DE60132581T2

DE60132581T2 - Medikament zur behandlung von durch parasitäre protozoen verursachte erkrankungen

Info

Publication number: DE60132581T2
Application number: DE60132581T
Authority: DE
Inventors: Anders Hofer; Lars Thelander
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2009-01-29
Anticipated expiration: 2021-04-21
Also published as: ATE384521T1; EP1284725A2; US7157449B2; SE0001531D0; EP1284725B1; ES2298229T3; DE60132581D1; WO2001080809A2; US20030109505A1; WO2001080809A3; AU2001250722A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer durch ein parasitäres Protozoon hervorgerufenen Krankheit sowie eine pharmazeutische Zusammensetzung als solche.
Hintergrund
Viele weit verbreitete Krankheiten werden durch Protozoenpathogene hervorgerufen, beispielsweise Malaria, Leishmaniose und Trypanosomiasis. Letztgenannte wird durch Infektion mit Spezies der Protozoongattung Trypanosoma hervorgerufen. Die Ursache von Amerikanischer Trypanosomiasis, oder Chagas-Krankheit, ist T. cruzi, das üblicherweise durch infizierte Triatomiden auf Menschen übertragen wird, während die Afrikanische Trypanosomiasis, oder Afrikanische Schlafkrankheit, durch Infektionen mit Tiypanosoma brucei rhodiense und T. b. gambiense hervorgerufen wird. Tatsächlich ist die Afrikanische Schlafkrankheit (für eine Übersicht siehe Brun, R. (1999) Karger-Gazette 63, 5–7) eine verheerende Krankheit, deren Name auf den komatösen Zustand im Endzustand der Krankheit zurückgeht. Ohne Behandlung stirbt der Patient innerhalb weniger Monate bis zu mehreren Jahren nach Infektion. Der beschriebene schwere komatöse Zustand tritt auf, wenn diese Parasiten auch in das Zentralnervensystem eindringen, nachdem sie zuvor hauptsächlich im Blut zirkulierten.
T. brucei wird durch Tsetse-Fliegen zwischen Säugerwirten verbreitet. Der Parasit durchläuft im Säugerwirt ebenso wie in der Fliege viele verschiedene Lebenszyklusstadien (Vickerman, 1985). Wenn die Trypanosomen durch einen Tsetse-Biss in den Säugerwirt gelangen, beginnen sie als langgestreckte („long slender") Blutformen zu proliferieren. Mit fortschreitender Krankheit entwickeln sich mehr und mehr Trypanosomen zu kurzen gedrungenen („short stumpy") Formen, die nicht proliferieren können, aber im Gegensatz zu den langgestreckten Formen auf eine neue Tsetse-Fliege übertragen werden können. In der Fliege durchlaufen die Trypanosomen einige weitere Entwicklungsstadien, bevor sie auf einen neuen Säugerwirt übertragen werden.
Die meisten Wirkstoffe, die gegen T. brucei wirken, durchdringen die Blut-Hirn-Schranke nicht und sind daher nutzlos, sobald die Trypanosomen das ZNS befallen haben. Zurzeit sind die einzigen Wirkstoffe, die gegen eine Infektion von T. brucei im späten Stadium wirken, Difluormethylornithin (DFMO) und arsenhaltige Mittel wie Melarsoprol. Die arsenhaltigen Mittel haben schwere Nebenwirkungen, und der Patient stirbt oft an einer wirkstoffinduzierten Enzephalitis. DFMO ist weniger toxisch, aber sehr teuer in der Herstellung, und wirkt nur gegen T. b. gambiense.
Um alternative Behandlungen zu finden, war der Purinstoffwechsel lange Zeit ein heißes Thema auf dem Gebiet von Trypanosomen und verwandten Organismen (Übersicht bei Hassan, H. F. und Coombs, G. H. (1988) FEMS Microbiol. Rev. 54, 47–84). Es wurde bereits festgestellt, dass Trypanosomen die Fähigkeit fehlt, de novo Purine zu bilden, und dass sie daher Hypoxanthin, Adenin oder Guanin benötigen, die von verschiedenen Phosphoribosyltransferasen wiederverwertet werden. Jede dieser drei Basen ist geeignet, da die Trypanosomen, wie die meisten Organismen, alle Enzyme besitzen, um IMP, AMP und GMP ineinander umzuwandeln. Es können auch Nukleoside (Adenosin, Inosin und Guanosin) verwendet werden, sie werden jedoch vor ihrer Wiederverwertung üblicherweise in Zucker und Base gespalten (Pellé, R., Vern., L. S., Parkin, D. W. (1988) J. Biol. Chem. 273, 2118–2126 Proc. Am. Ass. Cancer Res. 22, 352).
Weit weniger Aufmerksamkeit wurde jedoch auf die Synthese von Pyrimidinen in Trypanosomen gerichtet (für eine Übersicht siehe Hassan, H. F. und Coombs, G. H. (1988) FEMS Microbiol. Rev. 54, 47–84). Es ist bekannt, dass T. brucei vollständig in der Lage ist, UTP de novo und durch Wiederverwertung von Uracil herzustellen. Da es keine Informationen gibt, ob T. brucei CTP de novo oder durch Verwertung von Cytidin oder Cytosin synthetisiert, war es bis jetzt nicht möglich, Wirkstoffe zu entwickeln, die auf der Kontrolle von CTP-Spiegeln basieren.
Zusammenfassung der vorliegenden Erfindung
Erfindungsgemäß wurde erstmals gezeigt, dass die Trypanosomen, anders als Säugerzellen, keinen Wiederverwertungsweg (Salvage Pathway) für die CTP-Synthese besitzen. Stattdessen wird CTP nur de novo synthetisiert. Die Erfindung betrifft daher die Verwendung eines CTP-Synthetaseinhibitors und einer Purinbase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytidin und/oder Hypoxanthin, und/oder eines Nukleosids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenosin, Guanosin und/oder Inosin, die dessen toxische Wirkung in vivo supprimieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer von parasitären Protozoen hervorgerufenen Krankheit, bei denen CTP de novo durch CTP-Synthetase synthetisiert wird. Vorzugsweise wird ein CTP-Synthetaseinhibitor in Form eines Glutaminanalogen verwendet, wobei die weitere Komponente verwendet werden kann, um dessen toxische Wirkungen zu supprimieren, die dem Patienten, dem das Medikament verabreicht wird, schaden könnten. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung erstmals ein nichttoxisches und kostengünstiges Medikament bereit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt NTP-Pools in T. brucei in verschiedenen Lebenszyklusstadien. In A) sind alle NTPs gezeigt, während in B) der Bereich, der die CTP-Pools zeigt, vergrößert wurde. Die Proben sind von procyclischen (PC), langgestreckten (LS), kurzen gedrungenen (SS) und in vitro kultivierten Blufformen (C). Die Abkürzung für jedes Stadium des Lebenszyklus (PC, LS, SS, C) steht unter dem entsprechenden Balken in B), und die gleiche Reihenfolge der Proben wird in A) verwendet. Die Werte sind als Relativwerte (in %) zum Gesamt-NTP-Pool (CTP + UTP + ATP + GTP) angegeben.
