DE4223438A1

DE4223438A1 - Cyclische oligonucleotidphosphorthioate

Info

Publication number: DE4223438A1
Application number: DE4223438A
Authority: DE
Inventors: Carlo Battistini; Silvia Fustinoni; Maria Gabriella Brasca; Domenico Ungheri
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL; Carlo Erba SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1991-07-18
Filing date: 1992-07-16
Publication date: 1993-01-21
Also published as: ITMI921720A1; GB9115586D0; ITMI921720A0; GB2257704A; GB2257704B; IT1255222B; US5547941A; JPH05186495A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf cyclische Oligonucleotidphosphorthioate, auf ein Verfahren zu ihrer Herstellung und auf diese enthaltende pharmazeutische Zusammensetzungen.

Die Verbindungen dieser Erfindung können als antivirale, insbesondere als anti-HIV (Human Immunodeficiency Virus) Agenzien, nämlich als Arzneimittel gegen AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom) therapeutisch und/oder prophylaktisch nützlich sein.

Die vorliegende Erfindung stellt eine Verbindung der Formel (I) bereit

worin
jede Gruppe B unabhängig eine natürlich vorkommende oder eine modifizierte heterocyclische Base ist, die durch ein Stickstoffatom oder ein Kohlenstoffatom des Rings an den Zuckerteil gebunden ist;
jede Gruppe X unabhängig Wasserstoff, Fluor, Hydroxy oder eine C₁-C₆-Alkoxygruppe ist; und
jede Gruppe Y unabhängig Wasserstoff, Sulphidryl oder eine Hydroxygruppe ist.

Die vorliegende Erfindung schließt auch die pharmazeutisch akzeptablen Salze der Verbindungen der Formel (I) wie auch die möglichen Diastereomeren ein, die durch Formel (I) gedeckt sind, und zwar getrennt und in Mischung, ein.

Wenn B eine natürlich vorkommende heterocyclische Base ist, ist es z. B. vorzugsweise Cytosin, Thymin, Uracil, Guanin, Adenin oder Hypoxanthin; besonders bevorzugt ist Cytosin oder Thymin.

Wenn B eine modifizierte heteocyclische Base ist, ist es vorzugsweise z. B. Diaminopurin oder 8-Bromadenin.

Wenn X eine C₁-C₆-Alkoxygruppe ist, ist es vorzugsweise eine Methoxygruppe.

Besonders bevorzugt ist X ein Wasserstoff oder eine Hyroxygruppe.

Vorzugsweise ist Y eine Hydroxy- oder Sulphidrylgruppe.

In den Verbindungen der Formel (I) soll, wenn Y eine Hydroxygruppe ist, die Struktur

zueinander äquivalent sein.

Es ist auch beabsichtigt, daß in den Verbindungen der Formel (I) die Konfiguration am Phosphoratom unabhängig R (R_p- Konfiguration) oder S (S_p-Konfiguration) sein kann. Beide reine Diastereomere und Mischungen von Diastereomeren werden von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.

In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck diastereomere Verbindungen, die sich nur in der Konfiguration eines oder mehrerer ihrer chiralen Zentren (Stereoisomere) unterscheiden, aber welche keine Enantiomere sind (nicht übereinander legbare Spiegelbilder). Wie bereits gesagt, umfaßt die Erfindung auch die pharmazeutisch akzeptablen Salze der Verbindungen der Formel (I).

Die Salze umfassen Salze mit pharmazeutisch akzeptablen Basen, sowohl mit anorganischen Basen wie z. B. Alkalimetall-, beispielsweise Natrium- oder Kalium-Hydroxiden oder Ammoniakverbindungen, als auch mit organischen Basen, wie z. B. Alkylaminen, z. B. Methylaminen oder Triethylamin, Aralkylaminen, z. B. Benzylamin, Dibenzylamin, α- oder β-Phenylethylamin oder mit heterocyclischen Aminen wie z. B. Piperidin, 1- Methylpiperidin, Piperazin oder Morpholin.

Beispiele für spezifische Verbindungen, die bei dieser Vebindung bevorzugt werden, sind die folgenden Verbindungen, sowohl als reine R_pR_p- oder S_pR_p-Diastereomere als auch als diastereomere Mischungen von R_pR_p- und S_pR_p-Diastereomeren:
Cyclo-2-′-deoxy-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2-′-deoxy-P- thiocytidylyl-(3′→5′),
Cyclo-2′-deoxy-P-thiothymidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-P- thiothymidylyl-(3′→5′),
und die pharmazeutisch wirksamen Salze davon.

Ein bevorzugtes Salz gemäß der vorliegenden Erfindung ist das Dinatriumsalz von Cyclo-2′-deoxy-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′- deoxy-P-thiocytidylyl-(3′→5′) der Formel (II):

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können durch ein Verfahren hergestellt werden, das die folgenden Schritte umfaßt:

A) Umsetzen einer Verbindung der Formel (ii) worin
R₁ eine Hydroxy-Schutzgruppe ist,
B′ eine Gruppe B ist, wie sie oben definiert wurde, worin, wenn vorliegend, eine oder mehrere exocyclische Aminogruppen der heterocyclischen Base durch eine Amino- Schutzgruppe geschützt sind,
Z Sauerstoff oder Schwefel ist und X wie oben definiert ist, vorausgesetzt, daß, wenn X eine Hydroxygruppe ist, sie zweckmäßigerweise durch eine geeignete Hydroxy-Schutzgruppe geschützt ist,
mit einer Verbindung der Formel (iii) worin
R₃ eine Hydroxy-Schutzgruppe ist, die anders als R₁ entfernbar ist,
B′ und X wie oben definiert sind;
B) Fakultativ Thiooxidieren oder Oxidieren einer resultierenden Verbindung der Formel (iv) worin
R₁, B′, Z, X und R₃ wie oben definiert sind,
mit einem thiooxidierenden oder einem oxidierenden Agens;
C) Fakultativ Trennen des resultierenden diastereomeren Gemisches der Verbindung der Formel (v) worin
R₁, R₃, B′, Y und X wie oben definiert sind,
in die einzelnen Diasteremeren;
D) Entfernen der Schutzgruppe R₃ aus einer Verbindung der obigen Formel (v) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (vi) worin
R₁, B′, X und Y wie oben definiert sind;
E) Phosphorylieren oder Thiophosphorylieren der freien Hydroxygruppe in 3′-Position der Verbindung der obigen Formel (vi) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (vii) worin
R₁, B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
F) Entfernen der Gruppe R₁ aus einer Verbindung der obigen Formel (vii) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (viii) worin
B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
G) Cyclisieren einer Verbindung der Formel (viii) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (ix) worin
B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
H) Fakultativ Thiooxidieren oder Oxidieren einer Verbindung der obigen Formel (ix) mit einer thiooxidierenden oder einem oxidierenden Agens und, wenn notwendig, Entfernen der möglicherweise noch in einer Verbindung der Formel (ix) vorhandenen Schutzgruppen unter Erhalt der gewünschten Verbindung der Formel (I) und, wenn gewünscht, Trennen der diastereomeren Mischung einer Verbindung der Formel (I) in einzelne Diastereomere und/oder, wenn gewünscht, Bilden eines Salzes einer Verbindung der Formel (I) oder Darstellen einer freien Verbindung aus einem Salz.

Wenn in den vorstehenden Formeln B′ eine Gruppe B ist, worin eine oder mehrere exocyclische Aminogruppen an der heterocyclischen Base vorhanden sind, können die Aminogruppen durch eine geeignete Amino-Schutzgruppe wie z. B. Benzoyl oder Isobutyryl geschützt werden.

In der Verbindung der Formel (ii) und (iii) können die Hydroxy-Schutzgruppen beispielsweise Dimethoxytrityl, Monomethoxytrityl, Pixyl, Terbutyldimethylsilyl, Terbutyldiphenylsilyl, p-Nitrophenylethylcarbonyl, p- Chlorphenylsulphonylethoxycarbonyl, Fluorenylmethyloxycarbonyl oder 4-Methoxytetrahydropyran-4-yl sein.

