DE69133576T2

DE69133576T2 - Verfahren zur Herstellung von Enantiomerisch reine Beta-D-Dioxolan-Nukleoside

Info

Publication number: DE69133576T2
Application number: DE69133576T
Authority: DE
Inventors: Chung K. Athens Chu; Raymond F. Decatur Schinazi
Original assignee: University of Georgia; Emory University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Current assignee: University of Georgia; Emory University; University of Georgia Research Foundation Inc UGARF
Priority date: 1990-12-05
Filing date: 1991-12-05
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2011-12-06
Also published as: EP0562009A4; JP3881165B2; JP2007008959A; CA2590125A1; JPH07502973A; JP4280276B2; ES2291268T3; EP1600448A3; CA2099589C; EP1164133B1; EP0562009A1; EP1164133A3; JP3421335B2; US5179104A; EP1164133A2; CA2099589A1; JP2001097973A; AU714646B2; AU1664097A; WO1992010497A1

Description

Die Regierung hat Rechte an dieser Erfindung aufgrund von Stipendien des Public Health Service of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases und des Department of Veteran's Affairs, die die Forschung, die zu dieser Erfindung geführt hat, teilweise finanziert haben.
Hintergrund der Erfindung
Diese Erfindung liegt im Bereich der organischen Synthese von Nucleosiden und betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen β-D-(–)-Dioxolannucleosiden.
Es ist herausgefunden worden, dass eine Anzahl von 2',3'-Dideoxynucleosiden wirksame antivirale Mittel gegen das humane Immundefizienz-Virus (HIV) sind, dem Verursacher des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS). Die Leitsubstanz AZT (Mitsuya, H.; Broder, S. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986 83, 1911) ist von der U.S. Food and Drug Administration für Patienten mit AIDS und AIDS-related complex zugelassen worden. Mehrere andere 2',3'-Dideoxynucleoside sind zurzeit in verschiedenen Stufen von klinischen Versuchen einschließlich von 3'-Azido-2',3'-dideoxyuridin (AZDU oder CS-87, siehe, Chu, C. K.; et al., J. Med. Chem., 1989, 32, 612; und Eriksson, B. F. H.; et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 1927), 2',3'- Dideoxyinosin (DDI) und 2',3'-Dideoxycytidin (DDC) (siehe Yarchoan, R. et al., Science, 1989, 245, 412), 3'-Deoxy-2',3'-didehydrothymidin (D4T, Lin, T. S., et al., Biochem. Pharmacol., 1987, 36, 311; Hamamoto, Y., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1987, 31, 907; Balzarini, J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 140, 735), und 2'-Fluorarabinofuranosyl-2'-3'-dideoxycytidin (Martin, T. A., et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 2137; Watanabe, K. A., et al., J. Med. Chem., 1990, 33. 2145; Sterzycki, R. Z., et al., J. Med. Chem., 1990, 33, 2150).
Es ist bekannt, dass in diese Nucleoside in der 5'-triphosphorylierten Form die HIV-reverse Transkriptase inhibieren sowie den Kettenabbruch der wachsenden viralen DNA-Kette verursachen. Furman, P. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1986, 83, 8333; Cheng, Y. C. et al., J. Biol. Chem., 1987, 262, 2187; St. Clair, M. H., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1987, 31, 1972; und Schinazi, R. F., et al., Antimicrob. Agents Chemother., 1989, 33, 115.
Die Stereochemie der Nucleosidderivate spielt eine wichtige Rolle bei deren biologischer Aktivität. Die C1'-Position der Ribose in dem Nucleosid (der Kohlenstoff, der an den Stickstoff der heterocyclischen Base gebunden ist) ist ein Chiralitätszentrum, da der Kohlenstoff an vier verschiedene Reste gebunden ist. Gleichermaßen gibt es am C4' des Nucleosids (der Ringkohlenstoff, der an die Hydroxymethylgruppe gebunden ist, die in Nucleotiden phosphoryliert ist) ein optisch aktives Zentrum. In den natürlich vorkommenden Nucleosiden befinden sich sowohl die Base, die an das C1'-Atom gebunden ist als auch die Hydroxymethylgruppe, die an das C4'-Atom gebunden ist auf der gleichen Seite des Kohlenhydratrings.
Eine Kohlenhydratkonfiguration, bei der sich die C1'- und C4'-Substituenten auf der gleichen Seite der Kohlenhydratebene befinden (d.h. die Substituenten sind cis), wird als eine "β-Konfiguration" bezeichnet. Eine Kohlenhydratkonfiguration, bei der sich die C1'- und C4'-Substituenten auf gegenüberliegenden Seiten der Kohlenhydratebene befinden (d.h. die Substituenten sind trans), wird als eine "α-Konfiguration" bezeichnet. In Bezug auf Verbindung 1 von 2 wird ein Nucleosid als ein D-Nucleosid bezeichnet, wenn sich der Substituent, der nicht Wasserstoff ist und der an das C4'-Atom gebunden ist, über der Ebene des Kohlenhydratrings befindet. Das Nucleosid wird als ein L-Nucleosid bezeichnet, wenn sich der Substituent, der nicht Wasserstoff ist und der an das C4'-Atom gebunden ist, unter der Ebene des Kohlenhydratrings befindet.
Die nicht natürlich vorkommenden α-Isomere von Nucleosiden (in denen sich die C1'- oder C4'-Substituenten auf gegenüberliegenden Seiten der Kohlenhydratebene befinden) sind selten biologisch aktiv und sind typischerweise toxisch.
Vor Kurzem wurde eine Analyse der Festkörperkonformationen von sechs aktiven und zwei inaktiven nucleosidischen Anti-HIV-Mitteln durchgeführt, um zu versuchen die Anwesenheit oder Abwesenheit von gewissen stereochemischen Eigenschaften mit einer hohen HIV-Aktivität zu korrelieren. Van Roey, P., et al., J. Am. Chem. Soc., 1988, 110, 2277; und Van Roey, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1989, 86, 3929. Die Röntgenstrukturen deuteten darauf hin, dass die aktiven Anti-HIV-Nucleoside, die C3'-exo oder ähnliche Kohlenhydratkonformationen annehmen, während die inaktiven Verbindungen die C3'-endo-Konformation bevorzugen. (Endo und exo bezeichnen Konformationen, bei denen sich die Atome bezogen auf die Base auf der gleichen oder der gegenüberliegenden Seite des Zuckerrings befinden). Die C3'-exo- und C3'-endo-Konformationen platzieren das C5'-Atom in axiale bzw. äquatoriale Positionen. Die Position des C5'-Atoms beeinflusst die Lage der 5'-Hydroxygruppe bezogen auf die Base. Da die 5'-Hydroxygruppe der Ort der Phosphorylierung des Nucleosids ist, ist deren Lage im Bezug auf den Rest des Nucleosids wichtig.