2 zeigt den Einbau von Tritiummarker in CTP, UTP und Nukleinsäuren. In A) ist der Einbau von Tritium in UTP (Dreiecke) und CTP (Quadrate) gezeigt, während in B) der Einbau von Marker in RNA + DNA (Quadrate) und nur DNA (Dreiecke) gezeigt ist.
3 zeigt die CTP-Pools nach 1 h Behandlung mit verschiedenen CTP-Synthetaseinhibitoren. Proben sind ohne Wirkstoff (Kontrolle) mit 25 und 100 μM DON (DON25 bzw. DON100), mit 100 μM Acivicin (Aci100) und mit 25 μM CPEC (CPEC25) gezeigt.
4 zeigt die Wirkung von DON (A) und Acivicin (B) auf die Proliferation von Trypanosomen. In A) wurden die Trypanosomen ohne Wirkstoff (Quadrate), mit 1 μM DON (Dreiecke) oder mit 5 μM DON (Karos) behandelt. In B) wurden die Trypanosomen ohne Wirkstoff (volle Quadrate), mit 1 μM Acevicin (Dreiecke), mit 5 μM Acivicin (Karos) oder mit 25 μM Acivicin (leere Quadrate) behandelt.
5 zeigt die Freisetzung nach 1 h Exposition mit 5 μM DON. Die Trypanosomen wurden 1 h mit DON behandelt und dann geerntet und in wirkstofffreiem Medium resuspendiert.
6 zeigt die Proliferation von BALG/c-Mäusefibroblasten mit zunehmenden DON-Konzentrationen in Abwesenheit (Quadrate) oder Gegenwart von 10 μM (Karos) oder 160 μM Hypoxanthin (Dreiecke). Der Proliferationsindex auf der Ordinate zeigt die relative Menge von Zellen im Vergleich mit der Probe ohne Wirkstoff.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Gemäß einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines CTP-Synthetaseinhibitors, insbesondere eines Glutaminanalogen, und einer Purinbase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytidin und/oder Hypoxanthin, und/oder eines Nukleosids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenosin, Guanosin und/oder Inosin, die dessen toxische Wirkung in vivo supprimieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer von parasitären Protozoen hervorgerufenen Krankheit. Wie später deutlich wird, wird die Hauptrolle des Glutaminanalogen darin gesehen, dass es bestimmte Schritte in der Nukleotidbiosynthese inhibiert.
Wie oben erwähnt, basiert die vorliegende Erfindung auf der Beobachtung, dass die Trypanosomen, anders als Säugerzellen, keinen Wiederverwertungsweg für die CTP-Synthese haben. Stattdessen wird CTP de novo synthetisiert. Säugerzellen sind bekanntermaßen vielseitiger, was den Nukleotidstoffwechsel betrifft, und sie sind in der Lage, sowohl Purinbasen als auch Pyrimidine de novo herzustellen. Die Wiederverwertungswege beinhalten Phosphoribosyltransferasen (für Adenin, Hypoxanthin, Guanin und Uracil) sowie Ribonukleosidkinasen (für Adenosin, Guanosin, Uridin und Cytidin). CTP kann sowohl durch Wiederverwertung von Cytidin als auch durch de novo-Biosynthese aus UTP erhalten werden. Die letztgenannte Reaktion wird durch CTP-Synthetase katalysiert.
Die Erfinder haben außerdem bereits beschrieben (Hofer, A., Ekanem, J. T. und Thelander, L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34098–34104), dass kultivierte T. brucei aus Blut im Vergleich mit den anderen NTP-Pools und anderen Zelltypen einen außergewöhnlich niedrigen CTP-Pool haben. In dieser Arbeit wurden die zwei Stadien im Säugerwirt und die procyclische Form untersucht, die das erste der drei Stadien in der Fliege ist. Die anderen Insektenformen können nur durch Sezieren der Tsetse-Fliegen erhalten werden.
Erfindungsgemäß wurde nun also bestätigt, dass auch T. brucei bei langgestreckten und kurzen gedrungenen, in Mäusen gezüchteten Trypanosomen einen außergewöhnlich niedrigen CTP-Pool besitzt. Es wird hier auch erstmals gezeigt, dass CTP nur de novo gebildet werden kann, und dass für den niedrigen CTP-Spiegel eine langsame Synthese und kein übermäßiger Abbau verantwortlich ist. All diese Beobachtungen haben die Erfinder zu CTP-Synthetase als interessantem Ziel für eine Chemotherapie geführt. Außerdem wurde bei Plasmodium falciparum gezeigt, dass Cytidinaufnahme und de novo-Purinsynthese fehlen, siehe Hassan, H. F. und Coombs, G. H. (1988): Purine and Pyrimidine metabolism in parasitic protozoa. FEMS Microbiol. Rev. 54, 47–84.
Wie oben erwähnt, ist der CTP-Synthetaseinhibitor ein funktionelles Analog, Derivat, Substitutionsprodukt, Isomer oder Homolog der Aminosäure Glutamin, die die Eigenschaft von Glutamin, an CTP-Synthetase zu binden, beibehalten. Der Begriff "Glutaminanalog" soll daher jedes der oben erwähnten beinhalten. Die Herstellung von erfindungsgemäßen Glutaminanalogen erfolgt nach üblichen, dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannten Verfahren, siehe beispielsweise die nachfolgend im Zusammenhang mit bestimmten Ausführungsformen genannten Literaturstellen oder Standardliteraturstellen.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist der CTP-Synthetaseinhibitor ein Norleucinderivat, wie 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON). DON ist ein Glutaminanalog, das ein breites Spektrum von Reaktionen inhibiert, die Glutamin erfordern, wenngleich die Hauptwirkung diejenige auf die de novo-Purinbiosynthese und die CTP-Synthetase in Säugerzellen zu sein scheint (Lyons, S. D., Sant, M. E., Christopherson, R. I. (1990) J. Biol. Chem. 265, 11377–11381). Es hemmt die Proliferation und hat als Mittel gegen Krebs umfangreiche klinische Versuche durchlaufen (Übersicht bei Catane, R., Von Hoff, D. D., Glaubiger, D. L. und Muggia, F. M. (1979) Cancer Treat. Rep. 63, 1033–1038; und Ahluwalia, G. S., Grem, J. L., Hao, Z. und Cooney, D. A. (1990) Pharmacol. Ther. 46, 243–271). US-Patent 2,965,634 betrifft Norleucinderivate, wie DON, und ein Verfahren zu deren Herstellung. Die dort als Beispiel genannte Verwendung basiert auf den phytotoxischen Eigenschaften, z. B. als Herbizide oder Unkrautvernichtungsmittel. Es wird nichts erwähnt, was den Fachmann auf diesem Gebiet dazu führen würde, die Verwendung von Norleucinderivaten in Medikamenten in Betracht zu ziehen. Die vorliegende Erfindung offenbart daher erstmals die Verwendung von DON bei der Behandlung von klinischen Zuständen, die von Protozoenpathogenen hervorgerufen werden. Wie weiter unten im experimentellen Teil gezeigt, hemmte bereits 1 μM DON die Trypanosomenproliferation vollständig, und es senkte selektiv den CTP-Spiegel in T. brucei, ohne die UTP-, ATP- oder GTP-Spiegel zu beeinträchtigen.