Die Reaktion zwischen einer Verbindung der Formel (ii) und einer Verbindung der Formel (iii) und die intramolekulare Cyclisierung einer Verbindung der Formel (viii) kann in einem organischen Lösungsmittel wie z. B. Pyridin, Pyridin- Acetonitril oder Triethylamin-Acetonitril in Gegenwart eines kondensierenden Agens wie z. B. eines behinderten Acylhalids, Arylsulphonylchlorids oder Diarylchlorophosphats, vorzugsweise in Gegenwart von Trimethylacetylchlorid oder Adamantoylchlorid, durchgeführt werden. Die fakultative Thiooxidierung einer Verbindung der Formel (iv) in Schritt B) oder einer Verbindung der Formel (ix) in Schritt H) kann mit bekannten thiooxidierenden Agenzien durchgeführt werden, wie z. B. elementarem Schwefel (S₈); vorzugsweise mit einer Suspension von Schwefel in Pyridin, einer Lösung von Schwefel in Kohlenstoffdisulfid, 3H-1,2-Benzodithiol-3-on-1,1-dioxid in Triethylamin-Acetonitril, Aroyl-disulfid oder Arylacyldisulfid in Dichlorethan mit einer organischen Base oder Tetraethylthiuramdisulfid in Acetonitril.

Die fakultative Oxidation einer Verbindung der Formel (iv) in Schritt B) oder einer Verbindung der Formel (ix) in Schritt H) kann in einer in der Nukleotid-Chemie üblichen Arbeitsweise durchgeführt werden, beispielsweise mit Jod in einem geeigneten Lösungsmittel, wie z. B. Pyridin-Wasser.

Die fakultative Trennung des diastereomeren Gemisches der Verbindungen der Formel (v) in Schritt C) kann unter Verwendung bekannter Verfahren, die üblicherweise in der Chemie verwendet werden, wie z. B. Silicagel- Säulenchromatographie, durchgeführt werden.

Vom Schritt D) weg kann der synthetische Weg entweder mit der diastereomeren Mischung oder mit jedem einzelnen Diastereomeren ausgeführt werden.

Die Entfernung der Schutzgruppe von den geschützten Hydroxygruppen, die möglicherweise in Verbindungen, die im Verfahren involviert sind, kann üblicherweise mit einem zur Entfernung von Schutzgruppen geeigneten Agens ausgeführt werden, beispielsweise mit Tetrabutylammonium- oder Caesiumfluorid, wenn Silyl-Gruppen als Schutzmittel verwendet werden; oder Basen wie DBU (1,8-Diazobicyclo-[5.4.0]-indec-7- en) oder Triethylamin, wenn para-Nitrophenylethyloxycarbonyl-, p-Chlorphenylsulphonylethyloxycarbonyl-, Fluorenylethyloxycarbonyl-Gruppen als Schutzmittel verwendet werden; oder anorganische oder organische Säuren wie z. B. Benzolsulphonsäure oder Zink-bromid in aprotischem Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid, wenn Tritylgruppen, z. B. Dimethoxytrityl- oder Pixylgruppen als Schutzmittel verwendet werden.

Die freie Hydroxygruppe einer Verbindung der Formel (vi) kann phosphoryliert werden unter Verwendung eines geeigneten Phosphorylierungsagenses, wie z. B. Phosphortrichlorid, Phosphortristriazolid und N-Methylmorpholin in einem trockenen dipolaren aprotischen Lösungsmittel.

Die freie Hydroxygruppe einer Verbindung der Formel (VI) kann thiophosphoryliert werden unter Verwendung von Triethylammoniumphosphinat und Trimethylacetylchlorid in Pyridin und anschließende Thiooxidation mit Schwefel zu dem entsprechenden H-Phosphonthioat oder unter Verwendung von Phosphortristriazolid und anschließender Behandlung mit Hydrogensulfid und N-Methylmorpholin unter Erhalt des entsprechenden Hydrogenphosphondithioats, welches in Schritt G) unter Verwendung von N-Methyl-2-chlorpyridiniumjodid cyclisiert werden kann.

Die Entfernung der Amino-Schutzgruppen, die möglicherweise in der heterocyclischen Base vorliegen können, kann nach der intramolekularen Cyclisierung mit einem geeigneten Agens zur Entfernung der Amino-Schutzgruppe durchgeführt werden, z. B. mit Ammoniak in Wasser-Dioxan, Ethylendiamin in Ethanol oder wäßrigem Hydrazin in Pyridin-Essigsäure.

Die Verbindungen der Formeln (ii) und (iii) sind bekannte Verbindungen und können durch die folgenden bekannten Verfahren hergestellt werden.

Die Verbindungen der Formel (ii) können beispielsweise entsprechend dem Verfahren, das in "B. C. Froehler et al., Nucleic Acid Research 14, 5399, (1968)", beschrieben ist, hergestellt werden, und die Verbindungen der Formel (iii) können nach dem Verfahren, das in "K. Ogilvie, Nucleosides Nucleotides and their Biological Application, (1983), Academic Press, S. 2091" beschrieben ist, hergestellt werden.

Alternativ können die Kondensation von Schritt A), die Phosphorylierung von Schritt E) und die Cyclisierung von Schritt G) unter Verwendung analoger Verfahren, die auf diesem Gebiet wohl etabliert sind, beispielsweise der Hydroxy-benzo triazol- und der Phosphoramidit-Methode durchgeführt werden.

Ein bevorzugtes Beispiel für die Verwirklichung dieses Verfahrens ist in dem folgenden Schema I ausgeführt, welches die Herstellung der Verbindung, wie in Formel II dargestellt ist, zeigt, wobei von einem handelsüblich erhältlichen Nukleosid wie III ausgegangen wird.

Im einzelnen wurde ein 5′-O-geschütztes Nukleosid, das zweckmäßigerweise auch an der exocyclischen Aminogruppe des heterocyclischen Teils wie III geschützt ist, z. B. N⁴-Benzoyl- 5′-O-dimethoxytrityl-2′-deoxycytidin hergestellt, um mit einem P (III) Phosphortriazolid oder besser mit dem Produkt, hergestellt durch Vermischen von Phosphortrichlorid, Triazol und N-Methylmorpholin in trockenem Dichlormethan oder in anderem trockenen dipolaren aprotischen Lösungsmittel, nach einem bekannten Verfahren umzusetzen [B. C. Froehler et al., Nucleid Acid Research 14, 5399 (1986)], wobei ein Nukleotid- 3′-hydrogenphosphonat wie IV erhalten wurde.

Ein geeigneterweise geschütztes Nucleosid, das eine freie 5′- Hydroxygrupppe wie VI aufweist, kann aus der gleichen Ausgangsverbindung III durch Schutz der 3′-Position und Entfernung der Schutzgruppe aus der 5′-Position erhalten werden. Als Beispiel kann ein 5′-O-Dimethoxytrityl (DMT)- Derivat (V; R¹=DMT, R²=Benzoyl, R³=-Si(CH₃)₂C(CH₃)₃ hergestellt werden und die Schutzgruppe selektiv an der 5′- Position durch Säurebehandlung nach bekannten Verfahren entfernt werden: [K. Ogilvie, Nucleosides and their Biological Application, 1983, Academic Press, S. 209], wobei ein geschütztes Nucleosid wie VI erhalten wird.

Das Hydrogenphosphonat-Nucleotid vom Type IV und das Nucleosid vom Type VI können in einem trockenen Lösungsmittel wie Pyridin durch Zugabe eines kondensierten Agens, beispielsweise eines behinderten Acylhalids, vorzugsweise Trimethylacetylchlorid oder Adamantoylchlorid gekoppelt werden. Diesem Kopplungs-Vorgang muß ein Oxidationsschritt, der mit elementarem Schwefel (S₈) oder besser mit einer Suspension von Schwefel in Pyridin oder mit einer Lösung von Schwefel in Kohlenstoffdisulfid oder mit anderen bekannten thiooxidierenden Agenzien wie 3H-1,2-Benzo-dithiol-3-on-1,1- dioxid oder einem Aroyldisulfid oder einem Arylacyldisulfid oder Tetraethylthiouramdisulfid durchgeführt wird, folgen.

