BR112015013440B1 - composições compreendendo dinucleotídeos de purina cíclicos com estereoquímicas - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO DINUCLEOTÍDEOS DE PURINA CÍCLICOS COM ESTEREOQUÍMICAS É um objeto da presente invenção fornecer estimuladores imunes de cíclico-di-nucleotídeos (CDN) altamente ativos e novos que ativam DCs através de um receptor citoplasmático recentemente descoberto, conhecido como STING (Estimulador de Genes Interferon). Em particular, CDNs da presente invenção são fornecidos sob a forma de uma composição que inclui um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos que induzem a ativação de TBK1 dependente de STING, na qual os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são estereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros e particularmente substancialmente diastereoisômeros de tiofosfato Rp, Rp ou RpSp CDN puros.

Description

[1] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente US provisório 61/737.006, depositado em 13 de Dezembro de 2012, e ao Pedido de Patente US provisório 61/790.514, depositado em 15 de Março de 2013, que são por este meio incorporados em sua totalidade, incluindo todas as tabelas, figuras, e reivindicações.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[2] A seguinte discussão dos fundamentos da invenção é fornecida apenas para auxiliar o leitor na compreensão da invenção e não é admitida descrever ou constituir o estado da técnica da presente invenção.

[3] O sistema imunológico humano em geral pode ser dividido em dois ramos, conhecidos como "imunidade inata" e "imunidade adaptativa". O ramo inato do sistema imunológico é predominantemente responsável pela reação inflamatória inicial através de uma série de fatores solúveis, incluindo o sistema de complemento e o sistema de quimiocina/citocina; e um número de tipos de células especializadas, incluindo mastócitos, macrófagos, células dendríticas (DCs) e células assassinas naturais. Em contraste, o ramo imune adaptativo envolve uma resposta de anticorpo atrasada e mais duradoura juntamente com respostas de células T CD8+ e CD4+ que desempenham um papel crítico na memória imunológica contra um antígeno. Um terceiro ramo do sistema imunológico pode ser identificado como envolvendo células T YÕ e células T com repertórios de receptor de célula T limitados, tais como células MAIT e células NKT.

[4] Para uma resposta imune eficaz a um antígeno, células que apresentam antígenos (APCs) devem processar e exibir o antígeno em um contexto apropriado de MHC para uma célula T, que então resultará em qualquer estimulação de células T colaboradoras (linfócitos T auxiliares) e citotóxicas. Após a apresentação de antígeno, interação bem sucedida de moléculas coestimulatórias em ambas APCs e células T devem ocorrer ou ativação será abortada. GM-CSF e IL-12 servem como moléculas pró- inflamatórias eficazes em muitos modelos de tumor. Por exemplo, GM-CSF induz células precursoras de mielóides a se proliferarem e se diferenciarem em células dendríticas (DCs) embora sinais adicionais sejam necessários para ativar sua maturação para células apresentadoras de antígeno eficazes necessárias para a ativação de células T. Barreiras a terapias imunes eficazes incluem tolerância ao antígeno alvo que pode limitar a indução de células T CD8 citotóxicas de magnitude e função apropriadas, tráfico pobre das células T geradas para sítios de células malignas e persistência pobre da resposta induzida por células T.

[5] DCs que fagocitam restos de células de tumor processam o material para a apresentação de complexo principal de histocompatibilidade (MHC) regulam positivamente a expressão de moléculas de co-estimulação e migram para linfonodos regionais que estimulam linfócitos específicos de tumor. Esta via resulta na proliferação e ativação de células T CD4+ e CD8+ que reagem aos antígenos tumor-associados, Com efeito, tais células podem ser detectadas com frequência no sangue, tecidos linfóides e lesões malignas de pacientes.

[6] Novos insights sobre os mecanismos subjacentes à imune- evasão, juntamente com os regimes de tratamento de combinação que potenciam a atividade de vacinação terapêutica — direta ou indiretamente — através da combinação com inibidores de checkpoint imune ou outras terapias, serviram como base para o desenvolvimento de vacinas que induzem imunidade antitumoral eficaz. O cíclico-di-AMP (produzido por Listeria monocytogenes) e seu análogo cíclico-di-GMP (produzido por Legionella pneumophila) das CDNs são reconhecidos pela célula hospedeira como um PAMP (Padrão Molecular Associado a Patógeno), que se liga ao PRR (Receptor de Reconhecimento do Patógeno) conhecido como STING. STING é uma proteína adaptadora no citoplasma de células de mamífero hospedeiro que ativa ao eixo de sinalização da quinase de ligação de TANK (TBK1)—IRF3, resultando na indução de IFN-0 e outros produtos dos genes dependentes de IRF-3 que ativam fortemente imunidade inata. É agora reconhecido que o STING é um componente da via de vigilância citosólica do hospedeiro, que detecta a infecção com patógenos intracelulares e em resposta induz a produção de IFN-0, levando ao desenvolvimento de uma resposta imune de proteção adaptável específica do patógeno consistindo de células T CD4 e CD8 antígeno- específicas bem como anticorpos específicos do patógeno. Exemplos de dinucleotídeos de purina cíclicos são descritos em detalhes em, por exemplo, Patentes U.S. N°s 7.709.458 e 7.592.326; W02007/054279; e Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18: 5631 (2008), cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.

[7] Ainda há uma necessidade de melhoria composições e métodos para estratégias imunológicas para tratamento de doenças, como o câncer, que podem ser refratárias a abordagens terapêuticas tradicionais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[8] É um objeto da presente invenção fornecer estimuladores imunes de cíclico-di-nucleotídeos (CDN) altamente ativos e novos que ativam DCs através de um receptor citoplasmático recentemente descoberto, conhecido como STING (Estimulador de Genes Interferon). Em particular, CDNs da presente invenção são fornecidos sob a forma de uma composição que inclui um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos que induzem a ativação de TBK1 STING-dependente, na qual os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são estereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros e diastereoisômeros de tiofosfato Rp, Rp ou RpSp CDN particularmente substancialmente puros.

[9] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma composição que inclui um ou mais dinucleotídeo de purina cíclico, em que os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são diastereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros, ou pró- drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos. Estas composições, que induzem a ativação de TBK1 STING-dependente, podem incluir um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis e podem encontrar uso como adjuvantes, conforme descrito neste documento. Particularmente preferenciais são derivados de tiofosfato de dinucleotídeos de purina cíclicos conforme descrito a seguir

[10] Em seu papel como adjuvantes, em determinadas modalidades as composições presentes podem ser usadas como adjuvantes em uma estratégia terapêutica ou profilática que emprega vacina(s). Assim, diastereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros, ou pró-drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos, podem ser utilizados em conjunto com uma ou mais vacinas selecionadas para estimular uma resposta imune a um ou mais antígenos predeterminados. Os diastereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros, ou pró-drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos da presente invenção podem ser fornecidos junto com essas vacinas ou além delas.

[11] Tais vacina(s) podem compreender bactérias ou vírus inativados ou atenuados que compreendem os antígenos de interesse, antígenos purificados, vetores virais ou bacterianos vivos de entrega recombinantemente projetados para expressar e/ou secretar os antígenos, vetores de células apresentadoras de antígeno (APC) compreendendo células que são carregadas com os antígenos ou transfectadas com uma composição compreendendo um ácido nucleico codificando os antígenos, veículos de entrega de antígeno lipossomal, ou vetores de ácido nucleico nu codificando os antígenos. Esta lista não pretende ser um fator limitante. A título de exemplo, tais vacinas(s) também podem incluir uma célula de tumor inativada que expressa e segrega um ou mais dos ligantes GM-CSF, CCL20, CCL3, IL - 12 p 70, FLT-3.

[12] As composições da presente invenção podem ser administradas a indivíduos em necessidade respectiva de uma variedade de rotas parenterais e não-parenterais em formulações contendo veículos, adjuvantes e transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Rotas preferenciais são parenterais e incluem mas não estão limitadas a uma ou mais dentre administrações intradérmicas, intramusculares, intramusculares, intraarteriais, subcutâneas, intratecais, e peridurais. Particularmente preferencial é a administração por via subcutânea. Composições farmacêuticas preferenciais são formuladas como emulsões aquosas ou óleo-em-água.

[13] As composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender ser administradas sozinhas ou em combinação com um ou mais componentes farmaceuticamente ativos adicionais como adjuvantes, lipídios tais como digitonina, lipossomas, e antagonistas de via CTLA-4 e PD-1, agentes de bloqueio de via PD-1, bactérias inativadas que induzem a imunidade inata (por exemplo, inativada ou atenuada Listeria monocytogenes),composições que mediam a ativação imune inata através de receptores do tipo Toll (TLRs), receptores do tipo (NOD) (NLRs), receptores (RIG)-I com base em gene induzíveis porretinóico ácido (RLRs), receptores de lectina do tipo C (CLRs), padrões moleculares associados a patógeno ("PAMPs"), agentes quimioterápicos etc.

[14] Como descrito a seguir, dinucleotídeos de purina cíclicos formulados com um ou mais lipídios podem exibir propriedades aprimoradas, incluindo atividade de ativação de células dendríticas melhorada. Assim, a presente invenção também refere-se a uma composição que compreende um ou mais CDNs e um ou mais lipídios. Em determinadas modalidades preferenciais, um ou mais CDNs são formulados com digitonina, uma formulação lipossomal e/ou uma emulsão óleo-em-água. Uma composição de acordo com uma das reivindicações 1-5, compreendendo ainda um ou mais de um antagonista de CTLA-4 e um agonista de TLR-4.

[15] Em modalidades preferenciais, os um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos de tiofosfato compreendem um diastereoisômero de tiofosfato Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puro selecionado do grupo constituído por tiosfosfato de c-di-AMP, tiofosfato de c-di-GMP, tiofosfato de c-di-IMP, tiofosfato de c-AMP-GMP, tiofosfato de c-AMP-IMP e tiofosfato de c-GMP-IMP ou combinações destes, incluindo pró-drogas e seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

[16] Em um aspecto relacionado, a presente invenção refere-se aos métodos de induzir, estimular, ou adjuvar uma resposta imune em um indivíduo. Estes métodos compreendem administrar ao indivíduo uma composição que inclui um ou mais dinucleotídeo de purina cíclico, em que os dinucleotídeos de purina cíclicos de tiofosfato presentes na composição são diastereoísômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancíalmente puros, ou pró- drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos. As vias preferenciais de administração são as parenterais. Como notado acima, particularmente preferenciais são os derivados de tiofosfato de tais dinucleotídeos de purina cíclicos.

[17] E m determinadas modalidades, o método é um método de tratamento de câncer. A título de exemplo, os diastereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros, ou pró drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos da presente invenção podem ser fornecidos junto com, ou além de, uma ou mais composições de vacina de câncer que são conhecidas na técnica. O paciente a receber tal tratamento pode estar sofrendo de um câncer selecionado do grupo constituído por uma célula de câncer colorretal, um câncer escamoso aero-digestivo, um câncer de pulmão, um câncer no cérebro, um câncer de fígado, um câncer de estômago, um sarcoma, uma leucemia, um linfoma, um mieloma múltiplo, um câncer de ovário, um câncer de útero, um câncer de mama, um melanoma, um câncer de próstata, um carcinoma pancreático e um carcinoma renal. Em outras modalidades, o método é um método de induzir, estimular, ou adjuvar uma resposta imune de um patógeno.

[18] Em ainda outros aspectos relacionados, a presente invenção se refere a métodos de induzir ativação de TBK1 STING-dependente em um indivíduo, que compreendem administrar um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos que vinculam STING ao indivíduo, em que os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são diastereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros, ou pró-drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis respectivos. As vias preferenciais de administração são as parenterais. Como notado acima, particularmente preferenciais são os derivados de tiofosfato de tais dinucleotídeos de purina cíclicos.

[19] Os métodos descritos neste documento podem incluir a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz dos CDNs substancialmente puros da presente invenção, ou pró-drogas ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, antes ou na sequência de uma terapia primária administrada ao mamífero para remover ou matar células cancerosas que expressam o antígeno do câncer. As composições da presente invenção podem ser fornecidas como uma terapia neoadjuvante; no entanto, em modalidades preferenciais, as composições da presente invenção são administradas após a terapia primária. Em várias modalidades, a terapia primária compreende a cirurgia para remover as células cancerosas do mamífero, terapia de radiação para matar as células cancerosas no mamífero ou tanto a cirurgia e quanto a radioterapia.

[20] Em outras modalidades, os métodos descritos neste documento podem incluir a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz dos CDNs substancialmente puros da presente invenção para o tratamento de desordens em que mudança de imunidade de Th1 para Th2 confere benefício clínico. Imunidade mediada por células (CMI) é associada com os linfócitos T CD4+ TH1 produzindo citocinas IL-2, interferon (IFN)-y e fator de necrose de tumor (TNF)-a. Em contraste, a imunidade humoral é associada com os linfócitos T CD4+ TH2 produtores de IL-4, IL-6 e IL-10. Desvio imune para respostas de TH1 normalmente produz ativação de linfócitos citotóxicos (CTL) de células T, células assassinas naturais (NK), macrófagos e monócitos. Geralmente, respostas de Th1 são mais eficazes contra patógenos intracelulares (vírus e bactérias que estão dentro de células hospedeiras) e tumores, enquanto respostas Th2 são mais eficazes contra bactérias extracelulares, parasitas incluindo helmintos e toxinas. Além disso, é esperado que a ativação da imunidade inata é normalize o equilíbrio de sistema imune de auxiliar de T tipo 1 e 2 (Th1/Th2) e suprima a reação excessiva das respostas do tipo Th2 que causam alergias E- dependentes de imunoglobulinas (lg) e asma alérgica.

[21] BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[22] A Fig. 1 mostra uma estrutura geral de CDNs.

[23] A Fig. 2 mostra uma estrutura de c-di-GMP (compostos 11 A) e c- di-AMP (composto 10A).

[24] A Fig. 3 mostra uma estrutura de Rp, Rp-c-di-GMP-tiofosfato (composto 11B) e Rp, Rp-c-di-AMP-tiofosfato (composto 10B).

[25] A Fig. 4 mostra uma estrutura de Rp, Sp-c-di-GMP-tiofosfato (composto 11C) e Rp, Sp-c-di-AMP-tiofosfato (composto 10C).

[26] A Fig. 5 ilustra uma estrutura de Sp, Sp-c-di-GMP-tiofosfato e Sp, Sp-c-di-AMP-tiofosfato.

[27] A Fig. 6 mostra um esquema de síntese de AMP-di-c e c-di- AMP-tiofosfato.

[28] A Fig. 7 retrata a indução de IFN-|3 nas células de apresentação de antígeno por CDNs de origem e diastereoisômeros das correspondentes moléculas ditio derivadas.

[29] A Fig. 8 mostra a indução de IFN-p em células apresentadoras de antígeno pelos diastereoisômeros de CDN após o tratamento com fosfodiesterase de veneno de cobra

[30] A Fig. 9 retrata respostas de células T CD4 e CD8 OVA- específicas medidas em PBMC em 10 dias pós vacinação em conjunto com o tratamento de CDN.

[31] A Fig. 10 mostra respostas de células T CD4 e CD8 SIV gag- específicas medidas na pós-vacinação PBMC em conjunto com o tratamento de CDN.

[32] A Fig. 11 retrata a proteção induzida pelo CDN em um modelo murino de desafio de Listeria-OVA.

[33] A Fig. 12 mostra eficácia antitumoral induzida por CDNs formulados com GVAX em um modelo murino de câncer da próstata.

[34] A Fig. 13 retrata os análogos de pró-drogas 2'-O-substituintes de CDNs da presente invenção.

[35] A Fig. 14 mostra a síntese de análogos de pró-droga O- ou S- substituintes de CDNs da presente invenção.

[36] A Fig. 15 mostra a indução de IFN-p em uma linha celular monocítica humana após administração da forma de uma pró-droga mono- 2’-O-miristoílo c-di-GMP de c-di-GMP.

[37] A Fig. 16 mostra respostas de células T CD8 OVA-específicas após a vacinação com uma forma de pró-droga de mono-2'-0-miristoílo c- di-GMP de c-di-GMP.

Descrição Detalhada da Invenção

[38] A presente invenção se refere ao uso de estimuladores imunes de cíclico-di-nucleotídeos (CDN) altamente ativos e novos que ativam DCs através de um receptor citoplasmático recentemente descoberto, conhecido como STING (Estimulador de Genes Interferon). Em particular, CDNs da presente invenção são fornecidos sob a forma de uma composição que inclui um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos que induzem a ativação de TBK1 STING-dependente, na qual os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são estereoisômeros Rp, Rp ou Rp, Sp substancialmente puros e diastereoisômeros de tiofosfato Rp, Rp ou RpSp CDN particularmente substancialmente puros.

[39] Recentes insights sobre o projeto e desenvolvimento de adjuvantes são informados por um entendimento fundamental que estruturas microbianas conservadas conhecidas como Padrões Moleculares associados a Patógenos (PAMPs) são detectadas pelos Receptores de Reconhecimento Padrão (PRRs) da célula hospedeiro, desencadeando uma cascata de sinalização a jusante tendo por resultado a indução de citocinas e quimiocinas e a iniciação de uma resposta imune específica adaptativa. A maneira com que o sistema imunológico inato está ligado ao complemento PAMP de um micróbio molda o desenvolvimento de uma resposta adaptativa adequada para impedir o patógeno invasor de causar a doença. Um objetivo do projeto de adjuvante é selecionar PAMPs definidos ou moléculas sintéticas específicas para PRRs designados para início de resposta desejada. Adjuvantes como monofosforil lipídio A (MPL) e CpG são PAMPs reconhecidos por receptores do tipo Toll (TLRs), uma classe de PRRs transmembranares que sinalizam através de moléculas de adaptador MyD88 e Trif e mediam a indução de citocinas pro- inflamatórias dependentes de NF-kB. MPL (agonista de TLR-4) e CpG (agonista de TLR-9) são adjuvantes clinicamente avançados e são componentes de vacinas que são aprovadas ou pendentes de aprovação pela FDA. Embora TLRs presentes na superfície das células (por exemplo, TLR-4) e endossemos (por exemplo, CpG) detectem patógenos extracelulares e vacuolares, o ciclo de crescimento produtivo de vários agentes patogênicos, incluindo vírus e bactérias intracelulares, ocorre no citosol. A compartimentalização de PRRs extracelulares, vacuolares e citosólicos levou à hipótese de que o sistema imunológico inato distingue entre os micróbios patogênicos e não patogênicos através da monitorização do citosol. Deve ser evidente para aqueles versados na técnica que os agonistas específicos para PRRs compreendendo via citosólica de vigilância que inicia o desenvolvimento de imunidade protetora contra agentes patogênicos intracelulares e é relevante para a vacina. Estes mesmos ligantes de direcionamentos também serão essenciais no desenvolvimento de vacinas eficazes com direcionamento a malignidades, conhecidas por necessitar de células T CD4+ e CD8+ tumor-   específicas.

