DE60225141T2 - Verfahren zur erhöhung der in vivo wirksamkeit von oligonukleotiden und zur entzündungshemmung in säugetieren - Google Patents

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Description

  • ZUGEHÖRIGE ANMELDUNG
  • Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen Anmeldung der Vereinigten Staaten 60/1303,071, die am 6. Juli 2001 eingereicht wurde, deren Offenbarung hierin vollständig durch Bezugnahme miteinbezogen ist.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • (a) Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nukleotid-Substituenten zur Steigerung der in vivo-Wirksamkeit von Nukleinsäure-Molekülen sowie zur Entzündungshemmung in Säugern.
  • Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von 2,6-Diaminopurin (DAP) und Analoga davon an sich in entzündungshemmenden Zusammensetzungen sowie die Herstellung von Nukleinsäure-Molekülen mit gesteigerter physiologischer Wirksamkeit und verminderter Toxizität.
  • (a) Kurze Beschreibung des Standes der Technik
  • Therapieansätze auf Grundlage der Verwendung von Nukleinsäure-Molekülen werden immer beliebter. Therapien auf Grundlage von Genen sowie Therapien auf Grundlage von Antisense-Molekülen werden die Medizin in naher Zukunft wahrscheinlich entscheidend verändern.
  • Die bisherigen Probleme mit Nukleinsäure-Molekülen als Therapeutika, und insbesondere mit Antisense-Oligonukleotiden, sind Toxizität (sowohl systemisch als auch topisch), Stabilität und unspezifische Bindung an Zeltoberflächen-Proteine gewesen. Die Toxizität der Antisense-Oligonukleotide scheint unter den Arten zu variieren, wobei Ratten am empfindlichsten sind, obwohl die Toxizität bei höheren Dosen als denjenigen, die therapeutisch wirksam sind, auftritt (siehe zum Überblick ST Crooke, Hematologic Pathology, 1995, 9: 5972). Bei Lungen-/Atemwegserkrankungen umfasst die Toxizität von Nukleinsäure-Molekülen, die mit der Verabreichung von therapeutischen Antisense-Molekülen/Genen in Verbindung steht: eine Steigerung der Immunstimulation, ein mononukleares zellulär entzündliches Eindringen in die Lungen, und möglicherweise Überempfindlichkeit und Bronchokonstriktion der Atemwege.
  • Verschiedene, weniger optimale Lösungen sind bisher zur Umgehung des Toxizitätsproblems vorgeschlagen worden. Zu den beliebtesten gehört die Herstellung von Nukleinsäure-Molekülen, die verschiedene modifizierte DNA-Basen, RNA-Basen und/oder eine modifizierte Rückgrat-Struktur enthalten. Zum Beispiel beschreibt WO 99/67378 Antisense-Oligonukleotid-Konstrukte auf Grundlage von modifizierten Zuckern. Ebenso hat Nyce in WO 00/09525 und WO 00/62736 behauptet, dass die Adenosin-Base, die in Antisense-Oligonukleotiden zur Behandlung von Atemwegserkrankungen enthalten ist, eine Hauptursache der Toxizität in Lungen darstellt, obwohl Nyce dies nicht bewiesen hat. Entsprechend schlägt Nyce kurze Adenosin-Oligonukleotide und Oligonukleotide vor, in welchen die Adenosin-Base durch ein Analog von Adenosin ausgetauscht worden ist. Es sind jedoch keine der kurzen Adenosin-Oligonukleotide sowie keine der Adenosin-Analoga, die von Nyce vorgeschlagen wurden, jemals auf ihre biologische Aktivität oder ihre angeblich verminderte Toxizität hin untersucht worden.
  • Man hat anhand des Cyanophagen S-2L herausgefunden, dass in DNA 2,6-Diaminopurin-Nukleosid (2-Amino-2'-desoxyadenosin; DAP) anstelle von Adenosin vorliegt (Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293–318, 1995); Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88: 8–18, 1978). Ab diesem Zeitpunkt ist 2,6-Diaminopurin-Nukleosid (DAP) viel verwendet und untersucht worden, besonders als chemischer Ausgangspunkt zur Synthese von antiviralen Verbindungen, wie zum Beispiel 2-Amino-2',3'-didesoxy-adenosin (nicht DAP), welches in der Lage ist, die AIDS-Virus(HIV)-Replikation in vitro selektiv zu hemmen (Baizarini, J. et al., Biochem. & Biophys. Res. Communications 145: 269–76 (1987). Die Verwendung von DAP in Antisense-Oligonukleotid- oder in Gentherapie-Verfahren ist jedoch nicht vorgeschlagen worden.
  • Ebenso beschreiben US-Patente Nr. 5,925,624 und Nr. 5,889,178 Derivate von 2,6-Diaminopurin-beta-D-ribofura-nuronamid. Obwohl diese Derivate eine entzündungshemmende Wirkung (vor allem gegen die Freisetzung von neutrophilem Superoxid) aufweisen und in der Therapie von Atemwegserkrankungen verwendet werden können, haben sie eine chemische Formel, die sich von der Formel von DAP und Analoga davon unterscheidet.
  • WO 00/12563 beschreibt Verfahren zum Einbringen von 2-Aminoadenosin und 2-Aminoadenosin-Analoga in Oligonukleotide.
  • Zusammenfassend gab es bisher keinen Vorschlag oder kein Beispiel, dass DAP und Analoga davon in Nukleinsäure-Moleküle (Genkonstrukte und Antisense-Moleküle) zum Steigern der in vivo-Wirksamkeit dieser Oligos eingebracht werden können.
  • Daher besteht ein seit langem bestehendes Bedürfnis nach Nukleinsäure-Molekülen, die im Körper stabil bleiben und gleichzeitig eine hohe Wirksamkeit und niedrige Toxizität aufweisen.
  • Insbesondere besteht ein Bedarf nach Nukleinsäure-Molekülen, die einen Nukleotid-Substituenten umfassen, wie zum Beispiel 2,6-Diaminopurin (DAP) und Analoga davon, ein Bedarf nach einer Zusammensetzung, die selbiges umfasst, sowie ein Bedarf nach Verfahren zur Verwendung dieser Nukleinsäure-Moleküle, insbesondere in Gen- und Antisense-Therapieverfahren. Niemand hat jemals untersucht, ob der Austausch von einer Base (Basen) durch einen Nukleotid-Substituenten die Wirksamkeit im Hinblick auf Stabilität, Bindung und Abbau sowie die Toxizität von Antisense-Oligonukleotiden beeinflussen kann, noch hat jemand auf eine solche Art und Weise modifizierte Antisense-Oligonukleotide auf ihre biologische Aktivität in Zellen, in Kultur oder in Tieren hin untersucht.
  • Die vorliegende Erfindung erfüllt diesen Bedarf sowie jeglichen anderen Bedarf, welcher für einen Fachmann beim Lesen der vorliegenden Beschreibung offensichtlich ist.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Nukleinsäure-Molekülen, wie zum Beispiel Genkonstrukte und Antisense-Oligonukleotide, die im Körper stabil bleiben und gleichzeitig eine hohe Wirksamkeit und geringe Toxizität aufweisen.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Steigerung der in vivo-Wirksamkeit eines Nukleinsäure-Moleküls beschrieben, das an einen Säuger verabreicht wird, umfassend das Einbringen von mindestens einem Nukleotid-Substituenten in das Nukleinsäure-Molekül. Ein solcher Einbau steigert die physiologische in vivo-Wirksamkeit des Nukleinsäure-Moleküls und vermindert im Vergleich zu einem Nukleinsäure-Molekül, das keinen Nukleotid-Substituenten umfasst, dessen Toxizität bei Verabreichung an einen Säuger. Der Nukleotid-Substituent wird in das Nukleinsäure-Molekül zum Austausch der darin enthaltenen Adenosin-Base eingebracht. Der Nukleotid-Substituent wird aus der Gruppe bestehend aus 2,6-Diaminopurin und Salzen davon ausgewählt.
  • Die Erfindung betrifft auch ein verbessertes Verfahren zur in vivo-Verabreichung von mindestens einem Nukleinsäure-Molekül an einen Säuger. Die Verbesserung besteht darin, mindestens ein 2,6-Diaminopurin und/oder ein Salz davon in das Nukleinsäure-Molekül einzubringen. 2,6-Diaminopurin oder dessen Salz wird in das Nukleinsäure-Molekül eingebracht, um darin eine Adenosin-Base zu ersetzen.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes oder gereinigtes Nukleinsäure-Molekül bereitgestellt, das aus Antisense-Oligonukleotiden und Nukleinsäure-Molekülen ausgewählt ist, die eine Sequenz umfassen, die für ein therapeutisches Genprodukt kodiert, wobei das Nukleinsäure-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung einen Nukleotid-Substituenten umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,6-Diaminopurin und Salzen davon.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die mindestens ein Nukleinsäure-Molekül, das wie oben definiert ist, sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Die Zusammensetzung der Erfindung kann zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung geeignet sein, die ausgewählt ist aus Erkrankungen der Atmungssysteme, neurologischen Erkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologischen Erkrankungen, Erkrankungen der Harnorgane, Karzinomen, pathogenen Infektionen, genetischen Erkrankungen, Hypereosinophilie, generalisierte Entzündung und Krebs.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zur Antisense-Therapie beschrieben, welches den Schritt der direkten Verabreichung einer wirksamen therapeutischen oder prophylaktischen Menge von mindestens einem Antisense-Oligonukleotid, das wie oben definiert ist, an das Atmungssystem eines Säugers, der dessen bedarf, umfasst. Dieses Verfahren ist zur Verhinderung und/oder Behandlung von Erkrankungen der Atmungssysteme, Krebs, pathogenen Infektionen und genetischen Erkrankungen, und insbesondere für Erkrankungen der Atmungssysteme geeignet, die mit einer Entzündung der Lungen, der Atemwege und/oder der Nase verbunden sind, wie zum Beispiel pulmonale Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, zystische Fibrose, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, chronische Bronchitis, eosinophile Bronchitis, Asthma, Allergie, Sinusitis, Respiratory-Syncytial-Virus oder eine andere Atemwegsinfektion und Hypereosinophilie.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch die Verwendung des obigen isolierten oder gereinigten Nukleinsäure-Moleküls zur Herstellung eines Arzneimittels zur Antisense-Therapie dar.
