1310 -(S)- 1020 (S)

1910 (W) 1285 (M) '995 (S) ^: _:

1650 (S) 1280 (M) 955 (M) '

1645 (S) 1260 (S) 912 (M)

1600 (S) 1245 (S) 905 (M)

Bei der Elementaranalyse erhielt man folgende Werte:

berechnet für C₁₁H₁₄Ii₄O₄: C, 49,62j H, 5,30; N, 21,04. gefunden C, 49,62; H, 5p4j H, 20,81.

Die Kenndaten des Sparsomyein A, die vorstehend angegeben sind, befinden sich in guter Übereinstimmung mit den Daten, die in der Literatur für Tubercidin angegeben sind. Vgl. hierzu K. Anzai, G-. Nakamura and S. Suzuki:^irA new antibiotic, tubercidin". J. Antibiotics, Ser. Α., pp. 201-204, Sept. 1957. In dieser Arbeit befindet sich jedoch kein Hinweis darauf, wie das Tubercidin hergestellt werden kann.

D. 9-(2',3^t-0-Isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-deazaadenin; 2¹, 3¹-0-Isopropyliäensparsomyοin A; 7-(2,3-0-Isopropyliäen-ß-D-ribofuranosyl)-7H-pyrroloi-2,3-d3-pyrimid in

Eine Mischung aus 1 g Sparsomyein A, welches über Nacht bei 108 C bei einem vermindertem Druck von 0,3 mm getrocknet worden war, 7,5 g p-Toluolsulfonsäuremonohydrat und 50 ml Aceton, welches zuvor über Kaliumpermanganat und Kaliumcarbonat (in dieser Reihenfolge) destilliert worden war, wurde bei Raumtemperatur zwei ^tunden gerührt. Das , Reaktionsgemisch wurde auf 3⁰O abgekühlt und mit einer Lösung von 200 ml 0,5 η Natriumbicarbonat von 3⁰C versetzt. Die auf diese Weise erhaltene Lösung wurde bei. 35⁰C unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand-wurde zunächst zweimal mit je 100 ml siedendem Chloroform und dann noch zweimal mit je 100 ml Ghloro« form von Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte wurden zunächst einzeln filtriert, dann vereinigt und eingedampft. Der auf diese Weise gewonnene Rückstand wurde in 25 ml siedendem Wasser gelöstj die so erhaltene Lösung wurde.filtriert. Beim Abkühlen des IiItrates erhielt man einen kristallinen Niederschlag von 2' _i3'-*0-Isopropyliden-sparsomy< ein A in einer Menge von O_S75 g (65$)j der Schmelzpunkt des Präparates lag bei 170-173°Ö.

-24-00982(371820

BADORlGfNAL

. - 24 -

1Θ206Α3

Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Wasser lag 9~(2',3^l-0-Isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl(-7-äeazaadenin (2' ^'-O-Isopropylidensparsomyein A) (2·, 3^I-Isopropylidentubercidin). mit einem Schmelzpunkt von 174-177° 0 vor. Diese Substanz erga"b bei der Analyse folgende Werte:

berechnet für Cj ,H₁₈N^O,:

0, 54,89; H, 5,92; N, 18,19; 0, 20,92; CH^C, 4,92. gefunden: G, 54,72; H, 5,92; N, 18,51; 0, 21,2; OH₅O, 4,3.

E) N^N^S'-'-Dribenzoyl-ä¹,3'-0-isopropylidentubercidin ("Verb.D) Zu einer Lösung von 1,74 g 2',3^I-0-Isopropylidentubercidin in 50 ml Pyridin gibt man im Eisbad 4,35 g Benzoylchlorid. Man rührt das Reaktion;

. gemisch 90 Minuten im Eisbad und gießt dann in 150 ml Eis und Wasser.

■ Die Mischung wird mit 2 η Chlorwasserstoffsäure angesäuert und filtrier! Das durch Abfiltrieren gewonnene feste Material wird aus Aceton-Wasser umkristallisiert; auf diese Weise erhält man 3,28 g einer Substanz, die nochmals aus Aceton-Wasser umkristallisiert wird. Nach dem zweiten Umkristallisieren liegen 2,78 g der analytisch reinen Verbindung D mit einem Schmelzpunkt von 131,5 - 133⁰C vor.

Analyse: berechnet für C-rH^N/),,: C, 67,84; H, 5,04; N, 9,04. gefunden C, 67,31; H, 5,04; N, 9,13.

3?) N -Benzoyl-2¹ ,^'-O-isopropylidentubercidin (Verbindung E) Zu einer teilweisen Lösung von 0,5 g der in der vorstehend beschriebe-) nen Weise erhaltenen Verbindung D in 50 ml einer Mischung aus wasserfreiem !Tetrahydrofuran und wasserfreiem Methanol (1:1 Volumenverhältnis) gibt man in einem Eisbad unter Ruhren 0,2 ml einer 25$igen Natriummethoxidlösung in Methanol. Man entfernt die Mischung dann aus dem Eisbad und verfolgt den Ablauf der Reaktion durch Dünnschichtchromatographie an Silicagel mit 50?S Aceton-50$Skellysolve B (technische Hexane) Nach 25 Minuten bei Raumtemperatur (etwa 25⁰C) gibt man weitere 0,2 ml einer 25$igen Natriummethoxidlösung zu. Nach 64 Minuten ist die Hauptmenge des Ausgangsmateriales verschwunden. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht-(etwa 17 Stunden) in einem Kühlschrank auf eine Temperatur zwischen 0 und 5°C abgekühlt und danach durch Zugabe eines Austauscherharzes ( Dowex 50 W-X 8) auf einen pH-Wert zwischen 5 und 6 angesäuert. Die Lösung wird unter vermindertem Druck bei 40 bis 45°0 eingeengt, •wobei ein Syrup zurückbleibt, der über 50 g Sillkagel mit einer Mischung

__ ₂₅ _ 009820/1828

BAD ORIGiJSJAL

aus 25% Aceton und 75$ Skellysove B chromatographiert wird. Man fängt Fraktionen von jeweils 7 ml auf. Die Fraktionen 80 bis 115 weräV vereinigt und eingeengt, wobei man 210 mg der Verbindung E erhält. Diese Verbindung ergibt bei der Analyse folgende Wertet

berechnet für P₂₁H₂₂F₄O₅: G, 61,30; H, 5,63; N, 13,62. gefunden ' G, 61,05; H, 5,64; N, 13,43.

Nach dem Umkristallisieren aus Äther-SkellysoveB liegt der Schmelzpunkt der Verbindung E bei 106,5 bis 109⁰O.

Präparat 2

6-Methylmercapto-9-(2^!,3'-Q-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-?- deazapurin (Verbindung 3?)

Zu einer lösung von 6-Mercapto-9-ß-D-ribofuranosyl-7-äeazapurin vgl. hierzu Pike, et al., J. Heterocyclic Ghem. 1, 159 (1964) - (1g) in 8 ml 0,4 ή Natriumhydroxid gibt man unter lOminütigem Schütteln bei 24⁰G 0,21 ml Methyljodid in kleinen Anteilen. Danach gibt man nochmals 1,3 ml 0,4 n Natriumhydroxid zu und schüttelt die lösung erneut mit 0,2T ml Methyljodid. Man läßt das Reaktionsgemisch zurnächst vier Stunden bei Raumtemperatur (etwa 24⁰O) und dann in einem Kühlschrank bei etwa 0 bis 5°G über Nacht 20 Stunden stehen. Das sich abscheidende feste Material wird abfiltriert, über Natriumhydroxid getrocknet, mehrere Minuten mit 6 ml absolutem ithanol zum Rückfluß erhitzt und dann abgekühlt. Auf diese, Weise erhält man weiße Nadeln \ von 6-Methylmercapto-9-ß-D-ribofuranosyl)7-deazapurin, die abfiltriert werden. ··-.-.

Eine Mischung aus 1 g dieser. Nadeln, die über Nacht bei 108⁰O unter einem Druck von 0,3 mm getrocknet worden sind, 7,5 g p-Ioluolsulfonsäuremonohydrat und 50 ml Aceton, welches zuvor über Kaliumperman-' ganat .und Kaliumcarbonat (in dieser Reihenfolge) destilliert worden ist, wird bei Raumtemperatur zwei Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wird dann unter vermirfiertem Druck auf 3°0 abgekühlt. Der auf diese Weise gewonnene Rüokstand wird zunächst zweimal mit je 100 ml siedendem Chloroform und dann zweimal mit je 100 ml Chloroform von Raumtemperatur extrahiert. Die Extrakte werden einzeln filtriert, dann vereinigt und eingedampft. Der so gewonnene Rückstand wird in 25 ml siedendem Wasser gelöst; die lösung wird filtriert. Beim Abkühlen

009820/1828

- ²⁶' ~ BAD ORIGINAL

- üb -

des Filtrates erhält man einen kristallinen Niederschlag der Verbindung i¹. '^:

Verwendet man bei Herstellung des Präparates 2 anstelle von Methyljod id andere niedere Alkylgodide, z.B. Äthyl-, Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutyljodid u.a., so erhält man entsprechende 6-Alkylmercapto-9-(2',3^l-0-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-deaz:apurinverbindungen, in denen die Alkylgruppe Äthyl, Propyl, Isopropyl, Butyl oder Isobutyl ist.

Behandelt man bei der in Präparat 1 angegebenen Weise 9-ß-D-Ribofuranosyl-6-hydroxy-7-deazapurin bzw. in der Ketoform 7ß-D-Ribofuranosyl-7H-pyrrolo-[ 2,3-dj -pyrimidon-4), 9-ß-D-Ribofuranosyl-6-mercapto-7-äeazapurin und 9-ß-D-Ribofuranosyl-7-deazapurin (vgl. Journal of Heterocyclic Chemistry 1, 159 (1964)) mit Aceton in Gegenwart einer Benzolsulfonsäure, z.B. p-Ioluolsulfonsäure, so erhält man die entsprechenden 2', 3t-o-Isopropylidenderivate.