[40] Ativação da Via Citosólico de Vigilância (CSP) é Integral para o desenvolvimento de imunidade protetora para patógenos intracelulares. A CSP detecta patógenos bacterianos, virais e protozoários, levando à ativação do eixo de sinalização da quinase de ligação a TANK (TBK-1)/IRF-3 e indução de IFN-J3 e outros genes de co-regulamentado. Os ácidos nucleicos virais e bacterianos ambos ativam este caminho, e indução de IFN-P é MyD88 e Trif- independente. Embora interferon do tipo I seja muitas vezes pensado principalmente como uma resposta anti-viral do hospedeiro, indução de IFN-p é uma marca de crescimento citosólico em macrófagos infectados com a bactéria intracelular Listeria monocytogenes(Lm). Uma dicotomia conhecida no modelo do camundongo de listeriose é que, enquanto o Lm do tipo selvagem prepara imunidade de T-célula CD4 e CD8 potente que protege camundongos contra desafio bacteriano, vacinação com Lm de listeriolisina O LLO-excluída não traz células funcionais T ou induz imunidade protetora. Essa diferença é prova da exigência de expressão de genes de célula hospedeira e acesso citosólico por Lm para trazer imunidade protetora funcional mediada por T-célula. O nível de IFN-p em células hospedeiras infectadas é regulado por bombas de efluxo multidrogas de Lm (MDRs), que segregam pequenas moléculas estruturalmente independentes, incluindo antibióticos. IFN-p não é induzido em células hospedeiras infectadas com mutantes de LLO Lm que estão confinados ao fagolisossoma. Níveis normais de IFN-p são induzidos em macrófagos infectados MyDÕK1' Trif1' deficientes em toda a sinalização mediada por TLR. Estes dados demonstram que, embora Lm se ligue a TLRs, em resposta à infecção por Lm de tipo selvagem, a CSP de célula hospedeira é necessária para o desenvolvimento de imunidade protetora, correlacionada com a indução de IFN-p.

[41] O termo "cíclico-di-nucleotídeos" ("CDNs") como usado neste documento refere-se a uma classe de moléculas que compreende ligações 2'-5' ou 3'-5' de fosfodiéster entre dois nucleotídeos de purina. Isso inclui ligações 2'-5'-2',5', 2'-5'-3'5' e S'.S'-S'.S'. CDNs ativam a via citosólica de vigilância através da ligação direta de dois citosólico PRRs, DDX41 e STING. A resposta de interferon de tipo I à infecção por outras bactérias intracelulares e Lm resulta da secreção de c-di-AMP ou seu dinucleotídeo cíclico relacionado (CDN), c-di-GMP, e sua ligação direta com DDX41 e caixa helicase de DEAD (aspartato-glutamato-alanina-aspartato) e STING (Estimulador de Genes de Interferon), um receptor recentemente definido da via citosólica de vigilância. CDNs são segundos mensageiros expressados pela maioria das bactérias e regulam processos diversos, incluindo a motilidade e formação de biofilmes. CDNs se ligam com alta afinidade a DDX41 e o complexo com a proteína do adaptador STING, resultando na ativação de via de sinalização de TBK1/1RF3, e induzindo IFN-p e outros produtos dos genes dependentes de IRF-3 que ativam fortemente imunidade inata.

[42] Moléculas de CDN nativas são sensíveis à degradação por fosfodiesterases que estão presentes nas células do hospedeiro, por exemplo em células apresentadoras de antígeno, que ocupam as formulações de vacinas que contêm as referidas moléculas CDN nativas. A potência de um adjuvante definido pode ser diminuída por essa degradação, já que o adjuvante seria incapaz de ligar e ativar o seu alvo definido de PRR. Menor potência de adjuvante poderia ser medida, por exemplo por uma menor quantidade de expressão induzida de uma molécula de assinatura da imunidade inata (por exemplo, o IFN-J3), correlacionado com potência da vacina mais fraca, conforme definido pela magnitude da resposta imune antígeno-específica medida.

[43] Na presente invenção, derivados de ditio-difosfato de c-di-AMP e GMP-di-c são fornecidos. A síntese de processo para os referidos derivados de ditio-difosfato de resultados de moléculas de c-di-AMP e GMP-di-c em uma mistura de diastereoisômeros, incluindo Rp,Rp, Sp,Sp e Rp,Sp derivados de ditio-difosfato de moléculas c-di-AMP e GMP-di-c.  Ficou demonstrado anteriormente que as referidas misturas de diastereoisômeros contendo derivados Rp,Rp e Rp,Sp de ditio-difosfato de c-di-GMP recrutaram e ativaram células inflamatórias para os espaços broncoalveolares, quando administradas a ratos por uma via intranasal. No entanto, não havia nenhuma evidência que estes tais derivados de ditio- difosfato de c-di-GMP forneceram quaisquer vantagens no que diz respeito a estimular uma resposta imune em comparação com as moléculas de c-di- GMP de origem e, na verdade, essas preparações de ditio-difosfato c-di- GMP tinham potência apenas semelhante ou mais fraca em comparação com as moléculas de c-di-GMP de origem.

[44] Definições

[45] "Administração" como é usado neste documento no que se refere a um humano, mamífero, sujeito mamífero, animal, sujeito veterinário, sujeito placebo, objeto de pesquisa, sujeito experimental, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, refere-se sem limitação ao contato do ligante exógeno, reagente, placebo, pequena molécula, agente farmacêutico, agente terapêutico, agente de diagnóstico ou composição ao sujeito, célula, tecido, órgão, ou fluido biológico e afins. "Administração" pode referir-se, p. ex.,a terapêutica, farmacocinética, diagnóstico, pesquisa, placebo e métodos experimentais. Tratamento de uma célula engloba o contato de um reagente com a célula, bem como o contato de um reagente com um fluido, onde o fluido está em contato com a célula. "Administração" engloba também tratamentos in vitro e ex vivo, p. ex., de uma célula, por um reagente, diagnóstico, composição de ligação, ou por outra célula. Por "administrados juntos" não se quer dizer ser implícito que dois ou mais agentes sejam administrados como uma composição única. Embora a administração como composição única seja contemplada pela presente invenção, tais agentes podem ser entregues a um único sujeito como administrações separadas, que podem ser ao mesmo tempo ou não, e que podem ser pela mesma rota ou rotas diferentes de administração.

[46] Um "agonista", conforme se relaciona com um ligante e receptor, compreende uma molécula, combinação de moléculas, um complexo ou uma combinação de reagentes, que estimulam o receptor. Por exemplo, um agonista de fator de estimulação de colônia granulócito-macrófago (GM-CSF) pode abranger GM-CSF, uma muteína ou um derivado de GM-CSF, um peptídeo mimético de GM-CSF, um anticorpo que estimula receptores de GM-CSF ou uma pequena molécula que imita a função biológica de receptor de GM-CSF.

[47] Um "antagonista", conforme ele se relaciona com um ligante e receptor, compreende uma molécula, combinação de moléculas ou um complexo, que inibe, neutraliza, regula negativamente, e/ou dessensibiliza os receptores. "Antagonista" abrange qualquer reagente que inibe a atividade constitutiva do receptor. Uma atividade constitutiva é aquela que se manifesta na ausência de uma interação ligante/receptor. "Antagonista" também abrange qualquer reagente que inibe ou impede uma atividade estimulada (ou regulada) de um receptor. A título de exemplo, um antagonista do receptor GM-CSF inclui, sem implicar qualquer limitação, um anticorpo que liga o ligante (GM-CSF) e impede-o de ligação ao receptor, ou um anticorpo que se liga ao receptor e impede o ligante de ligação ao receptor, ou onde o anticorpo bloqueia o receptor em uma conformação inativa.

[48] Como usado aqui, um "análogo" ou "derivado", com referência a um peptídeo, um polipeptídeo ou proteína refere-se a outro peptídeo, polipeptídeo ou proteína que possui uma função idêntica ou similar como o original do peptídeo, polipeptídeo ou proteína, mas não necessariamente compreende uma sequência de aminoácidos semelhantes ou idênticos ou estrutura do peptídeo, polipeptídeo ou proteína original. Um análogo de preferência satisfaz pelo menos um dos seguintes: (a) um agente proteico tendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos  55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácido original (b) um agente proteico codificado por uma sequência de nucleotídeos que se hibridiza sob condições rigorosas em uma sequência nucleotídica codificando a sequência de aminoácidos original; e (c) um agente proteico codificado por uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos, 95% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de nucleotídeos codificando a sequência de aminoácidos original.

[49] "Células apresentadoras de antígeno" (APCs) são células do sistema imunológico usadas para a apresentação de antígeno de células T. APCs incluem células dendríticas, monócitos, macrófagos, células de Kupffer de zona marginal, micróglia, células de Langerhans, células T e células B. Células dendríticas ocorrem em pelo menos duas linhagens. A primeira linhagem engloba pre-DC1, DC1 mielóide e DC1 maduro. A segunda linhagem engloba células progenitoras de início CD34 +CD45RA'multi potentes, células CD34+CD45RA+, células CD34+CD45RA+CD4+ IL- 3Ra+ pro-DC2, células CD4+CD11c plasmocitóides pre-DC2, DC2s plasmocitóide-derivadas de DC2 de linfóide humano e DC2s maduras.

[50] "Atenuação" e "atenuado" engloba uma bactéria, vírus, parasita, organismo infeccioso, príon, célula de tumor, gene no organismo infeccioso e afins, que é modificado para reduzir a toxicidade a um hospedeiro. O hospedeiro pode ser um hospedeiro humano ou animal, ou um órgão, tecido, ou células. A bactéria, para dar um exemplo sem limitação, pode ser atenuada para reduzir a ligação a uma célula hospedeira, para reduzir a propagação de uma célula hospedeira para outra célula hospedeira, para reduzir o crescimento extracelular, ou para reduzir o crescimento intracelular em uma célula hospedeira. Atenuação pode ser avaliada medindo-se, por exemplo, índices ou indícios de toxicidade, o LD50, a taxa de depuração de um órgão, ou o índice competitivo (ver, por exemplo, Auerbuch, et al. (2001) Infect. Immunity 69:5953-5957). Geralmente, uma atenuação resulta em um aumento do LD50 e/ou um aumento da taxa de depuração de pelo menos 25%; mais geralmente pelo menos 50%; mais geralmente, pelo menos, 100% (2-vezes); normalmente pelo menos 5-vezes; mais normalmente ao menos 10-vezes; mais normalmente ao menos 50-vezes; muitas vezes pelo menos 100-vezes; por mais vezes pelo menos 500-vezes; e, mais frequentemente ao menos 1000-vezes; geralmente pelo menos 5000-vezes; mais geralmente pelo menos 10,000-vezes; e mais usualmente pelo menos 50,000-vezes; e na maioria das vezes pelo menos 100,000-vezes.

[51] Por "purificado" e "isolado" quer-se dizer que uma espécies especificada é responsável por pelo menos 50%, mais frequentemente é responsável por pelo menos 60%, tipicamente é responsável por pelo menos 70%, mais tipicamente é responsável por pelo menos 75%, mais tipicamente é responsável por pelo menos 80%, geralmente é responsável por pelo menos 85%, mais usualmente é responsável por pelo menos 90%, mais usualmente é responsável por pelo menos 95%, e convencionalmente é responsável por pelo menos 98% em peso, ou maios, das espécies presentes em uma composição. Os pesos de água, tampões, sais, detergentes, redutores, inibidores de protease, estabilizadores (incluindo uma proteína adicionada como a albumina) e excipientes geralmente não são usados na determinação da pureza.

[52] "Especificamente"ou "seletivamente"liga-se, ao se referir a um ligante/receptor, ácido nucleico/ácido nucleico complementar, anticorpo/antígeno ou outro par de ligação (por exemplo, uma citocina a um receptor de citocina) (cada um geralmente referido como uma biomolécula de "destino" ou um "alvo") indica uma reação de ligação, que está relacionada com a presença do alvo em uma população heterogênea de proteínas e outros produtos biológicos. Ligação especifica pode significar, por exemplo, que o composto de ligação, ligante de ácido nucleico, anticorpo ou composição de ligação derivados do sítio de ligação a antígeno de um anticorpo do método contemplado liga-se ao seu alvo com uma afinidade que é muitas vezes maior, pelo menos, 25% mais frequentemente pelo menos 50% maior, mais frequentemente pelo menos 100% (2-vezes) maior, normalmente pelo menos dez vezes maior, mais normalmente pelo menos 20 vezes maior e mais normalmente pelo menos 100 vezes maior do que a afinidade com uma molécula não-alvo.

[53] "Ligante"refere-se a uma pequena molécula, ácido nucleico, peptídeo, polipeptídeo, sacarídeo, polissacarídeo, glicano, glicoproteína, glicolipídio, ou suas combinações, que se liga a uma biomolécula alvo. Embora tais iigantes possam ser agonistas ou antagonistas de um receptor, um ligante também inclui um agente de ligação que não é um agonista ou antagonista e não tem nenhuma propriedade de agonista ou antagonista. Ligação específica de um ligante ao seu alvo cognato é frequentemente expressa em termos de uma "afinidade". Em modalidades preferenciais, os Iigantes da presente invenção se ligam com afinidades de entre cerca de O4 M'1 e cerca de 108 M‘1. A afinidade é calculada como Kd = koff/kon (koff é a constante da taxa de dissociação, Kon é a constante da taxa de associação e Kd é a constante de equilíbrio).

[54] A afinidade pode ser determinada no estado de equilíbrio medindo-se a fração ligada (r) de ligante marcado em várias concentrações (c). Os dados são marcados usando a equação de Scatchard: r/c = K(n-r): onde r = mols de ligante ligado/mol do receptor no estado de equilíbrio; c = concentração do ligante livre no estado de equilíbrio; K = constante de associação de equilíbrio; e n = número de sítios de ligação de Iigantes por molécula do receptor. Pela análise gráfica, representa-se graficamente r/c no eixo y versus r no eixo x, assim produzindo uma plotagem de Scatchard.  A medição de afinidade pela análise de Scatchard é bem conhecida na técnica. Vide, por exemplo, van Erp et al., J. Immunoassay12: 425-43, 1991; Nelson and Griswold, Comput. Methods Programs Biomed. 27: 65-8, 1988. Em alternativa, a afinidade pode ser medida por calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Em um típico experimento ITC, uma solução de ligante é titulada em uma solução de seu cognato alvo. O calor libertado mediante sua interação (AH) é monitorado ao longo do tempo. Conforme quantidades sucessivas do ligante são tituladas na célula de ITC, a quantidade de calor absorvido ou liberado é em proporção direta à quantidade de ligação. Conforme o sistema atinge a saturação, o sinal de calor diminui até que apenas calores de diluição são observados. Uma curva de ligação é então obtida de uma representação gráfica dos calores de cada injeção contra a razão entre ligante e parceiro de ligação na célula. A curva de ligação é analisada com o modelo de ligação apropriado para determinar AH, n e KB. Observe que KB = 1/Kd-

[55] O termo "sujeito" como usado neste documento se refere a um organismo humano ou não humano. Desse modo, os métodos e as composições descritos neste documento são aplicáveis às doenças humana e veterinária. Em determinadas modalidades, sujeitos são "pacientes", ou seja, seres humanos viventes que estão recebendo cuidados médicos para uma doença ou condição. Isso inclui pessoas sem nenhuma doença definida que estão sendo investigadas por sinais de patologia. Preferenciais são os sujeitos que têm um diagnóstico existente de um câncer específico que está sendo alvo de composições e métodos da presente invenção. Cânceres preferenciais para o tratamento com as composições aqui descritos incluem mas não estão limitados a câncer de próstata, carcinoma renal, melanoma, câncer pancreático, câncer de colo uterino, câncer de ovário, câncer de cólon, câncer de cabeça & pescoço, câncer de pulmão e câncer de mama.

[56]"Quantidade terapeuticamente eficaz" é definida como uma quantidade de um reagente ou composição farmacêutica que é suficiente para mostrar um benefício do paciente, ou seja, causar uma diminuição, prevenção ou melhora dos sintomas da condição a ser tratada. Quando o agente ou composição farmacêutica compreende um agente de diagnóstico, uma "quantidade eficaz para diagnóstico" é definida como uma quantidade que é suficiente para produzir um sinal, imagem ou outro parâmetro de diagnóstico. Quantidades eficazes da formulação farmacêutica irão variar de acordo com fatores como o grau de suscetibilidade do indivíduo, a idade, sexo e peso do indivíduo e as respostas idiossincráticas do indivíduo. "Quantidade efetiva" engloba, sem limitação, uma quantidade que pode amenizar, reverter, atenuar, prevenir ou diagnosticar um sintoma ou sinal de uma condição médica ou doença ou um processo causal respectivos. A menos que tenha sido ditado em contrário, explicitamente ou por contexto, uma "quantidade efetiva" não está limitada a uma quantidade mínima suficiente para amenizar uma condição.

[57] "Tratamento" ou "tratar" (em relação a uma condição ou doença) é uma abordagem para a obtenção de resultados benéficos ou desejados incluindo e de preferência resultados clínicos. Para efeitos da presente invenção, resultados benéficos ou desejados em relação a uma doença incluem, mas não se limitam, a um ou mais dos seguintes: prevenir uma doença, melhorar uma condição associada com uma doença, a cura de doenças, diminuir a gravidade de uma doença, atrasar a progressão de uma doença, aliviar um ou mais sintomas associados com uma doença, aumentar a qualidade de vida de alguém que sofre de uma doença, e/ou prolongar a sobrevivência. Da mesma forma, para efeitos da presente invenção, resultados benéficos ou desejados no que diz respeito a uma condição incluem mas não se limitam a um ou mais dos seguintes: impedir uma condição, melhorar uma condição, curar uma doença, diminuir a gravidade de uma doença, atrasar a progressão de uma doença, aliviar os um ou mais sintomas associados com uma condição, aumentar a qualidade de vida de alguém que sofre de uma condição, e/ou prolongar a sobrevivência. Por exemplo, em modalidades onde as composições aqui descritas são utilizadas para tratamento de câncer, os resultados benéficos ou desejados incluem mas não estão limitados a uma ou mais das seguintes opções: reduzir a proliferação de (ou destruir) as células neoplásicas ou cancerosas, reduzir a metástase de células neoplásicas encontradas em cânceres, reduzir o tamanho do tumor, diminuir os sintomas decorrentes do câncer, aumentar a qualidade de vida daqueles que sofrem de câncer, diminuir a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, atrasar a progressão do câncer, e/ou prolongar a sobrevida de pacientes com câncer. Dependendo do contexto, "tratamento" de um sujeito pode implicar que o sujeito está precisando de tratamento, por exemplo, na situação onde o sujeito compreende uma desordem que espera-se ser amenizada pela administração de um reagente.

[58] Por "purificado" e "isolado" quer-se dizer, ao se referir a um polipeptídeo, que o polipeptídeo está presente na ausência substancial das outras macromoléculas biológicas com as quais está associado na natureza. O termo "purificado" como usado neste documento significa que um polipeptídeo identificado é responsável por pelo menos 50%, mais frequentemente é responsável por pelo menos 60%, tipicamente é responsável por pelo menos 70%, mais tipicamente é responsável por pelo menos 75%, mais tipicamente é responsável por pelo menos 80%, geralmente é responsável por pelo menos 85%, mais usualmente é responsável por pelo menos 90%, mais usualmente é responsável por pelo menos 95%, e convencionalmente é responsável por pelo menos 98% em peso, ou mais, dos polipeptídeos presentes. Os pesos de água, tampões, sais, detergentes, redutores, inibidores de protease, estabilizadores (incluindo uma proteína adicionada como a albumina) e excipientes e moléculas com um peso molecular de menos de 1000 geraímente não são usados na determinação da pureza de polipeptídeo. Veja, por exemplo, discussão de pureza em Pat. U.S. N.° 6.090.611, emitido a Covacci, et al.

[59] "Peptídeo"refere-se a uma pequena sequência de aminoácidos, onde os aminoácidos são ligados entre si por ligações peptídicas. Um peptídeo pode ocorrer livre ou ligado a outra fração, tais como uma macromolécula, lipídios, oligo ou polissacarídeo, ou um polipeptídeo. Onde um peptídeo é incorporado a uma cadeia do polipeptídeo, o termo "peptídeo" ainda pode ser usado para se referir especificamente à pequena sequência de aminoácidos. Um "peptídeo" pode ser conectado a outra fração através de uma ligação peptídica ou algum outro tipo de ligação. Um peptídeo tem pelo menos dois aminoácidos de comprimento e geralmente menos de cerca de 25 aminoácidos de comprimento, onde o comprimento máximo é uma função de costume ou contexto. Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeos" podem ser usados de forma intercambiável.