  • Die vorliegende Erfindung stellt zusätzlich ein Verfahren zur Herstellung eines isolierten oder gereinigten Nukleinsäure-Molekül, das wie oben definiert ist, dar, welches den Austausch von mindestens einem Adenosinrest des Oligonukleotids mit DAP oder einem Salz davon umfasst.
  • Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin die Verwendung von DAP und Salzen davon zum Austausch mindestens eines Adenosinrests eines Oligonukleotids zur Steigerung der entzündungshemmenden in vivo-Wirksamkeit des Oligonukleotids bereit.
  • Die Aufgaben der Erfindung sind in den beigefügten Ansprüchen definiert.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1A, 1B, 1C und 1D zeigen die chemischen Strukturen von Adenin, Adenosin, Inosin, 2,6-Diaminopurin (2-Amino-2'-desoxyadenosin; DAP) und verschiedenen Analoga davon.
  • 2A sind Darstellungen von semi-quantitativen PCRs, die die biologische Wirksamkeit unterschiedlicher Antisense-Moleküle gegenüber der gemeinsamen Beta-Kette von humanem GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptor in U937-Zellen zeigt. 1 = unbehandelte Zellen; 2 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden; 3 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden, die DAP anstelle von 2 Adenosin-Basen enthalten (AS107-DAP); und M = Molekulargewichtsmarker. G3PDH 460 bp = stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen das konstitutive G3PDH-Gen vorkommt; GM-CSFRβ 340 bp: stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen die Bande der gemeinsamen Beta-Kette vorkommt.
  • 2B ist eine Darstellung von semi-quantitativen PCRs, die die biologische Wirksamkeit von Antisense-Molekülen gegenüber der allgemeinen Beta-Kette von humanem GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptor in TF-1-Zellen zeigt. 1 = unbehandelte Zellen; 2 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden; 3 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden, die DAP anstelle von 2 Adenosin-Basen enthalten (AS107-DAP); und M = Molekulargewichtsmarker. G3PDH 460 bp stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen das konstitutive G3PDH-Gen vorkommt; β-Kette 340 bp stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen die Bande der gemeinsamen Beta-Kette vorkommt.
  • 3 ist eine Darstellung von semi-quantitativen PCRs, die die biologische Unwirksamkeit des Austausches von Adenosin durch dessen Analogon Inosin im Antisense-Molekül gegenüber der gemeinsamen Beta-Kette von humanem GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptor in TF-1-Zellen darstellt. 1 = TF-1-Kontrolle (unbehandelte Zellen); 2 = Zellen, die mit Sense-AS107 behandelt wurden; 3 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden; 4 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden, das Inosin anstelle von 2 Adenosin-Basen enthält (AS107-I); 5 = Zellen, die mit Antisense-AS107 behandelt wurden, welches einen Basen-Mismatch aufweist; und M = Molekulargewichtsmarker. G3PDH 450 bp stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen das konstitutive G3PDH-Gen vorkommt; β-Kette 340 bp stellt die Anzahl an Basen dar, an welchen die Bande der gemeinsamen Beta-Kette vorkommt.
  • 4A ist ein Diagramm, dass die Wirkungen der Verabreichung eines Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotids (AS 141) auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge von sensibilisierten Brown Norway-Ratten zeigt, das gegen die gemeinsame Beta-Kette von GM-CSF, IL-3 und IL-5 der Ratte gerichtet ist, im Vergleich zu den Wirkungen desselben Antisense-Moleküls, das DAP anstelle von 2 Adenosin-Basen enthält (AS141-DAP). Die Widerstandsfähigkeit der Lunge wurde 0–2 h nach Verabreichung einer Dosis von 60 μg jedes Oligonukleotids gemessen.
  • 4B ist ein Diagramm, das die Wirkungen der intratrachealen Verabreichung eines Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotids (AS 141) auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge von sensibilisierten Brown Norway-Ratten zeigt, das gegen die gemeinsame Beta-Kette von GM-CSF, IL-3 und IL-5 der Ratte gerichtet ist, im Vergleich zu den Wirkungen desselben Antisense-Moleküls, das Inosin anstelle von 2 Adenosin-Basen enthält (AS141-Inosin). Die Widerstandsfähigkeit der Lunge wurde 0–2 h nach Verabreichung einer Dosis von 60 μg jedes Oligonukleotids gemessen.
  • 5 ist ein Diagramm, das die Wirkungen der intratrachealen Instillation von Adenosin, DAP (2-Amino-2'-desoxyadenosin) und Analoga davon auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge von sensibilisierten Ratten zeigt.
  • 6A ist ein Balkendiagramm, das den Einbau von DAP in Oligonukleotide zeigt, die in antisense-Richtung zu CCR3 der Ratte positioniert sind, und das zeigt, dass die gemeinsame β-Kette der IL-3/IL-5/GM-CSF-Rezeptoren die physiologische in vivo-Wirksamkeit dieser Antisense-Moleküle steigert. Die biologische Aktivität der Antisense-Moleküle wurde im Rattenmodell von Asthma gemessen: unbeladene Kontrolle; beladene Kontrolle; Ratten, die mit 200 μg Antisense-ASA4 und AS141 (18 Nukleotide) behandelt wurden; Ratten, die mit 200 μg Antisense-ASA4 und AS141 behandelt wurden, die DAP anstelle von Adenosin-Basen enthielten (ASA4-DAP; 141-DAP); Ratten, die mit 200 μg Mismatch-Antisense-ASA4 und AS141 behandelt wurden; und Ratten, die mit 200 μg ASA4-DAP und AS141-DAP-Mismatch-Antisense-Molekülen behandelt wurden. Ansprechbarkeit auf Leukotrien D4 wurde 15 Stunden nach Beladung mit Ovalbumin gemessen.
  • 6B ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass die Kombination von zwei regulären und zwei DAP-enthaltenden Oligonukleotiden (insgesamt 60 μg) wirksamer ist als 50 μg jedes Oligonukleotids allein.
  • 7A ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass Oligonukleotide, die gegen CCR3 gerichtet sind und die DAP enthalten, bei der Hemmung von Lungenentzündung in vivo nach Antigen-Beladung wirksamer sind als Oligonukleotide ohne DAP.
  • 7B ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass Oligonukleotide, die gegen die gemeinsame β-Kette von IL-3/IL-5/GM-CSF-Rezeptoren gerichtet sind und die DAP enthalten, bei der Hemmung von Lungenentzündung in vivo nach Antigen-Beladung wirksamer sind als Oligonukleotide ohne DAP.
  • 7C ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass die Kombination von zwei DAP-enthaltenden Oligonukleotiden (insgesamt 50 μg) bei der Hemmung von Lungenentzündung in vivo nach Antigen-Beladung wirksamer ist als die Kombination von zwei normalen Oligonukleotiden ohne DAP.
  • 8 ist ein Balkendiagramm, das zeigt, dass Adenosin selektiv das Anlocken von Eosinophilen in die Lungen von Ratten steigert, während DAP keine solche Wirkung zeigt, und das DAP ein Antagonist der proinflammatorischen Wirkungen von Adenosin ist.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure-Moleküle, wie zum Beispiel Genkonstrukte und Antisense-Moleküle, die im Körper stabil bleiben, während sie hohe Wirksamkeit und niedrige Toxizität zeigen.
  • Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Steigern der in vivo-Wirksamkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, das an einen Säuger verabreicht wird. Dieses Verfahren umfasst den Schritt des Einbringens von mindestens einem Nukleotid-Substituenten in das Nukleinsäure-Molekül. Wie in den nachfolgenden Beispielen hierin gezeigt ist, steigert bei Verabreichung an einen Säuger ein solcher Einbau die physiologische in vivo-Wirksamkeit der Nukleinsäure-Moleküle und vermindert die Toxizität der Nukleinsäure-Moleküle im Vergleich zu Nukleinsäure-Molekülen, die nicht den Nukleotid-Substituenten umfassen.
  • Die „verminderte Toxizität" der Nukleinsäure-Moleküle kann unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Grundsätzen beurteilt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird der Nukleotid-Substituent so ausgewählt, dass Nukleinsäure-Moleküle, die den Nukleotid-Substituenten umfassen, geringere entzündliche in vivo-Eigenschaflen aufweisen und dadurch eine verminderte Toxizität haben. Stärker bevorzugt ist der Nukleotid-Substituent so ausgewählt, dass die Nukleinsäure-Moleküle, die diese Modifikationen umfassen, in der Lage sind, das Anlocken von Lymphozyten, Eosinophilen, Makrophagen und/oder Neutrophilen an eine Stelle, an der diese Nukleinsäuremoleküle verabreicht werden und/oder an eine Stelle der Erkrankung, zu hemmen.
  • Der Nukleotid-Substituent wird in das Nukleinsäuremolekül eingebracht, um eine Adenosin-Base darin auszutauschen. Der Nukleotid-Substituent ist 2,8-Diaminopurin (siehe 1) oder Salze davon.
  • Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein isoliertes oder gereinigtes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das einen Nukleotid-Substituenten umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2-6-Diaminopurin und Salzen davon, wie oben definiert. Das Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann aus einem Antisense-Oligonukleotid, einer doppelsträngigen RNA (als RNAi) oder einem Nukleinsäuremolekül bestehen, das eine Sequenz umfasst, die für ein therapeutisches Genprodukt kodiert. Der Nukleotid-Substituent wird in das Nukleinsäuremolekül eingebracht, um darin eine Adenosin-Base auszutauschen.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet die Bezeichnung „Nukleinsäure-Molekül" jede beliebige DNA, RNA-Sequenz oder jedes beliebige Molekül, das mindestens ein Nukleotid, einschließlich Nukleotidsequenzen, die für ein vollständiges Gen kodieren, aufweist. Diese Bezeichnung soll alle Nukleinsäuren umfassen, unabhängig davon, ob sie natürlich oder nicht-natürlich in einer bestimmten Zelle, einem bestimmten Gewebe oder einem bestimmten Organismus vorkommen. Diese Bezeichnung umfasst DNA und Fragmente davon, RNA und Fragmente davon, cDNAs und Fragmente davon, exprimierte Sequenz-Markierungen, künstliche Sequenzen einschließlich zufallsveränderte künstliche Sequenzen.
