DE3689221T2

DE3689221T2 - Hemmung der In-vitro-Infektivität und des zytopathischen Effektes von HTLV-III/LAV durch 2'3'-Dideoxycytidin.

Info

Publication number: DE3689221T2
Application number: DE86306495T
Authority: DE
Inventors: Samuel Broder; Hiroaki Mitsuya
Original assignee: US Department of Commerce
Current assignee: US Department of Commerce
Priority date: 1985-08-26
Filing date: 1986-08-21
Publication date: 1994-02-24
Anticipated expiration: 2006-08-22
Also published as: CA1277915C; DE3689221D1; EP0216511B1; HK67995A; IL79699A0; IE862264L; ATE96326T1; IL79699A; JPH0215524B2; NL940019I2; AU570855B2; NZ217184A; JPS62501777A; AU6284386A; EP0216511A2; NL940019I1; EP0216511A3; WO1987001283A1; IE63001B1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Hemmen einer In-Vitro-Infektivität und der zytopathischen Wirkung von HTLV-III/LAV durch 2',3'-Dideoxycytidin und dessen Mono- oder Triphosphaten.
Seit 1983 hat sich die Erkenntnis entwickelt, daß das HTLV- III-Virus das ätiologische Agens des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) und verwandter Krankheiten ist. Die Medizin ist gegenwärtig bemüht, Mittel zu finden, welche die Zerstörungen der Krankheit eindämmen. In Science (1983), Vol. 220, Seiten 506 bis 508, beschreibt Montagnier die Untersuchung und Isolation eines Agens, das danach als HTLV-III definiert wurde. In diesem Zusammenhang ist eine Anzahl von Patentanmeldungen unter Benennung von Robert C. Gallo als Miterfinder eingereicht worden; ein Patent wurde bereits erteilt, nämlich das US-Patent Nr. 4 520 113, das sich hauptsächlich auf den Nachweis von Antikörpern in den Seren von AIDS- und AIDS-Vorstufen-Patienten bezieht.
Die vorliegende Erfindung liegt jedoch in einem Verfahren zum Abschwächen der Wirkungen von HTLV-III durch das Zusammenbringen des Virus in Vitro mit einer besonderen Pyrimidin- Base, nämlich 2',3'-Dideoxycytidin und den verwandten Mono- und Triphosphaten dieser Base.
2',3'-Dideoxycytidin Die folgenden Fundstellen sind zur Bestimmung des Standes der Technik mit Bezug auf die vorliegende Erfindung relevant:
Furmanski u. a., "Inhibition by 2',3'-Dideoxythymidine of Retroviral Infection of Mouse and Human Cells", Cancer Letters, 8 : 307-315, 1980;
Wagar u. a., "Effects of 2',3'-Dideoxynucleosides on Mammalian Cells and Viruses", Jounal of Cellular Physiology, 121 : 402- 408 (1984);
Rosen u. a., "The Location of Cis-Acting Regulatory Sequences in the Human T Cell Lymphotropic Virus Type III (HTLV- III/LAV) Long Terminal Repeat", Cell, 41 : 813-823, Juli 1985;
Time, 12. August 1985, Seite 42 (Spalte 3).
Das US-Patent Nr. 4 434 788 für Nakataugawa zeigt die Verwendung von 3'-Deoxyguanosin und 3'-Deoxyuridin als Anti-Tumor- Mittel; und
das US-Patent Nr. 4 081 534 für Elion u. a. zeigt verschiedene Purin-Derivate, die gegen HSV verwendet werden.
Die Einzigartigkeit des HTLV-III-Virus und seiner Resistenz gegen Behandlung durch bekannte antivirale Mittel wurde in dem Magazin Time folgendermaßen beschrieben: "Die durch Haseltine von Harvard durchgeführte und in der Juli-Ausgabe der Zeitschrift Cell (Cell, 41 : 813-823, 1985) veröffentlichte Untersuchung ergibt, daß das Virus eine einzigartige genetische Komponente aufweist, die es sich selbst tausendmal schneller als alle anderen Virusarten reproduzieren läßt. Der Mechanismus dieser Reproduktion ist "einer der größten Effekte, die ich in der Biologie jemals gesehen habe", sagt Haseltine. "Er hilft erklären, warum AIDS eine so verheerende Krankheit ist und warum sie sich so schnell ausbreiten kann." In dem Prozeß wuchernder Replikation zerstört das AIDS-Virus seinen Wirt, die T-Zelle. Folglich ist es ein eigentümliches Merkmal dieser Krankheit, daß, während sie fortschreitet, die T-Helferzellen verschwinden und das Virus ebenfalls. Dann jedoch befindet sich der Patient bereits unweigerlich jenseits einer Genesungsmöglichkeit."
