CN105367617A - 一种基于环二腺核苷酸的衍生物、tat多肽及其在一型干扰素小分子中抑制剂的应用 - Google Patents

Abstract

本申请是基于环二腺核苷酸的衍生物、tat多肽及其在一型干扰素小分子中抑制剂的应用；环二腺核苷酸衍生物1，是3‘5’环二鸟苷酸(式I)在核糖体2位羟基位置连接了一个炔烃基团(式II)，分子量为696.4道尔顿，其结构如下：Sting作为一型干扰素生成通路中的重要分子，它的活性在维持细胞自发性免疫反应与炎症反应中起了至关重要的作用。因此我们通过对细菌环二腺核苷酸衍生物筛选和定向修饰，旨在开发一系列具有良好细胞通透性的小分子，可以特异性的激活或阻断Sting-TBK1-I型干扰素信号通路，从而达到促进(抗病毒)及抑制(过度免疫活化，例如系统性红斑狼疮)自发性免疫反应的作用。

Description

一种基于环二腺核苷酸的衍生物、tat多肽及其在一型干扰素小分子中抑制剂的应用

技术领域

本技术属于免疫学应用领域

背景技术

干扰素及其抗病毒作用

干扰素是1957年英国科学家Isaacs和Lindenmann在研究病毒干扰现象时发现的。所谓病毒干扰现象就是一种病毒感染某个细胞后能够干扰随后的其它病毒对该细胞的感染。最初，科学家们把灭活的流感病毒接种于鸡胚细胞内，结果发现这些细胞可以分泌一种可溶性物质来抑制和干扰流感病毒的复制，所以将这种物质命名为干扰素。干扰素是诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，干扰素的基因处于被抑制的静止状态。根据干扰素的来源、生物学性质及活性可分为以下两大类。

Ⅰ型干扰素：Ⅰ型干扰素包括IFN-α与IFN-β等。IFN-α主要由单核-巨噬细胞产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-α；IFN-β主要由成纤维细胞产生。IFN-α/β二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。

Ⅱ型干扰素：Ⅱ型干扰素即γ干扰素，主要由活化的T细胞(包括Th0、TH1细胞和几乎所有的CD8+T细胞)和NK细胞产生，是所谓的淋巴因子(LyTnPhokine)的一种。

一型干扰素的抗病毒活性很强，1mgIFN-α可达2亿以上国际单位，一个细胞只要有10个甚至1个分干扰素，即可促进其自发性免疫反应从而达到产生抗病毒的状态。干扰素既是天然的抗病毒蛋白质，且活性很强，对病毒的作用范围也很广。2005年，聚乙二醇重组干扰素α-2a通过美国FDA批准，正式用于乙肝治疗。在SARS爆发期间，干扰素对SARS起到很好的预防和治疗作用。国内有人曾用干扰素喷剂(300IU/10ml)试用过10000多人，也未出现不良反应，更不会引起全身发热，因此干扰素喷剂是绝对安全的。

一型干扰素的诱导途径

在未被感染的正常细胞中，一型干扰素的表达是受到抑制的。近几年来的研究揭示了详细的一型干扰素分子诱导机制。宿主细胞内广泛存在一种可以识别细胞质内外源DNA的受体蛋白cGAS。当病毒、细菌DNA暴露在细胞中后，该受体蛋白cGAS会与DNA结合并激活其环化酶酶活性从而将一分子的三磷酸腺苷(ATP)和一分子的三磷酸鸟苷(GTP)水解环化成2‘5’环二核苷酸c-AMP-GMP。该环二核苷酸分子进而可以和细胞内Sting效应双分子聚合体结合，促进其构象发生改变并活化该酶分子。随后Sting激活下游的激酶TBK1从而促进转录调控因子IRF3的活性来诱导一型干扰素的表达(图1)。

除了细菌、病毒DNA以外，近年来研究发现，细菌合成的多种环二核苷酸，包括大肠杆菌生成的3‘5’环二鸟苷酸和李氏杆菌生成的3‘5’环二腺苷酸均被证明可以直接和Sting结合，从而跳过cGAS分子而直接诱导一型干扰素的高量表达。

Sting过度激活引起的疾病

Sting作为一型干扰素合成通路中至关重要的一个效应蛋白，它的表达和功能起着至关重要的免疫平衡调节作用。最新的一些临床研究发现，Sting的过度活化和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的发病有着重要的关联。