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden unter Verwendung von im Fachbereich wohlbekannten Verfahren synthetisiert. Sie können in Form von DNA oder RNA vorliegen, und sie können einen oder mehrere verknüpfende Mononukleotid-Rest(e) umfassen, wie zum Beispiel Methylphosphonat-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Phoaphodiester-, Phosphorodithioat-, Boranphosphat-, Formacetal-, Thioformacetal-, Thioether-, Carbonat-, Carbamat-, Sulfat-, Sulfonat-, Sulfamat-, Sulfonamid-, Sulfon-, Sulfi-, Sulfoxid-, Sulfid-, Hydroxylamin-, Methylen(methylmino)-, Methylenoxy(methylimino)- und Phosphoramidat-Reste.
  • DAP-Base und Analoga davon können unter Verwendung herkömmlicher Phosphoramidit-Chemie chemisch in DNA- und RNA-Sequenzen eingeführt werden. Alternativ kann DAP mittels enzymatischer Verfahren über die Verwendung von DAP-Triphosphat und Polymerasen in DNA und RNA eingebracht werden, wie es im Fachbereich wohlbekannt ist. Interessanterweise hat DAP-Triphosphat auf synthetische DNA-Enzyme die Wirkung wie ein tatsächliches Analogon von ATP (Rackwitz, H. R., et al. Eur J Biochem 72: 191–200, 1977).
  • Die Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung können auch mit einem „Träger"-Molekül verknüpft sein, wie zum Beispiel mit Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Peptidomimetika, Feinchemikalien, Liganden, Lipiden, Nukleinsäuren oder Kohlenhydrat-Resten.
  • Die Größe der Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung variiert in Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung, wobei das Oligo typischerweise 2 bis etwa 10000 Nukleotide aufweist. Stärker bevorzugt variiert die Größe der Antisense-Nukleinsäure-Moleküle von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotiden, während die Größe für Nukleinsäure-Moleküle, die eine Sequenz umfassen, die für ein therapeutisches Genprodukt kodiert, üblicherweise von etwa 100 bis etwa 10000 Nukleotiden variiert.
  • Die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung können zur Behandlung und/oder Verhinderung verschiedener Erkrankungen geeignet sein. Übliche Beispiele von Erkrankungen, für die die vorliegenden Nukleinsäure-Moleküle nützlich sein können, umfassen Erkrankungen des Atmungssystems, neurologische Erkrankungen, kardiovaskuläre Erkrankungen, rheumatische Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologische Erkrankungen, Erkrankungen der Hamorgane, Karzinome, pathogene Infektionen, genetische Erkrankungen, Hypereosinophilie, generalisierte Entzündung und Krebs. Am stärksten bevorzugt umfassen Nukleinsäure-Moleküle die hierin im Folgenden in Tabelle 1 aufgelisteten Oligonukleotide. Tabelle 1: Antisense-Oligonukleotide zur Behandlung oder Verhinderung von Atopie und neoplastischer Zeltproliferation
    Figure 00110001
  • Da die DAP-substituierten Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung eine verbesserte Wirksamkeit und/oder verminderte Toxizität aufweisen, können sie in Gentherapie- und DNA-Impfungsverfahren verwendet werden. Zum Beispiel können DAP-substituierte Nukleinsäure-Moleküle als Therapeutika zur Hemmung der Vermehrung von Krankheitserregern des Atmungssystems; als Therapeutikum oder Impfstoff zur Behandlung oder zur Verhinderung der Entstehung neoplastischer Zellen in den Lungen/Atemwegen/Nase; als Therapeutika oder Impfstoffe zur Behandlung von genetischen Erkrankungen der Lungen/Atemwege/Nase, wie zum Beispiel zystischer Fibrose; und als Therapeutika oder Impfstoffe zur Behandlung und/oder Verhinderung von Asthma, Allergie, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, pulmonaler Fibrose, chronischem Husten und Schleimbildung, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, generalisierter Entzündung, entzündlichen Erkrankungen, Krebs, pathogenen Infektionen (z. B. Sinusitis, Respiratory-Syncytial-Virus oder anderen viralen Atemwegsinfektionen), genetische Erkrankungen oder anderen Erkrankungen des Atmungssystems verwendet werden. Darüber hinaus können DAP und dessen Analoga anstelle von Adenin oder einer beliebigen anderen Base in Gene insertiert werden, oder sie können in Verbindung mit den Genen verabreicht werden (z. B. in eine kodierende oder nicht-kodierende Region eingebracht werden), um die Immunantwort zu senken, die während der Gentherapie auftritt und/oder die Wirksamkeit von Gentherapie-Verfahren zu verbessern.
  • Insbesondere können DAP-substituierte Nukleinsäure-Moleküle durch Hemmung der Replikation von Krankheitserregern der Atemwege, wie zum Beispiel der Respiratory-Syncytial-Virus (RSV), Rhinovirus, Influenza-Virus, Bakterien und anderen Stoffen, die Erkrankungen verursachen, zur Behandlung von pathogenen Infektionen und/oder zur Verhinderung des Auftretens davon verwendet werden. Auf ähnliche Art und Weise können DAP-substituierte Nukleinsäure-Moleküle, die Antitumor-Aktivität aufweisen, zur Behandlung und Verhinderung von Lungen- oder anderen Karzinomen verwendet werden. DAP-substituierte DNA oder Gene sind auch für therapeutische Anwendungen besonders geeignet, bei welchen eine Entzündungsreaktion gegenüber dem Gen nicht erwünscht ist, wie zum Beispiel bei der Behandlung von genetischen Erkrankungen der Atemwege (z. B. zystische Fibrose).
  • In Abhängigkeit von der gewünschten Verwendung kann es erforderlich sein, dass das DAP-Nukleinsäure-Molekül in einen Vektor, wie zum Beispiel ein Plasmid oder einen Virus, eingebracht wird, und dass es eine Sequenz umfasst, die für ein therapeutisches Genprodukt kodiert.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Nukleinsäure- Moleküle Antisense-Oligonukleotide. Wie in den folgenden Beispielen hierin gezeigt wird, weisen DAP-substituierte Antisense-Oligonukleotide eine verbesserte Wirksamkeit und/oder eine verminderte Toxizität auf. Diese Antisense-Moleküle können daher als Therapeutikum oder Impfstoff, der/das gegen mindestens einen Lungen-/Atemwegs-/Nasen-Mediator oder -Rezeptor gerichtet ist, als Therapeutikum zur Verhinderung der Entzündungsreaktion, die bei Asthma oder allergischer Rhinitis vorkommt, sowie als Therapeutikum zur Verhinderung der Entwicklung von Allergie oder Asthma oder zur Desensibilisierung von Patienten mit diesen Erkrankungen verwendet werden.
  • Zum Beispiel können DAP-substituierte Antisense-Oligonukleotide gegen Nukleinsaure-Sequenzen gerichtet sein, die für Mediatoren und Rezeptoren oder andere Komponenten des Entzündungsprozesses kodieren, so dass der Entzündungsprozess durch Verhinderung der Expression dieser Proteine in den Lungen/Atemwegen (Therapeutikum gegen Asthma, chronisch-obstruktive Lungenerkrankung) oder in der Nase (allergische Rhinitis) oder in den Nebenhöhlen (chronische Sinusitis) ausgeschaltet werden kann.
  • Daher betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Antisense-Therapie, wobei das Verfahren den Schritt des Verabreichens einer wirksamen therapeutischen oder prophylaktischen Menge von mindestens einem Antisense-Oligonukleotid, das wie oben beschrieben definiert ist, an einen Säuger umfasst, der einer solchen Therapie bedarf. Dieses Verfahren ist insbesondere zur Verhinderung und/oder Behandlung von Erkrankungen der Atmungssysteme, neurologischen Erkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologischen Erkrankungen, Erkrankungen der Harnorgane, Karzinomen, Pathogeninfektionen, genetischen Erkrankungen, generalisierter Entzündung und Krebs geeignet.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird das Antisense-Oligonukleotid zur Verhinderung und/oder Behandlung von Atemwegserkrankungen, die mit einer Entzündung der Lungen, der Atemwege und/oder der Nase verbunden sind, wie zum Beispiel pulmonare Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, zystische Fibrose, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, chronische Bronchitis, eosinophile Bronchitis, Asthma, Allergie, allergische Rhinitis, Sinusitis und Hypereosinophilie, direkt in das Atmungssystem verabreicht.
  • Bevorzugt werden die Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht, die mindestens eines der Nukleinsäure-Moleküle, die wie oben definiert sind, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
  • Die Menge der Nukleinsäure-Moleküle, die in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorliegt, ist eine therapeutisch wirksame Menge. Eine therapeutisch wirksame Menge der Nukleinsäure-Moleküle stellt diejenige Menge dar, die notwendig ist, damit das Nukleinsäure-Molekül seine biologische Funktion entfaltet, ohne in dem Wirt, an welchen die Zusammensetzung verabreicht wird, überwiegend negative Wirkungen auszulösen. Die genaue Menge der zu verwendenden Nukleinsäure-Moleküle und der zu verabreichenden Zusammensetzung variiert in Abhängigkeit von Faktoren wie zum Beispiel der biologischen Aktivität der Oligos, der Art des zu behandelnden Zustands, der Verabreichungsweise sowie anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Üblicherweise setzt sich die Zusammensetzung aus etwa 1% bis etwa 90% Nukleinsäure-Molekülen) zusammen, und es werden etwa 20 μg bis etwa 20 mg Nukleinsäure-Molekül verabreicht.
  • Ein pharmazeutisch verträglicher Träger der Zusammensetzung kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus festen Trägern, flüssigen Trägern und Gasphasen-Trägem. Vorteilhafterweise ist der Träger ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipidpartikeln, Lipidvesikeln, Mikrokristallen und Oberflächen-aktiven Substanzen.
  • Weitere Mittel können zu der Zusammensetzung der Erfindung hinzugefügt werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung der Erfindung auch Mittel wie zum Beispiel Arzneimittel, Antioxidanzien, Oberflächen-aktive Substanzen, Geschmacksstoffe, flüchtige Öle, Puffer, Dispergiermittel, Treibmittel und Konservierungsmittel enthalten. Zur Herstellung solcher pharmazeutischer Zusammensetzungen können im Fachbereich wohlbekannte Verfahren verwendet werden.