[60]"Proteína" geralmente refere-se à sequência de aminoácidos compreendendo uma cadeia do polipeptídeo. Proteína pode se referir a um estrutura tridimensional do polipeptídeo. "Proteína desnaturada"refere-se a um polipeptídeo parcialmente desnaturado, tendo uma estrutura tridimensional residual ou, em alternativa, uma estrutura tridimensional essencialmente aleatória, ou seja, totalmente desnaturada. A invenção engloba os reagentes e métodos usando variantes de polipeptídeo, por exemplo, envolvendo a glicosilação, fosforilação, sulfatação, formação de ligação dissulfeto, desamidação, isomerização, pontos de clivagem em processamento de sequência de sinal ou líder, ligações covalentes e cofatores ligados e não ligados covalentemente, variantes oxidadas e afins. A formação de proteínas de dissulfeto ligadas é descrita (Veja, por exemplo, Woycechowsky e Raines (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:533539;Creighton, et al. (1995) Trends Biotechnol. 13:18-23).

[61] "Recombinante" quando usado com referência, por exemplo, a um ácido nucleico, célula, animal, vírus, plasmídeo, vetor ou similares, indica a modificação pela introdução de um ácido nucléico exógeno, não- nativo, alteração de um ácido nucléico nativo, ou por derivação, no todo ou em parte, de um de ácidos nucléico recombinante, célula, vírus, plasmídeo ou vetor. Proteína recombinante refere-se a uma proteína derivada, por exemplo, de um ácido nucléico recombinante, vírus, plasmídeo, vetor ou algo parecido. "Bactérias recombinantes" engloba bactérias onde o genoma é projetado por métodos recombinantes, por exemplo, por meio de uma mutação, deleção, inserção e/ou um rearranjo. "Bactérias recombinantes" engloba também uma bactéria modificada para incluir ácidos nucléicos recombinantes extra-genômicos, por exemplo, um plasmídeo ou um segundo cromossomo ou bactérias onde um ácido nucléico existente extra-genômico é alterado.

[62] "Amostra"refere-se a uma amostra de um humano, animal, placebo ou amostra de pesquisa, por exemplo, uma célula, tecido, órgão, líquido, gás, aerossol, pasta fluida, colóide, ou material coagulado. A "amostra" pode ser testada in vivo, por exemplo, sem remoção do humano ou animal, ou pode ser testada in vitro.A amostra pode ser testada após o processamento, por exemplo, por métodos histológicos. "Amostra" também se refere, por exemplo, a uma célula que compreende uma amostra de fluido ou tecido ou célula separada de uma amostra de fluido ou tecido. "Amostra" também pode se referir a uma célula, tecido, órgão, ou fluido que está recém tirado de um ser humano ou animal, ou a uma célula, tecido, órgão ou líquido que é processado ou armazenado.

[63] "Vacina" engloba as vacinas preventivas. Vacina também engloba vacinas terapêuticas, por exemplo, uma vacina administrada para um mamífero que compreende uma condição ou desordem associada com o antígeno ou epítopo fornecido pela vacina.

[64] O termo "anticorpo" neste documento se refere a um peptídeo ou polipeptídeo derivado de, modelado após ou substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina ou genes de imunoglobulina, ou fragmentos dos mesmos, capaz de fazer ligação especificamente com um antígeno ou epítopo. Vide, por exemplo, Fundamental Immunology, 3rd Edition, W.E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1993); Wilson (1994; J. Immunol. Methods 175:267-273; Yarmush (1992) J. Biochem. Biophys. Methods 25:85-97. O termo anticorpo inclui porções de ligação ao antígeno, isto é, "sítios de ligação ao antígeno" (por exemplo, fragmentos, subsequências, regiões determinantes de complementaridade (CDRs)) que retêm a capacidade de se ligar ao antígeno, incluindo um fragmento monovalente consistindo em (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo em domínios VL, VH, CL e CHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente, compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementaridade isolada (CDR). Os anticorpos de cadeia única também são incluídos por referência no termo "anticorpos".

[65] Dinucleotídeos de Purina Cíclicos

[66] Conforme descrito neste documento, a presente invenção diz respeito a dinucleotídeos de purina cíclicos estereoquimicamente purificados que induzem a ativação de TBK1 STING-dependente e seus métodos de preparação e uso.

[67] Células procarióticas, bem como as células eucarióticas usam várias pequenas moléculas para sinalização celular e comunicação intra- e intercelular. Nucleotídeos cíclicos como cGMP, cAMP etc. são conhecidos por terem atividade regulamentar e iniciatória em células pro- e eucarióticas. Ao contrário de células eucarióticas, as células procarióticas também usam dinucleotídeos de purina cíclicos como moléculas reguladoras. Em procariontes, a condensação de duas moléculas de GTP é catalisada pela enzima diguanilato ciclase (DGC) para render c-diGMP, que representa um importante regulador em bactérias.

[68] Trabalho recente sugere que CDNs como diGMP cíclico ou análogos respectivos podem também estimular ou aumentar a resposta imune ou inflamatória no paciente ou podem melhorar a resposta imune à vacina, servindo como um adjuvante em mamíferos. Detecção citosólica de DNA patógeno-derivado exige sinalização através de quinase 1 de ligação a TANK (TBK1) e seu fator de transcrição a jusante, fator 3 IFN-regulador (IRF3). Uma proteína de transmembrana chamada STING (estimulador de genes IFN; também conhecido como MITA, ERIS, MPYS e TMEM173) funciona como receptor de sinalização para estes dinucleotídeos de purina cíclicos, causando estimulação do eixo de sinalização TBK1-IRF3 e uma resposta STING-dependente de interferon tipo I. Veja, por exemplo, Fig. 1. Burdette et al., Nature 478: 515-18, 2011 demonstrou que STING se liga diretamente a monofosfato cíclico de diguanilato, mas não a outros nucleotídeos independentes ou ácidos nucleicos.

[69] O objetivo de formulação de vacina é tipicamente oferecer uma combinação de antígenos e adjuvantes capazes de gerar uma população suficiente de células T e/ou células B de memória para reagir rapidamente a um patógeno, célula de tumor etc. tendo um antígeno de interesse. A presente invenção refere-se aos métodos para fornecer composições de adjuvante compreendendo um ou mais dinucleotídeos cíclicos de purina, no qual os dinucleotídeos cíclicos de purina presentes na composição são diastereoisômeros substancialmente puros Rp, Rp ou Rp, Sp, métodos para sua fabricação e métodos para o uso respectivo de estimular uma resposta imune em um animal.

[70] Dinucleotídeos de purina cíclicos preferenciais incluem mas não estão limitados a c-di-AMP, GMP-di-c, c-di-IMP, c-AMP-GMP, c-AMP-IMP e c-GMP-IMP e análogos respectivos, incluindo, mas não limitado, a análogos de fosforotioato, referidos como "tiofosfatos". Uma estrutura geral do tiofosfato de CDN é fornecido na Fig. 1. Nesta figura, B1 e B2 representam  a fração base. Fosforotioatos são uma variante de nucleotídeos normais, em que um dos oxigénios sem ligação por ponte é substituído por um enxofre. A sulfurização da ligação de internucleotídeo reduz drasticamente a ação de endo- e exonucleases, incluindo exonuclease POL de DNA 1 51 para 3' e 31 para 5', nucleases S1 e P1, RNases, nucleases de soro e fosfodiesterase de veneno de cobra. Além disso, aumenta o potencial para atravessar a bicamada lipídica.

[71] Uma ligação de fosforotioato é inerentemente quiral. Aquele versado na técnica reconhecerá que os fosfatos nessa estrutura podem cada um existir em formas de R ou S. Assim, formas de Rp,Rp, Sp.Sp e Rp,Sp são possíveis. Em cada caso, preferenciais são os diastereoisômeros substancialmente puros Rp,Rp e Rp,Sp destas moléculas. Exemplos de tais moléculas de tiofosfato de CDN são retratados em figs. 2-6, que mostram formas de tiofosfato de Rp, Rp-c-di-adenosina monofosfato; RP, Sp-c-di-adenosina monofosfato; RP, Rp-c-di-guanosina monofosfato e Rp, Sp-c-di-guanosina monofosfato. Nestas figuras, a estereoquímica do centro de fosfato é mostrada como R ou S, consoante o caso.

[72] Preferenciais dinucleotídeos de purina cíclicos também incluem formas 2'-O-substituintes de CDNs e em particular tiofosfatos de CDN. Biodisponibilidade e estabilidade adicional podem ser fornecidas pela substituição de 2'-OH da fração de ribose. Um exemplo de tais análogos 2'- O-substituintes são mostrados na Fig. 11. Grupos substituintes favoráveis neste documento incluem, sem limitação, halogêneo, hidroxil, alquil, alquenil, alquinil, acil (-C(0)Raa), carboxil (-C(0)0-Raa), grupos alifáticos, grupos alicíclicos, alcóxi, substituído oxi (-0-Raa), aril, aralquil, radical heterocíclico, heteroaril, heteroarilalquil, amino (-N(Rbb)(RCc))> imino(=NRbb), amido (-C(0)N(Rbb)(Rcc) or -N(Rbb)C(0)Raa), azido (-N3), nitro (-N02), ciano (- CN), carbamido (-OC(0)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(0)ORaa),ureído (- N(Rbb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), tioureído (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinil (- N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinil(-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) ou - N(Rbb)C(-NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinil (-S(0)Rbb), sulfonil (-S(0)2Rb )e sulfonamidil (-S(0)2N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)S(0)2Rbb). Onde cada Raa, Rbb e RcCsão, de forma independente, H, um grupo químico opcionalmente ligado funcional ou um grupo substituinte adicional com uma lista preferencial, incluindo sem limitação H, alquil, alquenil, alquinil, alifático, alcoxi, acil, aril, aralquil, heteroaril, alicíclico, heterocíclico e heteroarilalquil. Substituintes selecionados dentro dos compostos descritos neste documento estão presentes de forma recursiva.

[73] Ainda outro dinucleotídeos de purina cíclicos preferenciais também incluem formas S-substituintes de CDNs, e em particular tiofosfatos de CDN, que podem vantajosamente fornecer pró-drogas com melhor biodisponibilidade. O termo "pró-droga" como usado neste documento refere-se a uma modificação dos compostos contemplados, na qual o composto modificado é convertido dentro do corpo (por exemplo, em uma célula de destino ou o órgão-alvo) de volta para a forma não modificada através de reações enzimáticas ou não enzimáticas. Em determinadas modalidades, o hidroxil em uma ribose compreende um grupo de abandono de pró-droga. Pró-drogas podem modificar as propriedades físico-químicas, biofarmacêuticas e propriedades farmacocinéticas das drogas. Pró-drogas tradicionais são classificadas como drogas que são ativadas através de transformação in vivo para formar a droga ativa. Razões para o desenvolvimento do pró-droga são tipicamente pobre solubilidade aquosa, instabilidade química, baixa biodisponibilidade oral, falta de penetração de barreira sangue-cérebro e metabolismo de alta primeira passagem associado com a droga de origem. Frações do pró- droga adequadas são descritos em, por exemplo, “Prodrugs and Targeted Delivery,” J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011.

[74] Um exemplo de tais análogos de pró-droga é mostrado na Fig. 12. Esta forma de pró-droga com lipofilicidade melhorada pode ser clivada em formas ativas através da ação de esterases presentes nos organismos alvo. Grupos substituintes favoráveis neste documento incluem, sem limitação, halogêneo, hidroxil, alquil, alquenil, alquinil, acil (-C(0)Raa), carboxil (-C(0)0-Raa), grupos alifáticos, groups alicíclicos, alcóxi, substituído oxi (-O-Raa), aril, aralquil, radical heterocíclico, heteroaril, heteroarilalquil, amino (-N(Rbb)(Rcc)), imino(=NRbb), amido <-C(0)N(Rbb)(Rcc) or - N(Rbb)C(0)Raa), azido (-N3), nitro (-N02), ciano (-CN), carbamido (- OC(0)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(0)ORaa),ureído (-N(Rbb)C(O)-N(Rbb)(Rcc)), tioureído (-N(Rbb)C(S)N(Rbb)(Rcc)), guanidinil (-N(Rbb)C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc)), amidinil(-C(=NRbb)N(Rbb)(Rcc) ou -N(Rbb)C(=NRbb)(Raa)), tiol (-SRbb), sulfinil (-S(0)Rbb), sulfonil (-S(0)2Rb)e sulfonamidil (-S(0)2N(Rbb)(Rcc) ou - N(Rbb)S(0)2Rbb). Onde cada Raa, Rbb e RcC são, de forma independente, H, um grupo químico opcionalmente ligado funcional ou um grupo substituinte adicional com uma lista preferencial, incluindo sem limitação H, alquil, alquenil, alquinil, alifático, alcoxi, acil, aril, aralquil, heteroaril, alicíclico, heterocíclico e heteroarilalquil. Substituintes selecionados dentro dos compostos descritos neste documento estão presentes de forma recursiva. Substituintes preferenciais incluem metil, isopropil e t-butil. Formas de pró- droga de nucleotídeos são conhecidas na técnica. Veja, por exemplo, Nucleotide Prodrugs for HCV Therapy, Sofia, M.J., Antiviral Chem and Chemother. 2011, 22: 23-49; Nucleoside, Nucleotide, and Non-Nucleoside Inhibitors of Hepatitis C Vírus NS5B RNA - Dependent RNA - Polymerase, Sofia, M.J., et al., J. Med. Chem., 2012, 55: 2481-2531.

[75] O termo "alquil", como usado aqui, refere-se a um radical de hidrocarboneto saturado reto ou ramificado que contém até vinte e quatro átomos de carbono. Exemplos de grupos alquil incluem sem limitação metil, etil, propil, butil, isopropil, n-hexil, octil, decil, dodecil e afins. Grupos alquil incluem tipicamente de 1 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a 12 átomos de carbono, com de 1 a cerca de 6 átomos de carbono sendo mais preferenciais. O termo "baixo alquil" como usado neste documento inclui de cerca 1 a cerca de 6 átomos de carbono. Grupos alquil como usado aqui podem, opcionalmente, incluir um ou mais grupos substituintes.

[76] O termo "alquenil", conforme usado neste documento, sozinho ou em combinação, refere-se a um radical de hidrocarbono de cadeia linear ou ramificada contendo até 24 átomos de carbono e tendo pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. Exemplos de grupos alquenil incluem sem limitação etenil, propenil, butenil, l-metil-2-buten-l-il, dienos como 1,3- butadieno e afins. Grupos alquenil incluem tipicamente de 2 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a 12 átomos de carbono, sendo de 2 a cerca de 6 átomos de carbono mais preferenciais. Grupos alquenil como usado aqui podem, opcionalmente, incluir um ou mais grupos substituintes.

[77] O termo "alquinil", conforme usado neste documento, sozinho ou em combinação, refere-se a um radical de hidrocarbono de cadeia linear ou ramificada contendo até 24 átomos de carbono e tendo pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Exemplos de grupos de alquinil incluem, sem limitação, etinil, 1-propinil, 1-butinil e afins. Grupos alquinil incluem tipicamente de 2 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 2 a 12 átomos de carbono, sendo de 2 a cerca de 6 átomos de carbono mais preferenciais. Grupos alquinil como usado aqui podem, opcionalmente, incluir um ou mais grupos substituintes adicionais.

[78] O termo "acil," como usado aqui, refere-se a um radical formado pela remoção de um grupo hidroxil de um ácido orgânico e tem a fórmula geral -C(O)-X onde X é normalmente alifático, alicíclico ou aromático. Exemplos incluem carbonilos alifáticos, carbonilos aromáticos, sulfonis alifáticos, aromáticos sulfinis, alifáticos sulfinis, fosfatos aromáticos, fosfatos alifáticos e afins. Grupos acil como usado aqui podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[79] O termo "alicíclico"refere-se a um sistema de anel cíclico, em que o anel é alifático. O sistema de anéis pode abranger um ou mais anéis, em que pelo menos um anel é alifático. Preferenciais alicíclicos incluem anéis tendo de cerca de 5 a cerca de 9 átomos de carbono no anel. Alicíclico como usado aqui pode, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[80] O termo "alifático", como usado aqui, refere-se a um radical de hidrocarboneto linear ou ramificado contendo até vinte e quatro átomos de carbono no qual a saturação entre quaisquer dois átomos de carbono é uma ligação única, dupla ou tripla. Um grupo alifático inclui preferencialmente de 1 a 24 átomos de carbono, mais tipicamente de 1 a 12 átomos de carbono, sendo de 1 a cerca de 6 átomos de carbono mais preferenciais. A cadeia linear ou ramificada de um grupo alifático pode ser interrompida com um ou mais heteroátomos que incluem nitrogênio, oxigênio, enxofre e fósforo. Tais grupos alifáticos interrompidos por heteroátomos incluem, sem limitação, polialcóxis, como glicóis de polialcaleno, poliaminas e poliiminas. Grupos alifáticos como usados aqui podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[81] O termo "alcóxi", como usado aqui, refere-se a um radical formado entre um grupo alquil e um átomo de oxigênio, no qual o átomo de oxigênio é usado para unir o grupo alcóxi a uma molécula de origem. Exemplos de grupos alcóxi incluem, sem limitação, metóxi, etóxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, sec-butóxi, tert-butóxi, n-pentóxi, neopentóxi, n-hexóxi e similares. Grupos alcóxi como usado aqui podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[82] O termo "aminoalquil" como usado aqui, refere-se a um radical de alquil amino-substituído C\-Cn. A porção de alquil do radical forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. O grupo amino pode ser localizado em qualquer posição e o grupo de aminoalquil pode ser substituído com um grupo substituinte adicional nas partes alquil e/ou o amino.

[83] Os termos "aralquil" e "arilalquil", como usados aqui, referem-se a um grupo aromático que é covalentemente ligado a uma radical de alquil C\-Cn. A parte de radical de alquil do grupo resultante de aralquil (ou arilalquil) forma uma ligação covalente com uma molécula de origem. Exemplos incluem, sem limitação, benzil, fenetil e afins. Grupos aralquil neste documento podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes ligados ao alquil, a aril ou ambos os grupos que formam o grupo radical.

[84] Os termos "aril"e "aromático", neste documento, se referem a radicais de sistema de anel carbocíclico mono- ou policíclico tendo um ou mais anéis aromáticos. Exemplos de grupos aril incluem sem limitação, fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, idenil e afins. Sistemas de anel de aril preferenciais tem de cerca de 5 a cerca de 20 átomos de carbono em um ou mais anéis. Grupos aril como usado aqui podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[85] Os termos "halogênio" ou "halo", conforme usados neste documento, referem-se a um átomo selecionado de flúor, cloro, bromo e iodo.

[86] Os termos "heteroaril" e "heteroaromático", neste documento, se referem a um radical que compreende um anel aromático mono- ou policíclico, sistema de anéis ou sistema de anéis fundidos em que pelo menos um dos anéis é aromático e inclui um ou mais heteroátomos. Heteroaril também deve incluir sistemas de anel fundido incluindo sistemas onde um ou mais dos anéis fundidos não contêm heteroátomos. Grupos heteroaril incluem tipicamente um átomo de anel, selecionado a partir de enxofre, nitrogênio ou oxigênio. Exemplos de grupos de heteroaril incluem, sem limitação, piridinil, pirazinil, pirimidinil, pirrolil, pirazolil, imidazol, tiazoil, oxazoül, isooxazolil, tiadiazolil, oxadiazolil, tiofenil, furanil, quinolinil, isoquinolinil, benzimidazolil, benzooxazolil, quinoxalinil e afins. Radicais de heteroaril podem ser anexados a uma molécula de origem diretamente ou através de uma fração de ligação como um grupo alifático ou hetero-átomo. Grupos heteroaril como usado aqui podem, opcionalmente, incluir mais grupos substituintes.