Beispiel 1

N -Benzoyl-9-(2',3^l-0-isopropyliden-.ß-D-ribofuranosyl)—7-deazaadenin-5'-phosphat (Verbindung G-)

Eine lösung aus 12 mMol frisch hergestelltem Cyanoäthy!phosphat in 12,0 ml wasserfreiem Pyridin wird durch wiederholtes Einengen unter vermindertem Druck bei 35°O zusätzlich getrocknet. Zwischen den einzelnen Zugaben von wasserfreiem Pyridin wird ausschließlich trockne Luft eingeführt. Nach dem letzten Einengen gibt man 2,05 g (5,0 mMol) N -Benzoylisopropylidentubercidin zu und dann nochmals 100 ml besonders getrocknetes Pyridin. Das Einengen wurde wiederholt wie vorstehend beschrieben. Der Rückstand wurde in 40 ml desselben Pyridine gelöst. Danach versetzte man mit Dicyelohexylcarbodiimid (6,19g, 30 mMol) und schüttelte die Mischung im Dunklen bei Raumtemperatur (etwa 23 bis 25⁰O) vier Tage. Man setzt zunächst 4,0 ml Wasser zu und schüttelt die Mischung dann mit 40 ml Wasser weitere 30 Minuten und filtriert. Das Eiltrat wird bei vermindertem Druck in einem Wasserbad von 35⁰O eingeengt, wobei man einen Syrup als Rückstand erhält, der in 50 ml Wasser gelöst wird; die Lösung wird mit Äther extrahiert. Anschliessend wird die wäßrige Schicht lyophilisiert. Nach Auflösung des lyophilisierten festen Materiales in Wasser setzt die Kristallisation ein. Die Kristalle wurden abfiltriert und in einem Valcuumexsikkator

- 27 - 009820/1828

' BAD ORIGINAL

über wasserfreiem Calciumchlorid getrocknet. Auf diese Weise erhält man 1,43 g F⁶-Benzoyl-9-(2S3^l-0-isopropyliaeii-ß-D-ribofuranosyi)-7-deazaadeiiin-5*-(2-cyanoäthyl)pliospliat mit Ϊ. s 210-21T⁰O,;->^^^303im (f 12.000). Sine kleine Probe (100 mg) wurde aus 12 ml Methanol und 12 ml Wasser umkristallisiertί F: 219,5-220⁰G.

Analyse; berechnet für G

gefunden

(543,47): 0, 53,03; H, 4,82;

H,. 12,89; P, 5,70.

0, 53,01? H, 4,14;

HV 12,47; P, 5,69.

Zu einer eiskalten Lösung von 544 mg (1 mMol) der wie -vorstehend angegeben gewonnenen Verbindung - auch als N -Benzbyl--5^l^(ß-cyanoä-! thylphosphoryllisopropylidentuberciäin zu bezeichnen - in je 5,5 ml Wasser und Pyridin gab man 11,0.ml 1,0 η Fatriumhyäroxiä. !Die Lösung wurde in einem Sisbad 30 Minuten gerührt und dann auf einen' pH-Wert von 6 eingestellt, und zwar durch Zugabe von frisch hergestelltem Dowex 50W-X8 (Pyridiniumform). Die Mischung wurde filtriert, das Harz mit Wasser gewaschen und die vereinigten Eiltrate lyophilisiert. Man erhielt auf diese Weise 500 mg der Verbindung G-* Diese Verbindung wurde ohne weitere Reinigung für die nächste Verfahrensstufe verwendet. .

In der in Beispiel 1 beschriebenen Weise lassen sich auch andere 9-(2^f ,3'-O-Isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)7->deazapurin-5' -phosphate der Formel II herstellen, indem das gewünschte Ribofuranosyl-7-deazapu rin mit 2-Cyanoäthylphosphat in Gegenwart eines Kondensationsmittels ■ wie ITjli'-Dicyclohexylcarbodiimiä umsetzt und das gewonnene ^-(S'^'-O-Isopropyliäen-ß-D-ribofuranosyl)7-äeazapurin-5'-(2-cyanoäthylphosphat) mit einer Base zu dem entsprechenden 9-(2¹,3^I-0-Isopropyliden-ß-D-ribof uranosyl)7-deazapurin-5'-phosphat «ersetzt. Auf diese Weise kann man folgende Verbindungen erhalten:

-28-

BAD ORIGINAL

009820/1828

Γ' -

/me thy lme r c ap t ο-"\

\äthylmercapto-

9-(2',3'-0-Isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)6-< y-deazapu-

hydroxy-

u.a.

mercapto-

In der "bei Präparat 1 E und 1 F angegebenen Weise lassen sich auch andere ΪΓ -Acyl~9-(2·, 3'--0-isopropylideii-ß-D-ribofuranosyl)7-deazaaäenine herstellen, indem man 9-(2^r,3'-0-Isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)7-äeazaadenin mit einem Säurechlorid oder Säureanhydrid umsetzt und das so gewonnene Material mit einer Base, z.B Natrium - oder Kaliummethoxid oder -äthoxid behandelt. Man kann beispielsweise folgende Verbindungen der Formel II (Z = Ή -Acylamino) erhalten: IT -Acetyl-, N -Propionyl-, N⁶-Butyryl-, N⁶-Valeryl~, N⁶-Hexanoyl-, N⁶-Phenylacetyl-, N⁶-Phenylpropionyl-, N -Decanoyl-_S IT -Lauroyl-, Έ -Anisoyl-, N -(ß-Oyclopentylpropionyl)-, N -Heptanoyl-9-(2^f,3^l-0-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)-7-deazaadenin u.a. Diese R -Acyl-9-(2',J'-O-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl)7-deazaadenine können in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise in die 5'-Phosphate umgewandelt werden.

Bezüglich der Herstellung der Zwischenprodukte mit der Struktur X wird auf die folgenden Präparate verwiesen. In diesen Präparaten sowie in den danach folgenden Beispielen und Präparaten werden zur Vereinfachung für die am häufigsten vorkommenden chemischen Gruppen und Verbindungen folgende Abkürzungen verwendet:

5«-o-Triplieny !methyl- ΪΡΜ

ß-D-Arabinofuranosyl" Ai¹

ß-D-Ribof uranosyl- Ri¹

ß-D-Deoxyribofuranoeyl- DRP

!riphenyl chlorine than SPCM

Iriplienylbrominethan Ü?PBM Trlphenyljoämethan

Präparat 3

1-(TPH-AP)-oytoBin ^BAD

. - 29 - 00 98 20/1

Zu einer "Lösung "von ΙΌ g i-AF-cybOsin-Hyäroobjoriö. in 200 ml Py rid in gibt man 12 g SPGM. Das Reaktionsgemisch wird bei F^jEtemperatiir (23-26⁰O) eine Woche gerührt. Danach gießt man imker Rühren in 3 1 Eiswasser, wobei sich '1-(I¹PH-AE)cytosin als Ol abscheidet. Das öl verfestigt sich beim Stehen mit Wasser über Nacht; öaa feste Material wird e/bfiltriert, zerbrochenj sorgfältig mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Dänach wird das feste■.Material mit 200 ml siedendem Heptan "verrieben; die Mischung wird durch einen Glasfrittentrichter filtriert, so daß das unlösliche Material zurückbleibt. Das feste Material wird nochmals mit jeweils 250 ml siedendem Heptan gewaschen und nach einer Zwischentrocknung in 1 1 siedendes Aceton eingetragen, welches 1 g Aktivkohle (Darco G- 60) enthält, Die heiße Suspension wurde filtriert, um die Kohle zu entfernen. Das Eiltrat wurde auf einem Dampfbad bis auf ein Volumen von etwa 75 ml eingeengt. Den Rückstand ließ man auf Raumtemperatur abkühle*, wobei sich ein kristallines Produkt abschied. Das kristalline Produkt wurde auf einem Glasfrittentrichter gesammelt und einmal mit 25 ml Aceton , welches zuvor mit Eis gekühlt worden war, gewaschen. Haoh dem Trocknen ',
setzung):

Trocknen lagen 13 g1-(TPM-AE)cytosin vor; E.: 227~228°ö (unter ZerAnalyse: berechnet für O₂₈H₀₇N₇O₅; 0, 69,26; H, 5,61; N, 8,86.· gefunden ^ " _a_ 69,09; H, 5,67; N,.8,93.

In äerselben We ise kann man 1^!~L5^t~O™(p-Methoxyphenyl)äiphenylmethyl- oder 1~{^5'—0-bis(p~methoxyphenyl)phenylmethyl-AE]-cytosin erhalten, wenr man Cytosinarabinosid oder dessen Hydrochlorid in Pyridinlösung inlt (p~Methoxyphenyl)diphenylchioromethan oder bis(p-Methoxyphenyl)phenylchloromethan bei einer Temperatur zwischen 0 und 60⁰O unter kontinuierlichem Rühren umsetzt. ·

Anstelle von TPCM ka,nn man auch I¹PBM verwenden;, man erhält dabei.das gleiche Endprodukt, nämlich 1~(TPM-AE)eytosin, :

In den folgenden Präparaten 4 bis 32-wird die IJmaetzung ,jeweils in Pyridin und in der bei Präparat 3 angegebenen Weise durchgeführt, ohne daß dieser Sachverhalt nochmal jeweils hervorgehoben würde. ''-

Präparat 4

- 30—

009820/1828

— "50 —

1'- (IPM-AF) -ura c il Man setzt 1~(AF)uracil mit TEGM um.

Präparat 5

1-(IPM-AP)~thymin Man setzt 1-(AF) thy min mit IPCM -um.