  • Die Nukleinsäure-Moleküle und die Zusammensetzung der Erfindung kann über verschiedene Verabreichungswege verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung in Form steriler injizierbarer Zubereitungen verabreicht werden, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspensionen. Diese Suspensionen können gemäß im Fachbereich bekannten Methoden unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Benetzungsmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterilen injizierbaren Zubereitungen können auch sterile injizierbare Lösungen oder Suspensionen in nicht-toxischen, parenteral-annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Lösungsmitteln sein. Sie können parenteral durch Injektion oder durch Infusion, zum Beispiel intravenös, intramuskulär oder subkutan verabreicht werden. Die Nukleinsäure-Moleküle und die Zusammensetzung der Erfindung kann auch als Cremes oder Salben zur topischen Verabreichung formuliert sein. Sie können auch mittels eines unter Druck stehenden Aerosol-Spenders, eines Nasensprühapparats, eines Zerstäubers, eines Dosieraerosols, eines Trockenpulver-Inhalators, oder einer Kapsel in die Atemwege eines Subjektes verabreicht werden. Geeignete Dosierungen variieren in Abhängigkeit von Faktoren, wie zum Beispiel der Menge jeder der Komponenten in der Zusammensetzung, der gewünschten Wirkung (Kurz- oder Langzeit), der zu behandelnden Erkrankung oder Krankheit, dem Verabreichungsweg und dem Alter und Gewicht des zu behandelnden Individuums. Jedenfalls können zur Verabreichung der Nukleinsäure-Moleküle und der Zusammensetzung der Erfindung im Fachbereich bekannte Verfahren verwendet werden.
  • So wird nunmehr beispielhaft hierin im Folgenden gezeigt: (1) die vorliegende Erfindung stellt eine neue Antisense-Technologie auf Grundlage von Analoga von 2,6-Diaminopurin, bei dem ein Adenosin ausgetauscht wurde, bereit; (2) nicht alle Adenosin-Substituenten sind gleich wirksam, wobei DAP und dessen Salze überraschenderweise wirksamer sind als die anderen; (3) die Nukleinsäure-Moleküle der Erfindung sind zur Hemmung der Synthese von Zielproteinen gleichermaßen und überraschenderweise sogar noch wirksamer als standardmäßige Antisense-Oligonukleotide; (4) dass die Antisense-Technologie gemäß der vorliegenden Erfindung auf Grundlage von DAP gegenüber den bestehenden Technologien leistungsfähiger ist und einen wesentlichen Vorteil darstellt, da Antisense-Moleküle auf Grundlage von DAP signifikantere entzündungshemmende Wirkungen aufweisen als herkömmliche Antisense-Oligonukleotide; (5) DAP-Nukleinsäure-Moleküle üben ihre entzündungshemmenden Wirkungen vermutlich über einen Mechanismus aus, der vermutlich nicht mit der Hemmung von Adenosin-Rezeptoren in Zusammenhang steht; (6) die vorliegenden Nukleinsäure-Moleküle weisen für jede entzündliche Erkrankung und/oder die Lungen/Atemwege eine signifikant verminderte Toxizität auf; (7) die Verwendung der DAP-Nukleinsäure-Moleküle, Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung sind wirksamer als die Verwendung regulärer Antisense-Moleküle (die kein DAP enthalten); und (8) schließlich weist 2,6-Diaminopurin an sich und dessen Analoga entzündungshemmende Wirkungen auf.
  • BEISPIELE:
  • Die folgenden Beispiele sind für die große Auswahl der Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung veranschaulichend und sollen nicht dessen Umfang einschränken. Modifizierungen und Variationen können damit durchgeführt werden, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen. Obwohl zum Ausüben oder zum Ausprobieren der vorliegenden Erfindung beliebige Verfahren und beliebiges Material verwendet werden kann, das dem hierin beschriebenen Material gleicht oder dazu äquivalent ist, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien beschrieben.
  • A) EINLEITUNG
  • Antisense-Oligonukleotide (AS) stellen eine neue Klasse von Arzneimitteln dar, die in der wissenschaftlichen und Patentliteratur ausführlich beschrieben worden sind. Dieser therapeutische Ansatz kann grundsätzlich auf jede beliebige Erkrankung angewendet werden, von welcher man annimmt, dass eine Überexpression eines oder mehrerer Gene das Vorliegen oder Fortbestehen der Erkrankung verursacht. Eine gesteigerte Wirksamkeit sowie eine entzündungshemmende Wirksamkeit macht AS zu einem bedeutenden therapeutischen Ansatz für jede Atemwegserkrankung einschließlich Asthma, Bronchiolenentzündung, virale und andere Formen von Infektion, Rhinitis, zystische Fibrose, chronische Bronchitis, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, eosinophile und andere Formen von Husten, pulmonare Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Konjunktivitis und andere Formen von entzündlichen Augen- oder Hauterkrankungen.
  • Ein Überblick der systemischen Wirkungen und Toxizität von Antisense-Oligonukleotiden ist von ST Crooke (Hematologic Pathology, 9: 5972; 1995) zusammengefasst worden. Eine Möglichkeit, die Toxizität der PS-Oligonukleotide zu umgehen, liegt darin, sie an der Stelle der Erkrankung, für dessen Behandlung sie entworfen wurden, zu verabreichen, wodurch die systemische Verteilung und damit verbundene Toxizität minimiert wird. PS-AS-Oligonukleotide sind in die Lungen von Mäusen oder Ratten zerstäubt worden (Templin MV et al. Antisense and nucleic acid drug development, 10: 359–368; 2000; Ali S et al. Am J Respir Critic Care Med 163: 989–993; 2001). Die Ergebnisse haben gezeigt, dass in Dosierungen, die als therapeutisch wirksam angesehen werden, eine sehr geringe systemische Verteilung stattfindet. Mit höheren Dosierungen findet jedoch in den Lungen von Mäusen ein multifokales zelluläres Eindringen statt, das überwiegend Lymphozyten und Neutrophile sowie ein paar Makrophagen und Monozyten umfasst. Obwohl die in Oligonukleotiden enthaltene Adenosin-Base pro- oder anti-entzündliche Wirkung aufweisen kann, haben wir kürzlich in Patent WO 99/66037 berichtet, dass ein Antisense-Oligonukleotid, das gegen den CCR3-Rezeptor gerichtet ist und 5 Adenosine pro 18 mer (27,7% Adenosin) enthält, zur Verhinderung der asthmatischen Reaktion in Ratten in vivo wirksam war.
  • Niemand hat systematisch untersucht, ob der Austausch von Basen durch Analoga die Wirksamkeit im Hinblick auf Stabilität, Bindung und Abbau sowie die Toxizität von Antisense-Oligonukleotiden beeinflussen kann, noch wurden sie auf ihre biologische Aktivität hin in Zellen in Kultur oder in Tieren untersucht. Man hat anhand des Cyanophagen S-2L herausgefunden, dass in DNA 2,6-Diaminopurin (DAP) anstelle von Adenosin vorkommt (Cheng, X., Annu Rev Biophys Biomol Struct 24: 293–318, 1995); Khudyakov, I. Y., et al., Virology 88: 8–18, 1978). DAP verändert die Struktur der doppelsträngigen DNA und führt eine dritte Wasserstoffbrückenbindung in den D:T-Doppelstrang (ähnlich zu den drei Wasserstoffbrückenbindungen, die von Cytosin und Guanosin gebildet werden) im Vergleich zum A:T-Doppelstrang ein (Chollett, A. und Kawashima, E. von Biogen SA (Genf), Nucleic Acids Research 16: 305–17, 1988). Diese zusätzliche Wasserstoffbrückenbindung führt während der DNA-DNA-Hybridisierung zu einer Steigerung der Selektivität und der Hybridisierungsstärke sowie zur Verhinderung der Spaltung verschiedener Restriktionsenzyme (Bailly, C. und Waring, M. J., Nucleic Acids Research 23: 885–92, 1995; Bailly, C. et al. PNAS 93: 13623–8, 1996).
  • Die zusätzliche N2-Aminogruppe des C2-Kohlenstoffes in DAP wird zur Rasenpaarung verwendet. Die zusätzliche Bindung führt zu gesteigerter Stabilität des DNA-Doppelstrangs und verleiht der kleineren Spirale sowohl der B- als auch der Z-DNA mehr Hydrophilie. DAP-Austausch von Adenosin führt zu einer Erhöhung der Tm von DAP-enthaltender DNA von 1,5°C pro DAP-Rest, wobei Tm die Temperatur darstellt, bei welcher zwei doppelsträngige komplementäre DNA-Stränge schmelzen (Hoheisel, J. D., Lehrach, H., FERS Letters 274: 103–6, 1990). DAP und dessen Analoga haben daher das Potenzial zur Steigerung der Wirksamkeit und entzündungshemmenden Aktivität von AS-Oligonukleotiden, wenn sie innerhalb des Oligonukleotids entweder als Austausch für eine Base, zusätzlich zu anderen Basen, enthalten sind, wenn sie in der Gentherapie oder allein, wie unten gezeigt, verabreicht werden.
  • B) MATERIAL UND METHODEN
  • Untersuchungen mit Zelllinien
  • Es wurden Untersuchungen zur Bestimmung durchgeführt, ob die in der internationalen Anmeldung WO 99/66037 (hierin mit einbezogen) beschriebenen Antisense-Oligonukleotide, die gegen die gemeinsame Beta-Untereinheit des IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptors gerichtet sind, die Expression und die Funktion dieses Rezeptors hemmen können, wenn sie durch Austausch von Adenosin durch entweder 2-Amino-2'-desoxyadenosin oder Inosin modifiziert wurden. TF-1- und U937-Zellen exprimieren große Mengen an GM-CSF-Rezeptoren. Zusätzlich hängt das Überleben von TF-1-Zellen von GM-CSF ab. Diese Zellen wurden in RPMI 1640 kultiviert, mit 10% Wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum, Penicillin, Streptomycin und I-Glutamin bei 37°C in 5% CO2 ergänzt (die TF-1-Zellen wurden mit GM-CSF ergänzt). Für 12 Stunden wurden sie entweder im Medium allein oder in Medium mit Oligonukleotiden kultiviert, die gegenüber der gemeinsamen Beta-Untereinheit des IL-3-, IL-5- und GM-CSF-Rezeptors Sense-(107S: 5'-ACCAT CCCGCT-GCAGACCC-3' (SEQ ID NO: 19) oder Antisense-(107A: 5'-GGGTCTGCAGCGGGATGGT-3'; SEQ ID NO: 20) Oligonukleotide sind. Die Sequenz für 107A-DAP war 51 GGGTCTGCDapQCGGGDapTOQT-3' (SEQ ID NO: 21); die Sequenz für 107A-Inosin (107A-I) war: 5'-GGGTCT-GCIGCGGGIT GGT-3' (SEQ ID NO: 22). Die Zellen wurden wiedergewonnen und 3-mal gewaschen. RNA wurde anschließend wiedergewonnen, und die Anwesenheit der Beta-Kette des Rezeptors wurde mittels semi-quantitativer RT-PCR bestimmt.