发明内容

发明目的：Sting作为一型干扰素生成通路中的重要分子，它的活性在维持细胞自发性免疫反应与炎症反应中起了至关重要的作用。因此我们通过对细菌环二腺核苷酸衍生物筛选和定向修饰，旨在开发一系列具有良好细胞通透性的小分子，可以特异性的激活或阻断Sting-TBK1-I型干扰素信号通路，从而达到促进(抗病毒)及抑制(过度免疫活化，例如系统性红斑狼疮)自发性免疫反应的的作用。

技术方案：一种环二腺核苷酸衍生物1，是3‘5’环二鸟苷酸(式I)在核糖体2位羟基位置连接了一个炔烃基团(式II)，分子量为696.4道尔顿，其结构如下：

环二腺核苷酸衍生物1的应用，可阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌。

3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体，物质是由环二腺苷酸衍生物反应得到，其如下结构：

3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体化学反应过程，在3’5’环二腺苷酸衍生物筛选过程中加入了炔烃集团，可用于点击化学反应连接促进穿透细胞的官能团或多肽，利用点击化学反应的方法连接了可以促进细胞膜穿透性的艾滋病病毒多肽tat，反应过程如下：

其反应流程如下：

1)在反应管中依次加入如下溶液

3’5’环二腺苷酸衍生物1、CuSO4、叠氮修饰的tat多肽如下；其中包含了2个用于连接的柔性甘氨酸分子和11个来源于艾滋病病毒HIVTat蛋白的穿膜多肽

叠氮(azide)N3-GGYGRKKRRQRRR

25μl5mMaminoguanidine.

25μl5mMsodiumascorbate

2)将反应管关闭后颠倒混合均匀，然后放置在室温摇床或旋转混合器上反应；

3)反应产物用高效液相色谱HPLC进行纯化。

3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体应用，阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌。

有益效果：3’5’环二腺苷酸衍生物1、3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体能有效降低一型干扰素在PMBC中的生成。

附图说明

图1：Sting-TBK1-IRF3一型干扰素合成通路

图2：3’5’环二腺苷酸合成物结构及分子量

A：3’5’环二腺苷酸合成物分子结构图B：基质辅助激光解析串联飞行时间(MALDI)质谱分析

图3：3’5’环二腺苷酸衍生物1-Sting拮抗剂结构及分子量

A：3’5’环二腺苷酸衍生物1-Sting拮抗剂结构B：基质辅助激光解析串联飞行时间(MALDI)质谱分析

图4：3’5’环二鸟苷酸衍生物1不能刺激人外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)分泌一型干扰素alpha

图5：3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌

图6：3’5’环二腺苷酸衍生物1与HIVtat多肽的点击化学反应

图7：3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat细胞通透性及Sting拮抗效果

具体实施方式

3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂

3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂结构及分子量

通过化学合成的方法，我们合成了多种环二核苷酸(图2)衍生物。通过体外细胞活性实验，我们筛选到了一个基于3‘5’环二鸟苷酸的小分子衍生物1结构(图3)。该分子是在核糖体2位羟基位置连接了一个炔烃基团，分子量为696.4道尔顿。

3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂不能引起人外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)分泌1型干扰素

通过体外活性实验我们发现3‘5’环二鸟苷酸的小分子衍生物1与3‘5’环二鸟苷酸相比不能刺激人PBMC产生一型干扰素。具体实验步骤及结果如下

a.人外周血PBMC的制备

1)在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2)取肝素抗凝静脉血与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

3)离心后管内分为三层，上层为血浆和RPMI1640液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外，还含有血小板。

4)用毛细血管或200μl枪头插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积的RPMI1640，1500rpm×10分钟，重复洗涤细胞两次。

5)末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞并计数。

b.一型干扰素诱导活性的测定

1)将500μl2x10⁵/mlPBMC加入到24孔细胞培养板中，然后静置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱过夜培养使之贴壁。

2)将不同浓度的3‘5’环二鸟苷酸及其衍生物1与100μMDigitonin混合，然后加入到PBMC培养液上清中。在细胞培养箱中静置15分钟。Digitonin作为柔性非离子去污剂可以增加细胞膜的通透性，从而帮助待测样品进入细胞内部。