Präparat β

9- (TPM-AS¹) -aä enin Man set25t 9™(Al)-adenin mit O)PBM

Präparat 7 9-|~5»-O- (p~methoxyphenyl) ä iphenylmethyl-AF3 -au enin Man setzt 9-(Ai¹)-adenin mit fe-Methoxyphenyl^iphenylchlormethan um.

Präparat 8

9-(TPM-AF)«6°mercaptopurin Man setzt 9-(AF)-6-mereaptopurin mit TPGM um.

Präparat 9

1»(TPM-AF)5-chloruracil Man setzt 1-(AF)-5<-chloruracil mit TPGM um.

Präparat 10

1 -(TPM-AF) 5-flimira c il

Man setzt 1-(AF)-5-fluoruracil mit TPGM um. '

Prälat 11 1-(TPM-AF)5-trifluormethyluracil Man setzt 1~(AF)5~trifluormethyluracil mit TPCM um.

Präparat 12

1-(TPM-AF)-5-feromuracil

Man setat 1-(AF)5-iDromuraoil mit TPOM um. Präparat. 13 ^6AD

- V - 009820/1828

1-(iDPM-AF)-5-doäuracil Man setzt !-(AF^-Joäuracil mit IPGM inn.

Präparat 14 :-■■■.'■

-guanin ■ ' ...■

Man setzt 9- (Αϊ¹) guanin mit IPGM um.

Präparat 15

9- ( !PM-AP) -hyp oxanthin Man setzt g-iAiOhypoxanthin mit IPGM um.

Präparat 16

9-(EPM-AF)-xanthin . '*

Man setzt 9-(AP)-xanthin mit IPBM um.

Präparat -17 1 -[ 5' -O- (p-methoxyphenyl) d ipheny !methyl- Αϊ¹] -5-me thylcy t osin Man setzt 1-(A3?)5-methylcytosin mit (p-Methoxyphenyl)cliphenylchlormethan um.

Präparat 18

1 - (ΤΡΜ-Αϊ¹)-3-methylcy tos in Man setzt 1-(AP)-3-methylcytosin mit TPGM um.

Präparat 19

9- ( TPM-Bi¹ )aä enin

Man setzt 9-(BP)-adenin mit TPBM um. ' '

gräparat 20 1~\j?' -O-(p-Mstlio3?yplieayl)diphenylmethyl-HEJ 5-methylcytosin Man setzt 1-(KF)5-metliyl©jto©in mit (p-MethoxyphenylJdiphenylchlor-

-triCluormethyluraoll Man setzt 1-(RF)-5-trifluörmethyluracil ait SlOM

BAD ORIGINAL 009820/1821

Präparat 22

1-(TPM-RF)cytosin Man setzt 1-(RP)cytosin mit TPGM um.

Präparat 25

1 - (I¹PM-RI¹) 3-me thy 1 cy t ο s in Man setzt 1-(RF)3-methylcytosin mit TPGM um.

Präparat 24

Man setzt 1-(DRF)uracil mit TPGM um.

Präparat 25

1-(TPM-DRI¹)-cyt os in Man setzt 1-(DRi¹)cytosin mit TPGM um,

Präparat 26

9- ( TPM-DRi¹) -ad enin Man setzt 9-(DRI")aäenin mit TPBM um«

Präparat 27 1 -[ 5' -0- (p-Methoxyphenyl) diphenylme thylUDR]?}?- j oduracil Man setzt 1-(DR3?)5~;joäuraeil mit (ρ -Me thoxyphenyl)d ipheny Ichlormethan

Präparat 28

1-('J¹PM-DRi¹)-5-fluoruracil Man setzt 1-(DiLi?)5-fluoruracil mit TPGM um.

Präparat 29

1 - ( TPM-DR-F ) - thymin Man setzt 1-(DRI¹)thymin mit TPCM um»

Präparat 30

9- (TPM-DRTP) -£uanin Man setzt 9-(DRF)guanin mit TPBM um.

33 _ 009820/18

BAD ORIGINAL

Präparat 31

Man setzt9--(DEF) xanthin mit (p-Methoxyphenyl)äiphenylchlormethan um.

Präparat 32 ■

9-[ 5 ^l-0-(p-Methoxyp.henyl)dip]ieny lmethyl -DEFJiyp oxanthin Man setzt 9~(DEF)hypOxanthin mit (p-Methoxyphenyl)diphenylchlormethan

In der in Präparat 3 angegebenen Weise können auch noch andere E-heter ο cy elis ehe ρ'-TrityI-, [ 5'-(P-Me thoxypheny1)d iphenyImethyI- und [S'-'bisCp-MethoxyphenylJphenylmethyl-KE'- und -DM?-Verbindungen hergestellt werden, indem man TPOM, TPBM, (p-Methoxyphenyl)diphenylchlor(oäer brom)methaii oder Ms(p-Methoxyphenyl)phenylchlor (oder 'brom)methan mit einer IT-heterocyclischen EB¹- oder "PEF-VeriDlnclung zu einer Verbindung der iOrmel TI umsetzt, iolgende Verbindungen der formel VI" lassen sich so herstellen:9-(EPM-EF)guanin, 1-(TPM-I^)5-bromuracil, 1-(TPM-RI¹)5-joduracil, 9(TPM-EE¹)hypoxanthin, 9-(TPM-EE¹ )xanthin, 3-(TPM-DEP)hypoxanthin, 1 - (5 * -0- (p-Methoxyphenyl )d ipheny Ime thy 1-DEE¹) thymin, 1 - (TPM-DEE¹) 3-methylcytosin, 1-(TPM-DEB¹ )5-methylcytosin, 1-(TPM-DEF)5-trifluormethyIu= racil, 1-(TPM-DEE¹)5-bromuraeil, 1-[5'-0-(p-Methoxyphenyl)diphenylmethyl· DEE¹] -5-chloruracil, 9-(TPM-DEE¹)-6-mercaptopurin, 1 -I' -O-bis ^)-Methoxypheny 1 )phenylmethyl-DEE¹~) 3-methylcytosin und-5-methyluracil, 9-Γ5' -O-bis· (p-Me thoxyphenyl )phenylme thyl-DEE¹) -2,6-d iaminopur in; 1 - (TPM-EE¹) 5-hydroxymethylcytosiTi; 9-(TPM-DEP)7-deazaadenin; 9~L5'-O-(p-Methoxypheny1)1 diphenylmethyl-AI^-mercapto-T-deazapurin; T-(TPM-Ai¹)6-azauracil,;i 9-(TPM DEF)7-deazahypoxanthin u.a. -"■"[."

SAD

20/1826

Präparat 33 9-ß-D-ArabinofuranosylguanIn

NHCOCH₂ C₇H₇O CH₂

H₃COCH

H₃COCN
C₇H₇OCHa

C₇H₇

C₇H₇C HsCOCN

C₇H₇OCH₂ MeOH/NHs

Xylol

^H C₇H₇O

C₇H₇O

H₃COC N ^U

HOCH₂

HQ

HNOs

-CH₃CO HOQH₂

H HC

H
HO

ORIGINAL INSPECTED ^H

000020/1621

Die Gruppe ΟγΗ_Ο in. den -vorstellenden Formeln be zeichnet die Benzyloxygruppe:

Unter mechanischem'. Rühren "wurde eine Suspension aus 5, 15 g (11,0 mMol) des Chlorquecksirberderivates von 2,6-Diacetamiäopurin (J. Davoll und B.A.Lowry,-J. Am. Chem. Soc. 73, 1650 (1951)), 4,0 g gereinigte Diatomeenerde (Gelite) und 325 ml Xylol durch azeotrope Destillation (50 ml) getrocknet. Eine Lösung aus 4,39 g (10,0 mMol) des rohen syrupartigeii 2,3,5-2ri-0--benzyl~D-arabinofuranosyl-chlorid (CP. J. I G-laudemans und H.G. Fletcher, Jr., J, Org. Chem. 28, 3004 (1963)) in 50 ml gereinigtem Xylol wurde zu der heißen Suspension unter Rühren zugesetzt; die Suspension wurde unter kontinuierlichem Rühren und Ausschluß von Feuchtigkeit drei Stunden zum Rückfluß erhitzt. Die heiße Mischung wurde durch ein Diatomeenerdebett filtriert J das Filterbett wurde mit heißem Xylol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum auf ein Volumen von etwa 100 ml eingeengt j das Konzentrat wurde in einen .Überschuß von Skellysolve B eingerührt. Der sich bildende Niederschlag wurde gesammelt_? mit Skellysolve B gewaschen und an der Luft getrocknet. Das feste Rohprodukt wurde mit Chloroform verrührt; die Mischung wurde filtriert\ üex Filterkuchen wurde sorgfältig mit Chloroform gewaschen. Die vereinigten Chloroform- g filtrate wurden dreimal mit 30$iger wäßriger Käliumjodidlösung und zweimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt- Der Rückstand wurde mit Methanol aufgeschlämmt ι die Mischung wurde im Vakuum zur Irockne eingedampft» Man erhielt auf diese Weise 62fo einer festen schaumigen Substanz? bei der es sich um ■ eine anomere Mischung !landelte* in welcher 9(2',3'sS'^Iri-O^benzylß-D-arabinofuranosyl)="2_?6-=diacetamiäo-purin die Hauptkomponente darstellte. .

Eine Lösung von 2,54 g (4,0 mMol) des rohen Materiales in 100 ml Methanol, welches bei O⁰C mit trooknem Ammoniak gesättigt woräea. war, wurde bei O⁰C 16 Stunden abgestellt. A^eohließenfl'wueße-ate Lösung im

■V : :. ■ 00.9820/1811 .

- 36 -

BAD ORIGINAL

Vakuum zur !Trockne eingedampft; das Acetamid wurde durch. Sublimation unter vermindertem Druck abgetrennt. Auf diese Weise erhielt 1,93 g (81$) eines amorphen festen Materiales, welches im wesentlichen aus dem ß-Anomer der Verbindung 9-(2' ,.-3¹,5'-Tri-O-benzyl-Duarabinofuranosyl)-2-acetamicb-6-aminopurin bestand.