Dieses Verfahren ergibt eine hohe Ausbeute an geschütztem (3′→5′)Phosphorthioat-dinucleotid wie VII als eine Mischung von Diastereomeren, die sich in der Phosphor-Konfiguration (R_p oder S_p) mit einem Überschuß an S_p-Konfiguration (z. B. S_p : R_p= 65 : 35, wenn in VII R¹=DMT, R²=Benzoyl, R³= Si(CH₃)₂C(CH₃)₃) unterscheiden. Die beiden Diastereomeren können mittels Silicagel-Säulenchromatographie getrennt werden und die Konfiguration am Phosphoratom kann durch Merkmale, die auf der Analogie von analytischen Daten (z. B. ³¹P NMR und HPLC) mit anderen Daten in der Literatur und durch die unterschiedliche Empfindlichkeit der entsprechenden vollständig von Schutzgruppen befreiten Analogen auf die hydrolytische Wirkung von Enzymen zugeordnet werden. Der synthetische Weg zu dem cyclischen Oligonucleotid des Typs kann unabhängig durchgeführt werden, wobei vom S_p-VII oder R_p- VII-Diastereomeren ausgegangen wird.

Ein Dinucleotid wie VII als ein einzelnes Diastereomer wird selektiv von der Schutzgruppe an der 3′-Position befreit (z. B. mit Tetrabutylammoniumfluorid, wenn R³=Si(CH₃)₂C(CH₃)₃ ist), um ein Zwischenprodukt wie VIII zu erhalten. Die 3′- Hydroxylgruppe von VIII kann durch Behandlung mit einem P (III) phosphorylierenden Agens wie Phosphortrichlorid oder Phosphortriazolid, oder besser mit dem Produkt, das durch Mischen von Phosphortrichlorid, Triazol und N-Methylmorpholin in trockenem Dichlormethan oder in anderem trockenem dipolaren aprotischem Lösungsmittel erhalten wird, phosphoryliert werden unter Erhalt eines 3′-O-Hydrogenphosphonderivates vom Typ IX. An dieser Stelle des synthetischen Verfahrens kann die 5′- Position des Dinucleotids freigegeben werden durch eine geeignete Behandlung (z. B. einer Säurebehandlung mit Zinkbromid oder Benzolsulfonsäure in aprotischem Lösungsmittel, vorzugsweise bei niedriger Temperatur, wenn die Schutzgruppe R¹ eine Dimethoxytritylgruppe ist), um ein Zwischenprodukt wie X zu erhalten. Der Schlüsselschritt unseres synthetischen Verfahrens ist die intramolekulare Kondensation unter Erhalt eines cyclischen Rückgrates, welches ein neues Verfahren für einen neuen Strukturtyp ist. Sie wird durchgeführt durch Zugabe eines kondensierten Agens, z. B. eines behinderten Acylhalids, vorzugsweise Primethylacetylchlorid oder Adamantoylchlorid, zu einer Lösung des Dinucleotids X, das eine Konzentration in einem trockenen polaren aprotischen Lösungsmittel wie einem Gemisch aus Pyridin und Dimethylformamid hat, durch Überlassen des Reaktionsgemisches, besser unter Stickstoff-Atmosphäre und bei Raumtemperatur, der Reaktion für die notwendige Zeitspanne, vorzugsweise 30 bis 60 Min. In unseren Beispielen wird als nachfolgender Schritt, elementarer Schwefel (S₈) oder besser eine Suspension aus Schwefel in Pyridin, oder eine Lösung von Schwefel in Kohlenstoffdisulfid, oder andere bekannte thiooxodierende Agenzien zugegeben, um ein cyclisches Oligonucleotidphosphorthioat wie XI zu erhalten. Für den Fall des Schutzes der exocyclischen Aminogruppe an der heterocyclischen Base wie im Schema beispielhaft gezeigt, erreicht eine Behandlung (wie Ammoniak in Wasser-Dioxyn, wenn R² eine Benzoylgruppe ist) die Entfernung der letzten Schutzgruppe unter Erhalt der Endverbindung, die eine Struktur vom Typ II hat. Bemerkenswerterweise zeigt sich, daß die intramolekulare internucleotidische Kondensation vollständig stereoselektiv hinsichtlich R_p-Konfiguration ist, d. h. das eingeführte zweite chirale Phosphoratom hat nur R_p- Konfiguration, wie auch immer die Konfiguration des anderen zuerst eingeführten Phosphoratomes ist.

Wie oben erwähnt, kann die Konfiguration an dem Phosphoratom des Phosphorthioats-Internucleotid-Teils, das zuerst über den synthetischen Weg eingeführt wird, bestimmt werden durch Auswertung der Geschwindigkeit des enzymatischen Abbaus der vollständig von Schutzgruppen befreiten Analogen der getrennten Diastereomeren des synthetischen Zwischenproduktes, nämlich VIIa und VIIb, die in einem Verhältnis 35 : 65 in dem als repräsentatives Beispiel beschriebenen Fall erhalten werden. Die zwei Diastereomeren werden unabhängig voneinander an der Position 3′ in dem synthetischen Prozeß von der Schutzgruppe befreit, um die Zwischenprodukte VIIIa bzw. VIIIb zu erhalten. Allerdings können die beiden letzten Diastereomere unabhängig, abgesehen von dem synthetischen Verfahren, weiter von Schutzgruppen befreit werden, um für analytische Zwecke XIIa und XIIb als Endproben gemäß Schema 2 zu erhalten:

Die zwei Proben XIIa und XIIb können unabhängig voneinander einen enzymatischen Abbau durch Wirkung einer Exonuclease wie Schlangengift-Phosphodiesterase durchmachen, wobei das Verschwinden der Ausgangsprobe durch HPLC mit der Zeit verfolgt wird. In dem vorliegenden Beispiel wurde die Probe XIIa viel schneller abgebaut als die Probe XIIb. Dementsprechend wurde die Konfiguration R_p XIIa zugeordnet und die Konfiguration S_p XII zugeordnet. Demnach läuft das Verfahren für Oligodeoxyribonucleotidphosphorthioat, das das H-Phosphonatverfahren und Thio-Oxidation umfaßt, stereoselektiv in einem gewissen Grad zugunsten der S_p- Konfiguration, d. h. S_p : R_p 65 : 35.

Weitaus auffallender und unerwartet ist das Ergebnis der stereochemischen Erläuterung des Phosphorthioat-Teils, der im Cyclisierungsschritt gebildet wird, insbesondere des zweiten chiralen Phosphors, der über den synthetischen Weg eingeführt wird. Die Zuordnung der Konfiguration zu diesem Phosphoratom wurde aus der Tatsache abgeleitet, daß sowohl das offene Dinucleotid R_p (Xa) als auch das Diastereomer S_p (Xb) nach Cyclisierung zu XI nur eins der zwei möglichen Diastereomeren ergibt und das Reaktionsprodukt in den beiden Fällen unterschiedlich ist. Tatsächlich kann XIa und IIa das R_p,R_p- Diastereomer oder das R_p,S_p-Diastereomer sein, andererseits kann XIb und daher IIb das S_p,R_p-Diastereomer (welches identisch ist dem R_p,S_p-Diastereomeren) oder das S_p,S_p- Diastereomer sein.

Das ³¹P NMR-Spektrum von IIa zeigt nur ein Signal, welches für das R_p,R_p-Diastereomer zutrifft, im Gegensatz dazu zeigt das ³¹P NMR-Spektrum von IIb zwei Signale von gleicher Intensität, die eindeutig angeben, daß IIb das S_p-R_p-Diastereomer ist.

Zusammenfassend wird festgestellt, daß der Cyclisierungsschritt mit anschließender Thiooxidation unabhängig davon, ob vom R_p-uncyclisierten Dinucleotid Xa oder dem S_p-analogen Xb ausgegangen wird, durch eine vollständige R_p-Stereoselektivität gekennzeichnet ist.