Man hat erkannt, daß die Chronizität der Infektion und die Neigung des Virus, das Gehirn zu infizieren, die Entwicklung neuer Klassen von Heilmitteln und Arzneien erforderlich macht, welche die Möglichkeit oraler Verabreichung bieten und die Fähigkeit des Hindurchdringens durch die Blut-Gehirn- Barriere haben. In dieser Untersuchung wurde die Fähigkeit von Purin und Pyrimidin-Nucleosid-Derivaten zum Hemmen der Infektivität und der zytopathischen Wirkung von HTLV-III/LAV in Vitro erforscht. Mit der Ribosehälfte des Moleküls in einer 2',3'-Dideoxy-Konfiguration unterdrückten die getesteten Pyrimidin-(Cytidin- und Thymidin-)Nucleoside das Virus, obwohl das Thymidin-Derivat beträchtlich weniger Aktivität zu haben scheint. Im allgemeinen wurde beobachtet, daß eine vollständige Unterdrückung des Virus bei Dosen auftritt, die 10- bis 20-fach niedriger als diejenigen sind, die zum Hemmen der Vermehrung der Target-T-Zellen und der Immunreaktivität normaler T-Zellen in Vitro notwendig sind. Eine Analyse von fünf Adenosin-Kongenern, die sich lediglich in der Zuckerhälfte unterschieden, zeigte, daß für eine antivirale Wirkung eine Verminderung (ein Fehlen von Hydroxyl-Determinanten) sowohl an den 2'- als auch 3'-Kohlenstoffen der Ribose notwendig war, und daß eine zusätzliche Verminderung am 5'-Kohlenstoff die antivirale Aktivität zunichte machte.
Dementsprechend sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von AIDS oder einer verwandten Krankheit, deren ätiologisches Agens HTLV-III ist, die Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von 2',3'-Dideoxycytidin oder eines Mono- oder Triphosphats hiervon vor, wobei diese therapeutisch wirksame Menge nicht ausreichend ist, um eine Vermehrung oder Immunreaktivität normaler T-Zellen zu unterbinden.
Fig. 1-a zeigt die zytopathische Wirkung von Target-T-Zellen.
Die Fig. 1-b bis 1-e zeigen die starke Schutzwirkung von 2', 3'-Dideoxynucleosiden auf das Überleben und das Wachstum von ATH8-Zellen, wenn sie HTLV-III/LAV ausgesetzt sind.
Fig. 2A zeigt ebenfalls die starke Schutzwirkung von 2',3'- Dideoxynucleosiden auf das Überleben und das Wachstum von ATH8-Zellen, wenn sie HTLV-III/LAV ausgesetzt sind.
Fig. 2B zeigt die Expression des HTLV-III/LAV-p24-gag-Proteins in H9-Zellen.
Fig. 2C zeigt den Schutz von ATH8-Zellen durch Adenosin-Kongener gegen die zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV.
In Fig. 1, welche das Überleben und das Wachstum von ATH8- Zellen in Anwesenheit von 2',3'-Dideoxynucleosiden zeigt, wenn sie HTLV-III LAV ausgesetzt sind, wurden 2 · 10&sup5; ATH8- Zellen mit Polybren behandelt, HTLV-IIIB ausgesetzt (2000 Viruspartikel/Zelle), in Kulturröhrchen resuspendiert und kultiviert (ausgefüllte Symbole) in a) Abwesenheit oder Anwesenheit von b) 50 uM 2',3'-Dideoxyadenosin (Calbiochem- Behring Corp., LaJolla, CA), c) 50 uM 2',3'-Dideoxyinosin (Calbiochem-Behring Corp.), d) 1 uM 2',3'-Dideoxycytidin (Calbiochem-Behring Corp.), and e) 500 uM 2',3'-Dideoxythymidin (P.L. Biochemicals Inc., Milwaukee, Wis.). Kontrollzellen wurden in gleicher Weise behandelt, aber nicht dem Virus ausgesetzt (nicht ausgefüllte Symbole). An verschiedenen Zeitpunkten wurden die gesamten lebensfähigen Zellen gezählt, wie im Beispiel 1 beschrieben.