[87] O termo "heteroarilalquil", como usado aqui, refere-se a um grupo de heteroaril como anteriormente definido que inclui ainda um radical de alquil covalentemente ligado CrC12. A parte de radical de alquil do grupo resultante heteroarilalquil é capaz de formar uma ligação covalente com uma molécula de origem. Exemplos incluem, sem limitação, piridinilmetil, pirimidiniletil, naftiridinilpropil e afins. Grupos de heteroarilalquil neste documento podem opcionalmente incluir mais grupos substituintes em uma ou ambas as partes de heteroaril ou alquil.

[88] Como notado acima, preferenciais dinucleotídeos de purina cíclicos também incluem formas de pró-droga de CDNs e em particular tiofosfatos de CDN. Pró-drogas podem modificar as propriedades físico- químicas, biofarmacêuticas e propriedades farmacocinéticas das drogas. Pró-drogas tradicionais são classificadas como drogas que são ativadas através de transformação in vivo para formar a droga ativa. Razões para o desenvolvimento do pró-droga são tipicamente pobre solubilidade aquosa, instabilidade química, baixa biodisponibilidade oral, falta de penetração de barreira sangue-cérebro e metabolismo de alta primeira passagem associado com a droga de origem. Frações do pró-droga adequadas são descritos em, por exemplo, “Prodrugs and Targeted Delivery,” J. Rautico, Ed., John Wiley & Sons, 2011.

[89] O termo "substancialmente puro" como usado aqui no que diz respeito a dinucleotídeos de purina cíclicos referem-se a uma forma Rp ou Rp, Sp que é pelo menos 75% pura em relação a outras possíveis estereoquímicas dos centros quirais indicados na figura acima. A título de exemplo, um "substancialmente puro tiofosfato de c-di-GMP Rp,Rp" iria ser pelo menos 75% de puro com respeito às formas Rp,Sp e Sp,Sp de tiofosfato de c-di-GMP. Em modalidades preferenciais, uma dinucleotídeo de purina cíclico substancialmente puro é de pelo menos 85% de pureza, pelo menos 90% de pureza, pelo menos 95% de pureza, pelo menos 97% de pureza e pelo menos 99% de pureza. Embora uma preparação de dinucleotídeo de purina cíclico substancialmente puro da invenção seja "estereoquimicamente pura", isto não deve indicar que todos os CDNs dentro a preparação tendo uma estereoquímica específica nestes centros quirais de outra forma sejam idênticos. Por exemplo, uma preparação de dinucleotídeo de purina cíclico substancialmente pura pode conter uma combinação de tiofosfato de c-di-GMP Rp, Rp e tiofosfato de c-di-AMP Rp, Rp e ainda ser uma preparação de dinucleotídeo de purina cíclico substancialmente pura. Tal preparação pode também incluir outros componentes conforme descrito a seguir, que são vantajosos para o tratamento do paciente, desde que todos os CDNs dentro da preparação tenham uma estereoquímica específica nestes centros quirais.

[90] As composições de CDN aqui descritas podem ser administradas para um hospedeiro, sozinho ou em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável, em quantidade suficiente para induzir, modificar ou estimular uma resposta imune adequada. A resposta imune pode incluir, sem limitação, resposta imune específica, resposta imune não-específica, resposta específica e não específica, resposta inata, resposta imune primária, imunidade adaptativa, resposta imune secundária, resposta imune de memória, ativação de células imunes, proliferação de células imunes, diferenciação de células imunes e expressão de citocinas. Em determinadas modalidades, as composições de CDN são administradas em conjunto com uma ou mais composições adicionais, incluindo vacinas destinadas a estimular uma resposta imune em um ou mais antígenos predeterminados; adjuvantes; antagonistas de via CTLA-4 e PD-1, lipídios, lipossomas, agentes quimioterápicos, linhas de células imunomoduladoras etc.

[91] As composições de CDN podem ser administradas antes, depois ou junto com uma composição terapêutica ou profilática adicional. Estas incluem, sem limitação, molécula de co-estimulação B7, interleucina-2, interferon-Y, GM-CSF, antagonistas de CTLA-4, OX-40/OX-40 ligante, ligante CD40/CD40, sargramostima, levamisol, virus vaccinia, bacilo Calmette-Guérin (BCG), lipossomas, alume, adjuvante completo ou incompleto de Freund, endotoxinas desintoxicadas, óleos minerais, substâncias de superfície ativa, tais como lipolecitina, polióis plurônicos, polianiões, peptídeos e emulsões de óleo ou hidrocarbonetos. Transportadores para induzir uma resposta imune de células T que preferencialmente estimulam uma resposta citolítica de células T contra uma resposta de anticorpo são preferidas, embora aquelas que estimulam os dois tipos de resposta possam ser usadas também. Em casos onde o agente é um polipeptídeo, o polipeptídeo em si ou um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo pode ser administrado. O transportador pode ser uma célula, como uma célula apresentadora antígeno (APC) ou uma célula dendrítica. Células apresentadoras de antígeno incluem tais tipos de células como macrófagos, células dendríticas e células B. Outras células apresentadoras de antígeno profissionais incluem monócitos, células de Kupffer de zona marginal, microglia, células de Langerhans, as células dendríticas interdigitantes, células dendríticas foliculares e células T. Células apresentadoras de antígeno facultativas também podem ser usadas. Astrócitos, células foliculares, endotélio e fibroblastos são exemplos de células apresentadoras de antígeno facultativas. O transportador pode ser uma célula bacteriana que é transformada para expressar o polipeptídeo ou entregar um polinucleotídeo que é posteriormente expresso nas células do indivíduo vacinado. Adjuvantes, tais como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio, podem ser adicionados para aumentar a capacidade da vacina de acionar, melhorar ou prolongar uma resposta imune. Materiais adicionais, tais como citocinas e quimiocinas e sequências bacterianas do ácido nucleico, como CpG, um agonista de receptor do tipo toll (TLR) 9 bem como agonistas adicionais para TLR 2, TLR 4, 5 TLR, TLR 7, 8 TLR, TLR9, incluindo lipoproteína, LPS, monofosforil lipídio A, ácido lipoteicóico, imiquimod, resiquimod, usados separadamente ou em combinação com as composições descritas são também potenciais adjuvantes. Outros exemplos representativos de adjuvantes incluem o adjuvante sintético QS-21 compreendendo uma saponina homogênea purificada a partir da casca de quilaia e Corynebacterium parvum (McCune et al, Cancer, 1979; 43:1619). Será entendido que o adjuvante está sujeito a otimização. Em outras palavras, aquele versado na técnica pode se envolver na experimentação de rotina para determinar o melhor adjuvante a se usar.

[92] Métodos para co-administração com um agente terapêutico adicional são bem conhecidos na arte (Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practiced Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

[93] Adjuvantes

[94] Além dinucleotideo(s) de purina cíclicos descritos acima, as composições da presente invenção ainda podem incluir uma ou mais substâncias adicionais que, devido à sua natureza de adjuvante, podem agir para estimular o sistema imunológico para responder a antígenos de câncer presentes sobre as células do tumor inativadas. Tais adjuvantes incluem mas são não limitados a lipídios, lipossomas, bactéria inativada que induz a imunidade inata (por exemplo, inativada ou atenuada Listeria monocytogenes),composições que mediam a ativação imune inata através de receptores do tipo Toll (TLRs), receptores do tipo (NOD) (NLRs), receptores do tipo (RIG)-I com base em gene induzíveis por ácido retinóico (RLRs), e/ou receptores de lectina do tipo C (CLRs). Lipoproteínas, lipopolipeptídeos, peptidoglicanos, ZnPPIX, lipopolissacarídeos, porinas neisseriais, flagelina, profilina, galactoceramida, muramil dipeptídeo são exemplos de PAMPs. Peptidoglicanos, lipoproteínas e ácidos lipoteicóicos são componentes da parede celular Gram-positivos. Lipopolissacarídeos são expressos pela maioria das bactérias, com MPL sendo um exemplo. Flagelina refere-se ao componente estrutural dos flagelos bacterianos que é secretado por bactérias patogênicas e comensais. A-Galactosilceramida (a- GalCer) é um ativador de células T assassinas naturais (NKT). Dipeptídeo de muramil é um motivo de peptidoglicano bioativo comum a todas as bactérias. Esta lista não pretende ser um fator limitante. Composições de adjuvante preferenciais são descritas abaixo.

[95] Antagonistas de via CTLA-4 e PD-1

[96] Pensa-se que CTLA-4 é um importante regulador negativo da resposta imune adaptativa. Células T ativadas regulam positivamente CTLA-4, que liga CD80 e CD86 em células apresentadoras de antígenos com maior afinidade do que CD28, inibindo assim a estimulação de células T, a expressão dos genes IL-2 e a proliferação de células T. Foram observados efeitos antitumorais do bloqueio de CTLA4 em modelos murinos de melanoma metastático, câncer de próstata metastático e carcinoma de cólon.

[97] Ipilimumab (Yervoy™) e tremelimumab são os anticorpos monoclonais humanizados que se ligam ao CTLA4 humano e evitam sua interação com CD80 e CD86. Estudos de fase I e II usando ipilimumab e tremelimumab demonstraram atividade clínica em pacientes com câncer. Outros reguladores imunes negativos que podem ser alvo de uma estratégia similar incluem morte celular programada 1, atenuador dos linfócitos T e B, fator de crescimento beta p transformador, interleucina-10 e fator de crescimento endotelial vascular.

[98] PD-1 é outro regulador negativo da resposta imune adaptativa que é expresso em células T ativadas. PD-1 liga H1-B7 e B7-DC, e o engajamento do PD-1 suprime a ativação de células T. Efeitos anti-tumorais foram demonstrados com bloqueio de caminho PD-1. BMS-936558, MK3475, CT-011, AMP-224 e MDX-1106 têm sido relatados na literatura como exemplos de bloqueadores de via PD-1 que podem encontrar utilidade na presente invenção.

[99] Aqonistas de TLR

[100] O termo "receptor do tipo Toll"(ou "TLR") como usado aqui refere-se a um membro da família de receptores do tipo toll de proteínas ou um fragmento respectivo que detecta um produto microbiano e/ou inicia uma resposta imune adaptável. Em uma modalidade, um TLR ativa uma célula dendrítica (DC). Receptores do tipo toll (TLRs) são uma família de receptores de reconhecimento de padrão que foram inicialmente identificados como sensores do sistema imune inato que reconhecem patógenos microbianos. TLRs compreendem uma família de membrana conservada abrangendo moléculas contendo um ectodomínio de repetições ricas de leucina, um domínio transmembrana e um domínio intracelular de TIR (Toll/IL-1 R). TLRs reconhecem estruturas distintas em micróbios, frequentemente referidos como "PAMPs" (patógeno associado a padrões moleculares). Ligação do ligante a TLRs invoca uma cascata de vias de sinalização intracelulares que induzem a produção de fatores envolvidos na inflamação e imunidade.

[101] Em humanos, dez TLR foram identificados. TLRs que são expressos na superfície das células incluem TLR-1, -2, -4, -5 e -6, enquanto TLR-3, -7/8 e -9 são expressos com o compartimento de ER. Subconjuntos de células dendríticas humanas podem ser identificados com base em padrões distintos de expressão de TLR. A título de exemplo, o subconjunto mielóide ou "convencional"de DC (mDC) expressa TLRs -8 quando estimulado e uma cascata de marcadores de ativação (por exemplo, CD80, CD86, MHC de classe I e II, CCR7), citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas são produzidas. Um resultado desta estimulação e expressão resultante é iniciação de células T CD4+ e CD8+ antígeno-específicas. Esses DCs adquirem uma melhor capacidade de ocupar antígenos e apresentá-los de uma forma adequada a células T. Em contraste, o subconjunto plasmocitóide de DC (pDC) expressa apenas TLR7 e TLR9 após a ativação, com uma resultante ativação de células NK, bem como as células T. Como a morte de células tumorais podem afetar adversamente a função DC, sugeriu-se que ativar DC com agonistas de TLR pode ser benéfico para iniciar a imunidade antitumoral em uma abordagem de imunoterapia para o tratamento de câncer. Também foi sugerido que o sucesso do tratamento do câncer de mama usando radiação e quimioterapia requer ativação de TLR4.

[102] Agonistas de TLR conhecido na técnica e que encontram uso na presente invenção incluem mas não estão limitados aos seguintes: Pam3Cys, um agonista de TLR-112; CFA, um agonista de TLR-2; MALP2, um agonista de TLR-2; Pam2Cys, um agonista de TLR-112; FSL-1, um agonista de TLR-2; Hib-OMPC, um agonista de TLR-2; ácido poli ribosínico:poliribocitídico (poli I:C), um agonista de TLR-3; ácido poliadenosina-poliuridílico (poli AU), um agonista de TLR-3; Ácido poliinosínico-policitidíco estabilizado com poli-L-lisina e carboximetilcelulose (Hiltonol®), um agonista de TLR-3; monofosforil lipídio A (MPL), um agonista de TLR-4; LPS, um agonista de TLR-4; flagelina bacteriana, um agonista de TLR-5; sialil-Tn (STn), um carboidrato associado à mucina MUC1 em um número de células cancerosas humanas e um agonista de TLR-4; Imiquimod, um agonista de TLR-7; resiquimod, um agonista de TLR-718; loxoribina, um agonista de TLR-7/8; e dinucleótido CpG (CpG-ODN) não metilado, um agonista de TLR-9.

[103] Por causa de suas qualidades de adjuvante, agonistas de TLR são preferencial mente usados em combinações com outras vacinas, adjuvantes e/ou moduladores imunes e podem ser combinados em várias combinações. Assim, em determinadas modalidades, os dinucleotídeos de purina cíclicos que se ligam a STING e induzem ativação de TBK1 STING- dependente e uma célula de tumor inativada que expressa e segrega uma ou mais citocinas que estimulam a indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação, conforme descrito neste documento, podem ser administrados em conjunto com um ou mais agonistas de TLR para fins terapêuticos.

[104] Lipídios e lipossomas

[105] Lipossomas são vesículas formadas a partir de uma ("unilamelar") ou mais ("multilamelar") camadas de fosfolipídios. Devido ao carácter anfipático dos blocos de construção de fosfolipídios, lipossomas normalmente compreendem uma camada hidrofílica apresentando uma face externa hidrofílica e encerrando um núcleo hidrofílico. A versatilidade de lipossomas na modalidade de componentes hidrofílicos/hidrofóbicos, sua natureza não-tóxica, biodegradabilidade, biocompatibilidade, adjuvanticidade, indução da imunidade celular, propriedade de liberação sustentada e rápida absorção por macrófagos os torna atraentes candidatos para a entrega de antígenos.

[106] WO2010/104833, que é incorporado por referência neste documento, na íntegra, descreve preparações de lipossoma que compreendem: a) um veículo aquoso; b) lipossomas compreendendo (i) dimiristoilfosfatidilcolina ("DMPC"), (ii) dimiristoilfosfatidilglicerol ("DMPG"), dimiristoiltrimetilamônio propano ("DMTAP"), ou ambos DMPG e DMTAP, e (iii) pelo menos um derivativo de esterol; e c) um ou mais polipeptídeo(s) imunogênicos ou carboidrato(s) covalentemente ligados a entre 1% e 100% do pelo menos um referido derivado de esterol.

[107] Tais formulações de lipossoma, referidas neste documento como VesiVax® (Molecular Express, Inc.), com ou sem os "polipeptídeo(s) ou carboidrato(s) imunogênico(s)" acima referidos, pode conter um ou mais componentes adicionais como peptidoglicano, lipopeptídeo, lipopolissacarídeo monofosforil lipídio A, ácido lipoteicóico, resiquimod, imiquimod, flagelina, oligonucleotídeos contendo motivos CpG não metilados, beta-galactosilceramida, muramil dipeptídeo, ácido retinóico alltrans, RNA viral de dupla hélice, proteínas de choque do calor, brometo de dioctadecildimetilamônio, surfactantes catiônicos, agonistas dos receptores do tipo toll, dimiristoiltrimetilamôniopropano e agonistas do receptor do tipo nod. Vantajosamente, estas formulações de lipossoma podem ser usadas para entregar um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos em conformidade com a presente invenção.

[108] Além disso, enquanto as formulações de lipossoma discutidas acima empregam um "derivado de esteróide" como uma âncora para a anexação de um polipeptídeo imunogênico ou carboidrato de um lipossoma, o esteróide simplesmente pode ser fornecido como um esteróide não conjugado tal como colesterol.

[109] Métodos adequados para a preparação de lipossomas de misturas de lipídios são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Basu &Basu, Liposome Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), Humana Press, 2002; Gregoriadis, Liposome Technology, 3rd Edition, InformaHealthCare, 2006. Métodos preferenciais incluem métodos de extrusão, homogeneização e sonificação aí descritos. Um método exemplar para a preparação de lipossomas para uso na presente invenção, que compreende secar uma mistura de lipídios, seguida de hidratação em um veículo aquoso e sonificação para formar lipossomas, é descrita em WO2010/104833.

[110] Em determinadas modalidades, os lipossomas são fornecidos dentro de um intervalo específico de tamanho médio. Tamanho de lipossoma pode ser selecionado, por exemplo, por extrusão de um veículo aquoso compreendendo lipossomas através de membranas com um tamanho de poro pré-selecionado e recolher o material que flui através da membrana. Em modalidades preferenciais, os lipossomas são selecionados para terem substancialmente entre 50 e 500 nm de diâmetro, mais de preferência substancialmente entre 50 e 200 nm de diâmetro e mais preferencialmente substancialmente entre 50 e 150 nm de diâmetro. O termo "substancialmente" como usado aqui neste contexto significa que pelo menos 75%, mais de preferência 80% e mais de preferência pelo menos 90% dos lipossomas estão dentro do intervalo designado.

[111] Outros lipídios e adjuvantes similares a lipídios que podem encontrar utilidade na presente invenção incluem emulsões óleo-em-água (o/w) (ver, por exemplo, Muderhwa et al, J. Pharmaceut. Sei. 88: 1332-9, 1999)), VesiVax® TLR (Molecular Express, Inc.), digitonina (ver, por exemplo, Patente U.S. 5,698,432), and lipídios de glucopiranosil (ver, por exemplo, Pedido de Patente U.S. 20100310602).

[112] Agentes Quimioterápicos

[113] Em modalidades adicionais os métodos ainda envolvem administrar ao sujeito uma quantidade efetiva de um ou mais quimioterápicos como um tratamento adicional. Em determinadas modalidades um ou mais quimioterápicos são selecionados dentre acetato de abiraterona, altretamina, anidrovinblastina, auristatina, bexaroteno, bicalutamida, BMS 184476, 2,3,4,5,6-pentaflúor-N-(3-flúor-4- metoxifenil)benzeno sulfonamida, bleomicina, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N- metil-L-valil-L-proli-1-Lprolina-t-butilamida, caquetina, cemadotina, clorambucil, ciclofosfamida, S'^'-didehidro^'-desoxi-S'-norvin- caleucoblastina, docetaxol, doxetaxel, ciclofosfamida, carboplatina, carmustina, cisplatina, criptoficina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina (DTIC), dactinomicina, daunorrubicina, decitabina dolastatina, doxorrubicina (Adriamicina), etoposida, 5-fluorouracil, finasterida, flutamida, hidroxiuréia e hidroxiuréiataxanos, ifosfamida, liarozol, lonidamina, lomustina (CCNU), MDV3100, mecloretamina (nitrogênio mostardo), melfalano, isetionato de mivobulina, didesidrorrizoxina, sertenef, streptozocin, mitomicina, metotrexato, taxanos, nilutamida, onapristona, paclitaxel, prednimustina, procarbazina, RPR109881, fosfato de estramustina, tamoxifeno, tasonermin, taxol, tretinoina, vimblastina, vincristina, vindesina sulfato e vinflunina.