Durch Hydrogenolyse von 2,97 g (5»O mMol) des rohen Monoacetamidpderivates (wie vor) in der von G-laudemans und Fletcher (J.Org. öhem. 28, 3004 (1963)) für !ri-O-benzyl-AF-adenin beschriebenen Weise und anschließende Kristallisation aus Wasser erhielt man 1,44 g (89^) 9-AF-2-acetamido-6-aminopurin.

Eine Lösung aus 1,30 g (4,0 mMol) des vorstehenden Monoacetates und 3,2 g Natriumnitrit in 10 ml heißem Wasser wurde auf Umgebungstemperatur abgekühlt und unter mechanischem Rühren mit 3,2 ml Eisessig versetzt bis vollständige Lösung eingetreten war. Man setzte das Rühren noch etwa eine Stunde fort, setzte dann etwa die gleiche Menge Wasser zu und rührte weiter 16 Stunden bei Umgebungstemperatur. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 4 eingestellt (mit pH-Papier); danach wurde die Lösung im Vakuum zur Erockne eingeengt. Der trockne Rückstand wurde mit heißem Methanol aufgerührt, die Suspension heiß filtriert und das Filter mit heißem Methanol gewaschen. Die vereinigten methanolischen Filtrate (ca. 40 ml) wurden mit 460 mg (2,0 mg-\Atom) Natrium versetzt; danach wurde die Lösung eine Stunde lang zum Rückfluß erhitzt. Nach, dem Neutralisieren mit Essigsäure wurde die Lösung auf ein Volumen von 30-40 ml eingeengt; die so entstandene Aufschlämmung wurde mehrere Stunden auf 5^GC gekühlt. Das Rohprodukt wurde gesammelt, sorgfältig mit Wasser gewaeohen und schließlich in Gegenwart von Aktivkohle zweimal aus Wasser umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man 6,77 mg (6OjS) 9-AF-2-guanin in Form von glänzenden Nadeln. '

Durch Behandlung von 9-AF-gmanin mit Natriumnitrit und Esslgaäisr© erhält man 9-AP-xenthin. Durch Behandlung von 9-Af-aäenin mit nitrit und Essigsäure erhält mein 9-AJF~i

In den bereits ^@@ohrieb«n©n und im fen folfiendtn Bei«pie!«a und Präparaten sind baw. werden verschiedene lQnenauet*u«cherh*rB« der Firm*

- 37 - 009820/1021

ßAn /

BAD ORIGINAL

DowCompany verwendet. Bei diesen Ionenaustauscherharzen handelt es sicxtL um flie folgenden?

DowexjO.I 8

Dowex 50 X 8 ist ein stark saures Katiqn-Austauscherharz, welches ringförmige Sulfonsäureaustauschergruppen enthält, die an ein Styrol-Polymergi.t.ter geknifft sind _s welches mit etwa Q⁰Ja Drviny!"benzol vernetzt ist. . -

Dowex 5OW X 8. ■

Dowex 5OW X 8 ist ein besonders gereinigtes Dowex 50 X 8; das Harz besitzt eine weiße Farbe im Gegensatz zur gelbbraunen Farbe des Dowex 50 X 8,. .

Dowex 1 X 8

Dowex 1X8 ist ein stark basisches Anion~Austauscherharz, in welchem guaternäre Ammoniumaustauschergruppen an ein Styrol-Polymergitter geknüpft sind_o

Dowex AG 1 X 8 ..'■".

Dowex AG 1 X 8 ist eine besonders gereinigte Form des Dowex 1 X 8_S die Ton den Bio-Rod Laboratories₉ Richmond_s California₉ USA₉ geliefert werdeno

Präparat 34-

ir-Benzoyl-1-(2^ü _s3'-di-O-benzoyl-TPM-AF)cytosin (Verbindung H) { Bine Mischung aus 6,2 g 1~(TPM-AF)cytosin_s 40 ml trocknem Pyridin und 6 ml Benzoylchlorid rührt man bei Raumtemperatur, etwa 24 bis 26 C, etwa 20 Stundend Das Reaktionsgemisch gießt man- in 500 ml kaltes IVas'ser und rührt wieder drei Stunden bei Raumtemperatur_o Der wäßrige Seil des Gemiebhes wird abgegossen? der gummiartige RücketaE wird zweimal mit Wasser gewaachen_s welches Jeweils abäekantiext wird« Das gummiartige und das feste Material werden in 150 ml Methylenchlorid gelöst j diese Ijösting wird nacheinander zweimal mit je 50 ml Wasser und einmal mii;^;50 ml einer gesättigten- wäßrigen Uatriumchloridlöaung gewaschen. Die Methylenchloriälösung wurde durch Überleiten über 10 g wasβerfreies Natriumsulfat^ welches sich in einem Glaefrittentriöhter befand, getrocknet. DasTrockenmiitel

- 0098 2Ö/1

BAD ORIGINAL

wurde mit 20 ml Methylenchlorid gewaschen; das Waschwasser wurde mit dem PiItrat vereinigt. Die Methylenchloridlösung wurde anschließend bei 40⁰O im Vakuum eingedampft, so daß man die Verbindung H als Rückstand erhielt. .

Präparat 35

ΪΓ-Acetyl-1 -(2^!, 3 ·-di-O-acetyl-TPM-rAP)cytosin (Verbindung J) Eine Suspension aus 750 mg 1-(TPM-AF)cytosin in 9 ml Pyridin wurde mit 3 ml Essigsäureanhydrid behandelt. Die Mischung wurde gerührt bis vollständige lösung erreicht war. Man setzte das Rühren danach noch zwei Stunden fort,wobei sich die lösung in eine kristalline Masse verwandelte» Diese Masse wurde in 90 ml Wasser eingetragen; k der entstehende weiße kristalline ITiederschlag wurde abfiltriert, ' sorgfältig mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhielt auf diese Weise 950 mg einer kristallinen Substanz mit Ε: 249-259,5 C. Diese Substanz wurde aus Äthanol umkristallisiert; nach dem Umkristallisieren lagen 800 mg farbloser Rosetten der Verbindung J mit einem Schmelzpunkt von 251-252⁰G vor.

Analyse? berechnet für O₅-H₅₅O^H₅: ü, 66,76; H, 5,44; N, 6,87; gefunden' G, 67,04; H, 5,47; H, 7,00.

Präparat 36

N⁴-Butyryl-9-(2⁸,3^!-di-O-butyry 1-TPM-Ai¹)adenin Zur Herstellung dieser Verbindung setzte man in der bei Präparat angegebenen Weise 9-(TPM=Ai¹)adenin mit Buttersäureanhydrid in Pyridin um.

Präparat 37

-Ai¹) guanin

Zur Herstellung dieses Produktes setzte man in der bei Präparat 34 angegebenen Weise 9-(TPM-Ai¹)guanin mit Benzoylchlorid um.

Präparat 38

-I-(3'-O-acetyl-TPM-DRF)5-methylcytosin Zur Herstellung dieser Substanz setzte man in der bei Präparat 34 angegebenen Weise 1-(TPM-DRi¹)5-methy!cytosin mit Essigsäureanhyärid um. ■

009820/1828

'■'■'■ -. 39 - ' BAD ORIGINAL

In der "bei Präparat 34 angegebenen Weise lassen sich auch".andere Acylverbindungen der Formel TII herstellen, wenn man eine Verbindung der Formel TI mit einem Säureanhydrid, Acylchlorid·, Aoylbromid (mit 2 Ms 12 Kohlenstoffatomen) oder Anisinsäure umsetzt. Folgende Verbindungen lassen sieh auf diese Weise erhalten: H iLauroyl-9-(2',3¹-äi-0-lauroyl-£Hi-AF)aäenin, 9-(2', 3'-Di-0-valeryl-aiPM-BS^l-)hypoxanthin_! 9-(2« ,3'-Di-O-hexanoyl-TPM-BF)xanthin, 3-(2',3^l-Di-0-qctanoyl~iDPM-B]?)-3-uracil, 1-(2S3^l-Di-0-isobutyryl-TPH-BF)5-fluoruracil, (1-(2«,3«- Di-0-anisoyl-!DPM-RF)thymin, N--Phenylacetyl-1-(2^t,3'-di-O-phenylacetyl-iDPM-BF)3-methylcytosin, i-CS'-O-Butyryl-iDPM-DRF^S-'aoäuracil, 1-(3*-O-Undecanoyl-TPM-DRF)5-trifluormethyluracil, 1-(3'-O-Deoanoyl-ΐΡΜ-DRF)5-bromuracil, SKCS^-O-Heptanoyl-TPM-DRF) guanin, 9-(3'-O-ITjionaoyl-2PM~DRF)6-mercaptopurin, 9-(3^f-Q-Octanoyl-IPM-DRF)xanthin u.a.

Präparat 39 ' , · ..