Seit Kurzem gab es Interesse an der Synthese von Nucleosidderivaten, in denen der 3'-Kohlenstoff des Nucleosids durch ein Heteroatom ersetzt ist. Norbeck, D. W., et al., in Tet. Lett., 1989, 30, 6263, berichtete die Synthese von (±)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (nachstehend als (±)-Dioxolan-T bezeichnet, siehe 1), die in einer racemischen Mischung aus Diastereomeren um das C4'- Atom resultiert. Das Produkt ist ein Derivat von 3'-Deoxythymidin, in dem das C3'-Atom durch ein O3'-Atom ersetzt ist. Das Produkt wurde in fünf Schritten aus Benzyloxyaldehyddimethylacetal und (±)-Methylglycerat synthetisiert, um eine Ausbeute von 79 % der 1:1 Diastereomerenmischung zu ergeben. Die röntgenkristallografische Analyse des Produkts zeigte, dass der Dioxolanring die ³T₄-Konformation annimmt, die üblicherweise in Ribonucleosiden beobachtet wird, mit dem O3'-Atom in der endo-Position. Norbeck berichtete, dass die racemische Mischung von Dioxolan-T eine Anti-HIV-Aktivität von 20 μM in ATH8-Zellen zeigt, und schrieb die niedrige Wirksamkeit gegen das Virus einem Effekt der endo-Konformation des O3'-Atoms zu.
Belleau, et al, berichtete in der Fifth International Conf. an AIDS, Montreal, Kanada 4. bis 9. Juni, 1990, Paper Nr. T.C.O.l., ein Verfahren zur Synthese von Cytidinnucleosiden, die Sauerstoff oder Schwefel in der 3'-Position enthalten. Der Dioxolanring wurde durch die Kondensation von RCO₂CH₂CHO mit Glycerin hergestellt. Wie die Norbeck-Synthese resultiert die Belleau-Synthese in einer racemischen Mischung aus Diastereoisomeren um das C4'-Atom des Nucleosids. Belleau berichtete, dass das Schwefelanalog, das als NGBP-21 oder (±)BCH-189 (siehe 1) bezeichnet wird, eine hohe Anti-HIV-Aktivität aufwies. (±)BCH-189 ist zurzeit in der präklinischen Toxikologie.
Das US-Patent Nr. 5,041,449 offenbart 2-substituierte-4-substituierte 1,3-Dioxolane, die als antivirale Mittel nützlich sind.
Die EP-A-0382526 offenbart eine Verbindung der Formel (I)
in der R₁ Wasserstoff ist, R₂ eine Purin- oder Pyrimidinbase oder ein Analog oder ein Derivat davon ist; Z S, S=O oder SO₂ ist und pharmazeutisch annehmbare Derivate davon.
Bis heute hat niemand ein Verfahren zur Synthese eines Nucleosidanalogs mit einem Sauerstoff in der 3'-Position berichtet, das zu einem enantiomerenreinen Dioxolannucleosid führt, das die gleiche Stereochemie wie die in der Natur gefundenen Nucleoside aufweist (das β-Stereoisomer). Es besteht ein Bedarf für eine solche Synthese als Forschungswerkzeug, um mehr Informationen über den Effekt der Stereochemie auf die antivirale Aktivität von Nucleosidderivaten bereitzustellen und um neue Anti-HIV-Mittel bereitzustellen.
Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Synthese von enantiomerenreinen Dioxolannucleosiden bereitzustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, enantiomerenreine Dioxolannucleoside mit signifikanter Anti-HIV-Aktivität bereitzustellen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
Die Erfindung wie offenbart ist ein Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen β-D-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]-nucleosids aus 1,6-Anhydromannose, das die folgenden Schritte aufweist, nämlich:

(i) Umwandeln von 1,6-Anhydromannose in ihr (2,3)-Isopropylidenderivat;
(ii) Herstellen von (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan aus dem (2,3)-Isopropylidenderivat; und
(iii) Kondensieren des (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolans aus Schritt (i) mit einer heterocyclischen Base in Gegenwart von SnCl₄, einer anderen Lewis-Säure, oder Trimethylsilyltriflat, um ein enantiomerenreines β-D-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]-nucleosid zu bilden.

Das (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan wird mit einer gewünschten heterocyclischen Base in Gegenwart von SnCl₄, einer anderen Lewis-Säure oder Trimethylsilyltriflat in einem organischen Lösemittel wie bspw. Dichlorethan, Acetonitril oder Methylenchlorid kondensiert, um das stereochemisch reine Dioxolannucleosid bereitzustellen.
Die enantiomerenreinen Dioxolannucleoside sind aktive HIV-Mittel, die deutlich wirksamer sind als die zuvor hergestellten racemischen Mischungen der Verbindungen. Die antivirale Aktivität der Verbindungen ist im Hinblick auf die allgemein akzeptierte Theorie, dass Reste in der endo-Konformation einschließlich dieser Dioxolane als antivirale Mittel nicht wirksam sind, überraschend. Ferner sind die enantiomerenreinen Dioxolannucleoside weniger toxisch als die racemische Mischung aus Nucleosiden, da das nicht natürlich vorkommende Isomer eliminiert wurde.
Das Produkt kann als Forschungswerkzeug verwendet werden, um die Inhibition von HIV in vitro zu studieren oder kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht werden, um das Wachstum von HIV in vivo zu inhibieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Darstellung der chemischen Strukturen von (±)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (Dioxolan-T) und (±)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-(1,3-thioxolan)]thymin (BCH-189).
2 ist eine Darstellung des Verfahrens zur Synthese von enantiomerenreinem β-D-(–)-Dioxolanthymin.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck "geschützt", wie hierin verwendet, bezeichnet einen Rest, der an einer funktionellen Gruppe eines Moleküls angeordnet wurde, um weitere Reaktionen des Rests während der Derivatisierung eines anderen Teils des Moleküls zu verhindern. Schutzgruppen, insbesondere für Sauerstoff und Stickstoff, sind dem Fachmann auf dem Gebiet der organischen Chemie gut bekannt.
Der Ausdruck "1,3-Dioxolannucleosid", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet ein Nucleosidderivat, wie in den 1 und 2 dargestellt, wobei ein 1,3-Dioxolan über den Oxathiolan-C5-Kohlenstoff (der in dem Nucleosid zum C1'-Kohlenstoff wird) an eine heterocyclische Base, typischerweise eine Purin- oder eine Pyrimidinbase, gebunden ist.
I. Herstellung von enantiomerenreinen Dioxolannucleosiden
Beim Herstellen von enantiomerenreinen Dioxolannucleosiden sollte darauf geachtet werden, stark saure Bedingungen zu vermeiden, die den Dioxolanring spalten würden. Die Reaktionen sollten, wenn möglich, unter basischen oder neutralen Bedingungen durchgeführt werden, und wenn saure Bedingungen notwendig sind, sollte die Reaktionszeit minimiert werden.
A. Herstellung von Dioxolanderivaten
Das Schlüsselausgangsmaterial für die Synthese von enantiomerenreinen β-D-(–)-Dioxolannucleosiden ist 1,6-Anhydromannose (Verbindung 1, 2). Dieser Zucker enthält die gesamte notwendige Stereochemie für das enantiomerenreine Endprodukt (siehe z.B. Verbindung 11, 2) einschließlich der korrekten diastereomeren Konfiguration um die 1 Position des Zuckers (die in dem später gebildeten Nucleosid zur 4'-Position wird). 1,6-Anhydromannose kann nach den in Knauf, A. E.; Hann, R. M.; Hudson, C. S. J. Am. Chem. Soc., 1941, 63, 1447; und Zottola, M. A.; Alonso, R.; Vite, G. D.; Fraser-Reid, B. J. Org. Chem., 1989, 54. 6123 beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Frühere Synthesen von Dioxolannucleosiden haben racemische Mischungen von Ausgangsmaterialien zur Herstellung des Riboserests verwendet. Wenn die Synthesen mit einer racemischen Mischung von Reagenzien beginnen, werden ungewünschte racemische Mischungen von enantiomeren Nucleosidprodukten gebildet. Diese Mischungen sind sehr schwierig zu trennen und erhöhen die Kosten des Endprodukts deutlich. Ferner erhöht der Einschluss von nicht natürlich vorkommenden Isomeren die Toxizität des Produkts.