  • Tiere
  • Brown Norway-Ratten im Alter von 6–8 Wochen und mit einem Gewicht von 220–275 g wurden von Harlan-Sprague-Dawley (Walkerville, MD) erhalten. Ratten wurden in herkömmlichen Tiereinrichtungen gehalten.
  • Sensibilisierung gegenüber Ovalbumin
  • Aktive Sensibilisierung von Ratten wurde durch subkutane Injektion von 1 ml Kochsalzlösung durchgeführt, die 1 mg Hühnereiovalbumin (OA) (Sigma, St. Louis, MO) und 3,5 mg Aluminiumhydroxidgel (BDH Chemicals, Poole, UK) enthielt.
  • Beladung mit Ovalbumin
  • Am Tag 14 nach der Sensibilisierung mit Ovalbumin nach Vollnarkose mit 65 mg/kg Pentothal und endotrachealer Intubation wurde die Beladung mit Ovalbumin durch intratracheale Injektion von 200 Mikrogramm Ovalbumin in 60 μl durchgeführt. Nach 8 Stunden oder 15 Stunden wurden die Ratten wiederum nach Vollnarkose intubiert, und es wurde eine Lungenspülung bestehend aus 5-mal 5 ml Tropfinfusion von 0,9% Kochsalzlösung durchgeführt. Die Zellen werden gewaschen, ausgezählt und auf Objektträgern in einen Cytospin IIITM zentrifugiert. Es wurde eine Differenzial-Zellzählung durchgeführt.
  • Messung von Atemwegsreaktionen
  • Die Ausrüstung und Methoden zur Messung der Widerstandsfähigkeit der Lunge war wie kürzlich beschrieben (Renzi, P. M., et al. Am. Rev. Respir. Dis 146: 163–169, 1992). Vollnarkose wurde entweder mit Pentothal (50 mg/kg) oder Urethan (1,1 g/kg) intraperitoneal herbeigeführt. Endotracheale Intubation wurde anschließend unter Verwendung eines PE-240®-Polyethylenkatheters mit einer Länge von 6 cm durchgeführt. Ein Heizkissen wurde zum Beibehalten einer konstanten Körpertemperatur verwendet, und die Rektaltemperatur wurde kontinuierlich mit einem elektronischen Thermometer (Telethermometer®, Yellow Springs Instrument Co., Yellowsprings, OH) überwacht. Die Widerstandsfähigkeit der Lunge (RL) wurde während spontaner periodischer Atmung gemessen, wobei sich die Tiere in der Seitenlagenposition befanden. Der Strom wurde gemessen, indem die Spitze eines Luftröhrenschlauchs in einer kleinen Plexiglas®-Box (265 ml Volumen) positioniert wurde. Ein Flelsh®-Nr. 0 Pneumotachograph, der an einen Differenzdruckumformer (MP -45+ 2 cm H2O; Validyne Corp, Northridge, CA) gekoppelt war, wurde an das andere Ende der Box angebracht, um die Luftströmung zu messen, und das Volumen wurde durch numerische Integration des Strömungssignals erhalten. Veränderungen des Speiseröhrendrucks wurden mittels eines mit Kochsalzlösung gefüllten Katheters und eines Differenzdruckumformers (Sanborn 267 BC®; Hewlett Packard, Waltham, MA) gemessen. Die andere Öffnung des Umformers wurde mit der Box verbunden. Der Speiseröhrenkatheter bestand aus einem Polyethylenschlauch (PE-200®) von 20 cm Länge, der an einem Schlauch (PE-100®) von kürzerer Länge (6 cm) angebracht war. Transpulmonaler Druck wurde als Differenz zwischen dem Speiseröhrendruck und dem Druck der Box berechnet. Die Atemwegsreaktion wurde als die RL beurteilt, welche durch Anpassen der Gleichung der Lungenbewegung mittels multipler linearer Regression unter Verwendung von handelsüblicher Software bestimmt wurde (RHT-Infodat Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
  • Messung der Widerstandsfähigkeit der Lunge unmittelbar nach Verabreichung regulärer oder modifizierter PS-Antisense-Oligonukleotide
  • Am Tag 14 nach Sensibilisierung mit Ovalbumin nach einer Vollnarkose mit 65 mg/kg Pentothal und endotrachealer Intubation wurden 60 μg eines PS AS-Oligonukleotids, welches gegen die gemeinsame Beta-Kette des GM-CSF-, IL-3- und IL-6-Rezeptors der Ratte (AS141A: 6'-TGGCACTTTAGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 23) gerichtet war, intratracheal injiziert. Die Widerstandsfähigkeit der Lunge wurde alle 5 Minuten für 30 Minuten und in 15-minütigen Intervallen am Basisniveau gemessen. Dieselben Untersuchungen wurden mit modifizierter AS141 wiederholt, wobei Adenosin durch DAP, AS141-DAP (5'-TGGCDapCTTTDapGGT-GGCTG-3'; SEQ ID NO: 24) oder durch Inosin, AS141-1 (5'-TGGCITTTIGGTGGCTG-3; SEQ ID NO: 25) ausgetauscht worden ist.
  • Untersuchungen, die die Ansprechbarkeit der Atemwege auf Adenosin und DAP-Nukleoside und andere spezifische DAP-Analoga bestimmen
  • Am Tag 14 nach der Sensibilisierung wurden die Ratten mit Pentothal (65 mg/kg) narkotisiert, intubiert, und RL wurde am Basisniveau gemessen. Den Ratten wurden steigende Dosen von Adenosin (CAS 58-61-7), 2,6-Diaminopurin-hemisulfat-Salz (CAS 69369-16-0), DAP (2-Amino-2-desoxyadenosin; CAS 4546-70-7), 2-Amino-9-(B-D-2'-desoxyribofuranosyl)purin (CAS 3616-24-8), 7-Deaza-2'-desoxyadenosin (CAS 60129-59-1), N6-Methyl-2'-desoxyadenosin (CAS 2002-35-9), 2-Aminoadenosin/2,6-Diaminopurinribosid (CAS 2096-10-08) über einen Dosisbereich von 0,125 μg bis 100 μg in 50 μl Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung plus Essigsäure verabreicht. Unmittelbar nach jeder Dosis wurde die RL gemessen. DAP wurde wie folgt gelöst: 3 mg DAP wurden mit 100 μl Essigsäure vereinigt, durch Hinzufügen von Kochsalzlösung auf 1,5 bis 3 ml eingestellt und auf 70°C erwärmt. Dies ergab eine Endkonzentration von 1 bis 2 μg/μl. Verdünnungen wurde in demselben Puffer durchgeführt. Kontrolltiere erhielten in derselben angegebenen Endkonzentration Kochsalzlösung mit Essigsäure.
  • Untersuchungen, die die Ansprechbarkeit auf Leukotrien D4 nach Beladung mit Antigen bestimmen
  • Wir haben kürzlich gezeigt, dass das Antisense-Molekül ASA4 (5'-ACTCATATTC ATAGGGTG-3'; SEQ ID NO: 26), welches gegen den CCR3-Rezeptor der Ratte gerichtet ist, zur Verhinderung des Eosinophilen-Einstroms in die Lungen nach Antigen-Beladung wirksam ist (siehe WO 99/66037 ). Wir setzten dieselben Oligonukleotidsequenzen für diese Untersuchungen ein. Am Tag 14 wurden die Ratten nach Vollnarkose mit Pentothal (65 mg/kg) intubiert und erhielten intratracheal 200 μg von ASA4, ASA4-DAP (5'-DapCTCDBpTDapT-TCDapTDapCGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27), Mismatch ASA4-DAP (5'-CDapTCDapT TDapTCATGDapGGTG-3'; SEQ ID NO: 28), AS141-DAP (5'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29), Mismatch AS141-DAP (5'-GTGCC-DapTTTGDapGTGGCTQ-3'; SEQ ID NO: 30), einer Kombination von ASA4-DAP und AS141-DAP (insgesamt 100 μg) oder Kochsalzlösung in 50 μl 0,9% NaCl. Zehn Minuten später wurde die Beladung mit Ovalbumin durch intratracheales Injizieren von 200 Mikrogramm Albumin in 50 μl 0,9% Kochsalzlösung durchgeführt. Nach 15 Stunden wurden die Ratten im Anschluss an die Vollnarkose wiederum intubiert, die Widerstandsfähigkeit der Lunge wurde am Basisniveau gemessen, und doppelte Konzentrationen von Leukotrien D4 wurden intratracheal injiziert (50 ng bis 1600 ng), bis sich das Basisniveau der Widerstandsfähigkeit der Lunge verdoppelte (EC200).
  • Untersuchungen, die den zellulären Einstrom in die Lungen nach Beladung mit Antigen bestimmen
  • Am Tag 14 wurden die Ratten nach Vollnarkose mit Pentothal (65 mg/kg) intubiert und erhielten intratracheal 200 μg ASA4, ASA4-DAP (6'-DepCTCDapTDapTTCDapTDapGGGTG-3'; SEQ ID NO: 27), AS141-DAP {6'-TGGCDapCTTTDapGGTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 29), Mismatch AS141-DAP (6'-GTGCCDapTTTGDapOTGGCTG-3'; SEQ ID NO: 30), eine Kombination aus ASA4-DAP und AS141-DAP (insgesamt 100 μg) oder Kochsalzlösung in 60 μl 0,9% NaCl. Zwanzig Minuten später wurde die Beladung mit Albumin durch intratracheales Injizieren von 200 μg Ovalbumin in 50 μl 0,9% Kochsalzlösung durchgeführt. Nach 15 Stunden wurden die Ratten nach Vollnarkose wiederum intubiert, und es wurde eine Lungenspülung durchgeführt, die aus 5-mal 5 ml Tropfinfusion bestand. Die Zellen wurden gewaschen, ausgezählt und auf Objektträgern in einem Cytospin III® zentrifugiert. Schließlich wurde eine Differenzial-Zellzählung durchgeführt.