IT -Anis oyl~ 1 -\ß^x -0- (p-methoxyplieny 1) diphenyImethy 1-AFJ cytοsin ( Verbindung E) '"„ -

A. H —Anisoyl-1-AF-cytosin (Yerbindung Ka*) 5g 1-AF-cytosin und 25 ml Anisoylchlorid werden in 100 ml Pyridin gelöst; die Lösung wird bei 25⁰C sechs Stunden gerührt. Zu dieser Mischung gibt man 400 ml 1,5 η Ohlorwasserstoffsäure·.. Sie so gewonnene Lösung laßt man über Facht bei Eaumtemperatur (22-24⁰O) stehen. DIf gebildete feste Substanz" wird abfiltriert, sorgfältig mit Wasser verrieben und gewaschen und an der Luft getrocknet„ Das feste Material wird danach in einer Mischung aus 275 ml Wasser und 251 ml Äthanol, die zuvor auf einem Dampfbad auf TO⁰O erwärmt worden war, suspendiert.■ Die rohe Suspension wurde auf 4⁰O abgekühlt und durch Zugabe Ton η ITatriumhydroxidlösung auf einen pH-WErt von 8 gebracht. Die feste Substanz wuröe sofort abfiltriert, mit Wasser gewaschen, an der Luft getrocknets mit 300 ml Äther gewaschen, erneut filtriert und an der Luft getrockBet. Auf dies® Weise erhielt man 16,6 g Rohprodukt. Dieses Rohprodukt wräe mit 195 ml Pyridin und 65 ml Wasser aufgenommen und auf Eisbad temperatur abgeiättiXt, Diö Lösung wurde unter lebhaft «m Rühren mit 350 ml 1,5 η H&tri^^yoroxidlosung beHandelt (eine halbe Stunde). Die Reaktion wurde iurssli 2r*ge£fc©. τοη 350 ®1 Döwex 50 χ 8 (!•einheit entsprechend einem Prüfei&b alt 4-59; Die 1600 Äachen/om²) (Pyrifliniumharz) beendet \ enBohli®i©aä, msü® SO Miirai^a -eerUturb (pH- j Wert s 7,0). Dae unlösliche Material woeöe mim ter

009S20/18IS

— 40 —

BAD ORIGINAL

der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum bei 5O⁰O zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde dreimal mit je 200 ml Äther verrührt und filtriert. Die feste Substanz, wurde danach in 300 ml slndendem Wasser suspendiert und dreimal filtriert. Die vereinigten Filtrate wurden unter vermindertem Druck auf ein kleines Volumen eingeengt, so daß man 2,0 g eines Produktes mit einem Schmelzpunkt von 197-200⁰O (unter Zersetzung) erhielt. Dieses Rohmaterial wurde viermal aus Wasser und einmal aus Äthanol umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man die Verbindung Ea mit einem Schmelzpunkt von 200,5 bis 201,5 0 (unter Zersetzung).

Analyse: berechnet für O₁₇H₁QO₇H₅: C, 54,11; H, 5,08; N, 11,14. gefunden 0, 54,38; H, 4,82; H> 11,31.

fe B-. H" -Anisoyl-1-[5^l-0-(p-methoxyphenyl)diphenylmethyl-AFjcytosin (Verbindung Kb)

Eine Lösung aus 4,8 g Verbindung Ka in 50 ml Pyridin wurde mit (p-Methoxypheny1)-di-phenylchiοrmethan behandelt. Nach 9 Stunden setzte man 10 ml Methanol zu und goß die Pyridinlösung unter Rühren in 600 ml Wasser. Sobald sich ein gummiartiges Material durch Koagulation abgeschieden hatte, wurde die Lösung dekantiert. Der Gummi wurde mehrere Male mit Wasser (unter zwischenzeitlichem Dekantieren) gewaschen und danach mit Methylenchlorid aufgenommen. Die Methylenchloridlösung wurde zweimal mit Wasser und einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 3O⁰O im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der dabei verbleibende Rückstand wurde in Benzol gelöst und

ρ über eine Silikagelkolonne (5,8 χ 48 cm) gegeben; die Kolonne wurde wie folgt eluiert: 20 100 ml Fraktionen mit 2?o Methanol und 98</£ Benzol und danach 40 100 ml Fraktionen mit 5$ Methanol und 95$ Benzol . Die Fraktionen 49-60 wurden mit Äther verrieben, wodurch man eine kristalline Substanz erhielt, die abfiltriert und mit Äther gewaschen wurde. Man erhielt auf diese Weise 4,21 g der rohen Verbindung Kb.

Präparat 40

N⁴-Benzoyl-1-(TPM-AF)cytosin (Verbindung L)

A. N -Benzoyl-1-AF-cytosin (Verbindung La) Eine Lösung von ü,5 g H -Benzoyl-1-(2' ,3'-äi-0-benz;oyl-AF)cytosin

" ⁴¹ " 009820/1828

in 17 ml Äthanol -wurde auf- 5⁰O abgekühlt und mit 0,4 g Natriumhydroxid in 3 ml ¥asser versetzt. Man ließ die .Mischung 30 Minuten "bei 5⁰C stehen und goß dann in 80 ml liswasser, neutralisierte mit 1 η Chlorwasserstoffsäure und filtrierte. Der abfiltrierte Niederschlag wurde auf dem Filter mit Wasser gewaschen und dann zweimal aus Xthanol-Skellysolve B umkristallisiert. Auf diese Weise erhielt man die Verbindung La.

B, Behandelt man die Verbindung La bei 22 bis 25°0 8 Tage mit TPOM, so erhält man die im Titel dieses Beispieles genannte Verbindung L.

Die in den folgenden Präparaten 41 bis 46 beschriebenen Verbindungen erhält man ebenfalls durch zweistufige Umsetzung. Die Umsetzung in f den Stufen A erfolgt jeweils in der bei Präparat 40 angegebenen Weise mit Natriumhydroxid bei 5⁰Of in Stufe B behandelt man dann die in Stufe A hergestellte Verbindung bei 22 bis 25⁰G 8 Tage mit TPGM.

Präparat 4I

N⁶-Butyryl~1-(TPM-AS¹) adenin (Verbindung M)

A. N⁶-Butyryl-1-AI^l-adenin (Verbindung Ma)

Diese Verbindung gewinnt man in der angegebenen Weise aus N -Buty ryl-1 -(2', 3'-di-O-butyryl-Ai¹)cytosin.

B. Die Verbindung Ma setzt man mit TPGM in der angegebenen Weise zur Verbindung M um.

Präparat 42

N²-Benzoyl-9-(TPM-AI¹)guanin (Verbindung N) "

A. N -Benzoyl-9-A]?-guanin (Verbindung Na)

Diese Verbindung gewinnt man aus N -Benzoyl-9-(2',^'^di-O-benzoyl Al)guanin .

B. Die Verbindung Na setzt man mit TPGM zur Verbindung N um.

BAD ORIGINAL

- 42 -

009820/1Ö 28

Präparat 43

N -Valeryl-i-iTPM-AF^-methylcytosin (Verbindung O) A* IT -Valeryl-i-AF-S-methylcytosin (Verbindung Oa) Diese Verbindung gewinnt man aus N -Valeryl-1~(2',3'-äi-0-valeryl-AF)-5-methy1cytοsin.

B. Die Verbindung Oa setzt man mit TPCM zur Verbindung 0 um.

Präparat 44

N -Lauroyl-i-iTPM-AF^-methylcytosin (Verbindung P)

A. N -Iauroyl-1-AF-3-methylcytosin (Verbindung Pa)

Diese Verbindung gewinnt man aus N -Lauroyl-1-(2^I,J'-di-O-lauroyl-AJ¹)-™ 3-methylcytosin.

B. Die Verbindung Pa setzt man mit TPCM zur Verbindung P um.

Präparat 45

H^-Benzoyl-1-(TPM-RF)eytosin (Verbindung Q)

A. N -Benzoyl-1-RF-cytosin (Verbindung Qa)

Diese Verbindung gewinnt man aus Ii -Benzoyl-1-(2^f ,3^I-di-0-benzoyl-RF— cytosin.

B. Aus der Verbindung Qa gewinnt man durch Umsetzung mit TPCM die Verbindung Q. c

Präparat 46

Ή -Acety 1-9-(TPM-Ri¹)adenin (Verbindung R)

A. N⁶-Aeetyl-9-Hi^I-adenin (Verbindung Ra)

Diese Verbindung gewinnt man aus U -Acetyl-9-(2·,3'-di-O-acetyl-RF)-adenin.

Bv Die Verbindung Ra behandelt man mit TPCM und gewinnt so die Verbindung R. -

In der bei Präparat 40 und Präparat 3 beschriebenen Weise lassen sich auch andere Verbindungen der Formel X erhalten, indem man Verbindungen der Formel VII mit einer Base behandelt und das so gewonnene Produkt veräthert* Folgende Verbindungen der Formel X lassen sich gewinnen:

_₄₃ _ 0 0 9 ß 2 0 / 1

M^-Propionyl-, l^-Butyryi-, N^-Valeryl-, H^-Hexanoyl-, -, 1^-Lauroyl-, H^-Phenylaeetyl-I-(TPM-Ai¹)cytosin, Έ -Lauroyl-9-(TPM-EF)guanin, F -Phenylacetyl-9-TPM-EF)adenin, N^-Benzoyl-1-TPM-EF)3-methylcytosin, Ii -Heptanoyl-i-CoiPM-EPOS-metnyleyfcosin, H²-Butyryl-9-(TPM-EF)guanin,_ H²-Anisoyl-9-(TPM-EF)guanin, F -Decanoyl-9- _ ' [5' -O-(p-metkoxypnenyl)diphenylmet.hyl-ElJ adenin, B-Propiony 1-1 -[5' -0-(p-metlioxypnenylOdi-plienylmetliyl-EiJS-inetliylGytbsin, IT -Phenylaoetyl-1-L5^I-0-(p-metnoxypnenyl)äip]ienylmethyl-im?| J-methyleytosin, Έ ,Ή -Diace ty 1-9-((EPM-DE^)2,6-diaminopurin, N -Phenyip

y )py

adenin, Έ -Hexanoyl-i-tS'-Q-Cp-methoxyph^
droxymethylcytosin u.a.

Beispiel 2 |

1-I)Eff-tnyrain-3^r-yl-9--KlJ^l-7-dea2;aaaenin-5^l-yi-pnGBpHät (Tertiindung AA). .]'■■.

(A) 1 - (TPM-DEi¹) tnymin-3' -yl-K⁶-^:benzoyl-9- (IP-Ei¹*) 7-aeazaadenin-5«-ylphosplaat (Tertandung AAa) " .