Bei einer alternativen Ausführungsform ist der CTP-Inhibitor Acivicin. Ähnlich DON wurde Acivicin zur Verwendung als wirksamer Bestandteil in einer herbiziden Zusammensetzung vorgeschlagen, siehe z. B. US-Patent 5,489,562 .
Zur Bereitstellung eines effizienten Medikaments zur Verwendung bei Behandlungsschemata sollten toxische Wirkungen des CTP-Synthetaseinhibitors, wie oben erwähnt, durch Verwendung einer geeigneteh Nukleobase, wie einer Purinbase oder eines Nukleosids, supprimiert werden. Bei Säugerzellen ist beispielsweise bekannt, dass DON auch die de novo-Purinbiosynthese beeinträchtigt, ein Weg, der bei Trypanosomen fehlt. Erfindungsgemäß ist dies das Hauptziel des Wirkstoffs bei Mäusefibroblasten in Gewebekultur. Ohne Purine im Kulturmedium erfolgte bei 1–2 μM eine vollständige Hemmung der Proliferation. Im nachfolgenden experimentellen Teil wird jedoch gezeigt, dass die Zugabe der Purinbase Hypoxanthin die DON-Konzentration, die zur Proliferationshemmung benötigt wird, auf mehr als 20 μM erhöht. Cytidin hatte keine derartige Wirkung. Dementsprechend scheint die beste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Kombinationstherapie mit DON und Hypoxanthin zu sein.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform ist die Purinbase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und/oder Hypoxanthin. Da Nukleoside jedoch bei Verabreichung in Zucker und Purinbase gespalten werden, wird bei einer alternativen Ausführungsform ein Nukleosid als die Komponente verwendet, die die toxischen Nebenwirkungen des verwendeten Glutaminanalogen supprimiert. Die Purinbase wird dann also bei der Herstellung mittels eines Nukleosids, z. B. Adenosin, Guanosin oder Inosin, bereitgestellt. Die Herstellung von Purinen und Nukleosiden ist dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt und kann nach irgendeinem üblichen Verfahren erfolgen, siehe z. B. die US-Patente 6,017,736 , 5,792,868 und 5,688,947 .
Die vorliegende Verwendung betrifft vorzugsweise ein Medikament zur Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malaria, Leishmaniose und Trypanosomiasis, z. B. Amerikanische Trypanosomiasis (Chagas-Krankheit) oder Afrikanische Trypanosomiasis (Afrikanische Schlafkrankheit).
Gemäß einem zweiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Prävention einer von einem parasitären Protozoon hervorgerufenen Krankheit, die einen CTP-Synthetaseinhibitor und eine Purinbase zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls anderen Hilfsstoffen umfasst.
Die vorliegende pharmazeutische Zusammensetzung wird im Wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt. Der CTP-Synthetaseinhibitor ist also ein Glutaminanalog, wie 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) oder Acivicin, während die Purinbase ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und/oder Hypoxanthin. In einer besonderen Ausführungsform wird die Purinbase in der Zusammensetzung mittels eines Nukleosids, z. B. Adenosin, Guanosin und Inosin, oder eines funktionellen Äquivalents oder Derivats davon bereitgestellt, das in der Lage ist, toxische Wirkungen eines Glutaminanalogen zu inhibieren.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann als eine einzige Zusammensetzung bereitgestellt werden, in der die Komponenten in einer Mischung in dem Träger vorliegen. Alternativ kann die Zusammensetzung in Form eines Kits angeboten werden, in dem die Komponenten als getrennte Einheiten zur im Wesentlichen gleichzeitigen Verabreichung an den Patienten vorliegen. Die Wahl der Form hängt von den gegebenen Umständen und den praktischen Erwägungen des Fachmanns auf diesem Gebiet ab.
Es ist möglich, die erfindungsgemäßen Wirkstoffe allein in Lösung zu verabreichen. In der bevorzugten Ausführungsform werden der oder die Wirkstoffe jedoch in einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert. Die vorliegende Zusammensetzung umfasst wenigstens einen Wirkstoff (CTP-Synthetaseinhibitor, eine Nukleobase wie ein Purin oder ein Nukleosid) zusammen mit ein oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern und/oder anderen therapeutischen Mitteln. Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet "verträglich" kompatibel mit anderen Komponenten der Formulierung und unschädlich für den Patienten oder die Wirtszelle. Diese Träger beinhalten solche, die dem Praktiker auf diesem Gebiet als zur oralen, rektalen, nasalen, topischen, bukkalen, sublingualen, vaginalen oder parenteralen (einschließlich subkutaner, intramuskulärer, intravenöser und intradermaler) Verabreichung bekannt sind, wobei intravenöse oder orale Verabreichung bevorzugt sind. Spezielle Träger, die sich zur Verwendung bei der Erfindung eignen, sind dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt und können wie nachfolgend genannt sein.
Die vorliegende Zusammensetzung kann oral in flüssiger Form oder in Tablettenform verabreicht werden und kann ein oder mehreres des Folgenden beinhalten: Laktose (wasserhaltig, "fast flow"), mikrokristalline Cellulose, kolloidales Siliciumdioxid, Croscarmellose-Natrium, Magnesiumstearat, Stearinsäure und andere Hilfsstoffe, Farbstoffe und pharmakologisch kompatible Träger. Da die vorliegende Zusammensetzung in sauren Medien instabil ist, muss dem sauren Milieu im Magen bei Verwendung oraler Dosierungsformen Rechnung getragen werden, um eine Freisetzung im Darm zu ermöglichen. Die vorliegende Zusammensetzung kann daher auch zusammen mit einem geeigneten Puffer wie Bicarbonat eingenommen werden. Alternativ kann sie mit einem magensaftresistenten Überzug beschichtet sein. Eine Isolierung des Wirkstoffs vor der Säure des magensaftresistenten Überzugs kann ebenfalls stattfinden, beispielsweise durch Verwendung einer Isolierschicht. Die Herstellung von magensaftresistenten Überzügen ist dem Fachmann auf diesem Gebiet allgemein bekannt. Zusammensetzungen zur oralen Verwendung können Patienten im Zustand des Fastens und des Nichtfastens verabreicht werden.