Die Phosphorthioatbildung nach der in Schema 1 gezeigten Vorgehensweise umfaßt zwei Stufen: die internucleosidische Kupplung an ein H-Phosphonatderivat und eine nachfolgende Thiooxidation. Es wurde kürzlich nachgewiesen, [F. Seela, "9th International Round Table - Nucloesides, Nucleotides & their Biological Applications", July 30-August 3, 1990, Uppsala (Schweden)], daß die Thiooxidation von getrennten H- Phosphonatdiastereomeren ein "stereospezifisches" Verfahren ist. Diese Feststellung führt zu dem Schluß, daß sowohl in den Fällen der asymmetischen Induktion, die in unserem Verfahren vor sich geht, die Stereoselektivität tatsächlich auf der Stufe der Bildung des ersten neuen chiralen Zentrums stattfindet, nämlich auf der Stufe der Bildung des H- Phosphonatdiesters. Dies bedeutet, daß die hier beschriebenen Verfahren auch "stereoselektive" Verfahren für die Bildung von linearen Oligodeoxyribonucleotid-H-phosphonaten und cyclischen Oligodeoxyribonucleotid-H-phosphonaten sind.

Die Verbindungen der Formel (I) können als antivirale Agenzien, speziell als anti-HIV (Human Immunodeficiency Virus)-Agenzien nützlich sein und daher können sie in der Prophylaxe und/oder Behandlung von AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrome) verwendbar sein. Die genannten Verbindungen zeigen eine deutliche Wirksamkeit bei der Hemmung der HIV-Proliferation, beispielsweise bewirken sie eine wesentliche Hemmung der HIV-Replikation "in vitro".

Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung wurden auf antivirale Aktivität an peripheralen humanen Lymphozyten, die durch Dichte-Gradientenzentrifugation isoliert wurden und mit einem Mitogen stimuliert wurden, getestet.

Die Infektion wurde durchgeführt mit einer standardisierten Präparation von HIV und Zellen, die in Gegenwart des Arzneimittels 4 Tage lang kultiviert worden waren.

Es wurden einzelne Kulturen gebildet, um die virale Replikation 2, 3 und 4 Tage nach der Injektion zu messen. Die Menge an viralem Kernprotein P 24, das durch die befallenen Zellen freigesetzt wurde, wurde in der überstehenden Flüssigkeit der behandelten und unbehandelten Zellen an den Tagen 2, 3 und 4 durch eine Elisa-Analyse bestimmt.

Die Gesamtmenge an viraler RNA, die durch die befallenen Lymphozyten synthetisiert worden war, wurde an den Tagen 2, 3 und 4 mittels einer Nucleinsäure-Hybridisierungs-Technik bestimmt. Unter Einbeziehung einer Standard-Präparation von HIV-RNA wurde die Menge an synthetisierter RNA quantitativ bestimmt.

Die antivirale Wirkung, die durch die getesteten Verbindungen induziert wurde, wurde durch die Hemmung der bewerteten Parameter (z. B. P 24 oder RNA) im Vergleich mit infizierten Kontrollen errechnet.

Die Anti-HIV-Aktivitäten der repräsentativen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind in den Tabellen 1 und 2 aufgeführt.

Tabelle 1

Anti-HIV-Aktivität von Verbindung IIb

Tabelle 2

Anti-HIV-Aktivität von Verbindung IIa

Verbindung IIa stellt das R_pR_p-Diastereomer der Verbindung der Formel (II) (unser interner Code FCE 26660A) dar. Verbindung IIb stellt das S_pR_p-Diastereomer der Verbindung der Formel (II) (unser interner Code FCE 26661A) dar. Wie aus der obigen Tabelle 1 zu ersehen ist, war die Verbindung IIb bei der nicht-cytotoxischen Konzentration von 10 µM fähig, die HIV- p-24-Expression zu 100% am dritten Tag und zu 83% am vierten Tag zu hemmen und sie war fähig, eine Reduktion des HIV-RNA- Spiegels von 100% am dritten Tag und von 56% am vierten Tag nach Verabreichung der Verbindung zu erreichen.

Die Verbindungen der Erfindung können in einer Reihe von Dosierungsformen, z. B. oral in Form von Tabletten, Kapseln, mit Zucker oder Film überzogenen Tabletten, flüssigen Lösungen oder Suspensionen verabreicht werden; rektal in Form von Suppositorien; parenteral z. B. intramuskulär oder durch intravenöse Injektion oder Infusion, oder lokal.

Die Dosierung hängt vom Alter, Gewicht, Zustand des Patienten und Verabreichungsweg ab; beispielsweise kann die gewählte Dosis für i.v.-Verabreichung für erwachsene Menschen im Bereich von 10 bis 500 mg pro Dosis, 1- bis 4mal täglich liegen.

Die Erfindung umfaßt pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung als aktive Hauptkomponente in Verbindung mit einer pharmazeutisch akzeptablen Grundlage (welche ein Trägerstoff oder ein Verdünnungsmittel sein kann) umfassen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, werden üblicherweise nach herkömmlichen Verfahren hergestellt und werden in einer pharmazeutisch geeigneten Form verabreicht.

Beispielsweise können feste orale Formen zusammen mit der aktiven Verbindung Verdünnungsmittel, beispielsweise Laktose, Dextrose, Saccharose, Zellulose, Weizenstärke oder Kartoffelstärke, enthalten; Gleitmittel, wie z. B. Siliciumdioxid, Talk, Stearinsäure, Magnesium- oder Kalziumstearat und/oder Polyethylenglykole; Bindemittel, wie z. B. Stärken, Gummi arabicum, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose oder Polyvinylpyrrolidon; trennende Agenzien, beispielsweise eine Stärke, Alginsäure, Alginate oder Natrium-Stärkeglykolat; schäumende Mischungen; Farbstoffe; Süßstoffe; Benetzungsmittel, wie z. B. Lecithin, Polysorbate, Laurylsulfate; und im allgemeinen nichttoxische und pharmakologisch inaktive Substanzen, die in pharmazeutischen Formulationen gebräuchlich sind.

Die pharmazeutischen Präparationen können in bekannter Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Mittel des Mischens, Granulierens, Tablettierens, mittels Verfahren der Zucker- Beschichtung oder Film-Beschichtung.

Die flüssigen Dispersionen zur oralen Verabreichung können beispielsweise Sirupe, Emulsionen oder Suspensionen sein.

Die Sirupe können als Träger beispielsweise Saccharose oder Saccharose mit Glycin und/oder Mannit und/oder Sorbit enthalten; insbesondere kann ein Sirup, der diabetischen Patienten verabreicht wird, als Trägerstoffe nur Produkte enthalten, die nicht zu Glukose metabolisierbar sind oder nur in geringer Menge zu Glukose metabolisierbar sind, beispielsweise Sorbit.

Die Suspensionen und die Emulsionen können als Trägerstoff beispielsweise einen natürlichen Gummi, Agar, Natriumalginat, Pektin, Methylzellulose, Carboxymethylzellulose oder Polyvinylalkohol enthalten.

Die Suspensionen oder Lösungen für intramuskuläre Injektionen können zusammen mit der aktiven Verbindung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, beispielsweise steriles Wasser, Olivenöl, Ethyloleat, Propylenglykol und, wenn gewünscht, eine geeignete Menge Lidocainhydrochlorid enthalten.

Die Lösungen für intravenöse Injektionen oder Infusionen können als Träger beispielsweise steriles Wasser enthalten oder vorzugsweise können sie in Form von sterilen, wäßrigen isotonischen Salzlösungen vorliegen.

Die Suppositorien können zusammen mit der aktiven Verbindung einen pharmazeutisch akzeptablen Träger enthalten, beispielsweise Kakao-Butter, Polyethylenglykol, Polyoxyethylensorbitan-Fettsäureester als oberflächenaktives Mittel oder Lecithin.