Eine Miscliung aus 500 mg (1 mMol) ¥⁶-Benzoyl-9-(IP-SF)7-aeazaaaenin-5'-phosphat und 485 mg (IuMbI)■' 1-(TPM-DEi¹ )thymin (G. ¥eimann und H.G. Khorana, 3"AGS, 84, 419 (1962)) "wurde durch wiederholt es Einengen unter vermindertem Druck bei 30⁰G mit speziell gereinigtem, trocfcnem Pyriäin getroclaiet. In den Eolhen wurde trockne Luft eingeleitet; danach noch 5ml "besonders gereinigtes, trocknes Pyriäin und 1.03 g (5 mMol) Ιί,Ν¹-Dicyclohexylcarboäiimiä. Die Mischung wurde im Dunlclen* bei Eaumtemperatur (21-25^OC) Trier Tage geschüttelt. Danach setzte man Wasser (5 g ml) zu und rührte die Mischung weitere 24 Stunden. Die Mischung wurde dann filtriert; das FiItrat wurde unter Yermindertem Druck zu einer syrupösen liasse eingeengt. · .

Ein Teil des Syrups wurde lyophilisiert und anschließend in 5 ml Acetor wieder aufgelöst. Die Lösung wurde über eine Silikagelkolonne gegossen und mit Äthylacetat chromatographiert, v/elches steigende Mengen an Skellysolve B enthielt. Die Fraktionen, die - wie durch Papierehrornatographie festgestellt wurde - das gewünschte Produkt enthielten, wurden eingedampft; auf diese Vieise erhielt man die gereinigte Verbindung AAa.

*'S)le Abkürzung IP-Ei' wird hier und in den folgenden BEIspielen für die Gruppe 2',V-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl- verwendet.

Q0982O7182Ö _{ßADORJGINÄL}

B. Verbindung AA

Die rohe und die gereinigte Verbindung AAa wurden vereinigt und zu einer Lösung· von 8 ml "Wasser, 20 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid und 20 ml Methanol gegeben. Man ließ die Mischung bei Raumtemperatur über ITacht stehen und engte dann im Hochvakuum bei 3O-35°O zur Trockne ein. Der so gewonnene Rückstand wurde mit Aceton verrieben, eine kleine Menge Έ,Ή*-Dicyclohexy!harnstoff (90 mg] wurde abfiltriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und danach 2 1/2 Tage mit 12 ml 80Joiger wäßriger Essigsäure bei Raumtemperatur behandelt, um die Tripheny!methyl- und die Isopropylidengruppen zu entfernen. Die Mischung wurde filtriert und das Filtrat wurde unter vermindertem Druck bei 35⁰C zu einem Syrup eingeengt. Der Syrup wurde in 20 ml Wasser aufgelöst; die Lösung wurde

™ mit 3 ή wäßriger Ammoniumhyäroxidlösung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und anschließend mit Äther extrahiert. Die Ätherextrakte wurden verworfen. Die wäßrige Schicht wurde eingeengt, um gelösten Äther zu entfernen. Das Konzentrat wurde danach mit Wasser auf ein Volumen von 25 ml gebracht. Diese Lösungsmenge wurde über eine Kolonne (3x51 cm) mit Diäthylaminoäthylcellulose (Carbonatform) chromatographiert, wobei Fraktionen von je 9 ml abgenommen wurden; zum Eluieren wurden je 2 1 Triäthylammoniumbicarbonat mit Konzentrationen von 0,02 bzw. 0,125 η verwendet. Die Fraktionen 66 bis 77 wurden vereinigt und erneut mit 80$iger wäßriger Essigsäure bei Raumtemperatur zwei Tage behandelt, nachdem durch Papier· Chromatographie gezeigt worden war, daß die Isopropylidengruppe

b noch nicht quantitativ aus der Probe entfernt war. Die Mischung wurde dann filtriert _} unter vermindertem Druck zu einem Syrup eingeengtj der in Wasser wieder aufgelöst, mit 3 η Ammoniumhydroxid neutralisiert und mit Äther extrahiert wurde. Die Ätherextrakte wurden verworfen? die Lösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt, um gelösten Äther zu entfernen. Nach dem Filtrieren und Eindampfen lag die Verbindung AA als weiße feste Substanz vor.

Beispiel 3

1-5'-yl-phosphat

(Verbindung BB)

1 g 1 - ( TPM-DRF) thymin-3' -yl~I⁶-benzoyl~9- (IP-EF) 7-ä eassaadenin-5.' yl-piiosphat wurde mit 80#iger wäßriger Essigsäure vier Tage bei

.._; ;_: -45- 009820/1828 _{BAD 0R|a},_NAL

-"45" ■

Raumtemperatur behandelt« Die so gewonnene Mischung wurde filtriert und unter -vermindertem Druck "bei 35⁰C zu einem Syrup eingeengt. Der Syrup wurde in Wasser gelöst, mit 2 η Ammoniumhydroxid neutralisiert und mit Äther extrahiert« Die Itherextrakte wurden -verworfen. Die Lösung wurde auf ein kleines Volumen eingeengt, um gelösten Ither zu entfernen. Mach dem filtrieren und Eindampfen lag die "Verbindung BB vor. .

Beispiel 4

1-AP-cytöSin-2·-yl- und 1-AP-cytosin-3*-yl-9-Hi¹-7-äeazaadenin-5^!-ylphosphat (Verbindungen OG und DD)

In der bei Beispiel 2A beschriebenen Weise wird N -Benzoyl-9-(IP-BP)* 7-deazaadenin^-5'-phosphat mitΉ -Benzoyl-1-(IPM-AP)cytosin in Gegenwart von ^,E'-Dicyclohexylcarbodiimid kondensiert, wobei man ein Ge-J misch aus H^-Benzoyl-i-CirPM-ÄF^cytosin-^¹-(und 3' )yl-N -benzoyl-9-(IP-PuP)7-deazaaäenin^'-5¹-yl-phosphat erhält.

Die so gewonnene Mischung wird in der in Beispiel 2B zunächst mit wäßrigem Methanol, welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure hydrolysiert= Auf diese Weise erhält man, eine Mischung der Verbindungen CC und DD, die durch,Chromatographie getrennt wird«,

Beispiel 5

l\P-Benzoyl~1 ~AI¹-3-methylcytosin-2»-yl» und I^-Benzoyl-i-AP-^-methyleytosin-3 * -yl-lT -benzoyl-9=HE=-7-äeazaadenin^-5^!-yl-phosphat (Verbindung-en EE und J¹I) . g

Bl9(IPHE)7

In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise wird N -Benzoyl-9--( deazaadenin-5'»phosphat mit Ή -Benzoyl-1-(IPM-AP)3-methylcytosin in Gegenwart von NsU'-DicyclOhexylcarbodiiiEid kondensiert, wobei man ein Gemisch aus lT⁴-Benzoyl-1»(!rPM-AP)-3-methylcytosin72¹¹ (und 3⁸)-yl H -benzoyl-9-(IP-Ri¹)7-äeazaaäenin-5^f-yl-phosphat erhälto Die so gewonnene Mischung wurde in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise, @fc nur mit wäßriger Essigsäure hydrolisiert. Auf diese Weise erhielt man eine Mischung der Verbindungen EE und I¹P-, die durch Chromatographieren getrennt wurde, * ... .;._: .

■■■■■; BAD

*) beschriebenen Weise _r ■. · ; ^: :.:

Beispiel 6

1-ΗΪ-5-trifluormethyluracil-2'(und 3')
9-RS¹-7-deazaaäenin-5'-yl-pnosphat (Verbindungen GG und HH) In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man Ή -Benzoyl -9-(IP-Rl)7-deazaadenin-5'-phosphat mit 1-(TPM-Rl)-5-trifluormethyiuracil in Gegenwart.von l^l'-Dicyclohexylcarboäiimid und erhält so ein Gemisch aus 1-(TPM-Rl)-5-trifluormethyluracil-2¹(und 3')-yl-N benzoyl-9-(IP-EP)7-deazaadenin-5'-yl-phosphat.

Das so gewonnene Gemisch hydrolisiert man in der in Beispiel 2B an-

zunächst
gegebenen WeiseNmit wäßrigen Methanol, welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure. Auf diese Weise erhält man eine Mischung der Verbindung GG und HH, die durch Ghromatographieren getrennt wird.

Beispiel 7

9-DRF-2,6-diaminopurin-3'-yl-

9-RP-7-deazaadenin~5'-yl-phosphat (Verbindung II) und F²,F⁶-Diacetyl-9-DRi¹-2,6-äiaminopurin-3'-yl-K'⁶-benzoyl-9-Ri¹-7-äeazaadeninT-5¹ -yl-phosphat (Verbindung KK)

In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man InT -Benzoyl 9-(IP-Ri¹)7-äeazaadenin-5 '-phosphat mit H²,J>T⁶-Diacetyl-9-(TPM-DRE¹)2,6 diaminopurin in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid und erhält so Έ² ,N -Diacetyl-9-(TPM-DEF)2,6-diaminopurin-3' -yl-IT -"benzoyl-9-( IP-Ri¹ )7-deazaadenin-5'-yl-phosphat (Verbindung JJ).

Hydrolisiert man die Verbindung JJ in der in Beispiel 2B angegebenen Weise zunächst mit wäßrigem Methanol, welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure, so erhält man die Verbindung II.

Hydrolisiert man die Verbindung JJ in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise mit wäßriger Essigsäure allein, so erhält man die Verbindung KK.