Bei Formulierung zur parenteralen Verabreichung, kann die vorliegende Zusammensetzung wässrige und nichtwässrige isotonische sterile Injektionslösungen beinhalten, die Antioxidanzien, Puffer, Bakteriostatika und gelöste Stoffe enthalten können, die den oder die Wirkstoffe isotonisch mit dem Blut des vorgesehenen Empfängers machen; und wässrige und nichtwässrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel enthalten können. Wie oben ausgeführt, kann die Zusammensetzung in verschlossenen Behältnissen für Ein- oder Mehrfachdosierungen angeboten werden, beispielsweise Ampullen und Fläschchen, und kann in einem gefriergetrockneten (lyophilisierten) Zustand aufbewahrt werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor Verwendung erfordert, beispielsweise Wasser für Injektionen. Injektionslösungen und Suspensionen können augenblicklich aus sterilen Pulvern, Granulaten und Tabletten der zuvor beschriebenen Art hergestellt werden.
Die Dosen müssen entsprechend dem zu behandelnden Zustand und dem Alter, Körpergewicht usw. des Patienten modifiziert werden. Geeignete Dosen werden für jeden speziellen Fall vom verantwortlichen medizinischen Praktiker bestimmt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung wird zur Verwendung bei der Behandlung und/oder Prävention einer Krankheit formuliert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malaria, Leishmaniose und Trypanosomiasis, z. B. Amerikanische Trypanosomiasis (Chagas-Krankheit) oder Afrikanische Trypanosomiasis (Afrikanische Schlafkrankheit).
Es wird ein Modellsystem bereitgestellt, aber nicht beansprucht, das rekombinante T. brucei umfasst, in die ein induzierbarer Promotor zur Kontrolle des CTP-Synthetasegens eingebaut wurde, um Lipide, Membranen und Markerproteine in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus von T. brucei zu untersuchen. Solche Untersuchungen sind beispielsweise für zukünftige Wirkstoffentwicklungen nützlich, da noch nicht genau bekannt ist, welcher Mechanismus bei Trypanosomen die drastischen Änderungen in Morphologie und Metabolismus auslöst, wenn sie zwischen verschiedenen Stadien des Lebenszyklus wechseln. Bei diesen Änderungen besteht ein großer Bedarf an der Synthese von Lipiden. Trypanosomen haben eine große mitochondrienartige, als Kinetoplast bezeichnete Organelle, deren Größe und Menge an Cristae dramatisch zunimmt, wenn sich die Trypanosomen von Blutformen zu procyclischen Insektenformen entwickeln (Vickerman, 1985). Lipide werden sowohl für diesen Prozess als auch für die generelle Reorganisation der Plasmamembran benötigt, die die Entwicklung der Parasiten begleitet. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass der CTP-Spiegel sehr niedrig ist, solange sich die Trypanosomen im Blut des Säugers befinden (etwa 0,5% des Gesamt-NTP-Pools). In der procyclischen Form, die das erste Entwicklungsstadium in der Fliege ist, ist der Spiegel jedoch viel höher (etwa 4% des Gesamt-NTP-Pools). Möglicherweise wird die CTP-Synthese hochreguliert, um einem erhöhten Bedarf an Lipiden nachzukommen. In vielen Systemen wurde gezeigt, dass CTP eine Schlüsselrolle bei der Regulation der Lipidsynthese spielt (Vance, D. E., Trip, E. M. und Paddon, H. M. (1980) J. Biol. Chem. 255, 1064–1069; und Lopez, G. C. und Wurtman, R. I. (1992) J. Neurochem. 59, 338–343).
Die Erfinder haben bereits gezeigt (Hofer, A., Ekanem, J. T. und Thelander, L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34098–34104), dass die niedrigen CTP- und CDP-Pools nicht zu einem niedrigen dCTP-Pool in der kultivierten Blutform führten, was impliziert, dass Ribonukleotidreduktase die niedrigen Cytidinnukleotid-Pools kompensieren könnte. Bei den langgestreckten, aus Mäusen isolierten Formen ist der dCTP-Pool jedoch ebenfalls niedrig. Die CTP-Pools (und vermutlich die CDP-Pools) scheinen unter dem Spiegel zu liegen, der durch Ribonukleotidreduktase kompensiert werden kann. Dass der dCTP-Pool bei der kurzen gedrungenen Form niedrig ist, ist weniger überraschend, da diese nicht proliferiert.
Dementsprechend muss man wissen, wie es den Parasiten gelingt, ihren CTP-Spiegel nahezu zu verzehnfachen, wenn sie sich von den Blutformen in die Insektenformen umwandeln. Die vorliegende Erfindung zeigt, dass die einzige Möglichkeit für Trypanosomen, zumindest die kultivierten Blutformen, CTP herzustellen, eine de novo-Synthese ist, und dass die Regulation des CTP-Pools eher durch Synthese als durch Abbau von CTP erfolgt. All diese Hinweise deuten auf CTP-Synthetase als den Hauptakteur bei der Regulation des CTP-Spiegels hin. Das vorliegende Modellsystem wird bereitgestellt, um die CTP-Synthetase in T. brucei unter einen induzierbaren Promotor stellen zu können, um beobachten zu können, was bei Induktion mit Lipiden, Membranen und Markerproteinen in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus geschieht.
Ausführliche Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die NTP-Pools bei T. brucei in verschiedenen Lebenszyklusstadien. In A) sind alle NTPs gezeigt, während in B) die Region, die die CTP-Pools zeigt, vergrößert wurde. Der CTP-Peak besteht sowohl aus CTP als auch aus dCTP. Der Teil, der dCTP darstellt, ist durch schwarze Farbe gekennzeichnet. Die Proben stammen von procyclischen (PC), langgestreckten (LS), kurzen gedrungenen (SS) und in vitro kultivierten Blutformen (C). Die Abkürzungen für jedes Stadium des Lebenszyklus (PC, LS, SS, C) steht unter dem entsprechenden Balken in B), und die gleiche Reihenfolge der Proben wird in. A) verwendet. Alle Werte sind Mittelwerte mit Standardabweichungen, die durch Fehlerbalken angegeben sind, außer dem C-Wert, der ein Mittelwert von 19 Versuchen ist, und den dCTP-Spiegeln der langgestreckten und kurzen gedrungenen Formen, die Einzelmessungen sind. Die Werte sind als Relativwerte (in %) zum Gesamt-NTP-Pool (CTP + UTP + ATP + GTP) dargestellt. Obwohl es also scheint, dass die UTP-, ATP- und GTP-Pools in allen Formen des Parasiten ähnlich sind, ist der CTP-Pool (besser zu sehen in 1B) in der procyclischen Form (PC) viel höher als in den Säugerformen (LS, SS, C). Die in Mäusen gezogenen Trypanosomen (langgestreckte, LS, und kurze gedrungene, SS, Formen) haben sogar noch niedrigere CTP-Spiegel als die kultivierten Blutformen (C).
2 zeigt den Einbau von Tritiummarker in CTP, UTP und Nukleinsäure. 200 ml Trypanosomen wurden durch Zentrifugation gesammelt und in 20 ml Medium resuspendiert. Nach 30 min Vorinkubation unter normalen Wachstumsbedingungen wurde ihnen tritiiertes Uracil gegeben und sie wurden zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt. In A) ist der Einbau von Tritium in UTP (Dreiecke) und CTP (Quadrate) gezeigt. Die Werte sind als spezifische Aktivität aufgetragen (DPM/nmol von jedem Nukleotid). Es scheint, dass Tritium nicht nur in den UTP-, sondern auch den CTP-Pool eingebaut wurde. In B) ist der Einbau von Marker in RNA + DNA (Quadrate) und nur DNA (Dreiecke) gezeigt. In diesem Fall sind absolute Werte gezeigt (DPM).