Die 1,6-Anhydromannose wird mit Dimethoxypropan und p-Toluolsulfonsäure in ihr Isopropylidenderivat umgewandelt, das ohne Isolierung in 4-Position zur Verbindung 2 benzoyliert wird (siehe 2). Es kann auch eine Acylgruppe verwendet werden, um die 4-Position zu schützen. Die Isopropylidengruppe der Verbindung 2 wird dann durch eine katalytische Menge einer Säure, wie bspw. Schwefelsäure, Chlorwasserstoffsäure, Ameisensäure, Trifluoressigsäure, Sulfamsäure in 60 % wässrigem Dioxan oder einem anderen geeigneten organischen Lösemittel in einem Temperaturbereich von etwa 0 bis 50°C entfernt, um (–)-1,6-Anhydro-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose in hoher Ausbeute als weißen Feststoff zu ergeben.
Im nächsten Schritt wird das Glykol von (–)-1,6-Anhydro-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose durch Behandlung mit NaIO₄ in H₂O/EtOH (1:1) bei etwa Raumtemperatur für eine Stunde oxidativ gespalten, um den entsprechenden Dialdehyd zu bilden. Bleitetraacetat kann ebenfalls als das Oxidationsreagens für diese Reaktion verwendet werden. Der Dialdehyd wird sofort in situ mit irgendeinem geeigneten Reduktionsmittel einschließlich von NaBH₄, Diisobutylaluminiumhydrid (DIBAL-H), Lithiumborhydrid (LiBH₄) oder Natrium-bis(2-methoxyethoxy)-aluminiumhydrid (Red-Al) bei etwa Raumtemperatur oder darunter reduziert. Unter den Reaktionsbedingungen isomerisiert die Verbindung 4 durch Benzoylmigration von einer sekundären zu einer primären Position um (–)-(2R,4R)-4-(2-Benzoxy-1-hydroxyethyl)-2-(hydroxymethyl)-dioxolan (Verbindung 5, 2) zu bilden.
Die 2-Position des Dioxolans wird dann mit einer geeigneten Sauerstoffschutzgruppe, z.B. einer trisubstituierten Silylgruppe, wie bspw. Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl, Trityl, einer Alkylgruppe, Acylgruppen, wie bspw. Acetyl, Propionyl, Benzoyl, p-NO₂ Benzoyl oder Toluyl, Methylsulfonyl oder p-Toluylsulfonyl geschützt. Eine bevorzugte Schutzgruppe ist t-Butyldiphenylsilyl. Nach dem Schützen der 2-Position des Dioxolans wird die Benzoylgruppe mit einer starken Base, wie bspw. Natriummethanolat oder Ammoniak in Methanol, bei etwa 0 bis 50°C von der 2-Hydroxyethyl-Position entfernt, um (–)-(2R,4R)-2-(geschütztes-O-methyl)-4-(1,2-dihydroxyethyl)-dioxolan (Verbindung 6, 2) in hoher Ausbeute zu ergeben.
Im nächsten Schritt wird die 1,2-Dihydroxyethylgruppe in der 4-Position des Dioxolans mit einem Oxidationsmittel, wie bspw. NaIO₄/RuO₂ oder Bleitetraacetat bei etwa 0 bis 50°C in eine Carbonsäure umgewandelt, um (+)-(2R,4R)-2-(geschütztes oxymethyl)-4-carboxyldioxolan (siehe Verbindung 7, 2) zu bilden.
Eine modifizierte Hunsdiecker-Reaction (Dhavale, D.; et al., Tetrahedron Lett., 1988, 29, 6163) wird dann in Essigsäureethylester mit Pb(OAc)₄ durchgeführt, um (+)-(2R,4R)-2-(geschütztes oxymethyl)-4-carboxyldioxolan in die entsprechenden Schlüsselzwischenprodukte (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan (siehe Verbindung 8, 2) in guter Ausbeute umzuwandeln.
B. Kondensation einer heterocyclischen Base mit dem Dioxolanderivat
Im nächsten Schritt dieses Reaktionsschemas wird das wie in Sektion A. beschrieben hergestellte enantiomerenreine Dioxolan mit einer geschützten Base in Gegenwart von Trimethylsilyltriflat (Trimethylsilyltrifluormethansulfonat) oder einer Lewis-Säure in einem trockenen organischen Lösemittel kondensiert.
Jede Verbindung, die einen Stickstoff enthält, der in der Lage ist, mit einem Zentrum von Elektronendefizienz zu reagieren, kann in der Kondensationsreaktion verwendet werden. Purinbasen schließen Folgendes ein, nämlich Adenin, Hypoxanthin, N⁶-Alkylpurine, N⁶-Benzylpurin, N⁶-Halopurin und Guanin. Pyrimidinbasen schließen Folgendes ein, nämlich Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, 2-Mercaptopyrimidin und Uracil. Eine Thyminbase ist in einer Kondensationsreaktion, die mit einem Dioxolanderivat durchgeführt wird, bevorzugt und eine Cytosinbase ist bevorzugt, wenn die Kondensationsreaktion mit einem 1,3-Thioxolan durchgeführt wird.
Funktionelle Sauerstoff- und Stickstoffgruppen an der heterocyclischen Base sollten vor der Kondensation mit dem Zucker geschützt werden. Schutzgruppen sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Folgendes ein, nämlich Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldimethylsilyl und t-Butyldiphenylsilyl, Tritylmethyl, Alkylgruppen, Acylgruppen (niederes Alkyl-C(O)), wie bspw. Acetyl und Propionyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl.
Friedel-Crafts-Katalysatoren (Lewis-Säuren), die in der Kondensationsreaktion verwendet werden können, schließen Folgendes ein, nämlich SnCl₄, ZnCl₄, TiCl₄, AlCl₃, FeCl₃, BF₃-Diethylether und BCl₃. Diese Katalysatoren benötigen wasserfreie Bedingungen, da die Gegenwart von Wasser deren Aktivität reduziert. Die Katalysatoren werden außerdem in Gegenwart von organischen Lösemitteln mit aktiven Wasserstoffen, wie bspw. Alkoholen und organischen Säuren, inaktiviert. Die Katalysatoren werden typischerweise in Lösemitteln, wie bspw. Kohlenstoffdisulfid, Methylenchlorid, Nitromethan, 1,2-Dichlorethan, Nitrobenzol, Tetrachlorethan, Chlorbenzol, Benzol, Toluol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan oder Acetonitril verwendet. Wasserfreies Aluminiumchlorid ist in Kohlenstoffdisulfid nicht löslich. Niedballa, et al., J. Org. Chem. 39, 25 (1974). Der bevorzugte Katalysator ist SnCl₄. Das bevorzugte Lösemittel ist 1,2-Dichlorethan.
Trimethylsilyltriflat kann unter den gleichen Bedingungen, wir zuvor für die Friedel-Crafts-Katalysatoren beschrieben, verwendet werden. Die Reaktion läuft in einem Temperaturbereich von –10°C bis 200°C ab.