Beispiel 8

9-Έ&-7-ύeasaaöenin-2 '■(und 3» )-yl-9-RI^I-7-äeazaadenin-5 '-yl-phosphat (Verbindungen IiL und MM)

In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man N -Benzoyl-

009820/1828

- 47 - BAD ORIGINAL

-9-(IP-lI¹)7'-deazaadeniii-5^l -phosphat mit N⁶-Benzoyl-9-(TPM-Ri¹) 7-deazaadenin in Gegenwart von Dlcyelohexylcarbodiimiä. Man erhält so ein Gemisch aus H -Benzoyl-9-CiPM~^~3sä3SÄassBRB^F^/7-d6azaaaenin-2^! (-und 3^! )-yl-lT⁶-'benzioyl-9-(l3i'-KE¹)7-deazaaäenin-5 '-yl-phosphat.

Diese Mischung hydrolysiert man in der in Beispiel 2B beschriebenen Weise zunächst mit -wäßrigem Methanol, welches Ammoniak' enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure. Auf diese Weise erhält man eine Mischung der Verbindungen 11 und MM, die man durch Chromatographie trennt. ·

Beispiel 9

9-DEi^-6--mercaptopurin-3' -yl-R3?-7-deazaadenin-5'-yl-phosphat (Verbindung IW) , ^

In der in Beispiel 2A "beschriebenen Weise kondensiert man Ή -Benzoyl-9-(lP-KI¹)-7-deazaadenin-5^t-phosphat mit 9-(TPM-DEi¹)-6-mercaptopurin in Gegenwart von Dicyclohexylcarboäiimid zu ö-mercaptopurin-J'-yl-N -"benzoyl^-iIP-Hi¹ )7-deazaaäenin-5^f-ylphosphat. -

Durch Hydrolyse dieses Produktes in der in Beispiel "2B beschriebenen Weise mit wäßrigem ammoniakhalt igen Methanol und wäßriger Essigsäure erhält man die Verbindung HH₀

Beispiel 10

9-AE-guanin-2'(und 3¹)-yl-9-ß-D-ribofuranosyl-7-äeazaadenin-5^l-ylphosphat (Verbindungen 00 und PP) ' . '

In der in Beispiel2Ä beschriebenen Weise kondensiert man H"^p-Benzoyl-9-(IP-KB¹)7-deazaaaenin-5'-Phosphat mit H²-Benzoyl-9-(TPM-Ai¹)guanin

in Gegenwart von Dicyclohexylcarboäiimid zu einem Gemisch aus M^--Benzoyl°9-(TPM-Ai¹)guanin-2⁸ (und3' )-yl-N⁶-benzoyl-9-(IP-Si")7°deaza-

adinen-5¹ -yl-phosphat·» ■

Die so gewonnene Mischimg wir^ in der in Beispiel 2B beschriebenen V/eise zunächst mit wäßrigem Methfeii. I₅ welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure hyarolisierte Auf dieee Weise erhält man eine Mischung der Verbindungen 00 unä PP₅ die durch Chromatographie getrennt wird.

009820/1828

Beispiel 11

-5 *-yl-phosp]aat

(Verbindung QQ)" .

In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man Έ -Benzoy3 -9-( IP-Ri¹) -7-deazaadenin-5^!-phosphat mit 9- [5' -O- (p-Methoxyphenyl)-c diphenylmethyl-AiiJhypoxanthin in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid zu 9-[5'-0-(p-Methoxyphenyl)diphenylmethyl-Al]hypoxanthin-3'-yl-N -benzoyl-9-( IP'¹ EP) 7-d eazaad enin-5 * -yl-ptiosphat.

Das so gewonnene Produkt wird in der in Beispiel 2B beschriebenen Weise zunächst mit wäßrigen Methanol, welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure hydrolysiert. Auf diese Weise erhält man die Verbindung QQ.

Beispiel 12

1 -ß-D-Arabinofuranosylcytosin-2' (und 3 *)-yl-9-RS¹-7-deazapurin-5' yl-phosphat (Verbindungen RR und SS)

In der xn Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man 9-(IP-Ri¹ )7-deazapurin-5 '-phosphat mit Ir-Benzoyl-I-((DPM-Ai¹)cytosin in Gegenwart von Dieyelohexylcarbodiimiä zu einem Gemisch aus N-Benzoyl-1-(5'-0-triphenylmethyl-ß-D-arabinofuranosyl)cytosin-2' (und 3»)-yl-9-(IP-Ri¹) 7-deazapurin-5' -yl-phosphat.

Die so gewonnene Mischung wird in der in Beispiel 2B beschriebenen Weise zunächst mit wäfcigem Methanol, welches Ammoniak enthält, und darm mit wäßriger Essigsäure hydrolysiert. Auf diese Weise erhält man eine Mischung der Verbindungen RR und SS, die durch Chromatographie getrennt wird.

Beispiel 13

1 -RF-jj-f luoruraeil-2»(und 3') -yl-S-BI-e-meroapto-7-deazapurin-5' yl-phosphat (Verbindungen IEi und UTJ)

In der in Beispiel 2A beschriebenen Weise kondensiert man 9HiP-Ri¹)-6-mercapto-7-*äeazapurin-5'-phoBpliat mit 1-(!EPM-Rf)5«fluoruracil in Gegenwärt von Dioyelohexylcarboäiimid zu einem Gemisch, aus 1-(SPM-HF)5-fluoruraeil-2·(und 3»)-yl-9-(IP-RF)6-mercapto-7-deazapurin-5*- yl-phosphat.

BAD ORIGINAL

" ⁴⁹ " 009820/1820

■ 18206Λ3

Die so gewonnene Mischung wird in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise nur mit waßrigei* Essigsaure hy^rollslecrfrv Man erhalt ein ' Gemisch-der Verbindungen ϊϊ und "ΏΈΓ,,,welches durch Chromatographie· getrennt wird»^:; ■ ^: ; ^: · ' ■' ^: .. ί ■ ■ · -

Beispiel.. 14 · - ; ^:\ · :-■:,,;.■■ · .

1 -KF-5-f luoruracil-2' (und 3¹ )-yl-9-Biⁱ-6-ffiethylmercapto-.7--äea£5apurin-5'-yl-phosphat (Verbindungen W und W¥)

In der in Beispiel Ik /beschriebenen Weise kondensiert man, 9-(IP-Bl)-6-methylmercaptb-7-dea2apurin-5^!-pho^aat mit .1r-(iEPM-BJ)-5-fluoruracil in Gegenwart^ von Dieyclohexylcarfeodiimia zu einem Gemisch yon 1-(EPM-Bi¹) 5-f luoruracil-2' (und 3^f)-yl-9- (IP-BS¹) 6-methylmercapto-7-deazapurin-5¹-yl-phosphat. _: ■

Die so gewonnene Mischung wird in der in Beispiel 2B besehr!ebenen Weise mit wäßriger Essigsäure hydrolisiert. Mf diese Weise erhält man eine Mischung der Verbindungen. VV und WW, die durch Öhromatographie getrennt wird.

Beispiel Ί5 ' "

9-DBF-guanin-3 · -yl-g-BP-re-hydroxy-T-äeaziapurin-S^f -χΐ-phosphat

(Vertindung XX) ^ ■

In der in Beispiel 2A "besohriebenen Weise kondensiert man 9-(IP-BJ¹)-

ö-hydroxy-T-deazapurin-S¹ -phosphat mit ir^-A.CBtyl-S^iiPM-DEI¹)guanin in Gegenwart von DicyclohexylearlDoäiimid zu N -Aoe:tyl-9-(TPM-DBF)- | r^¹ -y 1-9- (Ip-BS')^6^hyäroxy-7-ä eazapurin-5 ^Λ _: -yl-phosphat.

Das so gewonnene Produkt wird in"der in Beispiel 2B beschriebenen Welse zunächst mit wäßrigem Methanol, welches Ammoniak enthält, und dann mit wäßriger Essigsäure hydrollslert. Auf diese Welse erhält man die Verbindung XX, ^; ' .

Beispiel 16 ' V \ W" VV.V /-' VV^V ^VV./^V "V· .-.::--■■'.-

r!-^7-ä©a2apui?in-f %l^hospfce,t -

In &9T in Beispiel 2A laeeohrielDenan Weise kondensiert m&n 9-(IP-BP)-7-Ä^aapurlQ*f '^fÄosiöiat mit 1*(flMr5l^)-ti3^mia in

bad original

1820643

Das so gewonnene Produkt wird in der in Beispiel 3 beschriehenen Weise mit wäßriger Essigsäure hydrolysiert. Auf diese Weise erhält man die Verbindung ΥΪ.

In der in den Beispielen 21 und B oder - falls keine AGylaminogruppe vorhanden ist - in der in den Beispielen 2A und 3 beschriebenen Weise könßn andere 3¹, 5'- und/oder 2¹» 5'-Dinucleosidphosphate der !Formeln IVa, IVb, IVc und IVd hergestellt werden, in denen eine der Nucleosideinheiten ein 9-HF-7-deazapurin-5^s-phospliarsäurerest ist. Beispielsweise lassen sich folgende Verbindungen herstellen:

i-BJ-uracil-Z'-yl-1-EF-uracil-S«-yl 1 -DKB^l-uracil-3' -yli-AI-5-fluoruracil-2'-yl- 1 -Ai-5-f luoruracil-3' -yl·-- 9-AF-ad enin-2·-yl- 9-jLF-aä enin-3 * -yl-

1-DEJ^I-5-methyloytosin-3«-yl- ' phat

1 -DBJ¹-5-methylcytosin-3 ^r-yl-9-Hi'-xanthin-2«-yl-

9-KP-2,6-diaminopurin-2'-yl gr-KP-2,6-diaminopurin-3' -yl-1-EP-S-hyäroxymethyloytosin-2»-yl-1-Bl-5-hydröxymethyloytosin»3'-yl-