3 zeigt die CTP-Pools nach 1 h Behandlung mit verschiedenen CTP-Synthetaseinhibitoren. Es sind Proben ohne Wirkstoff (Kontrolle), mit 25 und 100 μM DON (DON25 bzw. DON100), mit 100 μM Acivicin (Aci100) und mit 25 μM CPEC (CPEC25) gezeigt. Die Einheit auf der Ordinate ist die gleiche wie in 1. Die Kontrolle ist ein Mittelwert aus zwei Versuchen, während die anderen Einzelmessungen sind.
4 zeigt die Wirkung von DON (A) und Acivicin (B) auf die Trypanosomenproliferation. In A) wurden die Trypanosomen ohne Wirkstoff (Quadrate), mit 1 μM DON (Dreiecke) oder mit 5 μM DON (Karos) behandelt. In (B) wurden die Trypanosomen ohne Wirkstoff (volle Quadrate), mit 1 μM Acivicin (Dreiecke), mit 5 μM Acivicin (Karos) oder mit 25 μM Acivicin (leere Quadrate) behandelt. Die Anzahl an Trypanosomen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Exposition mit dem Wirkstoff bestimmt. Es scheint, dass sowohl DON als auch Acivicin sehr aktiv waren.
5 zeigt die Freisetzung nach 1 h Exposition mit 5 μM DON. Die Trypanosomen wurden 1 h mit DON behandelt und dann geerntet und in wirkstofffreiem Medium resuspendiert. Die Anzahl an Trypanosomen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten nach Beginn der Freisetzung gezählt (Dreiecke). Es wurde ein Kontrollversuch durchgeführt, bei dem die Trypanosomen nicht DON, exponiert wurden, aber ansonsten genau wie die wirkstoffbehandelten Trypanosomen behandelt wurden (Quadrate). Jeder Punkt ist ein Mittelwert aus zwei Versuchen, wobei die Standardabweichung durch Fehlerbalken angegeben ist.
6 zeigt die Proliferation von BALG/c-Fibroblasten mit zunehmenden DON-Konzentrationen in Abwesenheit (Quadrate) oder Gegenwart von 10 μM (Karos) oder 160 μM Hypoxanthin (Dreiecke). Die Fibroblasten wurden in so geringer Dichte ausgesät, dass sie innerhalb von drei Tagen nicht konfluent werden konnten. Wenn sie sich auf den Platten angesiedelt hatten, erfolgte eine Exposition mit den Wirkstoffen, und sie wurden drei Tage lang stehen gelassen. An diesem Punkt wurde die Menge der Zellen indirekt mit einem Verfahren gezählt, das nachfolgend im Abschnitt "Material und Methoden" beschrieben wird. Der Proliferationsindex auf der Ordinate zeigt die relative Menge an Zellen im Vergleich mit der Probe ohne Wirkstoff.
EXPERIMENTELLER TEIL
Nachfolgend wird die Erfindung mit Hilfe von Beispielen erläutert.
Material und Methoden
Behandlung von Trypanosomen und Säugerzellen
Blutformen des Klons der pleomorphen T. brucei brucei-Variante AnTat 1.1 (Van Meirvenne, N. Janssens, P. G. und Magnus, E. (1975) Ann. Soc. Beige Med. Trop. 55, 1–23) wurden in NMRI-Mäusen gezogen. Langgestreckte Trypanosomen wurden an Tag 3 nach Injektion und kurze gedrungene Trypanosomen an Tag 5 nach Injektion durch DEAE-Cellulosechromatografie aus Blut gereinigt (Lanham, S. M. und Godfrey, D. G. (1970) Exp. Parasitl. 28, 521–534). Die Trypanosomen wurden durch Durchflusszytometrie als langgestreckte Formen (33–35% waren in S-Phase) und kurze gedrungene Formen (nur 6–7% waren in S-Phase) bestätigt.
Procyclische Insektenformen von T. brucei AnTat 1.1 wurden in SDM-79-Medium (Brun, R. und Schoenenberger, M. (1979) Acta Trop. 36, 289–292), das mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum supplementiert war, bei 27°C kultiviert. Kulturadaptierte Blutformen der T. brucei brucei-Zelllinie TC221 (Hirumi, H. Hirumi, K., Doyle, J. J. und Cross, G. A. M. (1980) Parasitology 80, 371–382) wurden in Hirumis modifiziertem Iscove-Medium-9 (Hirumi, H. und Hirumi, K. (1989) J. Parasitology75, 985–989), das mit 5% fötalem Rinderserum supplementiert war, in einer Feuchtatmosphäre mit 7% CO₂ bei 37°C vermehrt. Die kultivierten Parasiten wurden in der späten logarithmischen Wachstumsphase geerntet.
Balb/c-Mäusefibroblasten wurden als Monolager in Dulbeccos modifiziertem Eagles-Medium (Sigma), das mit L-Glutamin (0,584 g/l) und 10% hitzeinaktiviertem Pferdeserum supplementiert war, in einer Feuchtatmosphäre mit 7% CO₂ bei 37°C kultiviert. Die Menge an Fibroblasten auf jeder Platte wurde mit einem Verfahren bestimmt, bei dem die zelthaltigen Platten mit PBS, pH 7,5, gewaschen wurden, die Zellen durch eine 10-minütige Inkubation mit 0,2 M NaOH bei 50°C aufgelöst wurden und dann die OD_260-310 gemessen wurde (Suttle, D. P. und Stark, G. R. (1979) J. Biol. Chem. 254, 4602–4607). Die Zellen wurden vor Konfluenz gesammelt.
Messung von NTP-Pools
1–3 × 10⁸ Trypanosomen wurden gesammelt und anschließend mit 500 μl eiskalter 0,6 M Trichloressigsäure (TCA), die mit 15 mM MgCl₂ supplementiert war, aufgebrochen. Die Trichloressigsäure wurde durch zwei Extraktionen mit 720 μl 1,1,2-Trichlortrifluorethan (78%)/Trioctylamin (22%) entfernt, und die wässrige Phase wurde aufbewahrt. 1/5 der Probe wurde in einem Speedvac (Savant) zur Trockne eingedampft, auf eine 4,6 × 125 mm-Partisphere SAX-Säule aufgetragen und mit 1,5 ml/min in 0,5 M Ammoniumphosphat, pH 3,4, enthaltend 2,5% Acetonitril über HPLC laufen gelassen. Das Verfahren ist in früheren Arbeiten der Erfinder näher erläutert, siehe Hofer, A., Ekanem, J. T. und Thelander, L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34098–34104. Die Kopplung der HPLC an einen Flow Scintillation Analyzer (Radiomatic 150 TR, Packard) macht es möglich, die Radioaktivität in den chromatografischen Peaks zu prüfen. Für die Radioaktivitätsmessungen wurde üblicherweise die gesamte Probe auf die Säule geladen. Die Nukleotide wurden durch Messung der Peakhöhen und Vergleich mit einer Eichkurve quantifiziert. Desoxyribonukleotide wurden auf einer Boronatsäule von Ribonukleotiden abgetrennt, bevor sie mittels Partisphere SAX-Chromatografie analysiert wurden.