Die Auswahl des Katalysators für die Kondensation beeinflusst das Verhältnis von α- zu β-Nucleosidprodukt im Endprodukt. So ergab zum Beispiel die Kondensation der Zwischenprodukte (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(t-butyldiphenylsilyloxymethyl)dioxolan (Verbindung 8, 2) mit silyliertem Thymidin in Gegenwart von Trimethylsilyltriflat in CH₂Cl₂ eine Mischung aus (–)-1-[(2R,4R)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin 9-β (45 %) und (+)-1-[(2R,4S)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin 10-α (29 %). Die Reaktion mit SnCl₄ ergab jedoch exklusiv β-Isomer 9, wobei in der Dünnschichtchromatografie Spuren des α-Isomers 10 nachweisbar waren.
Im letzten Schritt dieses Verfahrens zur Herstellung von enantiomerenreinen (–)-β-D-Dioxolannucleosiden wird die 5'-O-Position des Nucleosids entschützt. Die Desilylierung kann mit einer Vielzahl von Reagenzien durchgeführt werden, einschließlich von Essigsäure, Trifluoressigsäure, Fluorwasserstoff, n-Tetrabutylammoniumfluorid, Kaliumfluorid und Pyridinium-HCl. So ergab z.B. die Desilylierung der Verbindungen 9 und 10 mit Tetrabutylammoniumfluorid die gewünschten freien Nucleoside 11 bzw. 12 (2). Essigsäure ist für die Verwendung im kommerziellen Maßstab bevorzugt, da diese preisgünstig ist. Andere Reagenzien für die Desilylierung sind dem Fachmann bekannt. Die Deacylierung wird in Säure oder Base erreicht. 5-O-Ether können mit BCl₃ oder Trimethylsilyliodid gespalten werden.
Das Verfahren zur Herstellung von enantiomerenreinen (–)-β-D-Dioxolannucleosiden wird in dem folgenden Ausführungsbeispiel für die Herstellung (–)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin, das als (–)-β-D-Dioxolan-T bezeichnet wird, näher erläutert. Die Nummerierung der Verbindungen in den Ausführungsbeispielen bezieht sich auf die in 2 dargestellten Strukturen.
(–)-1,6-Anhydro-2,3-isopropyliden-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose
1,6-Anhydro-β-D-mannopyranose (Verbindung 1) wurde mit Aceton (800 ml) und Methanol (300 ml) vermischt und für etwa dreißig Minuten gerührt, bis nur noch ein freifließender Feststoff zurückblieb. Dann wurden Dimethoxypropan (300 ml) und p-Toluolsulfonsäure (5 g) zugegeben und die Mischung wurde für 2 Stunden gerührt.
Die Reaktionsmischung wurde mit Triethylamin basisch gestellt (pH 8) und filtriert, um das weiße Feststoffmaterial zu entfernen. Die Lösemittel wurden abgedampft und der Rückstand wurde in Essigsäureethylester aufgenommen und dann kristallisiert, um 4 g des 2,3-isopropylidenierten Produkts als durchsichtige Nadeln zu erhalten.
Zu einer Lösung der 1,6-Anhydro-2,3-isopropyliden-β-D-mannopyranose (5,01 g, 0,025 mol) in Pyridin (40 ml) wurde bei 0°C Benzoylchlorid (3,74 ml, 0,062 mol) zugetropft. Die Mischung wurde bei 0°C für 45 Minuten gerührt. Dann wurde Eis zu der Reaktionsmischung zugegeben, um überschüssiges Benzoylchlorid zu entfernen. Das Lösemittel wurde im Vakuum abgedampft und der Rückstand wurde in Essigsäureethylester (200 ml) gelöst. Die organische Schicht wurde mit Wasser, gesättigter NaHCO₃ und konzentrierter Kochsalzlösung gewaschen. Das resultierende Material wurde über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet, filtriert und dann abgedampft, um (–)-1,6-Anhydro-2,3-isopropyliden-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose-Rohprodukt (Verbindung 2, 8,7 g) als gelblichen Feststoff zu ergeben.
(–)-1,6-Anhydro-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose (3).
Zu einer Lösung von 1, 6-Anhydro-4-O-benzoyl-2,3-isopropyliden-β-D-mannopyranose 2 (10,0 g, 32,6 mmol) in 60 % wässrigem Dioxan (820 ml) wurde konzentrierte H₂SO₄ (3,36 ml) zugegeben. Die Mischung wurde bei 70–80°C für 15 Stunden gerührt und dann in einem Eisbad gekühlt, mit NaHCO₃ neutralisiert und konzen triert, bis die Hälfte des ursprünglichen Volumens verblieb. Die Lösung wurde dann mit Essigsäureethylester extrahiert und die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und abgedampft, um 3 als weißen Feststoff zu ergeben. Der Feststoff wurde aus CH₂Cl₂-n-Hexan kristallisiert, um 3 (7,4 g, 85,3 %) als weißen Feststoff zu ergeben: [α]²⁵D – 154,7° (C, 0,21 MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 3,56-4,61 (m, 5H, 2,3,5,6-H), 4,82 (d, J = 8,1 Hz, 1H, OH D₂O austauschbar), 5,02 (S, 1H, 4-H), 5,09 (d, J = 3,7 Hz, 1H, OH, D₂O austauschbar), 5,28 (s, 1H, 1-H), 7,46-8,05 (m, 5H, Ar-H); IR (KBr) 3410, 1710 cm^–1; Anal., berechnet für C₁₃H₁₄O₆: C, 58,64; H, 5,31, gefunden: C, 58,51; H, 5,34.
(–)-(2R,4R)-4-(2-Benzoxy-1-hydroxyethyl)-2-(hydroxymethyl)dioxolan (5).
Zu einer Lösung von 3 (7,4 g, 27,8 mmol) in 95 %igem Ethanol (200 ml) wurde eine Lösung von NaIO₄ (6,54 g, 30,7 mmol) in Wasser (200 ml) zugegeben. Die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Überprüfung durch Dünnschichtchromatografie, um die vollständige Umsetzung des Diols zu Dialdehyd sicherzustellen, wurde die Reaktionsmischung auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens aufkonzentriert. Methanol (200 ml) wurde zu dem Rückstand zugegeben und die Mischung wurde auf 50°C abgekühlt. Natriumborhydrid (4,2 g, 111,0 mmol) wurde portionsweise über 5 Minuten zu der Mischung zugegeben und die Mischung wurde für 10 Minuten bei 50°C gerührt, mit Eisessig neutralisiert und aufkonzentriert, um rohes 3 als gelbes Öl zu ergeben. Das Öl wurde durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt, um reines 3 als farbloses Öl zu ergeben, das aus Diethylether/n-Hexan kristallisiert wurde, um 5 (6,12 g, 82 %) als weißen Feststoff zu ergeben: [α]²⁵D – 18,5° (C 0,20, Methanol); ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 3,47 (dd, J = 5,9, 3,7 Hz, 2H, CH₂OH), 3,72-4,14 (m, 4H, 4, 5-H und CHOH), 4,27-4,95 (m, 2H, CH₂OBz), 4,81-4,95 (m, 2-H und pri OH), 5,43 (d, J = 5,5 Hz, 1H, sec OH, D₂O austauschbar), 7,43-8,09 (m, 5H, Ar-H); Anal., berechnet für C₁₃H₁₆O₆: C, 58,19; H, 6,02. Gefunden: C, 58,09; H, 6,01.