Zusammensetzungen für örtliche Anwendung, wie z. B. Cremes, Lotionen oder Pasten, können beispielsweise durch Vermischen des aktiven Bestandteils mit einem herkömmlichen öligen oder emulgierenden Trägerstoff hergestellt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken. In diesen Beispielen sind NMR-Daten angegeben, die mit A das Nukleosid mit dem 5′-Ende (die linke obere der Strukturen wie in den Schemas gezeichnet) und mit B das Nukleosid mit dem 3′-Ende (die rechte untere der Strukturen wie in den Schemas gezeichnet) angeben.

Beispiele Beispiel 1 R_p und S_p N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(t.butyldimethylsilyl)- 2′-deoxycytidin-Triethylammonium-Salz (VIIa und VIIb mit R¹= DMT, R²=Bz, R³=TMDMS)

N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-doxycytidin-3′′- (hydrogenphosphonat)-Triethylammonium-Salz (IV) (8,8 g, 11,0 mmol) und N⁴-Benzoyl-3′-O-(t.butyldimethylsilyl)-2′- deoxycytidin (VI) (4,9 g, 11,0 mmol) wurden durch kombinierte Verdampfung mit trockenem Pyridin getrocknet und in dem gleichen Lösungsmittel (120 ml) gelöst. Destilliertes Trimethylacetylchlorid (3,39 ml, 27,5 mmol) wurden tropfenweise zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde unter Stickstoffatmosphäre 30 Min. lang bei Raumtemperatur gerührt. Elementarer Schwefel (3,52 g, 110 mmol) wurden zugegeben, und nach 3 Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Triethylamin (10 ml) beendet. Das Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum konzentriert, der Rückstand in Dichlormethan gelöst, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter Vakuum verdampft. Reinigung und Trennung der Diastereomeren R_p und S_p wurde durch Chromatographie mit zwei Silicagel-Säulen unter Verwendung eines linearen Gradienten von Ethylacetat zu Ethylacetat/Methanol 95 : 5. Die zwei Produkte wurden mit einer Gesamtausbeute von 70% erhalten.

Die Verbindung mit dem höheren R_f war das R_p-Isomer (VIIa) (3,87 g, 28% Ausbeute). Dünnschichtchromatographie auf Silicagel: R_f 0,34 bei Elution mit Ethylacetat/Methanol 85 : 15.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=0.07 (s, 6H, 2 SiCH₃); 0.66 (s, 9H, SiC(CH₃)₃); 2.1-2.6 (m, 4Hm CH₂2′A+CH₂2′B); 3.2-3.4 (m, 2H, CH₂5′A); 3.72 (s, 6H, 2 OCH₃); 3.7-4.1 (m, 3H, H4′B+CH₂5′B); 4.32 (m, 1H, H4′A); 4.50 (m, 1H, H3′B); 5.06 (m, 1H, H3′A); 6.15, 6.18 (zwei dd, J=6.3 Hz, 2H, H1′A+H1′B); 6.87 (d, J=8.5 Hz, 4H, aromatic H's ortho to OCH₃); 7.0-7.6 (m, 17H, aromatische H's+H5A+ H5B); 8.00 (d, J=7.3 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.12, 8.52 (zwei d, J=7.3 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.20 (bs, 2H, 2 NHCO).
³¹p NMR (81 MHz, DMSO-d₆): δ=54.22 (H₃PO₄ als externe Referenz.
FAB-MS: m/z 1201 ([M+Na]⁺); als Natriumsalz.

Die Verbindung mit niedrigerem R_f war das S_p Isomer (VIIb) (5.81 g, 42% Ausbeute). TLC auf Silicagel: R_f 0.25 Elutionsmittel Ethylacetat/Methanol 85 : 15.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=0.02 (s, 6H, 2 SiCH₃); 0.82 (s, 9H, SiC(CH₃)₃); 2.0-2.7 (m, 4Hm CH₂2′A+CH₂2′B); 3.2-3.5 (m, 2H, CH₂5′A); 3.67 (s, 6H, 2 OCH₃); 3.90 (m, 2H, CH₂5′B); 3.96 (m, 1H, H4′B); 4.28 (m, 1H, H4′A); 4.44 (m, 1H, H3′B); 5.04 (m, 1H, H3′A); 6.12, 6.16 (zwei dd, J= 6.4 Hz, 2H, H1′A+H1′B); 6.83 (d, J=8.5 Hz, 4H, aromatic H's ortho to OCH₃); 7.0-7.6 (m, 17H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.94 (d, J=7.3 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.12, 8.45 (zwei d, J=7.3 Hz, 2H, H6A+ H6B); 11.20 (bs, 2H, 2 NHCO).
³¹p NMR (81 MHz, DMSO-d₆): δ=54.70 (H₃PO₄ als externe Referenz.
FAB-MS: m/z 1201 ([M+Na]⁺); als Natriumsalz.

Beispiel 2 N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(R_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-2′-deoxycytidin- tetrabutylammonium-Salz (VIIIa mit R¹=DMT, R²=Bz)

0,2 m Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung in Tetrahydrofuran/Pyridin 4 : 1 (40 ml, 8 mmol) wurden zu N⁴- Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl- (3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(t.butyldimethylsilyl)-2′- deoxycytidin-triethylammonium-Salz (VIIA) (4,05 g, 3,2 mmol) gegeben und die resultierende Lösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck verdampft, der Rückstand wurde in Methylenchlorid gelöst und die organische Lösung wurde mit Wasser gewaschen. Die Reinigung wurde mit Silicagel- Säulenchromatographie durchgeführt, wobei mit Ethylacetat/Methanol 8 : 2 eluiert wurde, unter Erhalt der in der Überschrift genannten Verbindung (VIIIa) als ein weißer Feststoff (3,28 g, 80% Ausbeute).
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ=2.0-2.3 (m, 2H, CH₂2′B); 2.3-2.7 (m, 2H, CH₂2′A); 3.0-3.5 (m, 2H, CH₂5′A); 3.8-4.0 (m, 3H, H4′B+CH₂5′B); 4.30 (m, 2H, H3′B+H4′A); 5.02 (m, 1H, H3′A); 6.14, 6.16 (zwei dd, J=6.3 Hz, 2H, H1′A+ H1′B); 6.86 (d, J=8.8 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu OCH₃); 7.0-7.7 (m, 17H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.97 (d, J=7.0 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.09, 8.50 (two d, J=7.5 Hz, 2H, H6A+H6B).
FAB-MS (negative Ionen m/z 1041 ([M-H])^-)); als freie Säure.

Beispiel 3 N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-2′-deoxycytidin- tetrabutylammonium-Salz (VIIIb mit R¹=DMT, R²=Bz)

N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(t.butyldimethylisilyl)- 2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (VIIb) (4,15 g, 3,3 mmol) wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (VIIIb) erhalten wurde (4,4 g, 95% Ausbeute).
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ=1.9-2.3 (m, 2H, CH₂2′B); 2.3-2.6 (m, 2H, CH₂2′A); 3.0-3.4 (m, 2H, CH₂5′A); 3.69, 3.70 (two s, 6H, 2 OCH₃); 3.90 (m, 2H, CH₂5′B); 3.96 (m, 1H, H4′B); 4.28 (m, 2H, H3′B+H4′A); 5.02 (m, 1H, H3′A); 6.13, 6.17 (zwei m, 2H, H1′A,+H1′B); 6.85 (d, H=8.8 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu OCH₃); 7.0-7.7 (m, 17H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.98 (d, H=7.1 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.10, 8.47 (zwei d, J=7.3 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.17, 11.23 (zwei bs, 2H, 2NHCO).
FAB-MS: m/z 1087 ([M+Na]⁺); 1065 ([M+H]⁺); als Natriumsalz.

Beispiel 4 N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(hydrogenphosphonat)-2′- deoxycytidin-triethylammonium-Salz (IXa mit R¹=DMT, R²=Bz)

Eine gerührte Lösung von frischem destilliertem Phosphortrichlorid (1,1 ml, 12,5 mmol) und N-Methylmorpholin (13,8 ml, 125 mmol) in trockenem Methylenchlorid (125 ml) wurde bei Raumtemperatur zu 1,2,4-Triazol (2,93 g, 42,5 mmol), das unter Vakuum in Gegenwart von Phosphorpentoxid getrocknet worden war, gegeben.