In Fig. 2A, welche die Hemmung der zytopathischen Wirkung von HTLV-III/LAV durch 2',3'-Dideoxynucleoside gegen ATH8-Zellen zeigt, wurden 2 · 10&sup5; ATH8-Zellen mit Polybren vorbehandelt, in Kulturröhrchen HTLV-IIIB (2000 Virusteilchen/Zelle) ausgesetzt (ausgefüllte Säulen), und zwar in Anwesenheit bzw. Abwesenheit verschiedener Konzentrationen von 2',3'-Dideoxyadenosin, 2',3'-Dideoxyinosin, 2',3'-Dideoxyguanosin (P.L. Biochemicals Inc.), 2',3'-Dideoxycytidin, bzw. 2',3'- Dideoxythymidin. Kontrollzellen (nicht ausgefüllte Säulen) wurden in gleicher Weise behandelt, wurden aber dem Virus nicht ausgesetzt. Am Tag 5 wurden die gesamten lebensfähigen Zellen gezählt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
In Fig. 2B, welche die Hemmung der Infektivität und Replikation von HTLV-III/LAV in H9-Zellen durch 2',3'-Dideoxynucleoside zeigt, wurden 10&sup5; H9-Zellen verschiedenen Konzentrationen von 2',3'-Dideoxynucleosiden währen 4 Stunden ausgesetzt, dann während 30 Minuten 2 ug/ml Polybren ausgesetzt, pelletisiert, und HTLV-IIIB (3000 Virusteilchen/Zelle) während 1,5 Stunden ausgesetzt. Die Zellen wurden in frischem vollständigem Medium resuspendiert und in Röhrchen bei 37ºC in 5% CO&sub2;enthaltender angefeuchteter Luft kultiviert. Die Zellen wurden kontinuierlich den 2',3'-Dideoxynucleosiden ausgesetzt. An den Tagen 8 (links), 9 (Mitte), und 10 (rechts) der Kultur wurde der Prozentsatz der Target-H9-Zellen, die p24-gag-Protein von HTLV-III/LAV exprimieren, durch indirekte Immunofluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von monoklonalem Anti-HTLV-III/LAV-p24-Murin-Antikörper (von Dr. F. D. Veronese und Dr. R. C. Gallo geliefertes M26) bestimmt.
In Fig. 2C, die den Schutz von ATH8-Zellen durch Adenosin- Kongener gegen die zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV zeigt, wurden 2 · 10&sup5; ATH8-Zellen mit Polybren vorbehandelt, HTLV-IIIB (2000 Virusteilchen/Zelle) ausgesetzt, in Kulturröhrchen (ausgefüllte Säulen) in Anwesenheit bzw. Abwesenheit verschiedener Mengen von Adenosin-Kongenern resuspendiert: a) 2',3'-Dideoxyadenosin, b) 2'-Deoxyadenosin (Calbiochem- Behring Corp.), c) 3'-Deoxyadenosin (Cordycepin; Behringer- Mannheim GmbH, Westdeutschland), d) Adenosin-Arabinosid, und e) 2',3',5'-Trideoxyadenosin (beide von Dr. Johns, J. Driscoll und G. Milne geliefert). Die mit Hochstrich versehenen Zahlen a) beziehen sich auf die Positionen in der Zuckerhälfte. Kontrollzellen (nicht ausgefüllte Säulen) wurden dem Virus nicht ausgesetzt. Am Tag 5 wurden die gesamten lebensfähigen Zellen gezählt, wie im Beispiel 1 beschrieben.
In-dem System übt HTLV-III/LAV (als zellfreies Virus) bis zum Tag 4 der Kultur eine tiefgreifende zytopathische Wirkung auf die Target-T-Zellen aus. Bis zum Tag 10 werden 98% der Zellen durch das Virus abgetötet (Fig. 1-a). Das Abtöten von Zellen kann quantitativ als Funktion der Anfangsdosis des Virus (Tafel 1) beobachtet werden. Wenn ATH8-Zellen in einem 7- Tage-Versuch verwendet werden, stellen 5 Virusteilchen/Zelle die minimale zytopathische Dosis des Virus dar. In den unten berichteten Experimenten wurden 2000 bzw. 3000 Virusteilchen/Zelle verwendet, um verschiedene Verbindungen unter Bedingungen beträchtlichen Virusüberschusses zu testen.