(–)-(2R,4R)-4-(2-Benzoxy-1-hydroxyethyl)-2-(t-butyldiphenylsilyloxymethyl)dioxolan.
Zu einer Lösung von 3 (2,8 g, 10,4 mmol) und Imidazol (2,04 g, 30,0 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wurde t-Butyldiphenylsilylchlorid (3 ml, 11,5 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde abgedampft, um ein gelbes Öl zu ergeben, das durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt wurde, um 4 (4,48 g, 85 %) als farbloses Öl zu ergeben; [α]²⁵D – 14,2° (C 0,26, Methanol); ¹H NMR (DMSO-d₆): δ 1,00 (s, 9H, t-Bu), 3,68–3,87 (m, 3H, CH₂OTBDPS und CHOH), 3,98-4,16 (m, 3H, 4,5-H), 4,20-4,55 (m, 2H, CH₂OBz), 5,07 (t, J = 3,3 Hz, 1H, 2-H), 5,47 (d, J – 5,7 Hz, 1H, OH, D₂O austauschbar), 7,40-8,33 (m, 10H, Ar-H); Anal., berechnet für C₂₉H₃₄O₆Si: C, 68,73; H, 6,79. Gefunden: C, 68,86; H, 6,83.
(–)-(2R,4R)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-(1,2-dihydroxyethyl)-dioxolan (6).
Zu einer Lösung von (–)-(2R,4R)-4-(2-Benzoxy-1-hydroxyethyl)-2-(t-butyldiphenylsilyloxymethyl)-dioxolan (2,52 g, 5,0 mmol) in Methanol (40 ml) wurde eine 0,078 M Lösung von Natriummethanolat (7,3 ml) in Methanol zugegeben. Die Mischung wurde für 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit Essigsäure neutralisiert und aufkonzentriert. Der Rückstand wurde dann zwischen Essigsäureethylester und Wasser aufgeteilt und die wässrige Schicht mit Essigsäureethylester extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und dann mit Wasser gewaschen und dann getrocknet, abgedampft und durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt, um 6 (1,9 g, 95 %) als farbloses Öl zu ergeben: [α]²⁵D – 2° (C 0,25, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,00 (s, 9H, t-Bu), 3,40-3,52 (m, 3H, CH₂OH und CHOH), 3,64 (d, J = 3,7 Hx, 2H, CH₂OTBDPS), 3,82-3,95 (m, 3H, 4,5-H), 4,49 (t, J – 5,3 Hz, 1H, pri OH, D₂O austauschbar), 4,82 (d, J = 5,1 Hz, 1H, sec OH, D₂O austauschbar), 5,01 (t, J – 3,7 Hz, 1H, 2-H), 7,36-7,71 (m, 10H, Ar-H); Anal., berechnet für C₂₂H₃₃H₃₀O₅Si: C, 65,63; H, 7,53. Gefunden: C, 65,72; H, 7,52.
(+)-(2R,4R)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-carboxyldioxolan (7).
Zu einer zweiphasigen Lösung von 6 (1,6 g, 4,0 mmol) in CH₃CN (8 ml), CCl₄ (8 ml) und H₂O (12 ml) wurden NaIO₄ (3,59 g, 16,8 mmol) und RuO₂-Hydrat (8,5 mg) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für 5 Stunden kräftig gerührt. Methylenchlorid (40 ml) wurde zu der Mischung zugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt. Die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser gewaschen, durch ein Celitekissen gefiltert und dann aufkonzentriert, um rohes 7 (1,2 g, 77,4 %) als schwarzes Öl zu ergeben, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktion verwendet wurde. Für analytische Zwecke wurde rohes 7 durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt, um 7 als weißen Schaum zu ergeben. [α]²⁵D + 15,7° (C 0,28, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆): 6 0,99 (s, 9H, t-Bu), 3,43-4,05 (m, 4H, 5-H und CH₂OTBDPS), 4,25 (t, J = 6,8 Hz, 1H, 4-H), 5,04 (dd, J = 5,1, 3,7 Hz, 1H, 2-H), 7,38-7,72 (m, 10H, Ar-H).
(2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(t-butyldiphenylsilyloxymethyl)dioxolan (8).
Zu einer Lösung von 7 (0,46 g, 1,14 mmol) in Essigsäureethylester (10 ml) wurden Pyridin (0,09 ml, 1.25 mmol) und Pb(OAc)₄ (0,66 g, 1,49 mmol) zugegeben. Die Mischung wurde unter N₂ für 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann durch ein Celitekissen gefiltert und dann aufkonzentriert und durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt, um 8 (0,29 g, 63,5 %) als farbloses Öl zu ergeben: ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,06 und 1,10 (s, 9H, t-Bu), 1,92 und 2,06 (s, 1H, CH₃), 3,71-4,24 (m, 4H, 5-H und CH₂OTBDPS), 5,25 und 5,38 (t, J = 4,3 und 3,3 Hz jeweils, 1H, 2-H), 6,27-6,41 (m, 1H, 4-H), 7,20-7,72 (m, 10H, Ar-H); IR (KBr) 3400, 1620 cm^–1.
(–)-1-[(2R,4R)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (9) und (+)-1-[(2R,4S)-2-(t-Butyldiphenylsilyloxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (10).
Zu einer Suspension von Thymin (0,15 g, 1,2 mmol) in Haxamethyldisilazan (10 ml) wurde eine katalytische Menge (NH₄)₂SO₄ zugegeben und die Mischung wurde für 3 Stunden unter Rückfluss erwärmt. Die erhaltene klare Lösung wurde aufkonzentriert, um silyliertes Thymin als farbloses Öl zu ergeben. Eine Lösung von 8 (0,24 g, 0,6 mmol) in CH₂Cl₂ (5 ml) wurde zu einer Lösung von silyliertem Thymin in CH₂Cl₂ (5 ml) zugegeben und die Mischung wurde auf 5°C abgekühlt. Zu der gekühlten Mischung wurde Trimethylsilyltriflat (0,23 ml, 1,2 mmol) zugegeben und die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter N₂ gerührt. Eine gesättigte NaHCO₃-Lösung (20 ml) wurde zu der Mischung zugegeben und die Mischung wurde wiederum für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die organische Schicht wurde dann abgetrennt und die wässrige Schicht wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet, aufkonzentriert und durch Säulenchromatografie an Kieselgel getrennt um 9 (0,125 g, 44,6 %) als weißen Schaum und 10 (0,08 g, 28,6 %) als weißen Schaum zu ergeben: 9 (β-Form); [α]²⁵D – 6,98° (C 0,43, MeOH); ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,08 (s, 9H, t-Bu), 1,67 (s, 3H, CH₃), 3,92 (d, J = 3,2 Hz, 2H, CH₂OTBDPS), 4,14 (d, J = 4,0 Hz, 2H, 5-H), 5,06 (t, J = 3,2 Hz, 1H, 2-H), 6,36 (t, J + 4,0 Hz, 1H, 4-H), 7,26-7,75 (m, 10H, Ar-H), 9,51 (bnr s, 1H, H = NH): UV (MeOH) λ_max 265,0 (pH 2); 264,4 nm (pH 11); Anal., berechnet für C₂₅H₃₀O₅N₂Si: C, 64,34; H, 6,49; N, 6,00. Gefunden C, 64,28; H, 6,51; N, 5,98:
10 (α-Form); [α]²⁵D + 11,3° (C 0,23, MeOH); ¹H NMR (CDCl₃) δ 1,08 (s, 9H, t-Bu), 1,94 (d, J = 1,2 Hz, 3H, CH₃), 3,70 (d, J = 3,2 Hz, 2H, CH₂OTBDPS), 4,01 (dd, J = 9,5, 2,3 Hz, 1H, 5H), 4,35 (dd, J = 9,5, 5,3 Hz, 1H, 5-H), 5,55 (t, J = 3,2 Hz, 1H, 2-H), 6,32 (dd, J = 5,3, 2,3 Hz, 1H, 4-H), 7,17 (d, J = 1,2 Hz, 1H, 6'-H), 7,37-7,74 (m, 10H, Ar-H), 9,57 (br s, 1H, NH); UV (MeOH) λ_max 265,0; (pH 2); 264,5 nm (pH 11); Anal., berechnet für C₂₅H₃₀O₅N₂Si: C, 64,34; H, 6,49; N, 6,00. Gefunden C, 64,23; H, 6,51; N, 5,93.