[114] Linhas Celulares Imunomoduladoras

[115] Por "célula de tumor inativada"entenda-se uma célula de tumor ("autóloga"ou "alogênica"para o paciente) que foi tratada para evitar a divisão das células. Para fins da presente invenção, tais células preservam sua imunogenicidade e sua atividade metabólica. Tais células tumorais são geneticamente modificadas para expressar um transgene que é expresso dentro de um paciente como parte da terapia do câncer. Assim, uma composição ou vacina da invenção compreende células neoplásicas (por exemplo, tumor) que são autólogas ou alogênicas para o paciente em tratamento e mais de preferência é do mesmo tipo geral da célula do tumor que aflige o paciente. Por exemplo, a um paciente que sofre de melanoma geralmente será administrado uma célula geneticamente modificada derivada de um melanoma. Métodos para inativar as células do tumor para usar na presente invenção, tais como o uso da irradiação, são bem conhecidos na técnica.

[116] As células do tumor inativadas da presente invenção são administradas ao paciente em conjunto com uma ou mais moléculas de co- estimulação ou agentes. Um agente de co-estimulação preferencial é composto por um ou mais citocinas que estimulam a indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação. Métodos para avaliar tais agentes de co-estimulação são conhecidos na literatura. Indução e maturação de DCs é normalmente avaliada pelo aumento da expressão de certas moléculas de membrana como CD80 e CD86, e/ou secreção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12 e interferons do tipo I após estimulação.

[117] Em modalidades preferenciais as células de tumor inativada próprias são modificadas para expressar e secretar um ou mais citocinas que estimulam a indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação. A presente invenção é descrita em termos exemplares no que diz respeito ao uso de GM-CSF. Assim, a título de exemplo, a célula do tumor pode expressar um transgene que codifica GM-CSF, conforme descrito em Pat. U.S. N°s 5.637.483, 5.904.920, 6.277.368 e 6.350.445, bem como Publicação de Patente U.S. N° 20100150946, cada um dos quais é expressamente incorporado por referência neste documento. Uma forma de células cancerosas geneticamente modificadas que expressam GM-CSFou uma "vacina celular que expressa citocina" para o tratamento de câncer no pâncreas é descrita em Pat. U.S. N°s 6.033.674 e 5.985.290, ambos os quais são expressamente incorporados por referência neste documento.

[118] Outras citocinas adequadas que podem ser expressas de tais células inativadas tumorais e/ou células de espectador em vez de, ou juntamente com, GM-CSF incluem, mas não se limitam a um ou mais dos ligante CD40, IL-12, CCL3, CCL20 e CCL21. Esta lista não pretende ser um fator limitante.

[119] Embora seja preferível que as células de tumor inativadas administradas ao sujeito expressem uma ou mais citocinas de interesse, a linhagem de células de tumor pode ser acompanhada por uma linhagem de células de espectador inativada que expressa e segrega uma ou mais citocinas que estimulam indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação. A linha celular do espectador pode fornecer todas as citocinas que estimulam a indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação, ou podem suplementar as citocinas que estimulam a indução de células dendríticas, recrutamento e/ou maturação expressa e secretada pelas células inativadas de tumor. A título de exemplo, linhas celulares de espectador imunomoduladoras que expressam citocina são divulgadas na Pat. U.S. N°s 6.464.973 e 8.012.469, Dessureault et al., Ann. Surg. Oncol. 14: 869-84, 2007, e Eager e Nemunaitis, Mol. Ther. 12: 18-27, 2005, cada um dos quais é expressamente incorporado por referência neste documento.

[120] Por "polipeptídeo de fator estimulante de colônia granulócito- macrófago (GM-CSF)"entenda-se uma citocina ou fragmento respectivo com atividade imunomoduladora e pelo menos cerca de 85% de identidade de sequência de aminoácidos com GenBank N° de Adesão AAA52122.1.

[121] Vacinas

[122] Em determinadas modalidades, as composições de CDN são administradas em conjunto com uma ou mais vacinas destinadas a estimular uma resposta imune a um ou mais antígenos predeterminados. Exemplos de antígenos alvo que podem encontrar uso na invenção estão listados na tabela a seguir. O antígeno alvo também pode ser um fragmento ou polipeptídeo de fusão compreendendo uma porção imunologicamente ativa dos antígenos listados na tabela. Esta lista não pretende ser um fator limitante. Tabela 1: Antígenos.

Outros organismos para os quais antígenos adequados são conhecidos na técnica incluem, mas não se limitam a Chlamydia trachomatis, Streptococcus pyogenes(Grupo A Strep), Streptococcusagalactia(Grupo B Strep), Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrheae, Vibrio cholerae, espécies de Salmonella (incluindo typhi, typhimurium), enterica (incluindo Helicobactor pylori Shigella flexneri e outras espécies de Grupo D de shigella ), Burkholderiamallei, Burkholderia pseudomallei, Klebsiella pneumonia, espécies de Clostridium(incluindo C. difficile), Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus.Esta lista não pretende ser um fator limitante.

[123] Composições Farmacêuticas

[124] O termo "farmacêutico" neste documento refere-se a uma substância química destinada ao uso na cura, tratamento ou prevenção da doença e que está sujeita a um processo de aprovação pela U.S. Food and Drug Administration (ou um equivalente fora dos EUA) como um produto de droga por receita ou de venda livre. Detalhes sobre técnicas para a formulação e administração de tais composições podem ser encontrados em Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Edition (Mack Publishing Co., Easton,PA) and Nielloud and Marti-Mestres, Pharmaceutical Emulsions and Suspensions: 2nd Edition (Marcel Dekker, Inc, New York).

[125] Para fins de divulgação, as composições farmacêuticas podem ser administradas por uma variedade de meios, incluindo por via oral, por via parentérica, por spray de inalação, topicamente, ou por via retal em formulações contendo os transportadores farmaceuticamente aceitáveis, adjuvantes e veículos. O termo parenteral como usado aqui inclui mas não está limitado a injeções subcutânea, endovenosa, intramuscular, intra-  arterial, intradérmica, intratecal e epidural com uma variedade de técnicas de infusão. Injeção intravenosa e intra-arterial neste documento inclui a administração através de cateteres. Administração via stents intracoronarianos e reservatórios Intracoronários também é contemplada. O oral termo neste documento inclui, mas não está limitado a ingestão oral, ou à entrega por via sublingual ou bucal. Administração oral inclui bebidas fluidas, barras energéticas, bem como formulações da pílula.

[126] Composições farmacêuticas podem estar em qualquer forma adequada para o método pretendido da administração. Quando usados para uso oral, por exemplo, comprimidos, pastilhas, pastilhas para chupar, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersáveis, emulsões, cápsulas duras ou macias, xaropes ou elixires podem ser preparados. Composições destinadas para uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido da técnica para a manufatura de composições farmacêuticas, e tais composições podem conter um ou mais agentes incluindo agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes de coloração e agentes conservantes, a fim de prover preparações farmaceuticamente palatáveis. Comprimidos que contêm o composto de droga na mistura com excipientes farmaceuticamente aceitáveis não tóxicos, que são adequados para a fabricação de comprimidos, são aceitáveis. Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio ou de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou de sódio; agentes granuladores e desintegrantes, tais como amido de milho ou ácido algínico; agentes Iigantes, tais como amido, gelatina ou acácia; e agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem ser não revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhecidas incluindo revestimento entérico, revestimento colônico e microencapsulação para retardar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e/ou proporcionar uma ação sustentada durante um período mais longo. Por exemplo, um material retardante de tempo, tal como monoestearato de gliceril ou diestearato de gliceril sozinho ou com uma cera, pode ser empregado.

[127] Formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o composto de droga é misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, o carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou cápsulas de gelatina mole, em que o ingrediente ativo é misturado com transportador solúvel em água como polietilenoglicol ou um meio de óleo, por exemplo óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva.

[128] Composições farmacêuticas podem ser formuladas como suspensões aquosas em mistura com excipientes adequados para a fabricação de suspensões aquosas. Esses excipientes incluem um agente de suspensão, tal como carboximetilcelulose sódica, croscarmelose, povidona, metilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma arábica, e agentes dispersantes ou umidificantes, tais como fosfatida de ocorrência natural (por exemplo, lecitina), um produto de condensação de um óxido de alquileno com um ácido graxo (por exemplo, estearato de polioxietileno), um produto de condensação de óxido de etileno com um álcool alifático de cadeia longa (por exemplo, heptadecaetileno-oxicetanol), um produto de condensação de óxido de etileno com um éster parcial derivado de um ácido graxo e um anidrido de hexitol (por exemplo, mono-oleato de polioxietileno sorbitano). As soluções aquosas também podem conter um ou mais conservantes, tais como etil ou p-hidroxibenzoato de n-propil, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou mais agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.

[129] Suspensões oleosas podem ser formuladas suspendendo o(s) ingrediente(s) ativo(s) em um óleo vegetal, por exemplo, óleo de arachis, azeite de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco, ou em óleo mineral tal como a parafina líquida. As suspensões orais podem conter um agente espessante, como cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes edulcorantes tais como aqueles acima definidos e agentes flavorizantes podem ser adicionados para fornecer uma preparação oral palatável. Estas composições podem ser preservadas pela adição de um antioxidante como ácido ascórbico.

[130] Pós e grânulos dispersíveis da divulgação apropriados para a preparação de uma solução aquosa ou suspensão pela adição de água fornecem o ingrediente ativo na mistura com um agente de dispersão ou umectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Dispersantes adequados ou agentes umectantes e agentes de suspensão são exemplificados por aqueles já citados acima. Excipientes adicionais, por exemplo, edulcorantes, flavorizantes e agentes de coloração, podem também estar presentes.

[131] As composições farmacêuticas da divulgação também podem ser na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, como azeite ou óleo de arachis, um óleo mineral, tais como a parafina líquida, ou uma mistura destes. Agentes emulsionante adequados incluem gomas que ocorrem naturalmente, tais como a goma de acácia e goma de tragacanto, fosfatídeos que ocorrem naturalmente, tais como a lecitina de soja, ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, tais como monooleato de sorbitano e produtos de condensação destes ésteres parciais com óxido de etileno, como monooleato de polioxietileno sorbitano. A emulsão também pode conter agentes edulcorantes e flavorizantes.

[132] Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes edulcorantes, como glicerol, propilenoglicol, sorbitol ou sacarose. Tais formulações também podem conter um demulcente, um conservante, uns agentes flavorizantes ou corantes.

[133] As composições farmacêuticas da divulgação podem ser na forma de uma preparação injetável estéril, como uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Esta suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes ou umidificantes adequados e agentes de suspensão que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente aceitável parenteralmente não tóxico, tal como uma solução em 1,3-butanodiol ou preparada como um pó liofilizado. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis podem ser convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para este efeito, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintético. Além disso, ácidos graxos, tais como o ácido oleico, podem ser usados de mesma forma na preparação de injetáveis.

[134] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com o material veicular com finalidade de produzir uma forma de dosagem unitária variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo específico de administração. Por exemplo, uma formulação de liberação por tempo destinada à administração oral em humanos pode conter aproximadamente de 20 a 500 mg do material ativo composto por uma quantidade apropriada e conveniente do material do carreador, que pode variar de cerca de 5 a cerca de 95% das composições totais. É preferencial que a composição farmacêutica seja preparada que forneça quantidades facilmente mensuráveis para a administração. Normalmente, uma quantidade efetiva a ser administrada sistemicamente é aproximadamente 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg e depende de uma série de fatores, incluindo, por exemplo, a idade e peso do sujeito (por exemplo, um mamífero como um ser humano), a condição precisa que exige o tratamento e a sua gravidade, a rota de administração, e acabará por ser a critério do médico atendente ou veterinário. Vai entender-se, no entanto, que o nível de dose específica para qualquer paciente particular vai depender de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado; a idade, peso corporal, saúde geral, sexo e dieta do indivíduo a ser tratado; o tempo e a via de administração; a taxa de excreção; outras drogas que anteriormente foram administradas; e a severidade da condição específica em terapia, como é bem entendido por aqueles versados na técnica.

[135] Como notado acima, formulações da divulgação adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas tais como cápsulas, pílulas ou pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente ativo; como um pó ou granulado; como uma solução ou suspensão em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso; ou como uma emulsão líquida do tipo óleo-em-água ou uma emulsão líquida do tipo água-em-óleo. As composições farmacêuticas também podem ser administradas como bolus, electuário ou pasta.

[136] Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Pastilhas comprimidas podem ser preparadas ao comprimir, em uma máquina adequada, o princípio ativo em uma forma de fluxo livre, tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com ligantes (por exemplo, povidona, gelatina, hidroxipropilmetil celulose), diluentes inertes, conservante, desintegrante (por exemplo, amido glicolato de sódio, povidona reticulada, carboximetilcelulose de sódio reticulada) ou agentes de lubrificação, superfície ativa ou de dispersão. Pastilhas moldadas podem ser feitas moldando-se, em uma máquina adequada, usando uma mistura do composto em pó umedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem opcionalmente ser revestidos ou marcados e podem ser formulados a fim de fornecer liberação lenta ou controlada do ingrediente ativo neles usando, por exemplo, hidroxipropil metilcelulose, em proporções variáveis para fornecer o perfil de liberação desejado. Pastilhas podem ser opcionalmente providas com um revestimento entérico ou colônico para prover liberação em partes do intestino que não sejam o estômago. Isto é particularmente vantajoso com os compostos de Fórmula 1, quando tais compostos são suscetíveis à hidrólise ácida.

[137] Formulações adequadas para administração tópica na boca incluem pastilhas compreendendo o princípio ativo em uma base com sabor, geralmente sacarose e acácia ou tragacanto; pastilhas, compreendendo o princípio ativo em uma base inerte como a gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia; e desinfetante bucal contendo o ingrediente ativo em um transportador líquido apropriado.

[138] Formulações para administração retal podem ser apresentadas como um supositório com uma base adequada, que compreende, por exemplo, manteiga de cacau ou um salicilato.

[139] Formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentada como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de pulverizador contendo além do ingrediente ativo essas transportadoras como são conhecidas na técnica para ser apropriadas.

[140] Formulações adequadas para a administração parenteral incluem soluções de injeção isotônicas estéreis aquosas e não aquosas que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostáticos e solutos que tornam a formulação isotônica com o sangue do recebedor pretendido; e suspensões estéreis aquosas e não aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes vedados de doses única ou de doses múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos e podem ser armazenadas em uma condição de congelamento a seco (liofilizada), exigindo apenas a adição do transportador líquido estéril, por exemplo, água para injeções, imediatamente antes da utilização. As soluções e suspensões de injeção podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo descrito anteriormente.

[141] Como usado aqui, sais farmaceuticamente aceitáveis incluem mas não estão limitados a: acetato, piridina, amónio, piperazina, dietilamina, nicotinamida, fórmico, ureia, sódio, potássio, cálcio, magnésio, zinco, lítio, cinâmico, metilamino, metanossulfônico, pícrico, tartárico, trietilamino, dimetilamino e tris(hidoximetil)aminometano. Sais farmaceuticamente aceitáveis adicionais são conhecidos por aqueles versados na técnica.

[142] Uma quantidade efetiva para um determinado paciente pode variar dependendo de fatores como a condição sendo tratada, a saúde geral do paciente, a rota e a dose de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Orientação para os métodos de diagnóstico e tratamento está disponível (Veja, por exemplo, Maynard, et al. (1996) A Handbook of SOPs for Good Clinical Practice, Interpharm Press, Boca Raton, FL; Dent (2001) Good Laboratory and Good Clinical Practice, Urch Publ., London, UK).

[143] Uma quantidade eficaz pode ser dada em uma dose, mas não está restrita a uma dose. Assim, a administração pode ser duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte ou mais administrações da composição farmacêutica. Onde há mais de uma administração de uma composição farmacêutica nos métodos presentes, as administrações podem ser espaçadas por intervalos de tempo de um minuto, dois minutos, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais minutos, por intervalos de cerca de uma hora, duas horas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, e assim por diante. No contexto das horas, o termo "cerca de" significa mais ou menos qualquer intervalo de tempo dentro de 30 minutos. As administrações podem também ser espaçadas por intervalos de tempo de um dia, dois dias, três, quatro dias, cinco, seis dias, sete, oito dias, nove, dez dias, dias 11, 12 dias, dias 13, 14 dias, 15 dias, 16, 17 dias, 18, 19 dias, dias 20, 21 dias e suas combinações. A invenção não está limitada a intervalos de dosagem que são espaçados igualmente em tempo, mas  abrangem doses em intervalos não-iguais.

[144] Um cronograma de dosagem de, por exemplo, uma vez/semana, duas vezes por semana, três vezes/semana, quatro vezes/semana, cinco vezes/semana, seis vezes/semana, sete vezes/semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas e afins está disponível para a invenção. Os cronogramas de dosagens englobam a dosagem por um período total de tempo de, por exemplo, uma semana, duas semanas, três semanas, quatro semanas, cinco semanas, seis semanas, dois meses, três meses, quatro meses, cinco meses, seis meses, sete meses, oito meses, nove, dez meses, onze meses e doze meses.

[145] São fornecidos ciclos dos cronogramas de dosagem acima. O ciclo pode ser repetido cerca de, por exemplo, a cada sete dias; a cada 14 dias; cada 21 dias; cada 28 dias; a cada 35 dias; 42 dias; a cada 49 dias; a cada 56 dias; a cada 63 dias; a cada 70 dias; e afins. Um intervalo de não- dosagem pode ocorrer entre um ciclo, onde o intervalo pode ser cerca de, por exemplo, sete dias; 14 dias; 21 dias; 28 dias; 35 dias; 42 dias; 49 dias; 56 dias; 63 dias; 70 dias; e afins. Neste contexto, o termo "cerca de" significa mais ou menos um dia, mais ou menos dois dias, mais ou menos três dias, mais ou menos quatro dias, mais ou menos cinco dias, mais ou menos seis dias, ou mais ou menos sete dias.

[146] Métodos para co-administração com um agente terapêutico adicional são bem conhecidos na arte (Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA).

[147] Como observado, as composições da presente invenção de preferência são formuladas como composições farmacêuticas para entrega parenteral ou enteral, Uma típica composição farmacêutica para administração de um animal compreende um veículo farmaceuticamente aceitável como soluções aquosas, excipientes tóxicos, incluindo sais, conservantes, tampões e afins. Veja, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Easton ed. , Mack Publishing Co., pp 1405-1412 and 1461- 1487 (1975); The National Formulary XIV, 14th Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, DC (1975) . Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais, como azeite, e os ésteres injetáveis orgânicos, tais como oleato de etila. Transportadores aquosos incluem água, soluções aquosas/alcoólicas, soluções salinas, veículos parenterais, tais como o cloreto de sódio, dextrose Ringer, etc. Veículos intravenosos incluem repositores de fluidos e nutrientes. Conservantes incluem agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e gases inertes. O pH e a concentração exata dos vários componentes da composição farmacêutica são ajustados de acordo com habilidades ordinárias na técnica.