3)用预热的含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液洗涤细胞两次，然后加入500ul新鲜的培养液，然后放回细胞培养箱中静置培养。

4)培养5小时候，用无菌移液器移取培养液上清。然后利用ebioscience公司的一型干扰素alpha酶联免疫试剂盒依据标准曲线法测定培养上清中一型干扰素的浓度。

c.实验结果如表1和图4，在如上的测试条件下，2μM的3‘5’环二鸟苷酸可以有效地刺激人PBMC分泌产生一型干扰素。而3‘5’环二鸟苷酸小分子衍生物1即便在较高浓度下(25μM)也不能有效刺激PMBC分泌产生一型干扰素。

下表是3’5’环二鸟苷酸衍生物1不能刺激人外周血单个核细胞(Peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)分泌一型干扰素alpha的原始三组平行实验数据；表格1如下

3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌

通过竞争实验，我们发现3‘5’环二鸟苷酸衍生物1可以阻断3‘5’环二鸟苷酸刺激PMBC分泌生成一型干扰素的作用。并且这种阻断效应与3‘5’环二鸟苷酸衍生物1所加含量呈正相关关系。具体实验步骤如下

a.一型干扰素诱导活性的测定

1)将500μl2x10⁵/mlPBMC加入到24孔细胞培养板中，然后静置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱过夜培养使之贴壁。

2)将2μM3‘5’环二鸟苷酸与不同浓度的衍生物1混合并加入100μMDigitonin，然后将不同混合物加入到PBMC培养液上清中。在细胞培养箱中静置15分钟。Digitonin作为柔性非离子去污剂可以增加细胞膜的通透性，从而帮助待测样品进入细胞内部。

3)用预热的含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液洗涤细胞两次，然后加入500ul新鲜的培养液，然后放回细胞培养箱中静置培养。

4)培养5小时候，用无菌移液器移取培养液上清。然后利用ebioscience公司的一型干扰素alpha酶联免疫试剂盒依据标准曲线法测定培养上清中一型干扰素的浓度。

b.实验结果如表2和图5，在如上的测试条件下，3’5’环二腺苷酸衍生物1可以阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌。50μM的3’5’环二腺苷酸衍生物1可以完全阻断2μM的3’5’环二腺苷酸的一型干扰素刺激作用。因此我们确定3’5’环二腺苷酸小分子衍生物1为Sting的拮抗剂可以特异性的阻断3’5’环二腺苷酸与其结合。

下表是3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌的原始三组平行实验数据；表格2如下

3’5’环二腺苷酸衍生物1-拮抗剂通过点击化学反应(Clickchemistry)与细胞通透性多肽tat结合

由于3’5’环二腺苷酸不能直接穿透细胞壁，因此该分子的一型干扰素刺激作用需要增加细胞膜穿透性才能够达到。我们在其衍生物筛选过程中加入了炔烃集团，可用于点击化学反应连接促进穿透细胞的官能团或多肽。在这里我们利用点击化学反应的方法连接了可以促进细胞膜穿透性的艾滋病病毒多肽tat.反应示意图见图6，具体反应流程如下

4)在1.5ml反应管中依次加入如下溶液

433μl58μM的3’5’环二腺苷酸衍生物1

2.5μl0.1mMCuSO4

5μl0.5mM叠氮修饰的tat多肽如下。其中包含了2用于连接的柔性甘氨酸分子和11个来源于艾滋病病毒HIVTat蛋白的穿膜多肽叠氮(azide)N3-GGYGRKKRRQRRR

25μl5mMaminoguanidine.

25μl5mMsodiumascorbate

5)将反应管关闭后颠倒混合均匀，然后放置在室温摇床或旋转混合器上反应1小时。

6)反应产物用高效液相色谱HPLC进行纯化。

3’5’环二腺苷酸衍生物1-tet多肽聚合体具有良好的细胞膜通透性和拮抗sting活化能力

通过体外活性实验我们发现tat多肽连接的3‘5’环二鸟苷酸衍生物1与未连接多肽的衍生物相比显著增强了细胞膜的透过性，在没有破坏细胞膜通透性的情况下，可以有效地阻断Sting分子响应2’5’环二核苷酸和双链DNA分子ISD引起的2’5’环二核苷酸，从而显著(p<0.01)降低一型干扰素在PMBC中的生成(表3，图7)。