Fig. 1 (b-e) und Fig. 2A zeigen die starke Schutzwirkung von 2',3'-Dideoxynucleosiden auf das Überleben und das Wachstum von ATH8-Zellen, wenn diese HTLV-III/LAV ausgesetzt sind. Es wurde herausgefunden, daß Konzentrationen von mehr als 0,5 uM von 2',3'-Dideoxycytidin die ATH8-Zellen vollständig schützte und ihr Überleben und Wachstum ermöglichte. Diese Verbindung zeigte eine starke antivirale Wirkung bei Dosen, die 10- bis 20-fach niedriger als diejenigen sind, die das Wachstum der Target-Zellen hemmten, wenn kein Virus vorhanden war. Bei den vorhandenen Versuchsbedingungen erforderte 2',3'-Dideoxythymidin verhältnismäßig hohe Konzentrationen, um eine Schutzwirkung auszuüben, und anders als die getesteten vergleichbaren Dideoxynucleoside war seine Fähigkeit zum Vernichten der zytopathischen Wirkung des Virus am Tag 10 der Kultur verloren (Fig. 1-e und Fig. 2A unten).
Diese antiviralen Wirkungen wurden in einem anderen System unter Verwendung der Expression des HTLV-III/LAV-p24-gag-Proteins in H9-Zellen bestätigt (Fig. 2B). Die H9-Zellen sind gegen die zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV verhältnismäßig resistent, und die den Aussetzen von HTLV-III/LAV-Virionen folgende p24-gag-Protein-Expression kann als Anzeige viraler Infektivität und Replikation in Vitro verwendet werden. Die 2',3'-Dideoxy-Derivate von Cytidin waren starke Hemmer einer Virusreplikation in dem System, während 2', 3'-Dideoxythymidin verhältnismäßig höhere Konzentrationen erforderte, um eine antivirale Wirkung zu vermitteln, und diese Verbindung ermöglichte eine Wiederaufnahme der Virusreplikation bis zum Tag 10 der Kultur (Fig. 2B unten).
Außerdem wurden die Wirkungen der verschiedenen 2',3'-Dideoxynucleoside auf die Antigen-spezifische und Lectin-induzierte Reaktivität normaler Lymphozyten in Vitro getestet (Tafel 2). Ein normales Klon (TM3) von Tetanus-Toxoid-spezifischen Helfer/Induktor-T-Zellen wurden zum Beobachten der Wirkungen der Verbindungen auf Antigen-hervorgerufene Aktivierung verwendet, und normale zirkulierende Lymphozyten wurden zur Beobachtung von Wirkungen auf durch Kermesbeere- Mitogen und Phytohaemagglutinin betriebene Aktivierung verwendet. Die Konzentrationen dieser Verbindungen einschließlich solcher, die 10- bis 20-fach höher als diejenigen waren, die zum Blockieren der Infektivität und der zytopathischen Wirkung von HTLV-III/LAV in Vitro sind, ließen die In-Vitro Immunreaktivität normaler Lymphozyten grundsätzlich intakt.
Die Mechanismen, durch welche 2',3'-Dideoxynucleoside die Replikation von HTLV-III/LAV unterdrücken, sind nicht bekannt. Es ist bekannt, daß das 5'-Triphosphatprodukt von 2',3'-Dideoxycytidin und -Dideoxythymidin zelluläre Beta- und Gamma- DNA-Polymerasen sowie virale reverse Transkriptase, jedoch nicht Säugetier-Alpha-DNA-Polymerase hemmen kann. Es wird angenommen, daß Alpha-DNA-Polymerase das synthetische Schlüssel-DNA-Enzym für die DNA-Replikation während der Zellteilung ist, und daß es auch eine Rolle bei der DNA-Reparatur spielt. Von Interesse ist, daß DNA-Polymerase von Herpes simplex Typ 1 als ebenso resistent gegen 2',3'-Dideoxythymidin wie zelluläre Alpha-DNA-Polymerase beschrieben wird. Nicht phosphorylierte Dideoxynucleoside haben eher vernachlässigbare Wirkungen auf das Wachstum kultivierter Säugetierzellen (ein Phänomen, das hier in menschlichen T-Zellen bestätigt wird). Dies ist so vermutlich wegen ineffizienter intrazellulärer Umwandlung in die entsprechenden 5'-Triphosphate in Verbindung mit der Resistenz von Alpha-DNA-Polymerase gegen niedrige Konzentrationen der 5'-Triphosphate.