[148] Repetidas administrações de uma determinada vacina (aumento homólogo) têm se mostrado eficazes para impulsionar respostas humorais. Essa abordagem pode não ser eficaz em aumentar a imunidade celular porque imunidade prévia ao vetor tende a prejudicar a apresentação de antígenos robusta e a geração de sinais inflamatórios apropriados. Uma abordagem para contornar este problema tem sido a administração sequencial de vacinas que utilizam sistemas de entrega diferentes do antígeno (incremento heterólogo). Em um regime de incremento heterólogo, pelo menos uma entrega iniciada ou de incremento compreende entrega das composições de dinucleotídeo de purina cíclico/célula de tumor inativada aqui descritos. O ramo heterólogo do regime pode incluir entrega do antígeno, usando uma ou mais das seguintes estratégias: inativadas ou atenuadas bactérias ou vírus que compreendem o antígeno de interesse, que são partículas que tenham sido tratadas com alguma condição de desnaturação para torná-los ineficazes ou ineficientes em uma invasão patogênica; antígenos purificados, que são normalmente antígenos produzidos naturalmente purificados de uma cultura de células do patógeno ou uma amostra de tecido contendo o patógeno, ou uma versão recombinante Vetores de entrega virais ou bacterianos vivos projetados recombinantemente para expressar e/ou secretar antígenos nas células hospedeiras do sujeito. Estas estratégias dependem de atenuar (por exemplo, através de engenharia genética) os vetores virais ou bacterianos de forma serem não-patogênicas e não tóxicos; vetores de célula apresentadora de antígenos (APC), como um vetor de célula dendrítica (DC), que compreende as células que são carregadas com um antígeno, ou transfectadas com uma composição que compreende um ácido nucléico codificando o antígeno (por exemplo, Provenge® (Dendreon Corporation) para o tratamento do câncer de próstata metastático resistente à castração); veículos de entrega de antígeno lipossomal; e vetores de DNA nus e vetores de RNA nus, que podem ser administrados por um injetor do gene, eletroporação, fantasmas bacterianos, microesferas, micropartículas, lipossomas, nanopartículas policatiônicas e afins.

[149] Uma vacina de iniciação e uma vacina de incremento podem ser administradas por qualquer um ou uma combinação de rotas a seguir. Em um aspecto, a primeira vacina e vacina de incremento são administradas pela mesma rota. Em outro aspecto, a vacina de iniciação e vacina de incremento são administradas por diferentes rotas. O termo "rotas diferentes" abrange, mas não se limita a diferentes sítios no corpo, por exemplo, um sítio que é oral, não-oral, enteral, parenteral, retal, intranodo (linfonodo), intravenoso, arterial, subcutâneo, intramuscular, intratumor, peritumor, intratumor, infusão, da mucosa, nasal, no espaço cerebrospinal ou líquido cefalorraquidiano, e assim por diante, assim como por diferentes modos, por exemplo, orais, intravenosa e intramusculares.

[150] Uma quantidade eficaz de uma vacina de iniciação ou incremento pode ser dada em uma dose, mas não está restrita a uma dose. Assim, a administração pode ser duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, catorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, vinte ou mais administrações da vacina. Onde há mais de uma administração de uma vacina nos métodos presentes, as administrações podem ser espaçadas por intervalos de tempo de um minuto, dois minutos, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais minutos, por intervalos de cerca de uma hora, duas horas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 horas, e assim por diante. No contexto das horas, o termo "cerca de" significa mais ou menos qualquer intervalo de tempo dentro de 30 minutos. As administrações podem também ser espaçadas por intervalos de tempo de um dia, dois dias, três, quatro dias, cinco, seis dias, sete, oito dias, nove, dez dias, dias 11,12 dias, dias 13, 14 dias, 15 dias, 16, 17 dias, 18, 19 dias, dias 20, 21 dias e suas combinações. A invenção não está limitada a intervalos de dosagens que são espaçados igualmente em tempo, mas abrange doses em intervalos não-iguais, como um cronograma de iniciação consistindo de administração em 1 dia, 4 dias, 7 dias e 25 dias, apenas para fornecer um exemplo de não-limitação.

[151] Referências 1 Reed, S. G., Bertholet, S., Color, R. N. & Friede, M. New horizons in adjuvants for vaccine development. Trends in immunology 30, 23-32, doi: 10.1016/j.it.2008.09.006 (2009). 2 Dubensky, T. W., Jr. & Reed, S. G. Adjuvants for cancer vaccines. Seminars in immunology 22, 155-161, doi:10.1016/j.smim.2010.04.007  (2010). 3 Kastenmuller, K. et al. Protective T cell immunity in mice following protein-TLR7/8 agonist-conjugate immunization requires aggregation, type I IFN, and multiple DC subsets. The Journal of clinical investigation 121, 1782-1796, doi:10.1172/JCI45416 (2011). 4 Coffman, R. L, Sher, A. & Seder, R. A. Vaccine adjuvants: putting innate immunity to work. Immunity 33, 492-503, doi:10.1016/j.immuni.2010.10.002 (2010). 5 Burdette, D. L. et al. STING is a direct innate immune sensor of cyclic di-GMP. Nature 478, 515-518, doi:10.1038/nature10429 (2011). 6 Woodward, J. J., lavarone, A. T. & Portnoy, D. 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EXEMPLOS

[152] Os exemplos a seguir são dados para ilustrar a presente invenção. Este exemplos não se destinam a restringir o escopo da invenção de alguma forma.

[153] Exemplo 1: Métodos Gerais

[154] Solventes anidros e reagentes apropriados para síntese de oligonucleotídeo de fase de solução foram comprados e manipulados sob argônio ou nitrogênio secos, usando a técnica anidra. Reações de acoplamento de amidita e ciclizações foram realizada em acetonitrilo anidro ou piridina sob argônio ou nitrogênio seco. As matérias-primas para todas as reações em piridina seca foram secas por concentração (três vezes) a partir de piridina. Cromatografia em sílica gel preparativa foi realizada usando grau de alta pureza de Fluka 60A ou sílica Merck grau 9385 usando gradientes de metanol em diclorometano. HPLC analítico foi realizado em um sistema Varian ProStar 210 HPLC com um detector matriz de fotodiodo ProStar 330 monitorando em 254nm sobre uma coluna Varian Microsorb C 100-1018 250x4.6mm usando gradientes de 10mm TEAA e acetonitrilo no fluxo de 1,0 ml/min. HPLC preparativa foi realizada em um sistema Shimadzu LC20-AP HPLC preparativo, equipado com um detector SPD- 20A UV/Vis monitorando em 254nm sobre uma coluna Varian Microsorb 608 C de 41,6 x 250mm 18 usando gradientes de 10mm de TEAA e acetonitrila em uma taxa de fluxo de 50 ml/min. Extrações de fase sólida usando C-18 Sep-Pak (Waters) foram realizadas em cargas de ~3% (peso/peso). LC/MS (ESI/APCI) foi obtido em um único instrumento Shimadzu 2010 EV quadrapole com detecção de PDA, MS e ELSD usando uma HPLC analítica Shimadzu LC20D. Um espectrômetro de massa de alta resolução FT-ICR foi obtido da WM Keck Foundation Biotechnology Resource Laboratory da Universidade de Yale, em New Haven, CT. Os espectros de PMNR 1h e 31foram adquiridos em um espectrômetro Bruker 400 MHz ou um Varian Inova 500 MHz. OS PNMR 31 foram referenciados indiretamente a dioxano em D2O.

[155] A atribuição de dinucleotídeos cíclicos e derivados de HPLC purificados são resumidos na tabela 1 e descritos em detalhes nos exemplos. Tabela 1: Tempo de retenção em HPLC de Fase Reversa (min) e Mudanças Químicas 31P (ppm) a 25 ’C de sais de trietilamônio (10a,10b, 10c, 11a, 11b, 11c, 12, 13)

‘Gradiente HPLC: 2 para 20% CH3CN em 10mM TEAA durante 20 min a um fluxo de 1ml/min §Gradiente HPLC: 2 para 80% CH3CN em 10mM TEAA durante 20 min a um fluxo de 1ml/min

[156] Exemplo 2. Síntese de10a.

[157] A seguinte síntese de cíclico-di-AMP é descrito esquematicamente na Fig. 6 e é uma modificação de uma síntese de cíclico-di-GMP relatado por Gaffney et al. (One-flask synthesis of c-di-GMP and the [Rp,Rp] and [Rp,Sp] thiophosphate analogues. Organic Letters 12, 3269-3271 (2010)).

[158] a) Fosfitilação de 1 com 2-cloro-5,6-benzo-1,3,2-dioxafosforina- 4-ona (2) e extração sólido-líquido com CH2CI2/hexano (1:1) para render o 5'-DMT-3'-H-fosfonato de 4.

[159] Para uma solução de 1 (3,94 g, 5 mmol) em 15 ml de dioxano anidro e 5 ml de piridina seca foram adicionados, com agitação, 5,6 ml (7.0 mmol) de uma solução de estoque de 1,25 M em dioxano de 2-choro-5,6- benzo-1,3,2-dioxafosforina-4-ona (2). Depois de 15 min, a reação foi extinta com 1 ml de água e a mistura derramada em 10 ml 0,25 M de NaHCO3, seguido de extração (3x15 ml) com acetato de etila. A fase orgânica foi seca (Na2SO4) e concentrada para render 3.8 g. O sólido foi triturado com 100 ml de CH2CI2/hexano (1:1), filtrado, e o sólido residual secado para render um pó branco fino (3,5 g) que funcionou como um local em TLC (Rf = 0.1) eluindo com 5% de CH3OH em CH2CI2 com trietilamina a 0,5%.

[160] b) Destrituração por bissulfato de sódio absorvido a silica gel (NaHSO4-SiO2) e precipitação do 5'-OH-3'-H-fosfonato (5).

[161] Para uma solução de 4 (1,74 g, 2 mmol) em 85 ml de diclorometano e 0,072 ml de água (4 mmole) foram adicionados 0,55 g de NaHSO4-SiO2 (2,4 mmol H+/gr NaHSO4-SiO2). A reação foi completa após agitação à temperatura ambiente durante 35 minutos (TLC em 10% MeOH em CH2CI2 com 0,5% TEA). O NaHSO4-SiO2 foi removido por filtração e lavado (3 x 5ml) com CH2CI2. 100 ml de hexano:tolueno (1:1) foram adicionados, feitos em vórtice por 5 minutos e o solvente foi decantado (repetido duas vezes). Evaporação deu 0,92 g de 5 como um sólido. HPLC analítica indicou pureza de 96,4%. LC/MS no modo negativo confirmou m/z (M-1) 548.2 (calculado para C23H3iN5O7PSr: 548.2).

[162] c) Acoplamento, oxidação e destrituração.

[163] DMT-rA (bz)-pCE-TBDMS-fosforamidita (3) (3,5 g, 3.6 mmole) foi co-evaporada três vezes com 20 ml de acetonitrilo seco, a última vez deixando cerca de 10 ml de volume, ao qual foram adicionadas 10 peneiras moleculares 3A. A solução foi deixada sob argônio seco.

[164] 1,6 g de H-fosfonato (5) foi evaporado três vezes de CH3CN anidro, a última vez deixando 100 ml. Esta solução foi adicionada à solução de fosforamidita seca via seringa, seguida por 1,4 g de triflúoracetato de piridínio (que tinham sido secos por evaporação de 3x20 ml de piridina anidra). Depois de 20 min 3 ml de 5,5 M tert-butilhidroperóxido foram adicionados e agitados por 30 min. Após o resfriamento em banho de gelo, 0,3 g de NaHSO3 em 1 ml de água foram adicionados e a mistura agitada por 5 min. O solvente foi então evaporado e o resíduo retomado em 20ml (CH2CI2/MeOH, 98:2). As peneiras foram filtradas fora e solvente mudou para 81 ml de CH2CI2. NaHSO4-SiO2 (513 mg) e água (65 microlitros) foram adicionados e a reação agitada por 40 min. A mistura foi filtrada através de Celite, o pad lavado com CH2CI2 e o filtrado evaporado para render 7a bruto. LC/MS no modo negativo confirmou m/z (M-1) 1148.5 (calculado para C^F^NnO^Si/: 1148.37.

[165] d) Ciclização de dímero linear (7a) e oxidação para render 8a.

[166] Ao 7abruto (secado por evaporação de piridina anidra deixando 100 ml após evaporação final) foi adicionado DMOCP (1,9 g, 10.15 mmol). Depois de 12 minutos, a reação foi extinta com água (2,3 g), seguida imediatamente pela adição de iodo (0,96 g, 3.78 mmol). A mistura de reação foi derramada em 400 ml de água contendo 0,6 g NaHSO3. Depois de 5 min agitando, 11,2 g de NaHCO3 foram adicionados em porções e a solução agitada por 5 min. A mistura foi particionada duas vezes com 500 ml de acetato de etila/éter (3:2). As camadas orgânicas foram combinadas, secas (Na2SO4) e evaporadas. Tolueno (3 x 10 ml) foi adicionado e evaporado para remover piridina residual para render 2,37 g de 8a como um sólido amarelo-marrom. LC/MS no modo negativo confirmou m/z (M-1) 1146.6 (calculado para 1146.4

[167] e) Desproteção de 8a bruto com hidróxido de amónio concentrado para render 9a bruto e preparar HPLC para render 9a em forma pura.

[168] A 600 mg de 8a em um tubo de pressão de paredes de espessura de vidro de 200 ml foram adicionados 40 ml de metanol e 40 ml concentrado de amónia aquosa, e a mistura resultante foi agitada a 50°C por 16 hr. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e o resíduo lavado com acetato de etila (3x10 ml) para render 510 mg de 9a bruto.

[169] A porção de 102 mg de 9a bruto em 4 ml de 20% de CH3CN em 10mm de acetato de trietilamônio foi aplicada à coluna HPLC prep e eluída usando um gradiente de acetonitrilo e 10 mM de acetato de trietilamônio na água (20->50% CH3CN, mais de 20 minutos no fluxo de 50 ml/min). Frações HPLC contendo puro 9a foram agrupadas, evaporadas para remover CH3CN e liofilizadas para remover a água restante e tampão volátil para dar 32 mg de puro 9a como o sal de bis-trietilamônio. LC/MS no modo negativo confirmou m/z (M-1) 885.5 (calculado para C32Hs1N10O12P2Si2’: 885.3. (Também foi possível adiar a purificação de HPLC prep até após a última etapa, conforme descrito na série c-di-GMP e ditio-c-di-GMP abaixo).

[170] f) Desproteção de grupos TBS de9a com trihidro fluoreto de trietilamina, neutralização com TEAB e extração de fase sólida com um C18 Sep-Pak para render 10a puro como o bis-trietilamônio sal.

[171] A 20 mg de 9a foram adicionados 0,25 ml de trihidrofluoreto de trietilamina. A mistura foi colocada num agitador por 48h no ponto em que uma HPLC analítica de um amostra de 10 microlitros neutralizada com 100 microlitros de 1M de bicarbonato de trietilamônio indicou o consumo de matéria-prima e aparição de um único produto novo. A mistura de reação foi então adicionada gota a gota agitando a um volume de 10 x de refrigerados 1 M de bicarbonato de trietilamônio. Solução neutralizada depois foi carregada em uma Waters C-18 Sep-Pak, e depois de lavar a coluna com 6 volumes de acetato de trietilamônio de 10 mM, o produto foi eluído com CH3CN: acetato de trietilamônio (1:1). O CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa foi liofilizada até secura para render 14 mg de 10a como o sal de bis-trietilamônio. HRMS de 10a no modo negativo confirma m/z (M-H) 657.0985 (calculado para C2oH23N10012P2 '• 657.0978). 1H NMR (D2O) 45°C õ(ppm) 8.34 (s,2H), 8.11 (s,2H), 6.15 (s,2H), 4.34 (m, 4H), 4.15 (m,2H), 3.77 (m, 2H), 3.19 (q, J=7Hz), 1.27(t, J=7Hz). 31P NMR (D2O) 25° C. õ(ppm)-1.74.

[172] Exemplo 3. Síntese de 10b e 10c.

[173] A síntese a seguir é descrita esquematicamente na Fig 6.

[174] a) Hidrólise de DMT-rA comercialmente disponível DMT-rA(bz)- pCE-TBDMS-fosforamidita (3), p-eliminação e cromatografia de sílica do resultante 5'-DMT-3'-H-fosfonato (4):

[175] Para uma solução de DMT-rA(bz)-pCE-TBDMS-fosforamidita (3) (11 g, 11.1 mmole) em 50 ml de acetonitrila foi adicionada água (0,36 ml, 20 mmole, 1.8 equiv) e triflúoracetato de piridinio (2,3 g, 11,9 mmole, 1.07 equiv). Depois de agitar a mistura durante 5 minutos à temperatura ambiente, tert-Butilamina (50 ml) foi adicionada e agitação continuou por mais 10 minutos. A mistura foi então concentrada para uma espuma que foi pegada em diclorometano e aplicada a uma coluna de sílica gel eluindo com um gradiente de 5% a 10% de MeOH em diclorometano. Frações de coluna que contém o produto desejado foram agrupadas e concentradas para render o 5'-DMT-3'-H-fosfonato (4) como uma espuma (6,68 g, 7,8 mmole, 70% de rendimento)

[176] b) Destrituração e precipitação do 5'-OH-3'-H-fosfonato (5):

[177] A uma solução de 4 (6,68 g, 7.8 mmol) em 60 ml de diclorometano e 1,4 ml de água (78 mmole, 10 equiv) foi adicionada uma porção de 100 ml de ácido dicloroacético de 6% em diclorometano (73 mmole, equiv 9,35). Após agitação em temperatura ambiente por 10 minutos, piridina (11,2 ml, 139 mmole, 1.9 equiv baseado no DCA) foi adicionada para extinguir o ácido e a mistura concentrada para render 5 como um vidro amarelo/laranja. O vidro foi retomado em cerca de 20 ml de diclorometano e adicionado gota a gota com agitação a 500 ml de 7:3 hexano:éter dietílico para precipitar para fora o desejado 5'-OH-3'-H- fosfonato (5). O sobrenadante foi decantado para longe do precipitado (a maior parte do qual formou uma goma agarrada às paredes do frasco) e foi seco a pressão reduzida para baixo para formar uma pasta fluida granular. Esta pasta fluida foi evaporada três vezes com 40 ml de acetonitrilo seco, da última vez deixando cerca de 12ml.

[178] c) Preparação de uma solução seca de fosforamidita (3), em acetonitrila, acoplando com 5'-OH-3'-H-fosfonato 5) e sulfurização para o tiofosfato de dímero linear (6b) e destrituração para 7b.

[179] DMT-rA (bz)-pCE-TBDMS-fosforamidita (3) (9.08 g, 9.36 mmole, 1.2 equiv baseado em H-fosfonato (5) foi co-evaporada três vezes com 40 ml de acetonitrilo seco, a última vez deixando cerca de 20 ml de volume, aos quais foram adicionadas 10 peneiras moleculares 3A. A solução foi deixada sob argônio seco.

[180] Para a solução de fosforamidita (3) foi adicionado 5 (de b) com agitação sob argônio seco. Após agitação por 10 minutos à temperatura ambiente, metade da mistura de reação (para conversão para os análogos de ditio) foi transferida sob argônio para um segundo recipiente de reação e 3-((N,N-dimetilaminometilidenoe)amino-3H-1,2,4-ditiazol-5-tiona (0,88 g, 4,29 mmol, equivalente 1.1) foi adicionado. Após 30 min agitando em temperatura ambiente, a reação foi interrompida colocando-a em um congelador a -20°C. Quando armazenada em freezer por > 48 h um precipitado amarelo separou-se da solução. A mistura foi filtrada e o filtrado concentrado em uma espuma (3,9 g), dissolvido em 50 ml de CH2CI2 e tratado com 100 ul de água seguido imediatamente por 800 mg de NaHSO4-sílica. A mistura foi agitada por 30 min à temperatura ambiente e filtrada para remover a sílica. 60 ml de hexano em seguida foram adicionados ao filtrado e uma fase inferior oleada fora da solução. O óleo foi separado e evaporado para render 3,1 g de 7b bruto.