具体实验步骤如下

a.一型干扰素诱导活性的测定

1)将500μl2x10⁵/mlPBMC加入到24孔细胞培养板中，然后静置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱过夜培养使之贴壁。

2)将50μM3’5’环二鸟苷酸衍生物1及tat多肽连接的3’5’环二鸟苷酸衍生物1与待测细胞在37℃细胞培养箱中进行孵育1小时。

3)用培养液洗去化合物，然后将2μM3’5’环二鸟苷酸与100μMDigitonin混合，然后将不同混合物加入到预处理过的PBMC培养液上清中。在细胞培养箱中静置15分钟。Digitonin作为柔性非离子去污剂可以增加细胞膜的通透性，从而帮助待测样品进入细胞内部。干扰素刺激双链DNAISD(5’-TACAGATCTACTAGTGATCTATGACTGATCTGTACATGACTACA-3’)用于刺激细胞cGAS受体产生2’5’环二核苷酸(c-AMP-GMP)。利用转染试剂Lipofectamine将1μg/ml的ISD转染至人PBMC中，转染持续1小时。

4)用预热的含有10％FBS的RPMI1640细胞培养液洗涤细胞两次，然后加入500ul新鲜的培养液，然后放回细胞培养箱中静置培养。

5)培养5小时候，用无菌移液器移取培养液上清。然后利用ebioscience公司的一型干扰素alpha酶联免疫试剂盒依据标准曲线法测定培养上清中一型干扰素的浓度。

b.实验结果如表3和图7，在如上的测试条件下，3’5’环二腺苷酸衍生物1不具有细胞通透性。在没有破坏细胞膜通透性的条件下不能阻断3’5’环二腺苷酸和双链DNAISD激活的Sting-IRF3-IFN通路。而连接有穿膜蛋白tat多肽的衍生物1具有良好的细胞膜通透性，在50μM的浓度下可以有效阻断Sting分子响应环二核苷酸和DNA信号。因此穿膜多肽tat连接的3’5’环二腺苷酸小分子衍生物1有成为免疫调节一型干扰素药物的潜力。

下表是3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat细胞通透性及Sting拮抗效果的原始三组平行实验数据

表格3如下：

3’5’环二腺苷酸衍生物1不具有细胞通透性，不能阻断3’5’环二腺苷酸和双链DNAISD激活Sting-IRF3-IFN通路，而连接有穿膜蛋白tat多肽的衍生物1具有良好的细胞膜通透性，在50μM的浓度下可以有效阻断Sting分子响应环二核苷酸和DNA信号。**p<0.01。

Claims (6)

1.一种环二腺核苷酸衍生物1，其特征在于，是3‘5’环二鸟苷酸(式I)在核糖体2位羟基位置连接了一个炔烃基团(式II)，分子量为696.4道尔顿，其结构如下：

2.权利要求1环二腺核苷酸衍生物1的应用，其特征在于阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌。

3.一种3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体，其特征在于物质是由环二腺苷酸衍生物反应得到，其如下结构：

4.权利要求3所述的3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体化学反应过程，其特征在于，在3’5’环二腺苷酸衍生物筛选过程中加入了炔烃集团，可用于点击化学反应连接促进穿透细胞的官能团或多肽，利用点击化学反应的方法连接了可以促进细胞膜穿透性的艾滋病病毒多肽tat，反应过程如下：

。

5.权利要求3所述的3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体化学反应过程，其特征在于，其反应流程如下：

1)在反应管中依次加入如下溶液

3’5’环二腺苷酸衍生物1、CuSO4、叠氮修饰的tat多肽如下；其中包含了2个用于连接的柔性甘氨酸分子和11个来源于艾滋病病毒HIVTat蛋白的穿膜多肽

叠氮(azide)N3-GGYGRKKRRQRRR

25μl5mMaminoguanidine.

25μl5mMsodiumascorbate

2)将反应管关闭后颠倒混合均匀，然后放置在室温摇床或旋转混合器上反应；

3)反应产物用高效液相色谱HPLC进行纯化。

6.权利要求3所述的3’5’环二腺苷酸衍生物1-tat多肽聚合体应用，其特征在于阻断3’5’环二腺苷酸引起的人外周血细胞1型干扰素表达分泌。