Bestimmung des Gehalts von Ribonukleosiden und Nukleobasen im Kulturmedium
Die Probe (200 μl Kulturmedium) wurde durch ein Nanosep 3 K-Filter (Pall Filtron Corporation) zentrifugiert, und verschiedene Mengen Probe wurden auf eine 4,6 × 150 mm-Discovery HPLC-Säule (Supelco) geladen und mit 1 ml/min in 10 mM Ammoniumphosphat, pH 3,4, über HPLC laufen gelassen. Die Peaks wurden über ihr A260/A280 und mittels der Retentionszeiten von Standardnukleosiden und -basen, die mit dem Kulturmedium vermischt waren, identifiziert. Die Ribonukleoside und Basen wurden durch Messung der Peakhöhen und deren Vergleich mit einer Eichkurve quantifiziert.
Umwandlung von tritiiertem Uracil in UTP, CTP, Cvtidin, Uridin, RNA und DNA
200 ml Trypanosomen in logarithmischer Wachstumsphase (~0,5–1 × 10⁶ Trypanosomen/ml) wurden durch Zentrifugation gesammelt (2 min bei 3000 Upm) und in 20 ml Kulturmedium resuspendiert. Nach 30 min Vorinkubation bei 37°C und 7% CO₂ wurde ihnen eine Endkonzentration von 0,13 μM 39 Ci/mmol [5,6-3H]-Uracil (Moravek Biochemicals Inc.) gegeben und es wurde unterschiedlich lang inkubiert. Ein ähnliches Experiment wurde auch mit einer Endkonzentration von 0,34 μM 14,7 Ci/mmol [6-3H]-Cytosin oder 0,22 μM 22,9 Ci/mmol [5-3H(N)]-Cytidin versucht. Radioaktivität in den UTP-, CTP-, Cytidin- und Uridin-Pools wurde mittels einer an einen Flow Scintillation Analyzer gekoppelten HPLC bestimmt (siehe oben). Das durch TCA präzipitierte Material wurde in 0,56 M NaOH gelöst und über Nacht bei 37°C inkubiert. Szintillationszählung dieses Materials ergab die Gesamtmenge an Radioaktivität in Nukleinsäuren (RNA + DNA). Die Menge an Radioaktivität in DNA konnte durch TCA-Präzipitation und Sammeln auf Glasfiltern wie bereits beschrieben erhalten werden (Nicander, B. und Reichard, P. (1985) J. Biol. Chem. 260, 5376–5381).
Wirkstofftests
6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON), Acivicin und Azaserin wurden von Sigma bezogen. Sie wurden in Wasser gelöst und als 5 mM-Lösungen bei –20°C aufbewahrt. Cyclopentenylcytosin war ein freundliches Geschenk von Grant McClarty am Dept. of Medical Microbiology, University of Manitoba, 730 William Ave, Winnipeg, Manitoba R3E OW3, Canada. Es wurde als 50 mM-Lösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) bei 4°C aufbewahrt. Die Endkonzentration an DMSO im Wachstumsmedium der Trypanosomen war nie höher als 0,5%, und dies hatte keine Wirkung auf die NTP-Pools oder die Proliferation der Parasiten.
Ergebnisse
Bestimmung von NTP-Pools in verschiedenen Stadien des Lebenszyklus von T. brucei
Es sollte getestet werden, ob der früher von den Erfindern für kultivierte Blutformen beschriebene niedrige CTP-Spiegel (Hofer, A., Ekanem, J. T. und Thelander, L. (1998) J. Biol. Chem. 273, 34098–34104) auch in vivo gilt. Daher wurden die NTP-Pools in Ianggestreckten und kurzen gedrungenen Trypanosomen getestet, die in Mäusen gezogen worden waren. Die procyclische Form, die eines der Stadien in der Tsetse-Fliege ist, wurde ebenfalls aufgenommen, um zu sehen, ob die CTP-Konzentration in allen Lebenszyklusstadien niedrig ist oder ob sie möglicherweise am Umschalten zwischen den Lebenszyklusstadien beteiligt ist. Wie in 1A zu sehen, sind die UTP-, ATP- und GTP-Pools in allen Formen des Parasiten ähnlich. Der CTP-Pool (besser zu sehen in 1B) in der procyclischen Form (PC) ist jedoch viel höher als in den Säugerformen (LS, SS, C). Die in Mäusen gezogenen Trypanosomen (langgestreckte, LS, und kurze gedrungene, SS, Formen) haben sogar noch niedrigere CTP-Pools als die kultivierten Blutformen (C). Der dCTP-Pool wurde ebenfalls geprüft, und es wurde festgestellt, dass er in der Insektenform und der kultivierten Blutform ähnlich war, während die beiden aus Mäusen gereinigten Formen ebenfalls niedrige dCTP-Pools hatten.
Umsatz des CTP-Pools
Es sollte untersucht werden, warum der CTP-Pool in Trypanosomen so niedrig ist. Dies konnte entweder eine Folge mangelnder Synthese oder exzessiven Abbaus von CTP sein. In anderen Systemen kann CTP entweder de novo aus UTP oder durch Wiederverwertung von Cytidin synthetisiert werden. In einigen Organismen, wie Giaradia lamblia, kann auch Cytosin wiederverwertet werden (Aldritt, S. M., Tien, P. und Wang, S. S. (1985) J. Exp. Med. 161, 437–445). Wenn den Trypanosomen bis zu 15 mM Cytidin oder 1 mM Cytosin gegeben wurde und sie 1 h später geerntet wurden, war keine Änderung in der Größe des CTP-Pools zu entdecken. Ähnlich konnte, wenn den Trypanosomen tritiiertes Cytidin oder Cytosin gegeben wurde, kein Marker im CTP-Pool nachgewiesen werden. Durch HPLC-Chromatografie wurde bestätigt, dass das zugegebene Cytidin während der Inkubation nicht durch Cytidindeaminase im Serum zu Uridin abgebaut wurde. Es scheint daher in T. brucei keine Wiederverwertung von Cytidin oder Cytosin zu geben. Dann wurde der de novo-Weg getestet. Den Trypanosomen wurde tritiiertes Uracil gegeben, und sie wurden nach verschiedenen Inkubationszeiten geerntet. Tritium war nicht nur in den UTP-Pool, sondern auch in den CTP-Pool eingebaut (2A). Daraus wurde daher geschlossen, dass die Trypanosomen einen de novo-Syntheseweg für CTP besitzen. Die Akkumulation von Marker im UTP-Pool war rasch und nach 5 min nahezu gesättigt, während der CTP-Pool mit einer viel langsameren Geschwindigkeit markiert wurde. Dies wies darauf hin, dass für den niedrigen CTP-Spiegel eine langsame de novo-Synthese verantwortlich sein könnte. Es sollte auch untersucht werden, ob die Größe des CTP-Pools durch eine hohe Abbaugeschwindigkeit von CTP kontolliert wird. Daher wurde der Marker in zwei Abbauprodukten des CTP-Katabolismus, Cytidin und Uridin, durch HPLC-Chromatografie geprüft. In diesen Peaks konnte überhaupt keine Radioaktivität nachgewiesen werden. Im Gegensatz dazu wurde in Nukleinsäuren leicht Marker eingebaut (26). Unter Berücksichtigung der Nachweisgrenze von markiertem Cytidin und Uridin bei der vorliegenden Analyse lässt sich schließen, dass wenigstens 95% des CTP in den Trypanosomen zur RNA- und DNA-Synthese verwendet werden. Ein rascher Abbau ist daher nicht für den niedrigen CTP-Pool in T. brucei verantwortlich.