Nach 30 Minuten wurde das Gemisch auf 0°C abgekühlt und eine Lösung von N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(R_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-2′-deoxycytidin- tetrabutylammonium-Salz (VIIIa) (3,2 g, 2,5 mmol) (getrocknet durch kombinierte Verdampfung mit Pyridin) inMethylenchlorid (40 ml) wurde tropfenweise über 20 Min. zugegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 10 Min. lang gerührt, dann in 1M wäßriges Triethylammoniumhydrocarbonat (100 ml) gegossen, geschüttelt und getrennt.

Die wäßrige Phase wurde mit Methylenchlorid extrahiert (100×3 ml), dann wurden die kombinierten organischen Phasen getrocknet (Na₂SO₄) und zu einem Schaum verdampft.

Die Reinigung mittels Silicagel-Säulenchromatographie bei Elution mit Methylenchlorid/Methanol/Triethylamin 70 : 30 : 2 ergab die in der Überschrift genannte Verbindung (IXa) (2,2 g, 67% Ausbeute) als weißen Schaum.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): i. a. 2.2-2.6 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.70 (s, 6H, 2 OCH₃); 3.9-4.4 (m, 4H, CH₂5′B)+H4′A+ H4′B); 4.90, 5.08 (zwei m, 2H, H3′A+H3′B); 6.65 (d, J=605 Hz, 1H, P-H); 6.18 (m, 2H, H1′A+H1′B); 6.87 (d, J=8.5 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu OCH₃); 7.0-7.6 (m, 17H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.98 (m, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.11, 8.60 (zwei m, 2H, H6A+H6B); 11.18, 11.24 (zwei bs, 2H, 2NHCO). FAB-MS (negative Ionen): m/z 1127 ([M+Na-2H]^-); als freie Säure.

Beispiel 5 N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(hydrogenphosphonat)-2′- deoxycytidin-triethylammonium-Salz (IXb mit R¹=DMT, R²=Bz)

N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-2′- deoxycytidintetrabutylammonium-Salz (VIIIb) (3,85 g, 3 mmol) wurde analog zu dem, was in Beispiel 4 beschrieben wurde, behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (IXb) (2,16 g, 55% Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ= 2.1-2.7 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.2-3.4 (m, 2H, CH₂5′A); 3.71 (s, 6H, 2 OCH₃); 3.9-4.2 (m, 3H, CH₂5′B+H4′B); 4.38 (m, 1H, H4′A); 4.80, 5.10 (zwei m, 2H, H3′A+H3′B); 6.18 (m, 2H, H1′A+H1′B); 6.65 (d, J=605 Hz, 1H, P-H); 6.85 (d, J=8.5 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu OCH₃); 7.0-7.6 (m, 17H, aromatische H's+H5A+H5B); 8.00, 8.01 (two d, H=7.3 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.07, 8.38 (zwei d, J=7.3 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.09 (bs, 2H, 2 NHCO).

Beispiel 6 N⁴-Benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′- O-(hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (Xa mit R₂=Bz)

Benzolsulfonsäure (1,53 g, 9,67 mmol) wurden zu einer eisgekühlten Lösung von N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′- deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O- (hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (IXa) (2,0 g, 1,53 mmol) in Methylenchlorid/Methanol 7 : 3 (76 ml) gegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde 10 Min. lang gerührt, dann wurde es in 1,0 M wäßriges Triethylammoniumhydrogencarbonat (100 ml gegossen. Die organische Phase wurde einige Male mit Wasser gewaschen, dann wurden die wäßrigen Extrakte gesammelt und unter reduziertem Druck konzentriert. Das Rohprodukt wurde mittels reverse-phase-Säulenchromatographie auf R_p 8 gereinigt, wobei ein linearer Gradient von 0% bis 20% Acetonitril in Wasser verwendet wurde, um die in der Überschrift genannte Verbindung (Xa) als ein weißes Lyophil (1,12 g, 73% Ausbeute) zu erhalten.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=2.0-2.6 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.68 (m, 2H, CH₂5′A); 4.2-4.4 (m, 4H, H4′A+ H4′B+CH₂5′B); 4.88 (m, 2H, H3′A+H3′B); 6.17 (m, 2H, H1′A+H1′B); 6.62 (d, J=605 Hz, 1H, P-H); 7.2-7.6 (m, 8H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.98 (d, J=7.4 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.40, 8.61 (zwei d, J=8.0 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.20 (bs, 2H, 2 NHCO).
FAB-MS: m/z 827 ([M+Na]⁺); als freie Säure.

Beispiel 7 N⁴-Benzoyl-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′- O-(hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (Xb mit R²=Bz)

N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidyl- (3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin- triethylammonium-Salz (IXb) (2,19 g, 1,67 mmol) wurden analog zu der in Beispiel 6 beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (Xb) (1,01 g, 60% Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=2.1-2.7 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.66 (m, 2H, CH₂5′A); 4.0-4.3 (m, 4H, H4′A+ H4′B+CH₂5′B); 4.94 (m, 1H, H3′B); 5.01 (m, 1H, H3′A); 6.16, 6.20 (zwei m, 2H, H1′A+H1′B); 6.65 (d, J=600 Hz, 1H, P-H); 7.2-7.7 (m, 8H, aromatische H's+H5A+H5B); 7.98, 8.01 (zwei d, J=7.0 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.33, 8.39 (zwei d, J=7.3 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.15 (bs, 2H, 2NHCO).
FAB-MS: m/z 871 ([M+Na]⁺); 849 ([M+H]⁺); als Natriumsalz.

Beispiel 8 Cyclo-N⁴-benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴- benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)- triethylammonium-Salz (XIa mit R²=Bz)

N⁴-Benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′- O-(hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (Xa) (0,84 g, 8,34 mmol) wurden durch gemeinsames Verdampfen mit Pyridin getrocknet, in Pyridin (23 ml) und Dimethylformamid (2 ml) gelöst.

Trimethylacetylchlorid (0,3 ml, 2,5 mmol) wurden tropfenweise zugegeben und das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Min. unter Stickstoffatmosphäre gerührt. Es wurde elementarer Schwefel (2,76 g, 83,4 mmol) zugegeben und nach drei Stunden wurde die Reaktion durch Zugabe von Diethylamin (5 ml) abgebrochen.

Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, das Rohprodukt wurde mit Wasser gewaschen und der Schwefelüberschuß abfiltriert.

Die wäßrige Lösung wurde durch reverse-phase- Säulenchromatographie hinsichtlich R_p 8 unter Verwendung von Wasser/Acetonitril 9 : 1 gereinigt. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden kombiniert und unter Erhalt der in der Überschrift genannten Verbindung (XIa) als weißer Feststoff (0,47 g, 55% Ausbeute) lyophilisiert.
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ=2.2-2.5 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.7-4.1 (m, 6H, H4′A+H4′B+CH₂5′A+CH₂5′B); 4.69 (m, 2H, H3′A+H3′B); 6.03 (m, 2H, H1′A+H1′B); 7.32 (d, J=7.5 Hz, 2H, H5A+H5B); 7.46 (m, 4H, aromatische H's meta zu CONH); 7.55 (m, 2H, aromatische H's para zu CONH); 7.94 (d, J=7.6 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.39 (d, J=7.5 Hz, 2H, H6A+H6B); 11.17 (bs, 2H, 2NHCO).
FAB-MS: m/z 841 ([M+Na]⁺); 819 ([M+H]⁺); als freie Säure.