(–)-1-[(2R,4R)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (11),
Zu einer Lösung von 9 (93,3 mg, 0,2 mmol) in Tetrahydrofuran (THF) (3 ml) wurde eine 1,0 M Lösung von Tetra-n-butylammoniumfluorid in THF (0,24 ml, 0,24 mmol) zugegeben und die Mischung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde dann aufkonzentriert und durch Säulenchromatografie an Kieselgel gereinigt, um 11 (42 mg, 92,1 %) als weißen Feststoff zu ergeben: [α]²⁵D – 18,8° (C 0,17, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,75 (d, J = 1,2 Hz, 3H, CH₃), 3,63 (dd, J + 6,0, 2,6 Hz, 2H, CH₂OH), 4,03 (dd, J = 9,9, 5,5 Hz, 1H, 5-H), 4,22 (dd, J = 9,9, 2,0 Hz, 1H, 5-H), 4,90 (t, J = 2,6 Hz, 1H, 2-H), 5,16 (t, J – t.0 Hz, 1H, OH), 6,21 (dd, J = 5,5, 2,0 Hz, 1H, 4-H), 7,67 (d, J = 1,2 Hz, 1H, 6'-H), 11,27 (br s, 1H NH); UV (H₂) max 266,0 (ε 10757); 266,5 (ε 9894) (pH 2); 266,3 (ε 8397) (pH 11); Anal., berechnet für C₉H₁₂O₅N₂: C, 47,36; H, 5,31; N, 12,28. Gefunden: C, 47,28; H, 5,34; N, 12,29.
(+)-1-[(2R,4S)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin (12).
Das Entschützen von 10 (60 mg, 0,13 mmol) gemäß dem gleichen Verfahren, wie zuvor für 11 beschrieben, ergab 12 (26 mg, 87,6 %) als weißen Schaum: [α]²⁵D + 10,7° (C 0,15, MeOH); ¹H NMR (DMSO-d₆) δ 1,79 (s, 3H, CH₃), 3,43 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 2H, CH₂OH), 4,02 (dd, J = 9,5, 3,3 Hz, 1H, 5-H), 4,28 (dd, J = 9,5, 5,6 Hz, 1H, 5-H), 5,00 (t, J = 6,0 Hz, 1H, OH), 5,47 (t, J = 3,7 Hz, 1H, 2-H), 6,17 (dd, J = 5,6, 3,3 Hz, 1H, 4-H), 7,43 (d, J = 1,2 Hz, 1H, 6'-H), 11,32 (br s, 1H NH); UV (H₂O) λ_max 266,5 (ε 9454); 266,5 (ε 9199) (pH 2); 266,3 (ε 6925) (pH = 11); Anal., berechnet für C₉H₁₂O₅N₂; C, 47,36; H, 5,31; N, 12,28. Gefunden: C, 47,22; H, 5,32; N, 12,16.
II. Anti-HIV-Aktivität von Dioxolannucleosiden
Im Gegensatz zu dem vorherigen Bericht, dass β-D-(±)-Dioxolanthymin eine niedrige Wirksamkeit gegen HIV in ATH8-Zellen aufweist, zeigte die enantiomerenreine β-Form 11 eine starke Anti-HIV-Aktivität (EC₅₀ = 0,3 μM). Es war überraschend herauszufinden, dass enantiomerenreines β-D-(–)-Dioxolan-T eine deutlich höhere Anti-HIV-Aktivität aufweist als die racemische Mischung der Verbindung. Dieser Unterschied kann auf Basis der Phosphorylierungsgeschwindigkeit von 11 in diesen Systemen erklärt werden. Wie erwartet, zeigte das α-Isomer 12 keine signifikante Anti-HIV-Aktivität.
β-D-(–)-Dioxolannucleoside können als Forschungswerkzeuge verwendet werden, um das Wachstum von HIV in vitro zu inhibieren, oder können pharmazeutisch verabreicht werden, um das Wachstum von HIV in vivo zu inhibieren.
Die Fähigkeit von β-D-(–)-Dioxolannucleosiden, HIV zu inhibieren, kann durch verschiedene experimentelle Techniken gemessen werden. Die hier verwendete Technik, die nachstehend im Detail beschrieben ist, misst die Inhibition der viralen Replikation in mit Phytohämagglutinin (PHA) stimulierten, humanen, peripheren, mononuklearen Blutzellen (PBM), die mit HIV-1 (Stamm LAV) infiziert sind. Die Menge an produziertem Virus wird durch Messen des durch das Virus codierten Reversetranskriptaseenzyms bestimmt. Die Menge des produzierten Enzyms wird mit einer HIV-Kontrolle verglichen. Das Verfahren ist nachstehend im Detail beschrieben.
Antiviraler und Cytotoxizitätsassay in humanen, peripheren, mononuklearen Blutzellen

A. Drei Tage alte Phytohämagglutinin-stimulierte PBM-Zellen (10⁶ Zellen/ml) von Hepatitis B und HIV-1-seronegativen gesunden Spendern wurden mit einer Konzentration von etwa 100 Mal der 50 % Gewebekultur-infektiösen Dosis (TICD 50) pro ml mit HIV-1 (Stamm LAV) infiziert und in Gegenwart und Abwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der antiviralen Verbindungen gezüchtet.
B. Etwa 45 Minuten nach der Infektion wurde das Medium mit der zu testenden Verbindung (2 Mal die Endkonzentration in Medium) oder ohne Verbindung zu den Kolben zugegeben (5 ml; Endvolumen 10 ml). AZT wurde als Positivkontrolle verwendet.
C. Die Zellen wurden dem Virus ausgesetzt (etwa 2 × 10⁵ dpm/ml, wie dies durch ein Reversetranskriptaseassay bestimmt wurde) und dann in einen CO₂-Inkubator verbracht. HIV-1 (Stamm LAV) wurde vom Center for Disease Control, Atlanta, Georgia bezogen. Die zur Züchtung der PBM-Zellen, zum Ernten des Virus und zum Bestimmen der reversen Transkriptase-Aktivität verwendeten Verfahren waren die von McDougal et al. (J. Immun. Meth. 76, 171–183, 1985) und Spira et al. (J. Clin. Meth. 25, 97–99, 1987) beschriebenen mit der Ausnahme, dass kein Fungizone in dem Medium enthalten war (siehe Schinazi, et al., Antimicrob. Agents Chemother. 32, 1784–1787 (1988)). Die reverse Transkriptase-Aktivität in der vireninfizierten Kontrolle betrug etwa 2 × 10⁵ dpm pro ml. Die Werte für blanke und nicht infizierte Zellkontrollen betrugen etwa 300 bzw. 1.000 dpm. Ähnliche Ergebnisse werden erzielt, wenn Schritt C vor Schritt B durchgeführt wird.