  • Untersuchungen, die den zellulären Einstrom in die Lungen nach Verabreichung von Adenosin oder DAP bestimmen
  • Vierzehn Tage nach der Sensibilisierung wurden die Ratten nach einer Anästhesie mit 65 mg/kg Pentothal intubiert, und es wurden 100 μg Adenosin oder 2-Amino-2'-desoxyadenosin oder 2-Amino-2'-desoxyadenosin und anschließend, 10 Minuten später, wurden Adenosin oder Kochsalzlösung intratracheal in 50 μl injiziert. Fünfzehn Stunden später wurden die Ratten nach Vollnarkose mit Pentothal intubiert, und eine Lungenspülung wurde durchgeführt, und die Zellen wurden wie oben beschrieben ausgezählt.
  • C) ERGEBNISSE
  • Beispiel 1: Austausch von Adenosin durch DAP ist in vitro mindestens so wirksam wie ein reguläres Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid
  • Eine erste Untersuchungsreihe wurde zur Bestimmung entwickelt, ob der Austausch von Adenosin durch DAP die in vitro-Wirksamkeit von AS-Oligonukleotiden beeinflusst. In 2A ist zu beachten, dass die biologische Wirksamkeit des Antisense-Moleküls der gemeinsamen Beta-Kette von humanem GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptor nicht durch den Austausch von Adenosin durch 2-Amino-2'-desoxyadenosin in U937-Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, beeinflusst wird. AS107 ist ein 19 mer-Oligonukleotid, das 2 Adenosin-Basen enthält. Die Adenosin-Basen wurden durch DAP (AS107-DAP) ausgetauscht. Dieses modifizierte Oligonukleotid war beim Blockieren der mRNA für die gemeinsame Beta-Kette bei Bestimmung mittels semi-quantitativer PCR (mit G3PDH als konstitutives Gen) mindestens gleichermaßen wirksam wie AS107, das Adenosin enthielt (AS 107).
  • Zur Bestätigung der Wirksamkeit in einer anderen Zelllinie wurden die Untersuchungen in TF1-Zellen wiederholt, deren Überleben von GM-CSF abhängt. In 2B ist zu beachten, dass AS107-DAP beim Blockieren der mRNA-Expression mindestens gleichermaßen wirksam gegenüber der gemeinsamen Beta-Kette von humanem GM-CSF-, I1-3- und IL-5-Rezeptor war wie AS107, das Adenosin enthält (AS107). Der Austausch von Adenosin durch DAP in Antisense-Oligonukleotiden ist in vitro wirksam.
  • Beispiel 2: Nicht alle Substituenten von Adenosin sind beim Hemmen von Genen wirksam, wenn sie in Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide eingebracht werden
  • Untersuchungen wurden zur Bestimmung durchgeführt, ob der Austausch von Adenosin die Wirksamkeit von Antisense-Oligonukleotiden beeinflusst. In 3 ist zu beachten, dass die Wirksamkeit desselben Antisense-Oligonukleotids wie dasjenige, das oben beschrieben wurde (AS107), verloren geht, wenn beiden Adenosine durch Inosine ausgetauscht werden. Antisense-Moleküle, die Inosin (AS 107-I) enthalten, waren bei der Hemmung der mRNA-Expression bei Bestimmung mittels semiquantitativer PCR und im Vergleich zu AS107, das Adenosin enthielt, nicht wirksam. Untersuchungen wurden vor der Isolierung von RNA und vor der Durchführung der semi-quantitativen PCR durch Inkubieren von U937-Zellen mit Medium allein, AS107 oder AS107-1 bei einer Konzentration von 10 pmol für sechs Stunden durchgeführt.
  • Beispiel 3: Eine Steigerung der Widerstandsfähigkeit der Lunge, die nicht mit Adenosin zusammenhängt, tritt nach intratrachealer Injektion von Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotiden auf
  • Untersuchungen wurden zur Bestimmung der Wirkung der schnellen intratrachealen Injektion von Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotiden, die in 50 μl Kochsalzlösung enthalten sind, auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge durchgeführt.
  • 4A veranschaulicht die Wirkungen der intratrachealen Verabreichung von Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotid, das gegen die gemeinsame Beta-Kette von GM-CSF, IL-3- und IL-5 der Ratte gerichtet ist (AS141, ein 19 mer-Oligonukleotid, das 2 Adenosine enthält), sowie die Wirkung eines DAP-substituierten Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotids (AS141-DAP) derselben Sequenz in einer Dosis von jeweils 60 μg auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge von sensibilisierten Brown Norway (BN)-Ratten. Für diese Untersuchungen sowie die folgenden wurden sensibilisierte Brown Norway-Ratten, wie oben beschrieben, eingesetzt (Renzi PM, Am Rev Respir Dis 146: 183–9; 1992). Die Injektion von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung löste eine leichte Steigerung der Widerstandsfähigkeit der Lunge aus, wobei der maximale Anstieg 25% betrug. Übliche Antisense-Moleküle, die weniger als 15% Adenosin enthielten, verursachten einen mäßigen Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Lunge (87%). Die DAP-modifizierten Oligonukleotide verursachten einen leichten bis mäßigen Anstieg (33%) der Widerstandsfähigkeit der Lunge. Nyce hat in WO 00/62736 und WO 00/09525 vorgeschlagen, dass der Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Lunge durch Adenosin verursacht wird, das in dem Oligonukleotid enthalten ist. Die Oligonukleotide hatten jedoch nicht die Zeit zum Abbau und zur Freisetzung von Adenosin (wenige Minuten), und das Antisense-Oligonukleotid, welches eingesetzt wurde, enthielt nur 10% Adenosin (welches gemäß WO 00/62736 und WO 00/09525 keine Wirkung auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge haben sollte).
  • Ein Assay wurde zur Beurteilung durchgeführt, ob Bronchospasmen aufgrund der 2 Adenosine auftreten, die an AS141 durch 2 Inosine ausgetauscht wurden, da bekannt ist, dass Inosin im Vergleich zu Adenosin keine Bronchokonstriktion der Lungen/Atemwege verursacht (Mann, J. C. et al., J Appl Physiol 61: 1667–76, 1986). Wie in 4B gezeigt, löste die intratracheale Verabreichung desselben Antisense-Phosphorothioat-Oligonukleotids, das gegen die gemeinsame Beta-Kette von GM-CSF, IL-3 und IL-6 (AS141) der Ratte gerichtet ist, wobei Inosin durch Adenosin (AS141-Inosine) ausgetauscht war, ebenfalls einen vorübergehenden Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Lunge aus (um 108%). Diese Ergebnisse zeigen, dass die intratracheale Injektion der Antisense-Oligonukleotide über einen Mechanismus, der nicht mit Adenosin zusammenhängen zu scheint, vorübergehend die Widerstandsfähigkeit der Lunge steigert.
  • Beispiel 4: Wirkung unterschiedlicher DAP-Analoge auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge
  • Wir bestimmten die Wirkungen der intratrachealen Verabreichung von DAP-Analoga und Adenosin auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge in Brown Norway-Ratten. Wie in 5 gezeigt, wurden Adenosin, DAP und fünf unterschiedliche Analoga von DAP untersucht. Für jede Verbindung wurden mindestens 6 Ratten untersucht, und das durchschnittliche Prozentbasisniveau der Widerstandsfähigkeit der Lunge wird als Funktion der intratrachealen Dosis von DAP oder dessen Analoga dargestellt. Wie aus dieser Figur deutlich wird, stieg die Widerstandsfähigkeit der Lunge stufenweise auf einen Höchstwert bei einer Konzentration von 5 μg Adenosin, während sie nicht bei 2-Amino-2'-desoxyadenosin (DAP) oder den Analoga davon, die untersucht wurden, auftrat. Diese Ergebnisse zeigen daher, dass zum Gegensatz von Adenosin, DAP und dessen Analoga die Widerstandsfähigkeit der Lunge nicht signifikant steigern. Da Oligonukleotide innerhalb der Lungen fortschreitend abgebaut werden, kann es überraschenderweise vorteilhaft sein, diese Verbindungen anstelle von Adenosin zu verwenden.
  • Beispiel 5: DAP-modifizierte Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide sind bei der Hemmung der Hyperreaktivität der Atemwege wirksam, die nach Beladung mit Antigen in vivo auftritt
  • Die biologische in vivo-Aktivität von DAP-modifizierten Antisense-Molekülen, die gegen CCR3 der Ratte und die gemeinsame β-Kette von IL-3/IL-5/GM-CSF-Rezeptoren gerichtet sind, ist in 6A am Rattenmodell von Asthma gezeigt. ASA4 ist ein 18 mer-Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid, für das gezeigt worden ist, dass es den CCR3-Rezeptor sowie den Eosinophilen-Einstrom hemmt, der nach Beladung mit Antigen auftritt (siehe WO 99/66037 ). AS141 ist auch ein 18 mer-Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotid, für das gezeigt worden ist, dass es die gemeinsame β-Kette von IL-3/IL-5/GM-CSF-Rezeptoren und den Eosinophilen-Einstrom, der nach Beladung mit Antigen auftritt, hemmt (siehe WO 99/66037 ). ASA4 enthält 5 Adenosin-Basen (28% Adenosin). AS143 enhält 2 Adenosin-Basen. Es ist zu beachten, dass ASA4-DAP die Ansprechbarkeit der Atemwege auf Leukotrien D4 15 Stunden nach Beladung mit Ovalbumin im Vergleich zu Ratten, die kein AS erhielten (Kontrolle beladen; p < 0,01) oder Ratten, die mit DAP-Mismatch behandelt wurden, signifikant verminderte. Es ist ebenso zu beachten, dass ASA4-DAP eher wirksamer ist als unmodifiziertes ASA4, und dass im Vergleich zu den Ergebnissen, die mit unbeladenen Ratten erhalten wurden, kein Unterschied bestand. AS141 verminderte im Vergleich zu Kontrollbeladenen und mit 141-DAP-Mismatch behandelten Ratten ebenso signifikant die Hyperreaktivität auf LTD4 (P < 0,05). Darüber hinaus war die Ansprechbarkeit der Atemwege auf LTD4 bei den Ratten, die mit der Kombination aus CCR3 und den gemeinsamen β-Ketten-Oligonukleotiden behandelt wurden, im Vergleich zu jedem Antisense-Oligonukleotid signifikant vermindert, und diese Kombination war genauso wirksam wie die Kombination von DAP-Oligonukleotiden (insgesamt 50 μg; 6B).