Beispiel 9 Cyclo-N⁴-benzoyl-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴- benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)- triethylammonium-Salz (XIb mit R²=Bz)

N⁴-Benzoyl-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′- O-(hydrogenphosphonat)-2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (Xb) (1,01 g, 1,0 mmol) wurde analog der in Beispiel 8 beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (XIb) (0,5 g, 49% Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=2.3-2.6 (m, 2H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.7-4.2 (m, 6H, H4′A+H4′B+CH₂5′A+CH₂5′B); 4.77 (m, 2H, H3′A+H3′B); 6.05 (m, 2H, H1′A+H1′B); 7.29 7.37 (zwei bs, 2H, H5A+H5B); 7.47 (m, 4H, aromatische H's meta zu CONH); 7.58 (m, 2H, aromatische H's para zu CONH); 7.98 (d, J=7.6 Hz, 4H, aromatische H's ortho zu CONH); 8.40, 8.66 (zwei d, J=7.6 Hz, 2H, H6A+H6B); 10.96, 11.04 (zwei bs, 2H, 2NHCO).
FAB-MS: m/z 841 ([M+Na]⁺); als freie Säure.

Beispiel 10 Cyclo-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2-deoxy-(R_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz (IIa)

Cyclo-N⁴-benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴- benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)- triethylammonium-Salz (XIa) (0,33 g, 0,32 mmol) wurden in 17%iger wäßriger Ammoniaklösung (87 ml) gelöst und in einem verschlossenen Gefäß drei Stunden bei 50°C gerührt.

Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Vakuum konzentriert.

Der Rückstand wurde in Wasser gelöst und das unlösliche Benzoylamid wurde abfiltriert.

Das Filtrat wurde durch reverse-phase-Säulenchromatographie hinsichtlich R_p 8 gereinigt, wobei mit Wasser eluiert wurde. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden lyophilisiert und der so erhaltene weiße Farbstoffe wurde in Wasser gelöst und durch eine Dowex-50W-X8 Natrium-Kationen- Austauscher-Säule passieren gelassen. Die resultierende wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet unter Erhalt der in der Überschrift genannten Verbindung als Natriumsalz (IIa) (180 mg, 85% Ausbeute).
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=2.0-2.4 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.6-4.0 (m, 6H, CH₂5′A+CH₂5′B+H4′A+H4′B); 4.68 (m, 2H, H3′A+H3′B); 5.66 d, J=7.5 Hz, 2H, H5A+ H5B); 5.99 (m, 2H, H1′A+H1′B); 7.02, 7.16 (zwei bs, 4H, 2 NH₂); 7.82 (d, J=7.5 Hz, 2H, H6A+H6B).
³¹p NMR (81 MHz, DMSO-d₆): δ=53.03 (H₃PO₄) als externe Referenz.
FAB-MS: m/z 655 ([M+H]⁺); als Natriumsalz.

Beispiel 11 Cyclo-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2-deoxy-(R_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz (IIb)

Cyclo-N⁴-benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴- benzoyl-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)- triethylammonium-Salz (XIb) (0,5 g, 0,49 mmol) wurde analog der in Beispiel 10 beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (IIb) (0,23 g, 72% Ausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=2.0-2.4 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.6-4.0 (m, 6H, CH₂5′A+CH₂5′B+H4′A+H4′B); 4.68 (m, 2H, H3′A+H3′B); 5.64, 5.73 (zwei d, J=7.5 Hz, 2H, H5A+H5B); 5.99 (zwei m, 2H, H1′A+H1′B); 6.92, 7.00, 7.11, 7.15 (zwei bs, 4H, 2 NH₂); 7.78, 8.10 (zwei d, J=7.5 Hz, 2H, H6A+H6B).
³¹P NMR (81 Mhz, DMSO-d₆): δ=53.19, 52.94 (H₃PO₄ als externe Referenz.
FAB-MS: m/z 677 ([M+Na]⁺); 655 ([N+H]⁺); als Natriumsalz.

Beispiel 12 2′-Deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxycytidin- Natriumsalz (XIIa)

0,2 M Tetrabutylammoniumfluorid-Lösung in Tetrahydrofuran/Pyridin 4 : 1 (3,125 ml) wurde zu N⁴-Benzoyl-5′- O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴- benzoyl-3′-O-(t-butyldimethylsilyl)-2′-deoxycytidin- triethylammonium-Salz (VIIa) 310 mg, 0,25 mmol) gegeben, und die resultierende Lösung wurde wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt, wobei ein Rohprodukt (VIIIa) erhalten wurde, welches für den nachfolgenden Schritt verwendet wurde.

Der Rückstand VIIIa wurde in Dioxan (29 ml) gelöst und 30%ige wäßrige Ammoniaklösung wurde zugegeben (39 ml). Das Reaktionsgemisch wurde wie in Beispiel 10 behandelt. Benzolsulfonsäure (0,25 g) wurde zu einer eisgekühlten Lösung des oben erhaltenen Rohproduktes in Methylenchlorid/Methanol 7 : 3 (12,5 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Min. lang gerührt, dann wurde in 1,0 M wäßriges Triethylammoniumhydrogencarbonat (20 ml) gegeben. Die wäßrige Schicht wurde mit Diethylether gewaschen und unter reduziertem Druck konzentriert.

Das Rohprodukt wurde durch reserve-phase-Säulenchromatographie hinsichtlich R_p 8 gereinigt, wobei mit Wasser eluiert wurde. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden lyophilisiert und der so erhaltene weiße Feststoff wurde in Wasser gelöst und durch eine Dowex-50W-X8-Natriumkationen- Austauscher-Säule gegeben.

Die resultierende wäßrige Lösung wurde gefriergetrocknet, unter Erhalt der in der Überschrift genannten Verbindung als Natriumsalz (XIIa) (80 mg, 58% Gesamtausbeute).
¹H NMR (200 MHz, DMSO-d₆): δ=1.8-2.3 (m, 4H, CH₂2′A+ CH₂2′B); 3.57 (m, 2H, CH₂5′A) 3.8-3.9 (m, 3H, CH₂5′B+ H4′B); 4.01 (m, 1H, H4′A); 4.25 (m, 1H, H3′B); 4.76 (m, 1H, H3′A); 5.71 (dm J=7.5 Hz, 2H, H5A+H5B); 6.17 (m, 2H, H1′A+H1′B); 7.0-7.2 (bs, 4H, 2 HN₂); 7.79, 7.92 (zwei d, J=7.5 Hz, 2H, H6A+H6B).
³¹P NMR (81 MHz, DMSO-d₆): δ=54.27 (H₃PO₄ als externe Referenz.
FAB-MS: m/z 555 ([M+H]⁺)
.

Beispiel 13 2′-Deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxycytidin- Natriumsalz (XIIb)

N⁴-Benzoyl-5′-O-(dimethoxytrityl)-2′-deoxy-(S_p(-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-N⁴-benzoyl-3′-O-(t.butyldimethylsilyl)- 2′-deoxycytidin-triethylammonium-Salz (VIIb) (400 mg, 0,32 mmol) wurden analog der in Beispiel 12 beschriebenen Arbeitsweise behandelt, wobei die in der Überschrift genannte Verbindung (XIIb) (100 mg, 55% Gesamtausbeute) erhalten wurde.
¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆): δ=1.8-2.0 (m, 2H, CH(H)2′A+ CH(H)2′B); 2.01 (m, 1H, CH(H)2′B); 2.25 (m, 1H, CH(H)2′A); 3.53 (m, 2H, CH₂5′A); 3.7-3.9 (m, 3H, CH₂5′B+ H4′B); 3.95 (m, 1H, H4′A); 4.21 (m, 1H, H3′B); 4.73 (m, 1H, H3′A); 5.69, 5.70 (zwei d, J=7.2 Hz, 2H, H5A+H5B); 6.11 (m, 1H, H′A); 6.17 (m, 1H, H1′B); 6.9-7.1 (bs, 4H, 2 NH₂); 7.75, 7.89 (d, J=7.2 Hz, 2H, H6A+H6B).
³¹P NMR (81 MHz, DMSO-d₆): δ=54.45 (H₃PO₄ als externe Referenz.
FAB-MS: m/z ([M+Na]⁺); 555 ([M+H]⁺).