[181] d) Ciclização de dímero linear (7b), sulfurização e cromatografia de sílica para dar uma mistura de 8b e 8ç.

[182] 7b(3,05 g, 2,6 mmol) foi seco por evaporação a partir de piridina anidra (200 ml de piridina foram adicionados e rotoevaporados deixar 120ml) seguido pela adição de DMOCP (1,68 g, 9,1 mmol, 3.5 equiv). Depois de 12 minutos, a reação foi extinta com água (1.63 g, 91 mmol), seguida imediatamente pela adição de 0.675 g (3.0 mmol, 1.2 equiv) de 3-H-1,2-benzoditiol-3-ona. A mistura de reação foi derramada em 500 ml de bicarbonato de sódio de 0,25 M e em seguida extraída 2 x 500 ml com etilacetato/éter dietílico (3:2). As camadas orgânicas foram combinadas, secas (Na2SO4) e evaporadas sob vácuo. Tolueno (3 x 10 ml) foi adicionado e evaporado para remover piridina residual. O resíduo foi aplicado a uma coluna de sílica e eluído com um gradiente de 0 a 10% do CH30H em CH2CI2 para dar um total de 1,47 g contendo principalmente diastereoisômeros 8b e 8c.

[183] e) Desproteção da mistura de 8b e 8 c com hidróxido de amónio concentrado para dar 9b e 9 c, e separação via HPLC prep para dar 9b e 9 ç em forma pura.

[184] A 230 mg de uma mistura de 8b e 8c em um tubo de pressão de vidro foram adicionados 16ml de metanol seguidos de 16 ml de concentrado de amónia aquosa, e a mistura resultante foi agitada a 50°C por 16 hr. A mistura de reação foi concentrada sob vácuo e o resíduo lavado com acetato de etila (3x10 ml) para render 210 mg de mistura bruta de 9b e 9ç. LC/MS no modo negativo para a mistura 9b/9c confirmou m/z (M-1) 917 (calculado para C32H51N10O10P2S2SÍ2': 917.2.

[185] Separação da mistura de 9b/9c via HPLC prep. Uma porção de 105 mg de mistura bruta 9b e 9c em 4 ml de 30% de CH3CN em 10mM de acetato de trietilamônio foi aplicada à coluna HPLC prep e eluída usando um gradiente de acetonitrilo e 10 mM de acetato de trietilamônio (30->50% CH3CN, mais de 20 minutos no fluxo de 50 ml/min). Fracções HPLC contendo 9b puro foram separadas das que contém puro 9ç. As frações agrupadas foram evaporadas para remover CH3CN e liofilizadas para remover a água restante e tampão volátil para dar 18 mg de 9b e 14 mg de 9c como os sais de bis-trietilamônio.

[186] f) Desproteção de grupos TBS de 9b com trihidro fluoreto de trietilamina, neutralização com TEAB e extração de fase sólida (SPE) com um C-18 Sep-Pak para render 10b puro como o bis-trietilamônio sal.

[187] A 8 mg de 9a foram adicionados 0,4 ml de trihidrofluoreto de trietilamina. A mistura foi colocada num agitador por 16h no ponto em que uma HPLC analítica de um amostra de 5 microlitros neutralizada com 100 microlitros de 1M de bicarbonato de trietilamônio (TEAB) indicou o consumo de matéria-prima e aparição de um único produto novo. A mistura de reação foi então adicionada gota a gota agitando a um volume de -10 x de refrigerados 1 M de bicarbonato de trietilamônio. Solução neutralizada depois foi carregada em uma Waters C-18 Sep-Pak, e depois de lavar a coluna com 6 volumes de acetato de trietilamônio de 10 mM, o produto foi eluído com CH3CN: acetato de trietilamônio a 10mm (1:5). O CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa foi liofilizada até secura para render 6 mg de 10b como o sal de bis-trietilamônio. HRMS de 10b no modo negativo confirma m/z (M-H) 689.0526 (calculado para C20H23N1001OP2S2': 689.0521). 1H NMR (D2O) 35°C Õ8.39 (s, 2H), Õ8.16 (s, 2H), Ô6.16 (s, 2H), õ4.97-5.03(m, 2H), Õ4.78 (m, 2H), Õ4.50-4.55 (m, 4H), 04.04-4.08 (m, 2H), Õ3.20 (q, j=7Hz), Õ1.27(t, J=7Hz). 31PNMR (D2O) 25° C. õ(ppm) 54.41.

[188] g) Desproteção de grupos TBS de9c com trihidrofluoreto de trietilamina, neutralização com TEAS e extração de fase sólida com um C18 Sep-Pak para render 10c puro como o sal de bis-trietilamônio.

[189] A 6 mg de 9c foram adicionados 0,3 ml de trihidrofluoreto de trietilamina. A mistura foi colocada num agitador de 16 h e um procedimento de uma pequena alíquota como em (f) indicou consumo de matéria-prima e surgimento de um único produto novo. A mistura de reação foi então adicionada gota a gota agitando a um volume de ~10 x de refrigerados 1 M de bicarbonato de trietilamônio. Solução neutralizada depois foi carregada em uma Waters C-18 Sep-Pak, e depois de lavar a coluna com 6 volumes de acetato de trietilamônio de 10 mM, o produto foi eluído com CH3CN: acetato de trietilamônio a 10mm (1:5). O CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa foi liofilizada até secura para render 4 mg de 10c como o sal de bis-trietilamônio. HRMS de 10b no modo negativo confirma m/z (M-H) 689.0524 (calculado para C2oH23N10010P2S2’ : 689.0521). 1H NMR (D2O) 35°C õ(ppm) 8.50 (s, 2H), Õ8.37 (s, 2H), Õ8.20 (s, 2H), Õ8.10 (s, 2H), Õ6.17 (s, 2H), Õ6.14 (s, 2H), õ5.06-5.07(m, 2H), 54.96-5.02 (m, 2H), Õ4.87-4.93 (m, 2H), Õ4.75 (m, 2H), Õ4.34-4.56 (m, 10H), õ3.98-4.13(m, 2H), Õ3.20 (q, J=7Hz), Õ1.27(t, J=7Hz). 31PNMR (D2O) 25° c. õ(ppm) 54.54, 54.84, 55.92 (menor).

[190] Exemplo 4. Síntese de (11a), (11b) e (11c).

[191] 11a, 11b e 11c foram sintetizados, conforme descrito em Gaffney et al. com a adição de purificação de HPLC prep do produto final (exemplificado abaixo) em vez de uma recristalização, a fim de alcançar purezas de > 97% para testes biológicos. Alternativamente, a purificação de HPLC prep pode ser efetuada após as etapas de ciclização e desproteção conforme descrito para a série de adenosina na Fig. 6, exemplos 2 e 3.

[192] 11a

[193] A porção de 100 mg de 11a em 3 ml 10mm de acetato de trietilamônio foi aplicada à coluna HPLC prep e eluída usando um gradiente de acetonitrilo e 10 mM de acetato de trietilamônio na água (0% a 10% de gradiente de CH3CN por mais de 22 minutos no fluxo de 50 ml/min). Fracções HPLC contendo 11a puro foram agrupadas e o CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa restante liofilizada para ressecamento para render 40mg de 11a puro como o sal se bis- trietilamônio. HRMS de 11a no modo negativo como m/z (M-H) 689.0893 (calculado para C2oH23N10014P2' : 689.0876). 1H NMR (D2O) 45°C õ(ppm) 8.05 (s,2H), 5.98 (s, 2H), 4.90 (m, 2H), 4.76 (m, 2H), 4.41 (m, 2H), 4.33 (m, 2H), 4.09 (m, 2H), 3.19 (q, J=7Hz,6H), 1.28(t, J=7Hz, 9H). 31PNMR (D2O) 25° C. õ(ppm)-1.24.

[194] 11b

[195] A porção de 100 mg de 11b enriquecido em 3 ml 6% de CH3CN em 10mm de acetato de trietilamônio foi aplicada à coluna HPLC prep e eluída usando um gradiente de acetonitrilo e 10 mM de acetato de trietilamônio na água (6% a 18% de gradiente de CH3CN por mais de 22 minutos no fluxo de 50 ml/min). Fracções HPLC contendo 11b puro foram agrupadas e o CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa restante liofilizada para ressecamento para render 40mg (rendimentos de 40%) de 11b puro como o sal se bis-trietilamônio. HRMS de 11b no modo negativo confirmou m/z (M-H)721.0446 (calculado para C20H23N10O12P2S2 ’:721.0419). 1H NMR (D2O) 45°C Õ 8.05 (s, 2H), 5.98 (s, 2H), 5.03 (m, 2H), 4.77(m, 4H), 4.10 (m, 2H), 4.08 (m, 2H), 3.19 (q, j=7Hz, 6H), 1.28(t, J=7Hz, 9H). 31PNMR (D2O) 25° C. õ 54.87.

[196] 11c

[197] A porção de 60 mg de 11cenriquecido em 3 ml 6% de CH3CN em 10mm de acetato de trietilamônio foi aplicada à coluna HPLC prep e eluída usando um gradiente de acetonitrilo e 10 mM de acetato de trietilamônio na água (6% a 18% de gradiente de CH3CN por mais de 22 minutos no fluxo de 50 ml/min). Fracções HPLC contendo o 11c puro foram agrupadas e o CH3CN foi removido através de rotoevaporação e a amostra aquosa restante liofilizada para ressecamento para render 30mg (rendimento de 50%) de 11c puro como o sal se bis-trietilamônio. HRMS de 11c no modo negativo confirmou m/z (M-2H) 360.0171 (calculado para C2OH22NW012P2S2'2: 360.0173). 1H NMR (D2O) 55°C õ(ppm) 8.13 (s,2H), 8.03 (s,2H), 5.97 (m,2H), 5.06-5.12(br, 4H), 4.98-5.00(m,2H), 4.81-4.83 (m, 2H), 4.04-4.08 (m, 4H), 3.20 (q, j=7Hz), 1,27(t, J=7Hz). 31PNMR (D2O) 25° C. õ(ppm) 54.77, 56.00.

[198] Exemplo 5: Indução de interferon por CDNs

[199] Para determinar o nível relativo de 1FN-0 em células apresentadoras de antígeno induzido por cada uma das moléculas derivadas de Rp,Rp ditio c-di-GMP em relação às moléculas de GMP-di-c não modificadas como uma assinatura de potência adjuvante, 1x105 DC2.4 células, uma linha de células dendríticas de camundongo H-2b-restritas derivadas do camundongo, foram incubadas com 5, 20 e 100 pM de c-di- GMP, Rp, Rp e Rp, ou Sp ditio-difosfato c-di-GMP, bem como moléculas de c-di-AMP de ditio-difosfato Rp, Sp ou c-di-AMP Rp, Rp ou HBSS durante 30 minutos a 37°C com 5% de CO2. Após 30 minutos, as células foram lavadas e substituídas com mídia RPMI contendo 10% FBS. Para medir o nível de IFN-P induzido, fluidos de cultura celular de cada amostra foram coletados após 4 horas, e 10 pl foram adicionados a 5x104 células repórteres de luciferase L929-ISRE cultivadas em meios RPMI + 10% FBS. O nível relativo de produção de IFN-0 foi determinado pela medição de unidades de luz relativas (RLU) após 4 horas de incubação,

[200] Como mostrado na Fig. 7, os diastereoisômeros Rp, Rp ditio c- di-GMP e o Rp, Rp ditio c-di-AMP induziram níveis significativamente mais elevados de IFN-p que ambas as moléculas dinucleotídeo cíclico não modificado de c-di-GMP ou c-di-AMP. Além disso, o nível de IFN-p induzido pelos diastereoisômeros Rp, Sp ditio c-di-GMP e Rp, Sp ditio c-di-AMP foi inferior ao nível induzido por tanto ambos os diastereoisômeros Rp, Rp ditio c-di-GMP e a Rp, Rp ditio c-di-AMP assim como as moléculas de GMP-di-c e c-di-AMP nativas. Estes resultados demonstram que preparações purificadas de diastereoisômeros Rp, Rp ditio c-di-GMP e Rp, Rp ditio c-di- AMP mais profundamente ativam a resposta imune inata do que as moléculas de GMP-di-c e c-di-AMP sem modificações, bem como os derivados de Rp, Sp ditio. Os tio-derivados Rp, Sp derivados de c-di-GMP e c-di-AMP ativaram mal a resposta imune inata. Será evidente para aqueles versados na técnica que modalidades preferenciais de adjuvantes são dinucleotídeos cíclicos Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP ou Rp, Rp ditio- difosfato c-di-AMP, devido às suas propriedades de maior ativação da resposta imune inata, como mostrado pela magnitude da expressão de IFN- p induzida, em comparação com qualquer Rp, Sp ditio-difosfato c-di-GMP ou Rp, Sp ditio-difosfato c-di-AMP ou moléculas c-di-GMP ou c-di-AMP.

[201] Exemplo 6. Degradação de CDNs por fosfodiesterases

[202] Um mecanismo para a maior potência de derivados de Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP e c-di-AMP comparado a c-di-GMP e c-di-AMP não modificados nativos pode ser a resistência dos derivativos ditio-modificados à degradação por fosfodiesterases de célula hospedeira. Como um teste para este mecanismo, Rp, Rp ditio c-di-GMP, c-di-GMP não modificado e também moléculas Rp, Rp ditio c-di-AMP e c-di-AMP foram incubadas com e sem 1 mg de fosfodiesterase de veneno de cobra (SVPD) durante a noite a 37° C. Após este período de incubação, enzima de SVPD nas reações foi inativada e removida por incubação a 100° C por 10 minutos e as amostras foram então centrifugadas a 14.000 rpm durante 5 minutos. Para testar a capacidade relativa das amostras de ativar a imunidade inata, medida pelo nível de expressão de IFN-p, 1x105 células DC2.4 foram incubadas com 100 pM de derivados de Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP e c-di-AMP e c-di- GMP e c-di-AMP não modificados nativos processados de amostras incubadas com estas preparações de dinucleotídeo cíclico durante 30 minutos a 37° C com 5% de CO2. Após 30 minutos, as células foram lavadas e substituídas com mídia RPMI contendo 10% FBS e incubadas por mais 4 horas. Os fluidos de cultura então foram colhidos, e 10 pL desses fluidos foram adicionados a 5 x 104 células repórteres de luciferase L929-ISRE cultivadas em meios RPMI contendo 10% FBS. O nível relativo de expressão de IFN-p foi determinado pela medição de unidades de luz relativas (RLU) após 4 horas de incubação na linha de célula repórter.

[203] Como mostrado na Fig. 8, o nível de expressão de IFN-p nas células contendo Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP ("RR-CDG") ou Rp, Rp ditio-difosfato c-di-AMP ("RR-CDA") era equivalente, independentemente se os dinucleotídeos cíclicos foram incubados com SVPD. Em contraste, o nível de expressão de IFN-p foi significativamente menor em culturas contendo c-di-GMP ("CDG") ou c-di-AMP ("CDA") que tinha sido previamente incubado com SVPD, em comparação com as culturas contendo c-di-GMP ou c-di-AMP que não tinha sido incubado com esta enzima. Além disso, em culturas contendo dinucleotídeos cíclicos não incubados com SVPD, o nível de expressão de IFN-p foi maior com Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP ou Rp, Rp ditio-difosfato c-di-AMP em comparação com c-di-GMP ou c-di-AMP. Esses dados dão ainda mais apoio à ideia da maior potência de Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP ou Rp, Rp ditio-difosfato c-di-AMP em comparação com c-di-GMP ou c-di-AMP.

[204] Exemplo 7. Indução da resposta imune por CDNs

[205] Para testar a imunogenicidade in vivo aprimorada de Rp, Rp ditio c-di-GMP em relação a moléculas de GMP-di-c não modificadas, respostas de células T CD4+ e CD8+ OVA-específicas foram medidas em PBMCs em 10 dias pós vacinação em conjunto com o tratamento de CDN. As vacinas foram preparadas pela combinação de 10 pg de proteína de OVA (EndoFit OVA, InVivogen) e Addavax (2% de esqualeno final) com 25 pg ou 5 pg de dinucleotídeo cíclico, em um volume total de 100 pl. Grupos de cinco de camundongos fêmeas C57BL/6 (H-2b) foram imunizados uma vez por via subcutânea (SC) na base da cauda com os preparativos da vacina e as respostas de célula T CD4+ e CD8+ T OVA-específicas no compartimento do sangue periférico de célula mononuclear (PBMC) foram determinadas por análise de ELISpot 10 dias depois. 1x105 PBMCs e 1x105 células de alimentador de esplenócito isoladas de camundongos de idade correspondente ingênuos C57BL/6 foram estimulados ou não-estimulados com 1 pM de peptídeo de classe II MHC (TEWTSSNVMEERKIKV OVA265- 280) ou peptídeo de classe I MHC (OVA257-264 SIINFEKL) durante a noite e células que formam marca de IFN-y foram medidas, conforme descrito anteriormente.

[206] Como mostrado na Fig. 9, respostas de célula T CD4+ e CD8+ OVA-específicas foram de magnitude maior em camundongos imunizados com vacinas contendo Rp, Rp ditio c-di-GMP em comparação com não modificado c-di-GMP, em formulações contendo a mesma quantidade do dinucleotídeo cíclico adjuvante. Além disso, a magnitude das respostas de células T antígeno-específicas CD8+ foram maiores nos camundongos imunizados com formulações de vacina contendo 5 pg de Rp, Rp ditio c-di- GMP, em comparação com camundongos imunizados com formulações de vacina contendo 5 pg ou 25 pg de c-di-GMP não modificado.

[207] Exemplo 8. Indução da resposta de célula T por CDNs

[208] Para avaliar a imunogenicidade de Rp, Rp ditio c-di-GMP em relação a moléculas de GMP-di-c não modificadas, respostas de célula T CD8+ e CD4+ gag-específicas SIV foram medidas. Cinco camundongos C57BL/6 por grupo foram imunizados por via subcutânea duas vezes com 1 ug de Rp, Rp ditio c-di-GMP ou controle salino formulado em 2% esqualeno-em-água com 10 ug de proteína de gag SIV. As vacinas foram separadas por 20 dias, e baços foram colhidos seis dias após a segunda vacinação. Respostas imunes foram medidas para epítopos de célula T CD8 (AL11, SIV gag312-322. A) e CD4 (DD13, SIV gag3oo-3i2> 8) gag- específicas SIV por ensaio de ELISpot IFNy . As placas foram escaneadas e células formadoras de mancha (SFC) por poço foram enumeradas usando um analisador ImmunoSpot (CTL).

[209] Como mostrado na Fig. 10, animais imunizados com RR c-di- GMP induziram significativamente maiores respostas de célula T CD8 e CD4 gag-específicas SIV em comparação com os animais que receberam o controle salino. Estes resultados demonstram que as formulações de vacina com o derivado de c-di-GMP RR podem induzir respostas de célula T CD4 e CD8 gag-específicas SIV in vivo. Aquele versado na técnica reconhecerá que formulações de vacina contendo Rp, Rp ditiofosfato c-di-GMP ou Rp, Rp ditiofosfato c-di-AMP são preferenciais, já que tais dinucleotídeos cíclicos tem maior potência conforme mostrado pela maior magnitude das respostas imunes induzidas por vacina, e também a maior magnitude de respostas imunes induzida por vacina com comparativamente menores níveis de dose de adjuvante.