D. Am Tag 6 wurden die Zellen und der Überstand in ein 15-ml-Röhrchen überführt und bei etwa 900 g für 10 Minuten zentrifugiert. Fünf ml Überstand wurden entfernt und das Virus wurde durch Zentrifugation bei 40.000 Upm für 30 Minuten (Beckman 70.1 Ti-Rotor) konzentriert. Das solubilisierte Viruspellet wurde zur Bestimmung der Level an reverser Transkriptase weiterverarbeitet. Die Resultate sind in dpm/ml Probenüberstand ausgedrückt.

Die mittlere effektive Konzentration (EC₅₀) für (–)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin wurde durch das Verfahren der mittleren Wirksamkeit (Antimicrob. Agents Chemother. 30, 491–498 (1986)) bestimmt. Kurz gefasst, wird der Prozentsatz an Inhibition des Virus, wie er aus Messungen der reversen Transkriptase bestimmt wurde, gegen die mikromolekulare Konzentration der Verbindung aufgetragen. Der EC₅₀ ist die Konzentration an Verbindung, bei der es eine 50 %ige Inhibition des Viruswachstums gibt.
Der EC₅₀ von (–)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin in PBM-Zellen wurde mit 0,2 μM gemessen. Diese Aktivität schneidet im Vergleich mit 2',3'-Dideoxyadenosin (DDA, EC₅₀ = 0,91 μM), 3'-Azido-2',3'-Dideoxyuridin (AZDU, EC₅₀ = 0,18–0,46 μM) und 3'-Dideoxythymidin (DDT, EC₅₀ = 0,17 μM), bei denen es sich um strukturell ähnliche Verbindungen handelt, die bei der FDA die klinische Testphase durchlaufen, günstig ab.
III. Toxizität von Dioxolannucleosiden
Mit Mitogen stimulierte nicht infizierte humane PBM-Zellen (3,8 × 10⁵ Zellen/ml) wurden in Gegenwart und Abwesenheit von Wirkstoff unter ähnlichen Bedingungen wie den zuvor beschriebenen, für den antiviralen Assay verwendeten, gezüchtet. Die Zellen wurden nach 6 Tagen unter Verwendung eines Hemocytometers und des Tryptan-Blau-Ausschlussverfahrens, wie von Schinazi et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 22(3), 499 (1982) beschrieben, ausgezählt. Der IC₅₀ ist die Konzentration an Verbindung, die 50 % des normalen Zellwachstums inhibiert.
Der IC₅₀ von (–)-1-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]thymin wurde mit mehr als 100 μM gemessen, was anzeigt, dass die Verbindung in den untersuchten, nicht infizierten PBM-Zellen bis zu 100 μM nicht toxisch war.
IV. Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen
Menschen, die unter Krankheiten leiden, die durch eine HIV-Infektion ausgelöst werden, können durch Verabreichen einer effektiven Menge an β-D-(–)-Dioxolannucleosiden oder deren Salzen in Gegenwart eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers oder Streckmittels an den Patienten behandelt werden. Die aktiven Materialien können auf jeder geeigneten Route, z.B. oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch in flüssiger oder fester Form verabreicht werden.
Die aktive Verbindung ist in dem pharmazeutisch annehmbaren Träger oder Streckmittel in einer Menge enthalten, die ausreicht, um einem Patienten eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung zu verabreichen, um die HIV-Replikation in vivo zu inhibieren, ohne in dem behandelten Patienten schwerwiegende toxische Wirkungen hervorzurufen. Unter einer "HIV-inhibierenden Menge" wird eine Menge an aktivem Inhaltsstoff verstanden, die ausreichend ist, eine HIV-inhibierende Wirkung zu entfalten, wie dies z.B. durch einen Assay, wie einem der hierin beschriebenen, gemessen werden kann.
Die Zubereitungen sollten eine Serumkonzentration an aktivem Inhaltsstoff von etwa 0,2 bis 40 μM ergeben. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich liegt bei 0,2 bis 20 μM und besonders bevorzugt bei etwa 1 bis 10 μM.
Die pharmazeutischen Zubereitungen sollten eine Dosierung von 1 bis 60 Milligramm Verbindung pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag bereitstellen. Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Wirkstoffzusammensetzung wird von den Absorptions-, Inaktivierungs- und Ausscheidungsgeschwindigkeiten des Wirkstoffs wie auch anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, abhängen. Es ist anzumerken, dass die Dosierungswerte auch in Abhängigkeit von der Schwere des zu lindernden Zustands variieren werden. Es ist ferner verständlich, dass für ein bestimmtes Subjekt spezifische Dosisregime mit der Zeit gemäß dem individuellen Bedürfnis und dem professionellen Ermessen der Person, die die Zusammensetzungen verabreicht oder die die Verabreichung der Zusammensetzungen überwacht, eingestellt werden sollten, und dass die Konzentrationsbereiche, die hierin angegeben sind, nur beispielhaft sind und nicht dazu vorgesehen sind, den Rahmen oder die Ausführung der beanspruchten Zusammensetzung einzuschränken. Der aktive Inhaltsstoff kann auf einmal verabreicht werden oder kann auf eine Anzahl kleinerer Dosen, die zu verschiedenen Zeitintervallen verabreicht werden, aufgeteilt werden.
Ein bevorzugter Verabreichungsweg der aktiven Verbindung ist oral. Orale Zusammensetzungen werden im Allgemeinen ein inertes Streckmittel oder einen essbaren Träger aufweisen. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten verpresst werden. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung kann die aktive Verbindung mit Hilfsstoffen verarbeitet und in Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder Zusatzmaterialien können als Teil der Zusammensetzung enthalten sein.
Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jeden der folgenden Inhaltsstoffe oder Verbindungen einer ähnlichen Natur enthalten: Bindemittel, wie bspw. mikrokristalline Zellulose, Tragantgummi oder Gelatine; einen Hilfsstoff, wie bspw. Stärke oder Laktose, ein Sprengmittel, wie bspw. Alginsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Schmiermittel, wie bspw. Magnesiumstearat oder Sterote; ein Gleitmittel, wie bspw. kolloidales Siliciumdioxid; ein Süßmittel, wie bspw. Saccharose oder Saccharin; oder einen Geschmacksstoff, wie bspw. Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmack.
Wenn die Dosiseinheitsform eine Kapsel ist, kann diese zusätzlich zu dem Material des zuvor genannten Typs einen flüssigen Träger, wie ein Fettöl enthalten. Zusätzlich dazu können Dosiseinheitsformen verschiedene andere Materialien enthalten, die die physikalische Form der Dosiseinheit modifizieren, z.B. Beschichtungen aus Zucker, Schellack oder anderen enterischen Mitteln.
β-D-(–)-Dioxolannucleoside oder deren Salze können als Bestandteil eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Oblate, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßmittel und gewisse Konservierungsstoffe, Farben und Farbstoffe und Geschmacksstoffe enthalten.