  • Beispiel 6: DAP-modifizierte Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide sind bei der Hemmung der Atemwegsentzündung, die nach Beladung mit Antigen in vivo auftritt, wirksamer als herkömmliche Antisense-Oligonukleotide
  • Diese Untersuchungen wurden mit Antisense-Oligonukleotiden durchgeführt, die gegen den CCR3-Rezeptor der Ratte oder gegen die gemeinsame Beta-Kette von IL-3,5 und GM-CSF gerichtet waren. Mit Ovalbumin sensibilisierte und beladende Ratten wurden zehn Minuten vor der Beladung mit Ovalbumin durch intratracheale Injektion von Kochsalzlösung, 200 μg reguläres ASA4 oder 200 μg ASA4-DAP behandelt. Nach 15 Stunden wurden die Ratten narkotisiert, intubiert und eine bronchoalveoläre Spülung wurde zur Gesamt- und Differenzial-Zeltzählung durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verabreichung sowohl von üblichem ASA4 (7A) als auch AS141 (7B) und sowohl ASA4-DAP als auch AS141-DAP wirksam das Anlocken von Eosinophilen hemmte (um 84% bzw. 83% 7A). AS4DAP neigte jedoch dazu, das Anlocken von Neutrophilen und Makrophagen zu vermindern, und verminderte signifikant das Anlocken von Lymphozyten (um 74%). 141-DAP verminderte ebenso signifikant das Anlocken von Makrophagen (p < 0,05). Die Kombination von zwei A4-DAP- und 141-DAP-Oligonukleotiden (insgesamt 200 μg) verminderte ebenso signifikant das Anlocken von Lymphozyten und Makrophagen (7C). Diese Ergebnisse zeigen, dass DAP-modifizierte Oligonukleotide nicht nur wirksam sind, sondern auch eine breitere entzündungshemmende Wirkung als übliche Oligonukleotide aufweisen.
  • Beispiel 7: Adenosin weist entzündungshemmende Wirkungen in der Lunge auf, die für das Anlocken von Eosinophilen spezifisch sind, und DAP ist ein Antagonist der proinflammatorischen Wirkungen von Adenosin
  • In einer weiteren Untersuchung wurden Gruppen von sechs sensibilisierten, jedoch unbeladenen Brown Norway-Ratten mit Pentothal narkotisiert und endotracheal intubiert. Die Ratten erhielten anschließend eine intratracheale Injektion von entweder (1) Kochsalzlösung (Kontrolle), (2) 100 μg Adenosin, (3) 100 μg 2-Amino-2'-desoxyadenosin (DAP) oder (4) 100 μg DAP und anschließend 10 Minuten später 100 μg Adenosin. Die Ratten wurden 16 Stunden später für eine Lungenspülung aufgeweckt, wiederum anästhesiert und intubiert. Zellen, die im Medium vorhanden waren, wurden aus der Spülung gesammelt, ausgezählt und ein Differenzial wurde auf Cytoapin®-Objektträgem erhalten.
  • Wie in 8 gezeigt, wirkt Adenosin in den Lungen proinflammatorisch, was zu einer selektiven Anlockung von Eosinophilen (mehr als 10-facher Anstieg) führt, ohne die anderen Zellarten signifikant zu beeinflussen. Im Gegensatz dazu erhöht DAP nicht die Zellularität der Lungenspülung und hemmt das Anlocken von Eosinophilen, welches durch Adenosin ausgelöst wird, vollständig.
  • D) SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Angesichts der obigen Ausführungen weisen DAP-substituierte Antisense-Oligonukleotide die folgenden Vorteile im Vergleich zu unmodifizierten Antisense-Molekülen oder Inosin-modifizierten Antisense-Molekülen auf:
    • a) Wie in 1 bis 8 gezeigt und in der vorliegenden Patentanmeldung belegt, unterscheiden sich die chemischen Struktur und die Eigenschaften von DAP und DAP-Analoga von Adenosin. Diese unterschiedlichen chemischen Eigenschaften führen dazu, das Antisense-Oligonukleotide, die DAP und/oder DAP-Analoga aufweisen, im Vergleich zu unmodifizierten Antisense-Molekülen unterschiedliche chemische Eigenschaften, Hybridisierungseigenschaften und Stabilität aufweisen.
    • b) Beispiel 1 zeigt, wie DAP-Phosphorothioat-Antisense-Moleküle in unterschiedlichen Zelllinien in vitro wirksam sind.
    • c) Beispiel 2 zeigt, dass nicht alle Substituenten von Adenosin beim Hemmen von Genen wirksam sind, wenn sie in Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide eingebracht werden (wie bei Inosin gezeigt).
    • d) Beispiel 3 zeigt, dass ein Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Lunge nach intratrachealer Injektion von Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotiden auftritt, und dass dieser Anstieg nicht mit Adenosin zusammenhängt. Tatsächlich wird ein Anstieg der Widerstandsfähigkeit der Lunge bei Inosin-Oligos beobachtet, sogar obwohl Inosin nicht Adenosin-Rezeptoren stimuliert. Dieser Anstieg war jedoch bei DAP-modifizierten Oligos weniger bedeutsam.
    • e) Beispiel 4 zeigt, dass trotz der Tatsache, dass unterschiedliche Substituenten von Adenosin, DAP und Analoga von DAP bei intratrachealer Injektion in vivo unterschiedliche Wirkung auf die Widerstandsfähigkeit der Lunge aufweisen, diese Verbindungen weitaus weniger toxisch sind als Adenosin. Zum Beispiel war, wie in 5 gezeigt, bei einer Adenosin-Toxizität (6 μg) am Peak, die relative Rangordnung der untersuchten Verbindungen Adenosin > N6-Methyl-2'-desoxyadenosin > Rest einschließlich DAP. Bei einer 5-fach niedrigeren Konzentration (1 μg) war die Rangordnung der Toxizität jedoch unterschiedlich, nämlich die Adenosin > 2 Amino-2-desoxyadenosin/DAP > Rest. Freie DAP-Base wird als strukturelle Kontrolle zur Bestimmung verwendet, ob der Zucker für die Toxizität erforderlich ist.
    • f) Beispiel 5 zeigt, dass DAP-modifizierte Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung der Hyperreaktivität der Atemwege gegenüber Leukotrien D4, die nach Antigenbeladung in vivo auftritt, wirksam sind und stärker wirksam sind als herkömmliche PS-Oligonukleotide. Die Kombination aus zwei DAP-modifizierten Oligonukleotiden ist wirksamer als jedes Oligonukleotid allein, was die Synergie bestätigt.
    • g) Beispiel 6 zeigt, dass DAP-modifizierte Phosphorothioat-Antisense-Oligonukleotide zur Hemmung der Atemwegsentzündung, die in vivo nach Antigen-Beladung auftritt, wirksamer sind als herkömmliche Antisense-Oligonukleotide. Für ASA4 bestand ein starker Trend in Richtung einer Abnahme der Neutrophilen und Makrophagen, und auch in Richtung einer signifikanten Abnahme an Lymphozyten, während man diese Wirkungen nicht bei herkömmlichen PS-Antisense-Oligonukleotiden antraf. Für AS141 bestand ein starker Trend in Richtung einer Abnahme an Neutrophilen und ebenfalls in Richtung einer signifikanten Abnahme an Lymphozyten und Makrophagen, während man diese Wirkungen bei herkömmlichen PS-Antisense-Oligonukleotiden nicht antraf. Für die Kombination aus ASA4 und AS141 bestand ein starker Trend in Richtung abnehmender Neutrophilen und ebenso in Richtung einer signifikanten Abnahme an Lymphozyten und Makrophagen, während man diese Wirkungen nicht bei herkömmlichen PS-Antisense-Oligonukleotiden antraf.
    • h) Beispiel 7 zeigt, dass Adenosin in den Lungen von Ratten eine proinflammatorische Wirkung aufweist, die selektiv Eosinophile anlockt, und dass es keine signifikante Wirkung auf Lymphozyten aufweist. Gleichzeitig zeigt Beispiel 7, dass DAP den Einstrom von Eosinophilen blockiert, wodurch gezeigt ist, dass DAP an sich ein Antagonist von Adenosin ist.
  • Die obigen 7 Beispiele zeigen, dass DAP-substituierte Antisense-Moleküle sowie Antisense-Moleküle mit Analoga von DAP inherent wirksamer und weitaus weniger toxisch für die Lungen/Atemwege sind als freies Adenosin-Nukleosid oder unmodifizierte Antisense-Verbindungen, die Adenosin enthalten.
  • Ebenso sind Adenosine im Gegensatz zu dem, was in WO 00/09525 und WO 00/62736 gezeigt wurde, die in Antisense-Molekülen enthalten sind, auch nicht proinflammatorisch, da Antisense-Moleküle mit bis zu 28% Adenosin-Basen in der Lage waren, den Eosinophilen-Einstrom in dem gleichen Ausmaß zu hemmen wie Antisense-Moleküle, die kein Adenosin, jedoch DAP enthielten (siehe 7). Da jedoch die Oligonukleotide, die DAP enthalten, ebenso den Einstrom von Lymphozyten und Makrophagen hemmten (7) und Adenosin den Einstrom von Lymphozyten nicht beeinflusst (8), scheint es so, dass DAP, das in Antisense-Molekülen enthalten ist, seine Wirkungen über einen Mechanismus ausübt, der nicht mit dem/den Adenosin-Rezeptoren) zusammenhängt.
  • Zusammenfassend stellen DAP-Antisense-Moleküle eine verbesserte Technologieplattform zur Entwicklung von Antisense-Therapeutika und Impfstoffen zur Behandlung und Verhinderung von Atemwegserkrankungen bereit, wie zum Beispiel Asthma, allergische Rhinitis, chronische obstruktive Erkrankung, eosinophiler Husten, pulmonale Fibrose, zystische Fibrose, pathogene Infektionen, genetische Erkrankungen und Lungenkrebs, und jede beliebige weitere Erkrankung, bei welcher Entzündung eine Rolle spielt. Ebenso weist DAP an sich und Analoga davon eine starke Leistungsfähigkeit bei entzündungshemmenden Arzneimitteln zur Hemmung von Entzündung in Säugern auf.