-Bl-S^ioduraoil-2'-yl-

Ta n-2^^-yl-1 -EF~7-aeazaaäeniii-3' -yl- -3'-yl-

-2'-yl-

y yl-phosphftt

-5^f

SAD ORIGINAL

009320/132i

i.-AJ-cytosiu-2 * -yl~ 1 -AlT-cytosin-!?' -yl-

iii-a ^r-yl-

-Z«-yl-

g-EP-ad eniii-3¹^yI-9-DEF-7-äeazaäeiiin--3-yl-

9-HP-7-äeazapT2riiiL5* -yl-phospliat

1 -HF-S-metbylTrracil-^«-yl-1 -EF-5-me1;liyliiracil-3 * -ylg-itP-ad enin-2 · -yl-9-Rl-adenla-3'-yl-1 -Ai^l-5-hydroxymetliyI-2ⁱ-yl-1 -AJ^l-5-'liyäroxyffletliyl-3' -yl-

9-Ei-6-mercapto-7-äeazapx£r in-^ i-yl phosphat

9_DHj«.ljypoxaTitliin-«3 * -yl-9-DRF-7-äeazaadenin--3 * -yl-

1-RF-uraeil-2*-yl-

5' -yl-pliösphat

9"BF-6-ä-tliyliaercapto-7-dea2iapurin-5 * yl-pliospliai;

H -Anisoyl-9-HJB^l-giianinr-2 · (und Jljl-yl-H deazaad enin-5' -yl-phiosp3aate

-i -3)HF-5-methyIcytosIii--3^f -yl- ^lauroyl-9-BP-7-d.eazaadeiiiit-5ⁱ-yl-pltosplia1;

W- (J3-Gyclopeiitylpropioiiyl)^1-I)Hi. cytosIn-3^s -yl-^9-7-d eazapurin-5^f-yl-pliQspliat

N^-Butyryl-9-HS^I-aäeniii-2 * (imä 5* )-yl-9-Bi^l-7-äiaazapuriii-5'-yi-

N _f N -bis-Kieaylpropionyl-9^BlE-2,6-ä laisinopuriii-^«-yl-K -dβ canöy 1-9 BP-7'-Äeazaaäenin-5^f-yl-piiöspliate u.a. -

00982071820

Claims (5)

ει . Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von 3S5¹- und 2¹,5'-Dinucleosidphospha ten der Formeln

H H

HO-

=0

H H

H OH

IVa

H CK

HO-

»=0

CH

NJ

H H

H 0

in welchen

X Wasserstoff, oc-Hydroxy oder ß-Hydroxy,

Z Wasserstoff, Hydroxy, Amino, Acylamino (wobei die Acylgruppe 2 bis 12 Kohlenstoffatome enthält), Anisoyl, Mer capto oder Alkylmercapto (wobei die Alky!gruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist,

Y Cytosin-1-yl, Uraoil-1-yl, Ihymin-1-yl, Adenin-9-yi,

- 2—

ORiGiNAL

0098*20/1828

162OBA 3

Guanin-9-yl, 6~Mercaptopurin-9-yl, üraeil-3-yl, 5-FLuorouracil-1-yl._% . S-Chloruxacil-1 -yl, 5-Bromuracil-i yl, 5-Joduracil-i-yl, S-irifluoinaethyluracil-i-yl, Hy poxanthin-9-yl, Xantiiin-9-yl> 5-Metliylcytosin-1 -yl, 3-Me.tlaylcytoslii-»1--yl, 2,:6-33.iamimop.üriii-9-yl, S^Hydrox me thyley tos in-1 -yl, 7-Deazad enin-9-yl > 6-Mer eapt o*-7-deazapurin-9-yli 7-i)eazahypoxanth.iii-9-yli 6-Azauracil 1-yl ist, . . . -

dadurch gekennzeichnet, daß man ein 7-Deazapurinrit)Osid der Formel ' ..--.-"" .

HOCH₂

in welcher :

R^ und R₂ Alkylreste mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder zusammen eine Alkylenkette mit 4. bis 6 Kohlenstoffatomen sind uni Z die btretW oben angegebene Bedeutuns hat V ^ mit einem Phosphorylierungsmtttel in Gegenwart eines Konäensationsmittels und dann mit einer wäßrigen Alkalibase au einem , Phosphat der Formel II

BAD

■'■■* Q0982Q/1828

—COT

(HOlI₂=P-CH₂

i!

in welcher Z, IL und R₂ die bereits angegebene Bedeutung haben, umsetzt, die so gewonnene Verbindung II mit einer Verbindung der Formel X

in welcher

TO-CH₂

OH \

BAD ORiGlNAL

009820/112*

SS

Ϊ eine Triphenylmethyl-, eine (p-Metiioxyphenyl)äiph.enyl- oder eine t)is(p-MetkoxypIieiiyl)plieiiylmethylgruppe ist,

X die bereits angegebene Bedeutung nat >

Y¹ ' Gruppen der für Y angegebenen Äri;, in welchen jedoch die acylierbaren Aminogruppen aeyllert sind, bedeutet,

kondensiert, so daß man Verbindungen der^ lOrmeln

TO-CH₂

HO-

TOCH₂

H H

Ilia

\U/

OH

HO-

BAD ORiGiNAL

00982071828

16206Λ3

erhält, in welchen R₁, R₂* ^T» %* ^{γι vai}^ Z. die bereits angegebene Bedeutung haben und schließlich die schützenden Gruppen durch Hydrolyse mit einer Säure und einer Base ,entfernt, so daß man die Verbindungen der Formeln IV a und IVb" gewinnt.

2) Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man als Deazapurinribosid N -Benzoyl-9-(2', 3'-0-isopropyliden-ß-I)-ribofuranosyl) 7-deazaadenin und als Verbindung der Formel X 1-(5'-Triphenylmethyl-ß·' D-deoxyribofuranosyl)thymin verwendet, so daß man als Endprodukt 1-ß-D-Deoxyribofuranosylthymin-S'-yl-S-ß-D-ribofuranosyl-T-deazaadenin-5'-y!-phosphat gewinnt.

3) Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Phosphory- w lierungsmittel 2-Gyanoäthy!phosphat und das Kondensationsmittel Κ,Ν-

Di-cyclohexylcarbodiimid ist.

4) Verfahren zur Herstellung von 3',5'- und 2¹,S'-Dinucleosidphosphaten • der Formeln

ho-c:h₂ X»

HO- >=

OH OH

Ii

HOCH₂

^V «ve

γι

M¹V

H (,

HO-

/ο

H H

OH OH

IVd

V M

009820/1828 bad original

.Sf.

in welchen

Wasserstoff, ■ «-Hydroxy oder ß-Hydroxy, Wasserstoff, Hydroxy, Amino, Acylamino (wobei die Acylgruppe 2 bis 12 Kohlenstoffatome enthält), Anisoyl, Mercapto oder Alky!mercapto (wobei die Alkylgruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweist,

N -Aeylcytosin-1-yl» -uracil~1>-yl, -thymin-1 -yi, Ii -Acyl-

2
adenin-'9-yl, N -Acylguänin-9-yl, -o-mercaptopurin-g-yl,

-S-bromuracil-i-yl, -5-ioäuracil-i-yl, -S-trifluormethyluracil-i-yl, -hypoxanthin-9-yl, -xanthin-9-yl» N -Acyl-5-methylcytosin-1-yl, lT^-Acyl-3-methylcytosin-i-yl, Ή ,Η Diacyl-2,6-diaminopurin-9-yl, N^-Acyl-5-hydroxymethylcytosin-1-yl, M^ -Acyl-T-deazaaäenin-g-yl, -e-mercapto-T-äeazapurin-9-yl, -T-äeazahypoxanthin-g-yl oder -6-azauracil-i-yl dadurch gekennzeichnet,- daß man 7-Deazapurinribosiä der !Formel ·

BAD ORIGINAL in welcher

Rj und R₂ Alkylreste mit IbIiJ 4 Kohlenstoffatomen oder ssusammen

T-

Q09820/1&t8

SB

eine Alkylenke1;te mit 4 bis 6 Kohlenstoff atomen sind und Z die bereits oben angegebene Bedeutung hat, . mit einem Phosphorylierungsmittel in Gegenwart eines !Condensationsmittels und dann mit einer wäßrigen Alkalibase zu. einem Phosphat der Formel II ■

(HO)₂=P-OCH₂

Il

in welcher 25, R^ und Rg ^^-^e tereita-angegebene Bedeutung haben, umsetzt, die so gewonnene Verbindung II mit einer Verbindung der Formel X

TO-CH₂

■f H,

OH

BAD ORiGiNAL

0098^20/182f

in welcher

ί '-. eine Triphenylmethy 1-, eine (p->Methoxyphenyl)äiphenyl-

oder eine ■bis(p-Methoxyphenyl)phenylmethylgrüppe ist und X und X! die bereits angegebene Bedeutung haben,
kondensiert, so daß man Verbindungen der Formeln

TO-CHb ο ¥« HO-

TOGK₂

Ilia

CH₂

Il Ib

erhält, in welchen R₁, R₃, ϊ, X₈ γ* und Z die bereits angegebene
Bedeutung Itcben und schließlich die schützenden Gruppen durch Hydrolyse mit einet Säure und einer Base entfernt, so daß man die Verbindungen der Pomein IVc und IVd gewinnt.

0Ö982071828

5) Verfahren nach Anspruch 4 dadurch gekennzeichnet, daß man als 7-Deazapurinribosid N -Benzoyl-9-(2',J'-O-isopropyliden-ß-D-ribofuranosyl^-äeazaadenin und als Verbindung der Formel X 1-(5'-Tri phenylmethyl-ß-D-deoxyribofuranosyl)thymin verwendet, so daß man als Endprodukt IT -Benzoyl-1-ß-D-d eoxyribof uranosyl thymin-3¹ -ylg-ß-D-ribofuranosyl-T-cleazaaäenin-S'-y1-phosphat erhält.

Pur The IJpjohn Company

Kalamazoo, Mich., USA

Rechtsanwalt

BAD ORIGINAL

009820/1828