Beispiel 1

Bezugnehmend auf Tafel 1 wurde eine Tetanus-Toxoid-spezifische T-Zellinie durch wiederholte Stimulationszyklen mit Antigen hervorgerufen, wie in Mitsuya u. a., Science, 225 : 1484-1486 (1984), beschrieben, in Anwesenheit von letal bestrahlten (12.000 rad), menschlichen T-lymphotropen Virus Typ I (HTLV-1) produzierenden MJ-Tumorzellen in 96-Mulden- Mikrotiter-Kulturplatten (Costar, Cambridge, MA) kloniert. Das Klon ATH8 (aus einer mit 0,5 Zellen pro Mulde beschichteten Kultur erhalten) wurde auf der Basis seines schnellen Wachstums (in Anwesenheit von Interleukin-2) und hervorragender Empfindlichkeit für die zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV für die Arzneimittelmaskierung ausgewählt. Das ATH8-Klon trägt mehrere verschiedene Kopien von HTLV-I in seinem Genom, wenn es durch Southern-Transfer-Hybridisierung unter Verwendung einer radiomarkierten HTLV-I-cDNA-Sonde beurteilt wird, aber erzeugt keine nachweisbaren Mengen von HTLV-I-p24-gag-Protein. 10&sup5; ATH8-Zellen wurden mit 2 ug/ml Polybren während 30 Minuten vorbehandelt, pelletisiert, verschiedenen Mengen von HTLV-IIIB ausgesetzt, in 2 ml komplettem Medium (RPMI, ergänzt mit 15% nicht dialysiertem, wärmeinaktiviertem fötalem Kälberserum, 4 mM L-Glutamin, 5·10&supmin;&sup5; 2-Mercaptoethanol, 50 U/ml Penicillin, und 50 ug/ml Streptomycin) resuspendiert, das 15% (vol/vol)-Interleukin 2 (Lectin-erschöpft; Cellular Products Inc., Buffalo, NY) enthielt, und in Kulturröhrchen (3033, Falcon, Oxnard, CA) bei 37ºC in 5% CO&sub2; enthaltender angefeuchteter Luft inkubiert. Am Tag 7 wurden die gesamten lebensfähigen Zellen mittels der Trypanblau-Exklusionsmethode gezählt. Tafel 1 zeigt die zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV auf die ATH8-Zellen; die Daten sind als arithmetische Mittelwerte +/-1 Standardabweichung für Doppelbestimmungen ausgedrückt.