Beispiel 14 Enzymatische Hydrolyse der von Schutzgruppen befreiten Dinucleotid-thiophosphate

Die relative Empfindlichkeit der beiden Substrate XIIa und XIIb gegenüber Hydrolyse durch Schlangengift-Phosphodiesterase wurde bestimmt, indem eine Lösung (3 mM) von jedem Substrat in Tris-Puffer (25 mM), der MgCl₂ (5 mM) enthielt, bei pH 8 mit dem Enzyl (1 mg in 0,5 ml) (von Crotalus durissus), bezogen von Behringer, unkubiert wurde und das Verschwinden des Substrates durch HPLC verfolgt wurde. Insbesondere wurde für jedes Substrat eine Lösung, bestehend aus 700 µl Puffer, 200 µl Substratlösung plus µl Enzymlösung, hergestellt. Für jedes Substrat wurde eine Kontrolle mit denselben Bestandteilen und Volumen, außer daß das Enzym durch ein äquivalentes Volumenpuffer ersetzt wurde, hergestellt. Die vier Lösungen (die zwei Substrate und die zwei Kontrollen) wurde bei 37°C inkubiert, wobei gleiche Teile von jeder Lösung bei einer Zeit 0, nach 1 Stunde, nach 17 Stunden entnommen wurden. Diese Teilmengen wurden durch HPLC analysiert (Whatman Partisphere C18, eluiert mit einem linearen Gradienten von 10% bis 30% Methanol/0,1 M Ammoniumacetat) bei 220 nm analysiert.

Lediglich XIIa zeigte eine merkliche Reduktion im Bereich des HPLC-Peaks im Vergleich zu der Kontrolle: 50% nach 1 Stunde und 72% nach 17 Stunden. Dies zeigte die R_p-Konfiguration für XIIa an.

Im anderen Fall blieb das Dinucleotid XIIb größtenteils unverändert sowohl nach 1 Stunde wie nach 17 Stunden, was die S_p-Konfiguration für das Substrat anzeigt.

Beispiel 15

Tabletten, die jeweils 0,250 g wiegen und 50 mg der aktiven Substanz enthalten, können wie folgt hergestellt werden:

Zusammensetzung (für 10.000 Tabletten)
Cyclo-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz	500 g
Lactose	1400 g
Weizenstärke	500 g
Talkpulver	80 g
Magnesiumstearat	20 g

Das Cyclo-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-(R_p)- P-thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz, die Lactose und die Hälfte der Weizenstärke werden gemischt. Die Mischung wird dann durch ein Sieb von 0,5 mm Maschengröße gedrückt. Weizenstärke (10 g) wird in warmem Wasser (90 ml) suspendiert und die resultierende Pase wird verwendet, um das Pulver zu granulieren. Das Granulat wird getrocket, in einem Sieb von 1,4 mm Maschengröße zerkleinert, dann wird die verbleibende Menge an Stärke, Talk und Magnesium zugegeben, sorgfältig gemischt und zu Tabletten verarbeitet.

Beispiel 16

Kapseln, jede dosiert zu 0,200 g und 20 mg der aktiven Substanz enthaltend, können wie folgt hergestellt werden:

Zusammensetzung (für 500 Kapseln)
Cyclo-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-(R_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz	10 g
Lactose	80 g
Weizenstärke	5 g
Magnesiumstearat	5 g

Diese Formulation kann in harten zweiteiligen Gelatine-Kapseln eingekapselt werden und zu 0,200 g für jede Kapsel dosiert werden.

Beispiel 17 Intravenöse Injektion 25 mg/ml

Eine injizierte pharmazeutische Zusammensetzung kann hergestellt werden durch Lösen von 25 g Cyclo-2′-deoxy-(S_p)-P-thiocytidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-(R_p)-P- thiocytidylyl-(3′→5′)-Natriumsalz in steriler wäßriger Salzlösung zur Injektion (1000 ml) und Verschließen in Ampullen von 1-5 ml.

Claims

1. Verbindung der Formel (I) worin
jede Gruppe B unabhängig eine natürlich vorkommende oder modifizierte heterocyclische Base ist, die durch ein Stickstoff- oder ein Kohlenstoffatom des Rings an den Zuckeranteil gebunden ist;
jede Gruppe X unabhängig Wasserstoff, Fluor, Hydroxy oder eine C₁-C₁₆-Alkoxygruppe ist;
jede Gruppe Y unabhängig Wasserstoff, Sulphidryl oder Hydroxy ist; und
die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

2. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, worin jede Gruppe B unabhängig Cytosin, Thymin, Uracil, Guanin, Adenin oder Hypoxanthin ist;
X Wasserstoff ist;
Y Hydroxy ist; und
die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

3. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, welche ist
Cyclo-2′-deoxy-P-thiocytidilyl-(3′→5′)-2′-deoxy-P- thiocytidylyl-(3′→5′) oder
Cyclo-2′-deoxy-P-thio-thymidylyl-(3′→5′)-2′-deoxy-P- thiothymidylyl-(3′→5′) in der Form von R_pR_p oder S_pR_p-Diastereomer oder als diastereomeres Gemisch, sowie die pharmazeutisch akzeptablen Salze davon.

4. Verfahren zum Herstellen einer Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt:

A) Reaktion einer Verbindung der Formel (ii) worin
R₁ eine Hydroxygruppe ist;
B′ eine Gruppe B wie in Anspruch 1 definiert ist, worin, wenn vorhanden, eine oder mehrere exocyclische Aminogruppen der heterocyclischen Base durch eine Amino- Schutzgruppe geschützt sind;
Z Sauerstoff oder Schwefel ist und
X wie in Anspruch 1 definiert ist, vorausgesetzt, daß, wenn X eine Hydroxygruppe ist, sie zweckmäßigerweise durch eine geeignete Hydroxy-Schutzgruppe geschützt ist, mit einer Verbindung der Formel (iii) worin
R₃ eine Hydroxy-Schutzgruppe ist, die anders als R₁ abspaltbar ist;
B′ und X wie oben definiert sind;
B) fakultativ Thiooxidieren oder Oxidieren einer resultierenden Verbindung der Formel (iv) worin
R₁, B′, Z, X und R₃ wie oben definiert sind, mit einem thiooxidierenden oder oxidierenden Agens;
C) fakultativ Trennen des diastereomeren Gemisches einer Verbindung der Formel (v) worin
R₁, R₃, B′, Y und X wie oben definiert sind und worin Y wie in Anspruch 1 definiert ist, in die einzelnen Diastereomeren;
D) Entfernen der Schutzgruppen R₃ aus einer Verbindung der obigen Formel (v) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (vi) worin
R₁, B′, X und Y wie oben definiert sind;
E) Phosphorylierung oder Thiophosphorylierung der freien Hydroxygruppe in 3′-Position der Verbindung der obigen Formel (vi) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (vii) worin
R₁, B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
F) Entfernen der Gruppe R₁ aus einer Verbindung der obigen Formel (vii) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (viii( worin
B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
G) Cyclisierung einer Verbindung der Formel (viii) unter Erhalt einer Verbindung der Formel (ix) worin B′, X, Y und Z wie oben definiert sind;
H) fakultativ Thiooxidieren oder Oxydieren einer Verbindung der obigen Formel (ix) mit einem thiooxidierenden oder oxidierenden Agens und, wenn notwendig, Entfernen der Schutzgruppen, die möglicherweise noch in einer Verbindung der Formel (ix) vorliegen, unter Erhalt der gewünschten Verbindung der Formel (I) und, wenn gewünscht, Trennen des diastereomeren Gemisches einer Verbindung der Formel (I) in einzelne Diastereomere und/oder, wenn gewünscht, Bildung eines Salzes aus einer Verbindung der Formel (I) oder Gewinnen einer freien Verbindung aus einem Salz.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend einen geeigneten Träger und/oder Verdünnungsmittel und als wirksame Hauptkomponente eine Verbindung der Formel (I) wie in Anspruch 1 definiert oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon.

6. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung als ein antivirales Agens.

7. Verbindung der Formel (I) nach Anspruch 1 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS.

8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung als ein antivirales Agens.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz davon zur Verwendung bei der Behandlung von AIDS.

10. Verwendung einer Verbindung der Formel (I), wie sie in Anspruch 1 definiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon, bei der Herstellung eines Medikaments, das Aktivität gegen virale Infektionen aufweist.