[210] Exemplo 9. Indução de imunidade protetora por CDNs

[211] Para estabelecer a imunogenicidade reforçada e a imunidade protetora que acompanha induzida por Rp, Rp ditio c-di-GMP em relação a c-di-GMP sem modificação, respostas de célula T CD8 OVA-específicas medidas em PBMC e imunidade protetora avaliada contra desafio bacteriano letal. As vacinas foram preparadas pela combinação de 10 pg de proteína de OVA (EndoFit OVA, InVivogen) e Addavax (2% de esqualeno final) com 25 pg ou 5 pg de dinucleotídeo cíclico, em urn volume total de 100 pl. Grupos de cinco camundongos fêmeas C57BL/6 (H-2b) foram imunizados duas vezes por via subcutânea (SC) na base da cauda com os preparativos da vacina. O intervalo entre as imunizações de iniciação e incremento foi 36 dias. As magnitudes das fases de memória e expansão das respostas de célula T CD8 OVA257-específicas em PBMC foram quantificadas por análise de coloração de citocina intracelular (ICS) em 27 dias pós-vacinação de incremento e em 3 dias após o desafio com uma dose letal 2X (LD)50 (unidades formadoras de colônia 1 x 105; CFU) de Listeria monocytogenes do tipo selvagem que expressa OVA (WT Lm-OVA). Para análise ICS, 1 x 105 PBMCs de camundongos de teste combinados com 1 x 105 células alimentadoras de esplenócitos isoladas de camundongos com correspondência de idade ingênuos C57BL/6 foram estimuladas ou não estimuladas com 1 pM de peptídeo de classe I MHC (OVA257-264 SIINFEKL) por 5 horas na presença de Brefeldin A e produção de IFN-y foi medida por citometria de fluxo em um BD FACSVerse.

[212] Como mostrado na Fig. 11A, camundongos imunizados com vacinas adjuvadas com Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP geraram uma maior magnitude de células de memória T CD8 OVA-específicas, em comparação com camundongos imunizados com vacinas adjuvadas com c-di-GMP não modificado. As células T CD8 de memória OVA-específicas induzidas por imunização com Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP adjuvaram vacinas expandidas a uma magnitude maior após desafio com o patógeno expressando o antígeno cognato de OVA, em comparação com o nível de expansão de células de memória T CD8 OVA-específicas em camundongos imunizados com vacinas adjuvadas com c-di-GMP sem modificação. A representação gráfica de FACS mostrada na Fig. 11B demonstra que a magnitude de células de memória T CD8 OVA-específicas se aproximou de 30% da população total de células T CD8 em PBMC de camundongos imunizados com Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP com vacinas adjuvadas. O padrão ouro para imunização eficaz é testar se um candidato de vacina pode conferir proteção contra desafio subsequente com um patógeno virulento. Para testar a eficácia relativa de vacinas adjuvadas com Rp, Rp ditio c-di-GMP e c-di-GMP sem modificação, os camundongos foram desafiados com a injeção intravenosa de 2X dose LD50(1 x 105 CFU) de Listeria monocytogenesdo tipo selvagem OVA-expressante (WT Lm-OVA) 27 dias após a imunização de incremento. Três dias mais tarde, imunidade protetora foi determinada pelo plaqueamento de diluições de homogenatos dos baços colhidos de camundongos de teste 3 dias pós-desafio de WT Lm-OVA em meios de ágar de infusão cérebro-coração, e quantificando o número de colônias após incubação por uma noite a 37 °C. Fig. 11C mostra a imunização de camundongos com Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP com vacinas adjuvadas ofereceu proteção completa (abaixo do limite de detecção, LOD) contra o desafio de patógeno virulento. Será evidente para aquele versado na técnica que modalidades preferenciais de adjuvantes são dinucleotídeos cíclicos Rp, Rp ditio-difosfato c-di-GMP ou Rp, Rp ditio- difosfato c-di-AMP, devido às suas propriedades de conferir potência de vacina profunda, como mostrado por indução de agrupamento de memória de células T CD8 de alta magnitude que expande-se quando sofre o desafio com o antígeno cognato e fornece proteção completa contra o desafio de patógeno virulento.

[213] Exemplo 10. Indução de eficaz imunidade antitumoral por CDNs

[214] A relativa eficácia antitumoral in vivo de derivados de Rp, Rp ditio c-di-AMP e c-di-AMP sem modificação foi avaliada em um modelo de camundongo subcutâneo do câncer de próstata. As moléculas derivadas foram formuladas com 1 x 106 células de tumor da próstata murinas TRAMP-C2 irradiadas por completo expressando GM-CSF (GVAX). Grupos de 5 camundongos C57BL/6 machos foram implantados com 1 x 105 células tumorais TRAMP-C2 subcutâneas no coxim da pata. Nos dias 4 e 11 pós implantação de tumor, aos camundongos foram administradas vacinas subcutâneas no flanco de GVAX sozinho ou GVAX formulado com RR-CDA ou CDA e em relação ao controle HBSS. O crescimento do tumor foi monitorado por pinças, e volume de tumor foi calculado.

[215] [00202] Como mostrado na Fig. 12, pelo dia 52 pós- implantação tumoral, os camundongos vacinados com GVAX + RR-CDA demonstraram inibição de crescimento significativa do tumor em relação ao controle HBSS, com maior eficácia antitumoral em comparação com GVAX sozinho ou GVAX formulado com derivado de c-di-AMP sem modificações. Estes dados demonstram a aumentada potência antitumoral de molécula derivada de Rp, Rp ditio AMP-di-c em comparação com a molécula de c-di- AMP não modificada em um modelo murino de câncer da próstata.

[216] Exemplo 11. Formas de pró-droga de CDNs.

[217] Estratégias de pró-droga fornecem um método atraente para facilitar o particionamento na bicamada de células ou lipossomas de entrega. Acilação da ribose 2'-OH de GMP-di-c, c-di-AMP e ditio-análogos com C-12 a C-18 ácidos carboxílicos poderia servir como um valioso pró- droga. Dois exemplos são mostrados na Fig. 13 e descritos no exemplo. [00204] (a) Síntese de mono-2'-O-miristoil c-di-GMP 12 de 11a.

[218] Para o sal de bistrietilamina de 11a (8 mg, 9,0 micromoles) foi adicionado 0,3 ml DMF, 30 microlitros de piridina e 15 mg de anidrido mirístico (34 micromoles). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 48 horas e, em seguida, aquecida a 60°C por 0.5 horas. A massa do produto principal 12 foi confirmada por LC/MS no modo negativo, com m/z (M-1) 889 (calculado para C34H49N10O15p2-: 899.3). Após a evaporação, o resíduo foi tirado em até 30% CH3CN em 10mm TEAA, filtrado e purificado em uma coluna de HPLC de C-18 de 20mm prep com eluição de gradiente (30 a 60% CH3CN em 10mm de TEAA por mais 20 min em um fluxo de 20 ml/min). As frações contendo o produto desejado foram combinadas, rotoevaporadas e liofilizadas para dar 3 mg de mono-2'- O-miristoíl c-di-GMP (12). HRMS de 12 no modo negativo confirma m/z (M- 2) 449.1389 (calculado para C34H48N1015oP2'2: 449.1393). 1H NMR (DMSO + 1% D2O) 25°C õ(ppm) 7.98 (s,2H), 5.98 (s,1H), 5.73 (d, 1H), 5.66 (s,1 H), 4.74 (d,2H), 4.54 (s,1H), 4.23(s,1H), 3.81-3.99(br,4H), 2.55(s,2H), 1.44(s,2H), 0.85(t,3H). (picos NMR a 10,61, 7,33 e 6,55 em DMSO puro foram trocados na adição de 1% D2O). Metileno do grupo miristoil foram obscurecidos por picos de acetato de trietilamônio de campo e DMSO. O NMR é consistente com monoacilação em 2'-OH. 31P NMR (D2O) 25° C. õ(ppm) -1.37, -2.06.

[219] (b) Síntese de dialquil mono-2'-0-miristoíl [Rp,Rp] ditiofosfato c- di-GMP (13) de 11b.

[220] Para o sal de bistrietilamina de 11b (12 mg, 13,0 micromoles) foram adicionados 0,3 ml DMF, 30 microlitros de piridina e 15 mg de anidrido mirístico (34 micromoles) e DMAP catalítico. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente por 24 horas e, em seguida, aquecida a 60°C por 2 horas. O solvente foi removido pelo rotoevaporação e o resíduo retomado em 50% MeOH em 10mm de TEAA, filtrado e purificado em uma coluna de HPLC de C-18 prep de 20 mm (50% MeOH em 10mm de TEAA isocrática por 5 min seguido de gradiente para 100% MeOH por 10 min e, em seguida, 100% MeOH por 10 min). O produto desejado eluiu tarde neste sistema metanólico. As frações contendo o produto desejado foram combinadas, rotoevaporadas e então liofilizadas para dar 4 mg de mono-2'- O-miristoíl [Rp,Rp] ditiofosfato c-di-GMP (13). HRMS de 13 no modo negativo confirma m/z (M-2) 465.1148 (calculado para C34H48N10O13P2S2'2: 465.1165). 1H NMR (DMSO + 1% D2O) 25°C õ(ppm) 8.01 (s, 2H), 5.97 (d, 1H), 5.73 (d, 2H), 5.71 (m, 2H), 5.00 (m, 1H), 4.85 (m,1H), 4.56 (m,1H), 4.10-4.18 (m, 4H), 3.97 (m, 2H), 3.84-3.87 (m,1H), 3.16 (s,1H), 3.05 (d,2H), 1.47 (br,2H), 0.85(t ,3H). (picos de NMR a 10,60, 7.53, 6.90 e 6,63 em DMSO puro foram trocados na adição de 1% D2O). Metileno do grupo miristoil foram obscurecidos por picos de acetato de trietilamônio de campo e DMSO. O NMR é consistente com monoacilação em 2'-OH. 31P NMR  (CD3OD) 25° C. õ(ppm) 56.66, 55.46.

[221] Uma similar abordagem pró-droga usando derivatização de aciloxialquil de enxofre ou oxigénio nos tiofosfatos e fosfatos CDN, respectivamente, também pode ser usada. As estruturas de aciloxialquil na Fig. 14 são semelhantes ao Adefovir, um nucleosídeo eficaz analógico pro- droga que é usado para tratar a infecção de HIV e HBV. Uma vez dentro da célula esterases intracelulares irão clivar os grupos acil ou aciloxialqui presentes em 2'-OH ou fosfato (tiofosfato) e regenerar o dinucleotídeo cíclico subderivatizado.

[222] Exemplo 12. Atividade farmacológica de pró-drogas CDN.

[223] Para determinar a potência relativa de forma pró-droga de c-di- GMP para ativar a resposta imune inata, relativos níveis de IFN-p induzidos em uma linhagem de células de monócitos humanos foram avaliados. Para estas experiências, 4 x 105 monócitos humanos THP1-Blue foram transfectados com um gene repórter de fosfatase alcalina embriônica secretada IRF-induzível (Invivogen) e incubados com 100 pM de c-di-GMP, mono-2'-O-miristoíl c-di-GMP ou HBSS durante 30 minutos a 37° C com 5% de CO2. Após 30 minutos, as células foram lavadas e plaqueadas em placa de 96 poços em mídia RPMI contendo 10% FBS e incubadas a 37° C com 5% de CO2. Sobrenadantes de cultura celular de cada amostra foram coletados após 4 horas. 10 pl dos sobrenadantes de cultura de célula foram adicionados ao reagente QUANTI-Blue (Invivogen) e incubados durante 1530 minutos. Absorvância a 655 nm foi medida utilizando um espectrofotômetro modelo 680 (BioRad).

[224] Como mostrado na Fig. 15, o derivado de mono-2'-0-miristoíl c- di-GMP ("mono-2'-O-miristoíl CDG") induziu significativamente mais elevados níveis de IFN-p sobre a molécula de dinucleotídeo cíclico de c-di- GMP sem modificações e sobre níveis de fundo (HBSS) em uma linha celular de monócito humano. Além disso, estes dados demonstram em uma linhagem de células de monócitos humanos a indução superior das moléculas derivadas de Rp, Rp ditio c-di-GMP sobre as moléculas de Rp, Sp ditio c-di-GMP e GMP-di-c não modificadas. Estes resultados demonstram que preparações purificadas de derivados mono-2'-O-miristoíl c-di-GMP podem ativar a resposta imune inata em uma linhagem de células humanas.

[225] Exemplo 13. Indução de respostas imunes por pró-drogas CDN

[226] Para avaliar a capacidade do derivado de mono-2'-O-miristoíl c- di-GMP ("mono-2'-O-miristoíl CDG") para induzir respostas imunes in vivo, respostas de células T CD8 OVA-específicas foram medidas em esplenócitos 7 após a segunda vacinação em conjunto com o tratamento de CDN. Para testar a capacidade de mono-2'-0-miristoíl c-di-GMP relativa a estimular uma resposta imune OVA-específica, vacinas foram preparadas pela combinação de 10 pg de proteína de OVA (OVA EndoFit, Invivogen) e Addavax (2% de esqualeno final) com 0 (controle) ou 5 pg de derivado de mono-2'-O-miristoíl c-di-GMP ("mono-2'-0-miristoíl CDG"), em um volume total de 100 pl. Grupos de cinco de camundongos fêmeas C57BL/6 (H-2b) foram imunizados duas vezes por via subcutânea (SC) na base da cauda com os preparativos da vacina e as respostas de célula T CD4+ e CD8+ T OVA-específicas nos baços foram determinadas por coloração de citocina intracelular 7 dias depois. 1 x 106 esplenócitos foram estimulados ou não com 1 pM de peptídeo classe I MHC (SIINFEKL OVA257-264; SL8) durante a noite e produção de IFN-y foi medida pelo citômetro de fluxo em um BD FACSVerse.

[227] Como mostrado na Fig. 16, vacinas que continham derivado de mono-2’-O-miristoíl c-di-GMP induziram maiores respostas imunes em relação às vacinas de controle. Estes resultados demonstram que uma vacina contendo o derivado de mono-2'-O-miristoíl c-di-GMP pode estimular respostas imunes altamente potentes adaptáveis em um modelo animal.

[228] Uma pessoa versada na técnica prontamente aprecia que a presente invenção está bem adaptada para realizar os objetivos e obter os fins e vantagens mencionados, bem como aqueles inerentes na mesma. Os exemplos fornecidos neste documento são representativos de modalidades preferenciais, são exemplares e não se destinam como limitações do escopo da invenção.

[229] Deve-se entender que invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhes de construção e aos arranjos dos componentes estabelecidos na seguinte descrição ou ilustrado nos desenhos. A invenção é capaz de outras modalidades além daquelas descritas e de ser praticada ou ser realizada de várias maneiras. Além disso, deve ser entendido que a fraseologia e terminologia empregadas neste documento, bem como no resumo, é para fins de descrição e não deve ser considerado como limitação.

[230] Como tal, aqueles versados na técnica apreciarão que a concepção na qual se baseia esta divulgação pode ser prontamente utilizada como base para o projeto de outras estruturas, métodos e sistemas para a realização de vários efeitos da presente invenção. É importante, portanto, que as reivindicações sejam consideradas como incluindo tais construções equivalentes, na medida em que estas não saem do espírito e do escopo da presente invenção.

[231] Enquanto a invenção foi descrita e exemplificada em detalhes suficientes para que aqueles versados nesta técnica a produzam e usem, várias alternativas, modificações e melhorias devem ser aparentes sem que se desvie do espírito e o escopo da invenção. Os exemplos fornecidos neste documento são representativos de modalidades preferenciais, são exemplares e não se destinam como limitações do escopo da invenção. Modificações à mesma e outros usos ocorrerão para aqueles versados na técnica. Estas modificações são englobadas dentro do espírito da invenção e são definidas pelo escopo das reivindicações.

[232] Será imediatamente aparente para um indivíduo versado na técnica que diferentes substituições e modificações podem ser feitas à invenção divulgada neste documento sem que haja desvio do escopo e do espírito da invenção.

[233] Todas as patentes e publicações mencionadas no relatório descritivo são indicativas dos níveis daqueles versado na técnica à qual pertence a invenção. Todas as patentes e publicações mencionadas neste documento são incorporadas ao mesmo por referência na mesma medida como se cada publicação individual fosse indicada especificamente e individualmente para ser incorporada por referência.

[234] A invenção descrita de forma ilustrativa neste documento pode ser devidamente praticada na ausência de qualquer elemento ou elementos, limitação ou limitações que não sejam especificamente divulgados neste documento. Assim, por exemplo, em cada instância aqui constante, qualquer um dos termos "compreendendo", "consistindo essencialmente de" e "consistindo de" pode ser substituído por qualquer um dos outros dois termos. Os termos e expressões que foram empregados neste documento são usados como termos de descrição e não de limitação, e não há nenhuma intenção no uso de tais termos e expressões em excluir quaisquer equivalentes das características mostradas e descritas, ou partes delas, mas é reconhecido que várias modificações são possíveis no escopo da invenção reivindicada. Assim, deve ser entendido que, embora a presente invenção tenha sido especificamente divulgada por modalidades preferenciais e características opcionais, a modificação e a variação dos conceitos divulgados neste documento podem ser invocadas por aqueles versados na técnica, e que tais modificações e variações são consideradas como estando no escopo da presente invenção, conforme definido pelas reivindicações acrescentadas.

[235] Outras modalidades estão estabelecidas nas seguintes reivindicações.

Claims (13)

1. Composição para uso em um método de induzir uma resposta imune a um câncer em um indivíduo, ou induzir uma resposta imune a um patógeno em um indivíduo, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis que induzem a ativação de TBK1 STING-dependente, em que os dinucleotídeos de purina cíclicos presentes na composição são dinucleotídeos de purina cíclicos de tiofosfato que são diastereoisômeros Rp, Rp substancialmente puros, ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e em que o método compreende administração parenteral ao indivíduo em necessidade da composição.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende uma célula de tumor inativada ou uma mistura de células de tumor diferentes correspondentes ao tipo de câncer do indivíduo.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a célula de tumor é selecionada do grupo constituído por uma célula do câncer colorretal, uma célula do câncer escamoso aero-digestivo, uma célula do câncer de pulmão, uma célula do câncer no cérebro, uma célula do câncer de fígado, uma célula do câncer de estômago, uma célula do sarcoma, uma célula de leucemia, uma célula do linfoma, uma célula do mieloma múltiplo, uma célula do câncer de ovário, uma célula do câncer de útero, uma célula do câncer de mama, uma célula do melanoma, uma célula do câncer de próstata, uma célula do carcinoma pancreático, e uma célula do carcinoma renal.

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o dinucleotídeo de purina cíclico de tiofosfato é formulado com um ou mais lipídios.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que um ou mais lipídios compreendem digitonina.

6. Composição de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizada pelo fato de que um ou mais lipídios formam um lipossoma.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o dinucleotídeo de purina cíclico de tiofosfato é formulado com um ou mais adjuvantes.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que um ou mais adjuvantes compreendem CpG e/ou monofosforil lipídio A.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o método compreende adicionalmente a administração de uma ou mais vacinas ao indivíduo, em que a(s) vacina(s) compreendem um ou mais antígenos selecionados para estimular uma resposta imune a um patógeno expressando um ou mais dos antígenos.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que a(s) vacina(s) compreendem bactérias ou vírus inativados ou atenuados que incluem os antígenos de interesse, antígenos purificados, vetores virais ou bacterianos vivos de entrega recombinantemente projetados para expressar e/ou secretar os antígenos, vetores de células apresentadoras de antígeno (APC) compreendendo células que são carregadas com os antígenos ou transfectadas com uma composição compreendendo um ácido nucleico codificando os antígenos, veículos de entrega de antígeno lipossomal compreendendo os antígenos, ou vetores de ácido nucleico nu codificando os antígenos.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos de tiofosfato são formulados como uma nanopartícula.

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que substituinte de 2'-OH de uma ou ambas as frações de ribose dos um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos é substituído com um substituinte selecionado a partir do grupo consistindo em flúor, cloro, bromo e iodo.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que substituinte de 2'-OH de uma ou ambas as frações de ribose dos um ou mais dinucleotídeos de purina cíclicos é substituído com flúor.

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