β-D-(–)-Dioxolannucleoside oder deren Salze können auch mit anderen aktiven Materialien, die die gewünschte Wirkung nicht behindern, oder mit Materialien vermischt werden, die die gewünschte Wirkung unterstützen, wie bspw. Antibiotika, Antimykotika, Antiflogistika oder andere antivirale Wirkstoffe, einschließlich anderer nucleosidischer Anti-HIV-Verbindungen.
Lösungen oder Suspensionen, die für die parenterale, intradermale, subkutane oder topische Anwendung verwendet werden, können die folgenden Bestandteile einschließen: ein steriles Streckmittel, wie bspw. Wasser zu Injektionszwecken, eine Salzlösung, feste Öle, Polyethylenglykole, Glycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösemittel; antibakterielle Mittel, wie bspw. Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidanzien, wie bspw. Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Cheliermittel, wie bspw. Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie bspw. Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zum Einstellen der Spannkraft, wie bspw. Natriumchlorid oder Dextrose. Die parenterale Zubereitung kann in Ampullen, Spritzen zum Einmalgebrauch oder Violen mit mehreren Dosen, die aus Glas oder Plastik bestehen, enthalten sein.
Bei intravenöser Verabreichung, sind bevorzugte Träger eine physiologische Salzlösung oder eine phosphatgepufferte Salzlösung (PBS).
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die aktiven Verbindungen mit Trägern hergestellt, die die Verbindung gegen eine schnelle Eliminierung aus dem Körper schützen, wie bspw. Formulierungen mit kontrollierter Freisetzung einschließlich von Implantaten und mikroverkapselten Freisetzungssystemen. Biodegradierbare biokompatible Polymere, wie bspw. Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure können verwendet werden. Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen sind dem Fachmann offensichtlich. Die Materialien können auch kommerziell von der Alza Corporation und von Nova Pharmaceuticals Inc. bezogen werden. Liposomale Suspensionen (einschließlich von Liposomen, die mit monoklonalen Antikörpern gegenüber viralen Antigenen, auf infizierte Zellen zielen) sind ebenfalls als pharmazeutisch annehmbare Träger bevorzugt. Diese können in gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, wie diese z.B. im US-Patent Nr. 4,522,811 (das hierin unter Bezugnahme in seiner Gesamtheit aufgenommen ist) beschrieben sind. Liposomformulierungen können z.B. durch Auflösen des (der) geeigneten Lipids (Lipide) (wie bspw. Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin, Arachadoylphosphatidylcholin und Cholesterin) in einem anorganischen Lösemittel, das dann abgedampft wird, wobei eine dünne Schicht von getrockneten Lipiden an der Oberfläche des Behälters zurückgelassen wird, hergestellt werden. Eine wässrige Lösung der aktiven Verbindung oder ihrer Monophosphat-, Diphosphat- und/oder Triphosphatderivate wird dann in den Behälter eingebracht. Der Behälter wird dann von Hand geschwenkt, um das Lipidmaterial von den Seiten des Behälters zu befreien und die Lipidaggregate zu dispergieren, wodurch eine Liposomal-Suspension gebildet wird.
V. Herstellung von Phosphatderivaten von β-D-(–)-Dioxolannucleosiden
Mono-, Di- und Triphosphatderivate von β-D-(–)-Dioxolannucleosiden können, wie nachstehend beschrieben, hergestellt werden.
Das Monophosphat kann gemäß dem Verfahren von Imai et al., J. Org. Chem., 34(6), 1547–1550 (Juni 1969) hergestellt werden. So werden z.B. etwa 100 mg β-D-(–)-Dioxolannucleosid und etwa 280 μl Phosphorylchlorid unter Rühren in etwa 8 ml trockenem Essigsäureethylester bei etwa 0°C für etwa 4 Stunden umgesetzt. Die Reaktion wird mit Eis gequencht. Die wässrige Phase wird auf einer Aktivkohlesäule gereinigt, wobei mit 5 % Ammoniumhydroxid in einer 1:1-Mischung aus Ethanol und Wasser eluiert wird. Das Abdampfen des Eluats ergibt Ammonium-(β-D-(–)-dioxolannucleosid)-5'-monophosphat.
Das Diphosphat kann gemäß dem Verfahren von Davisson et al., J. Org. Chem., 52(9), 1794–1801 (1987) hergestellt werden. β-D-(–)-Dioxolannucleoside können aus dem entsprechenden Tosylat hergestellt werden, das z.B. durch Umsetzen des Nucleosids mit Tosylchlorid in Pyridin bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden und Aufarbeiten des Produkts auf übliche Weise (z.B. durch Waschen, Trocknen und Kristallisieren) hergestellt werden kann.
Das Triphosphat kann gemäß dem Verfahren von Hoard et al., J. Am. Chem. Soc., 87(8), 1785–1788 (1965) hergestellt werden. Das β-D-(–)-Dioxolannucleosid wird z.B. aktiviert (durch Herstellen eines Imidazolids gemäß dem Fachmann bekannter Verfahren) und mit Tributylammoniumpyrophosphat in DMF behandelt. Die Reaktion ergibt hauptsächlich das Triphosphat des Nucleosids mit etwas unreagiertem Monophosphat und etwas Diphosphat. Der Aufreinigung durch eine Anionenaustauschchromatografie auf einer DEAE-Säule folgt die Isolation des Triphosphats z.B. als das Tetranatriumsalz.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines enantiomerenreinen β-D-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]-nukleosids aus 1,6-Anhydromannose, das die folgenden Schritte aufweist: (i) Umwandeln von 1,6-Anhydromannose in ihr (2,3)-Isopropylidenderivat; (ii) Herstellen von (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan aus dem (2,3)-Isopropylidenderivat; und (iii) Kondensieren des (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolans aus Schritt (i) mit einer heterozyklischen Base in Gegenwart von SnCl₄, einer anderen Lewis Säure oder Trimethylsilyltriflat um ein enantiomerenreines β-D-[(2β,4β)-2-(Hydroxymethyl)-4-dioxolanyl]-nukleosid zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner Folgendes aufweist, nämlich das Umwandeln der (–)-1,6-Anhydro-4-O-benzoyl-2,3-isopropyliden-β-D-mannopyranose in (–)-1,6-Anhydro-4-O-benzoyl-β-D-mannopyranose welche dann zu (–)-(2R,4R)-4-(2-Benzoxy-1-hydroxyethyl)-2-(hydroxymethyl)-dioxolan oxidiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner das Schützen der 2-Hydroxy-Position des Dioxolans mit einer Sauerstoffschutzgruppe aufweist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Sauerstoffschutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Trimethylsilyl, Dimethylhexylsilyl, t-Butyldi methylsilyl, t-Butyldiphenylsilyl, Trityl, den Alkylgruppen, den Acylgruppen, Benzoyl, p-NO₂-Benzoyl, Toluyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl.
Verfahren nach Anspruch 3, das ferner Folgendes aufweist, nämlich das Entfernen der Benzoylgruppe von der 2-Hydroxyethyl-Position um (–)-(2R,4R)-2-(geschütztes O-Methyl)-4-(1,2-dihydroxyethyl)-dioxolan zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 5, das ferner Folgendes aufweist, nämlich das Oxidieren des (+)-(2R,4R)-2-(geschützten Oxymethyl)-4-carboxyldioxolans, um eine Verbindung zu bilden, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan.
Verfahren nach Anspruch 6, das ferner Folgendes aufweist, nämlich das Umwandeln von (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan in ein Produkt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (2R,4R)- und (2R,4S)-4-Acetoxy-2-(geschütztes oxymethyl)-dioxolan.