  • Während verschiedene Ausführungsformen der Erfindung beschrieben worden sind, versteht sich, dass die vorliegende Erfindung weitere Modifizierungen umfasst, und dass die vorliegende Patentanmeldung beliebige Variationen, Verwendungen oder Anpassungen der Erfindung umfassen soll, die im Allgemeinen den Grundsätzen der Erfindung folgen und solche Abweichungen von der vorliegenden Erfindung umfasst, die innerhalb des Wissens oder der üblichen Praxis im Fachbereich, welchem die Erfindung angehört, liegen. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (49)

  1. Isoliertes oder gereinigtes Nukleinsäuremolekül, welches ein Oligonukleotid ist, das eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ-ID Nr.: 1–6, 8–18 und 21, 24, 27, 28 und 30, die (i) einen Nukleotid-Substituenten umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,6-Diaminopurin und den Salzen daraus, oder wobei (ii) mindestens ein Adenosinnukleotid aus dem Oligonukleotid durch den Nukleotidsubstituenten ausgetauscht ist.
  2. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei der Nukleotid-Substituent 2,6-Diaminopurin ist.
  3. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 und 2, das mindestens einen Mononukleotid-Verbindungsrest umfasst, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Methylphosphonat-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Phosphodiester-, Phosphorodithioat-, Borphosphat-, Formacetal-, Thioformacetal-, Thioether-, Carbonat-, Carbamat-, Sulfat-, Sulfonat-, Sulfamat-, Sulfonamid-, Sulfon-, Sulfi-, Sulfoxid-, Sulfid-, Hydroxylamin-, Methylen(methylimino)-, Methylenoxy(methylimino)- und Phosphoramidat-Resten.
  4. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Nukleinsäuremolekül aus DNA besteht.
  5. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–3, wobei das Nukleinsäuremolekül aus RNA besteht.
  6. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–5, wobei das Nukleinsäuremolekül von 2 bis etwa 10.000 Nukleotide umfasst.
  7. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–6, wobei das Nukleinsäuremolekül mit einem Molekül verbunden ist, das aus der Gruppe beste hend aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Peptidomimetika, kleinen Chemikalien, Liganden, Lipiden, Nukleinsäuren oder Kohlenhydrat-Gruppen ausgewählt ist.
  8. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Antisense-Oligonukleotid ist.
  9. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 8, wobei das Antisense-Oligonukleotid von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotide umfasst.
  10. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 9, wobei das Antisense-Oligonukleotid die Nukleinsäuresequenz von der SEQ-ID Nr.: 21 aufweist.
  11. Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–7, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Sequenz umfasst, welche für ein therapeutisches Genprodukt codiert.
  12. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Antisense-Oligonukleotid die Nukleinsäuresequenz von der SEQ-ID Nr.: 21 aufweist und mindestens einen verbindenden Phosphorothioat-Rest umfasst.
  13. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 12, wobei das Nukleinsäuremolekül mehrere verbindende Phosphorothioat-Reste umfasst.
  14. Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 13, wobei alle Nukleotide von dem Nukleinsäuremolekül durch Phosphorothioat-Reste verbunden sind.
  15. Pharmazeutische Zusammensetzung, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleinsäuremolekülen, die in den Ansprüchen 1–11 festgelegt sind, und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
  16. Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Behandlung und/oder Verhinde rung einer Erkrankung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erkrankungen der Atmungssysteme, neurologischen Erkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologischen Erkrankungen, Erkrankungen der Harnorgane, Karzinomen, pathogenen Infektionen, genetischen Erkrankungen, Hypereosinophilie, generalisierten Entzündungen und Krebs.
  17. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15 und 16, wobei das Nukleinsäuremolekül in einer Menge von etwa 1% bis etwa 90% der Zusammensetzung vorhanden ist.
  18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15–17, die ferner ein Mittel umfasst, das aus der Gruppe bestehend aus Arzneimitteln, Antioxidationsmitteln, Netzmitteln, Aromastoffen, ätherischen Ölen, Pufferreagenzien, Dispergiermittein, Treibmitteln und Konservierungsmitteln ausgewählt ist.
  19. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15–18, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus festen Trägermaterialien, flüssigen Trägermaterialien und gasförmigen Trägermaterialien.
  20. Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der pharmazeutisch verträgliche Träger ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipidpartikeln, Lipidvesikeln, Mikrokristallen und Netzmitteln.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Krankheit, welche mit einer Entzündung der Lunge, der Atemwege und/oder der Nase verbunden ist.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Behandlung und/oder Verhinderung einer Erkrankung der Atmungssysteme ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pulmonaler Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Zystische Fibrose, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, chronischer Bron chitis, eosinophiler Bronchitis, Asthma, Allergie, allergischer Rhinitis, Sinusitis und Hypereosinophilie.
  23. Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei die Erkrankung des Atmungssystems Asthma ist und wobei das Oligonukleotid eine Nukleinsäuresequenz aufweist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den SEQ-ID Nr.: 1–6, 8–18.
  24. Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur unmittelbaren Verabreichung an das Atmungssystem.
  25. Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Verabreichung über eine Aerosol-Druckzerstäuberdose, einen Nasenspray-Zerstäuber, einen Vernebler, einen Dosieraerosol-Inhalator, einen Trockenpulverinhalator oder eine Kapsel.
  26. Zusammensetzung nach Anspruch 15, wobei das Nukleinsäuremolekül die Nukleinsäuresequenz von der SEQ-ID Nr.: 21 aufweist und mindestens einen verbindenden Phosphorothioat-Rest umfasst.
  27. Zusammensetzung nach Anspruch 26, wobei das Nukleinsäuremolekül mehrere verbindende Phosphorothioat-Reste umfasst.
  28. Zusammensetzung nach Anspruch 27, wobei alle Nukleotide von dem Nukleinsäuremolekül durch Phosphorothioat-Reste verbunden sind.
  29. Verwendung von einem isolierten oder gereinigten Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1–14 für die Herstellung von einem Medikament zur Antisense-Therapie.
  30. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Medikament zur Verhinderung oder zur Behandlung einer Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Erkrankungen der Atmungssysteme, neurologischen Erkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologischen Erkrankungen, Erkrankungen der Harnorgane, Karzinomen, pathogenen Infektionen, genetischen Erkrankungen, generalisierten Entzündungen und Krebs.
  31. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Medikament zur Verhinderung oder zur Behandlung einer Erkrankung des Atmungssystems ist, welche eine Erkrankung ist, die mit einer Entzündung der Lunge, der Atemwege und/oder der Nase verbunden ist.
  32. Verwendung nach Anspruch 29, wobei das Medikament zur Verhinderung und/oder Behandlung einer Erkrankung der Atmungssysteme ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pulmonaler Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Zystische Fibrose, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, chronischer Bronchitis, eosinophiler Bronchitis, Asthma, Allergie, allergischer Rhinitis, Sinusitis und Hypereosinophilie,
  33. Verfahren zur Herstellung von einem isolierten oder gereinigten Nukleinsäuremolekülen nach einem der Ansprüche 1–11, welches den Austausch von mindestens einem Adenosin des Oligonukleotids mit einem Nukleotid-Substituenten umfasst, wobei der Nukleotid-Substituent ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,6-Diaminopurin und Salzen daraus.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Nukleotid-Substituent 2,6-Diaminopurin ist.
  35. Verwendung von einem Nukleotid-Substituenten, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 2,6-Diaminopurin und Salzen daraus, zum Austausch mindestens eines Adenosin-Rests von einem Oligonukleotid mit dem Nukleotid-Substituenten zur Steigerung der entzündungshemmenden in vivo-Wirksamkeit von einem Oligonukleotid.
  36. Verwendung nach Anspruch 35, wobei der Nukleotid-Substituent 2,6-Diaminopurin ist.
  37. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–36, wobei das Nukleinsäuremolekül aus DNA besteht.
  38. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–36, wobei das Nukleinsäuremolekül aus RNA besteht.
  39. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–38, wobei das Nukleinsäuremolekül von 2 bis etwa 10.000 Nukleotide umfasst.
  40. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–39, wobei das Nukleinsäuremolekül mit einem Molekül verbunden ist, das aus der Gruppe bestehend aus Aminosäuren, Peptiden, Proteinen, Peptidomimetika, kleinen Chemikalien, Liganden, Lipiden, Nukleinsäuren oder Kohlenhydrat-Gruppen ausgewählt ist.
  41. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–40, wobei das Nukleinsäuremolekül ein Antisense-Oligonukleotid ist.
  42. Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Antisense-Oligonukleotid von etwa 10 bis etwa 100 Nukleotide umfasst.
  43. Verwendung nach einem der Ansprüche 35–40, wobei das Nukleinsäuremolekül eine Sequenz umfasst, welche für ein therapeutisches Genprodukt codiert.
  44. Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Antisense-Oligonukleotid ausgerichtet ist auf die Verhinderung oder die Behandlung einer Erkrankung, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Erkrankungen der Atmungssysteme, neurologischen Erkrankungen, kardiovaskulären Erkrankungen, rheumatischen Erkrankungen, Verdauungskrankheiten, Hautkrankheiten, ophthalmologischen Erkrankungen, Erkrankungen der Harnorgane, Karzinomen, pathogenen Infektionen, genetischen Erkrankungen, generalisier ten Entzündungen und Krebs.
  45. Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Antisense-Oligonukleotid ausgerichtet ist auf die Verhinderung oder die Behandlung einer Erkrankung des Atmungssystems, welche eine Erkrankung ist, die mit einer Entzündung der Lunge, der Atemwege und/oder der Nase verbunden ist.
  46. Verwendung nach Anspruch 41, wobei das Antisense-Oligonukleotid ausgerichtet ist auf die Verhinderung und/oder die Behandlung einer Erkrankung der Atmungssysteme, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pulmonaler Fibrose, Atemnotsyndrom des Erwachsenen, Zystische Fibrose, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, chronischer Bronchitis, eosinophiler Bronchitis, Asthma, Allergie, allergischer Rhinitis, Sinusitis und Hypereosinophilie.
  47. Verwendung nach Anspruch 35, wobei das resultierende Oligonukleotid die Nukleinsäuresequenz von der SEQ-ID Nr.: 21 aufweist und mindestens einen verbindenden Phosphorothioat-Rest umfasst.
  48. Verwendung nach Anspruch 47, wobei das resultierende Oligonukleotid mehrere verbindende Phosphorothioat-Reste umfasst.
  49. Verwendung nach Anspruch 48, wobei alle Nukleotide von dem resultierenden Oligonukleotid durch Phosphorothioat-Reste verbunden sind.
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