Test von CTP-Synthetaseinhibitoren
Die absolute Abhängigkeit der CTP-Produktion von der de novo-Synthese könnte für chemotherapeutische Zwecke genutzt werden, da der Wirt durch Cytidin gerettet werden kann. Es gibt zwei Hauptklassen von Verbindungen, die CTP-Synthetase inhibieren, Nukleosidanaloge und Glutaminanaloge. Ein Nukleosidanalog, Cyclopentenylcytosin (CPEC), und zwei Glutaminanaloge, 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) und Acivicin, wurden getestet, und es wurde beobachtet, wie sich der CTP-Pool während der einstündigen Inkubationsdauer änderte (3). CPEC hatte keine Wirkung, während sowohl DON als auch Acivicin den CTP-Pool senkten. Acivicin war weniger spezifisch als DON, da auch der GTP-Pool um 50% reduziert wurde (in der Figur nicht gezeigt). Als Nächstes wurde die Wirkung der Wirkstoffe auf das Trypanosomenwachstum untersucht. DON und Acivicin waren beide sehr wirksam (4A bzw. 4B), insbesondere DON, das Proliferation bereits in einer Konzentration von 1 μM vollständig hemmte. Wie erwartet, hatte CPEC (250 μM) auch bei diesem Versuch keine Wirkung (Daten nicht gezeigt). Cytidin (bis 5 mM) oder Cytosin (1 mM) konnten die Trypanosomen nicht aus der durch DON hervorgerufenen Proliferationshemmung retten, ein logisches Ergebnis, da bereits gezeigt wurde, dass T. brucei Cytidin oder Cytosin nicht wiederverwerten kann.
DON ist im Blut nicht stabil und hat im Menschen nur eine Halbwertszeit von wenigen Stunden (Kovach, J. S., Eagan, R. T., Pawis, G., Rubin, J., Creagan, E. T. und Moertel, C. G. (1981) Cancer Treat. Rep. 65, 1031–1036; Rahman, A., Luc, V., Smith, F. P., Vrown, J., Schein, P. S. und Woolley, P. V. (1981); und Sullivan, M. P., Nelson, J. A., Feldman, S. und Nguyen, B. V. (1988) Cancer Chemother. Pharmac. 21, 78–84). Daher wurde getestet, wie lange die Wirkung eines kurzen DON-Pulses auf die Trypanosomenproliferation dauert. In 5 wurden die Trypanosomen 1 h mit 5 μM DON behandelt. Nach der Inkubation wurden die Trypanosomen durch Zentrifugation gesammelt, das Pellet wurde mit Medium, das kein DON enthielt, gewaschen und im gleichen Medium resuspendiert, und die Trypanosomen wurden zurück in den Inkubator gegeben. Die Menge an Trypanosomen wurde während der Inkubation kontinuierlich aufgezeichnet. Kontrolltrypanosomen wurden in gleicher Weise behandelt, außer dass die einstündige Inkubation ohne DON erfolgte. Wie aus der Figur zu sehen ist, hielt die Wirkung der einstündigen Inkubation mit DON etwa 20 h an, bevor die Trypanosomen wieder zu proliferieren begannen.
Kombination von DON und Hypoxanthin
Die Wirkung von DON auf Trypanosomen und Säugerzellen wurde wie folgt verglichen. In 6 ist gezeigt, dass DON eine tiefgreifende Wirkung auf die Proliferation von Zellen hat, da bereits bei 1–2 μM eine maximale Inhibierung erfolgt. An diesem Punkt ist die Menge der Zellen nach 72 h etwa die gleiche wie vor der Inkubation mit DON (Daten nicht gezeigt). Während der dreitägigen Inkubation erfolgte also keine Proliferation. Eine noch höhere DON-Konzentration senkt die Zellmenge nicht weiter. Die restlichen Zellen zeigen jedoch eine seltsame Morphologie und sind offensichtlich krank. Es musste daher untersucht werden, ob die antiproliferative Wirkung auf Säugerzellen unter Erhalt der trypanoziden Wirkung aufgehoben werden konnte oder nicht. Bei Säugerzellen ist DON ein starker Inhibitor der de novo-Purinbiosynthese. In 6 sind zwei Versuche enthalten, bei denen die Hemmung der de novo-Purinbiosynthese durch 10 bzw. 160 μM Hypoxanthin umgangen wurde. Hypoxanthin ist eine natürlich vorkommende Purinbase im Blut von Säugern. In Gegenwart von 160 μM Hypoxanthin war die DON-Konzentration, die zur Inhibierung der Proliferation benötigt wurde, etwa 20-mal höher als ohne Hypoxanthin. Bei 10 μm Hypoxanthin war die antiproliferative Wirkung von DON immer noch hoch, und als das Medium nach der Inkubation geprüft wurde, wurde gefunden, dass das Hypoxanthin bei dem Versuch verbraucht worden war. Dies bedeutet, dass 10 μM Hypoxanthin wahrscheinlich sogar eine noch höhere Wirkung haben, als in der Figur angegeben. Trypanosomen, die keine de novo-Purinsynthese haben, werden in allen vorliegenden Versuchen in Gegenwart von 160 μM Hypoxanthin gezüchtet.
Beispiel 1: Wirkung von 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON)
Um festzustellen, in welchem Umfang DON gegen Plasmodium falciparum, die Ursache von Malaria, wirkt, führte das Schweizer Tropeninstitut (Socinstraße 57, Postfach, CH, 4002 Basel, Schweiz) den vorliegenden Versuch entsprechend seinen verfügbaren Standardverfahren als kommerzielle Dienstleistung unter Geheimhaltung durch (für eine genaue Offenbarung des Verfahrens wird auf das Schweizer Tropeninstitut verwiesen). Der vorliegende Versuch erlaubt ferner einen Vergleich zwischen der Wirkung von DON sowohl auf Trypanosoma brucei rhodiense als auch auf Plasmodium falciparum.
Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Parasit IC50 (μM)

Trypanosoma brucei rhodiense 0,43

Plasmodium falciparum

-KI-Isolat 0,52

-NF54-Isolat 0,36
Wie aus Tabelle 1 deutlich wird, liegt die Wirkung von DON für die Behandlung von Malaria im gleichen vorteilhaften Bereich wie die für die Behandlung der Afrikanischen Schlafkrankheit.
DISKUSSION
Die absolute Abhängigkeit von T. brucei vom de novo-Syntheseweg für CTP ist für die Wirkstoffentwicklung vielversprechend. CTP-Synthetaseinhibitoren könnten zusammen mit Cytidin verwendet werden, das nur den Wirt retten würde, da es von den Trypanosomen nicht in CTP umgewandelt wird. Der spezifischste bekannte CTP-Synthetaseinhibitor ist Cyclopentenylcytosin (CPEC). Leider inhibierte CPEC die CTP-Synthese in T. brucei nicht. Es ist unwahrscheinlich, dass CPEC und andere Pyrimidinnukleosidanaloge in T. brucei zur aktiven Triphosphatform metabolisiert werden, da Uridin-(Hammond, D. J. und Gutteridge, W. E. (1982) Biochim. Biophys. Acta 718, 1–10) und Cytidinkinaseaktivität fehlen. Säugerzellen haben eine Cytidin-Uridin-Kinase, die äußer Cytidin und Uridin zahlreiche andere Pyrimidinnukleosidanaloge phosphoryliert (Cihak, A. und Rada, B. (1976) Neoplasma 23, 233–257).
CTP-Synthetase katalysiert den Transfer einer Aminogruppe von Glutamin auf UTP. Einige Glutaminanaloge, wie 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON), Acivicin und Azaserin, bilden kovalente Bindungen mit allen Arten von Glutaminaminotransferasen. Zu diesen gehören die Proteine, die an de novo-Purinbiosynthese (zwei Schritte auf dem Weg, der zu IMP und der GMP-Synthase führt), de novo-Pyrimidinbiosynthese (Carbamoyiphosphatsynthetase II und CTP-Synthetase), NAD-Biosynthese, Glykosaminbiosynthese und dem γ-Glutamylzyklus beteiligt sind (für einen Überblick siehe Ahluwalia, G. S., Grem, J. L., Hao, Z. und Cooney, D. A. (1990) Pharmacol. Ther. 46, 243–271). Es gibt jedoch große Unterschiede in der Spezifität zwischen verschiedenen Glutaminanalogen für die verschiedenen Aminotransferasen, und DON inhibiert in erster Linie CTP-Synthetase und de novo-Purinbiosynthese (bis IMP), während Acivicin CTP-Synthetase und GMP-Synthase inhibiert und Azaserin de novo-Purin (IMP)-Biosynthese in Säugerzellen inhibiert (Lyons, S. D., Sant, M. E., Christopherson, R. I. (1990) J. Biol. Chem. 265, 11377–11381). Die Spezifität dieser Analogen scheint in den Trypanosomen ähnlich wie in Säugerzellen zu sein, außer dass Trypanosomen eine de novo-Purinbiosynthese fehlt und sie daher gegenüber Wirkstoffen, die diesen Weg beeinträchtigen, unempfindlich sind. Azaserin hatte keine Wirkung auf die Trypanosomenproliferation (Daten nicht gezeigt), und DON änderte die Purin-NTP-Pools in den Trypanosomen nicht.
Viele Fakten für die Verwendung von DON gegen Schlafkrankheit sehen vielversprechend aus. Die Erfinder haben entdeckt, dass die wachstumsinhibierende Wirkung einer einstündigen DON-Exposition für 20 h anhält, bevor die Trypanosomen wieder zu proliferieren beginnen. Dies ist ein großer Vorteil, da klinische Versuche gezeigt haben, dass DON im menschlichen Blut eine Halbwertszeit von nur wenigen Stunden hat (Kovach, J. S., Eagan, R. T., Pawis, G., Rubin, J., Creagan, E. T. und Moertel, C. G. (1981) Cancer Treat. Rep. 65, 1031–1036; Rahman, A., Luc, V., Smith, F. P., Vrown, J., Schein, P. S. und Woolley, P. V. (1981); und Sullivan, M. P., Nelson, J. A., Feldman, S. und Nguyen, B. V. (1988) Cancer Chemother. Pharmac. 21, 78–84). Außerdem konnten die Erfinder die Proliferationshemmung bei Säugerzellen mit Hypoxanthin lindern. Es ist zu hoffen, dass eine Kombinationstherapie mit DON und Hypoxanthin einige der Nebenwirkungen, die mit DON verbunden sind, lindert. Da Hypoxanthin im Blut natürlich vorkommt, sind von dieser Verbindung keine schweren toxischen Wirkungen zu erwarten. Von Hypoxantin ist bekannt, dass es durch die Blut-Hirn-Schranke dringt (Cornford, E. M. und Oldendorf, W. H. (1975) Biochim. Biophys. Acta 394, 211–219; und Spector, R. (1987) Neurochem. Res. 12, 7791–796).

Claims

Verwendung eines CTP-Synthetaseinhibitors und einer Purinbase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin, Cytidin und/oder Hypoxanthin, und/oder eines Nucleosids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenosin, Guanosin und/oder Inosin, die dessen toxische Wirkungen in vivo supprimieren, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer von parasitären Protozoen hervorgerufenen Krankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der in vivo-Inhibitor von CTP-Synthetase in einem parasitären Protozoon 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der in vivo-Inhibitor von CTP-Synthetase in einem parasitären Protozoon Acivicin ist.
Verwendung nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malaria, Leishmaniose und Trypanosomiasis, z. B. Amerikanischer Trypanosomiasis (Chagas-Krankheit) oder Afrikanischer Trypanosomiasis (Schlafkrankheit).
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung und/oder Vorbeugung einer von parasitären Protozoen hervorgerufenen Krankheit, welche einen in vivo-Inhibitor von CTP-Synthetase in einem parasitären Protozoon und eine Purinbase, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenin, Guanin und/oder Hypoxanthin, und/oder ein Nucleosid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenosin, Guanosin und/oder Inosin, die dessen toxische Wirkungen supprimieren, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger und gegebenenfalls anderen Hilfsstoffen umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der in vivo-Inhibitor von CTP-Synthetase in einem parasitären Protozoon 6-Diazo-5-oxo-L-norleucin (DON) ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei der in vivo-Inhibitor von CTP-Synthetase in einem parasitären Protozoon Acivicin ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5–7, wobei die Komponenten als Single Unit als Mischung in dem Träger vorliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5–8, wobei die Komponenten in Form getrennter Einheiten zur im Wesentlichen gleichzeitigen Verabreichung an den Patienten vorliegen.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach irgendeinem der Ansprüche 5–9, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Malaria, Leishmaniose und Trypanosomiasis, z. B. Amerikanischer Trypanosomiasis (Chagas-Krankheit) oder Afrikanischer Trypanosomiasis (Schlafkrankheit).