Tafel 1

Zytopathische Wirkung von HTLV-III/LAV auf ATH8-Zellen

Anzahl von HTLV-IIIB-Virusteilchen/Zelle

0
0,05
0,5
5
50
500
5.000

Anzahl lebensfähiger ATH8-Zellen (· 10&sup5;)

3,37 +/- 0,1
3,36 +/- 0,04
3,26 +/- 0,15
1,97 +/- 0,2
1,78 +/- 0,16
0,37 +/- 0,02
0,30 +/- 0,01 Tafel 2 Wirkung von 2',3'-Dideoxynucleosiden auf die In-Vitro-Immunreaktivität normaler Lymphozyten Adenosin¹ Guanosin¹ Inosin¹ Cytidin&sup4; Thymidin&sup4; Responderzellen keine

(Tafel 2 - Fortsetzung)

1 - Alle getesteten Nucleoside haben die 2',3'-Dideoxy-Konfiguration. Die Konzentrationen (uM) jedes 2',3'-Dideoxynucleosids ergibt im wesentlichen eine vollständige Hemmung der zytopathischen Wirkung von HTLV-III/LAV (Fig. 1 und 2A) und der viralen p24-Expression (ausgenommen 2', 3'-Dideoxythymidin; siehe Fig. 2B). ³H-Thymidin-Einbau wurde als Indikator der Aktivierung von Responderzellen benützt, falls nicht anders angegeben.
2 - 5 · 10&sup4; normale Helfer/Induktor-TM3-Zellen wurden mit Tetanus-Toxoid (0,6 begrenzende Flockungseinheiten/ml) plus 10 bestrahlte (4.000 rad) autologe periphere mononukleare Blutzellen (PBM) als Quelle von akzessorischen Zellen stimuliert und während 72 Stunden in Anwesenheit oder Abwesenheit des 2',3'-Dideoxynucleosids kultiviert. Nach In-Berührung-Bringen mit 0,5 uCi ³H-Thymidin bzw. 1 uCi ³H-Uridin während der letzten 5 Stunden wurden Zellen auf Glasfasern geerntet und die darin eingebaute Radioaktivität wurde ausgezählt. Die Daten als arithmetische Zählmittelwerte pro Minute (· 10³) +/-1 Standardabweichung für Dreifachbestimmungen ausgedrückt.
3 - 10&sup6; PBM von einer gesunden Person wurden mit Phytohaemagglutinin (PHA) oder Kermesbeere-Mitogen (PWM) stimuliert und während 72 Stunden kultiviert und, wie oben beschrieben, behandelt.
4 - ³H-Uridin-Einbau wurde als Indikator der Aktivierung der Responderzellen verwendet.
Die Pyrimidin-Base, die Gegenstand dieser Erfindung ist, enthält die Base selbst, und die üblichen Mono- und Triphosphate, und wo in der Beschreibung und den Patentansprüchen 2',3'-Dideoxyzytidin angegeben ist, sind in dieser Definition auch die Phosphate eingeschlossen.

Claims

1. Verfahren zum Abschwächen der zytopathischen Wirkungen des HTLV-III-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß das HTLV-III- Virus in Vitro mit 2',3'-Dideoxycytidin oder einem Mono- oder Triphosphat davon in Berührung gebracht wird.

2. Verfahren zum Abschwächen der zytopathischen Wirkungen des HTLV-III-Virus, dadurch gekennzeichnet, daß das HTLV-III- Virus in Vitro innerhalb einer menschlichen T-Zelle mit 2',3'-Dideoxycytidin oder einem Mono- oder Triphosphat hiervon in Berührung gebracht wird.

3. Verwendung einer therapeutisch wirksamen Menge von 2',3'- Dideoxycitidin oder einem Mono- oder Triphosphat hiervon, dessen therapeutisch wirksame Menge zur Verhinderung einer Vermehrung oder Immunreaktion normaler T-Zellen nicht ausreicht, bei der Zubereitung eines Medikaments zur Behandlung von AIDS oder einer verwandten Krankheit, deren ätiologisches Agens HTLV-III ist.