CN104312973A - I型干扰素在诱导atx蛋白表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种I型干扰素的新用途。该新用途为I型干扰素在如下任一中的应用：a1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达；a2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品。实验证明，I型干扰素通过I型干扰素受体(IFNAR)激活JAK-STAT、PI3K-AKT和NF-κB等信号通路诱导免疫细胞中ATX的表达，这些通路的抑制剂及相关基因siRNA能抑制I型干扰素诱导的ATX表达；TLR激活可诱导免疫细胞中ATX的表达，而且这种感染相关的ATX诱导表达是由I型干扰素介导的；与炎症反应和自身免疫相关的细胞因子TNF-α和IFN-γ能协同促进免疫细胞中ATX的表达，这一过程同样依赖于I型干扰素的产生和I型干扰素下游通路。本发明揭示了I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达的新功能，对I型干扰素的临床应用和ATX-LPA通路相关疾病的干预治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种I型干扰素的新用途，特别涉及I型干扰素在诱导ATX蛋白表达中的应用。
背景技术
早在1957年，Isaacs和Lindenmann发现了I型干扰素。正是由于它能够“干扰”病毒的复制，由此命名为干扰素(interferon，IFN)。干扰素是一类广泛表达的信号因子，具有很强的抗病毒和生长抑制作用。这些因子是抵御病毒侵染的第一道防线，在对恶性细胞的免疫监视过程中发挥重要作用。干扰素可以分为两种类型：I型干扰素和II型干扰素。I型干扰素包括13种干扰素-α和干扰素-β；II型干扰素即干扰素-γ。I型干扰素与位于细胞膜上的I型干扰素受体(IFNAR)结合，从而激活相应的信号通路，调控相关基因的表达，发挥生物学功能。这些信号通路包括JAK-STAT、p38MAPK、ERK、PI3K-AKT和NF-κB等。
I型干扰素的表达主要受到模式识别受体的控制，这些受体可以识别外源微生物保守的独特的模式分子。可以诱导I型干扰素表达的模式识别受体可以分为两类：Toll-like受体(TLR)和RIG-I-like解旋酶(RLHs)。RLHs广泛表达在各类细胞的细胞质中，可以识别侵染病毒产生的dsRNA。TLRs主要定位于细胞表面或者内体中，可以识别细菌、病毒等微生物的特定组分。当细菌或病毒侵染机体时，被相应的模式识别受体识别，从而诱导I型干扰素的表达。I型干扰素参与许多TLR相关的基因表达调控，并可以直接作用于免疫细胞，在抗感染免疫中发挥重要的作用。
Autotaxin(ATX)是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatase,NPP)家族中的一员即NPP2，最早从人黑素瘤细胞A2058的条件培养基中分离获得，是一个分泌型糖蛋白。它具有lysoPLD活性，其主要生理功能是催化溶血磷脂胆碱(LPC)水解生成溶血磷脂酸(LPA)。LPA通过细胞表面的受体发挥生物学功能，可以促进细胞的存活、增殖和迁移。人们发现在生理状况下，ATX是在血管发育、神经系统的发育所必须的。在疾病状态下，ATX是恶性肿瘤中表达发生最显著上调的40个基因之一；ATX/LPA可以促进肿瘤细胞的迁移，被认为是肿瘤治疗的重要靶点之一。ATX-LPA通路与多种炎症相关疾病有关。在微生物重复侵染的状态下，急性炎症转变成慢性炎症，ATX-LPA通路促使更多细胞因子的产生，并聚集到组织微环境中，从而加剧病情，抑制ATX的活性则可以使症状减轻。这种现象在多种慢性炎症相关疾病小鼠模型的研究中得到证实，如类风湿关节炎、哮喘、多发性硬化症等免疫相关疾病。但是免疫反应过程中ATX表达调控的机制目前还不清楚。因此，认识ATX在炎症中的表达调控机制显得极为迫切，具有较高临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种I型干扰素的新用途。
本发明所提供的I型干扰素的新用途具体为I型干扰素在如下任一中的应用：
(a1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达；
(a2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(b1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达；
(b2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明的另一个目的是提供一种具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明所提供的具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品，其活性成分为I型干扰素或能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质。
在本发明中，所述能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质具体为如下中任一种：
(1)Toll-like受体的配体；
(2)肿瘤坏死因子α和干扰素γ混合物。
在(1)中，所述Toll-like受体的配体具体可为TLR4配体、TLR3配体或TLR9配体；所述TLR4配体具体可为细菌脂多糖(LPS)(如Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为L2880)；所述TLR3配体具体可为poly(I:C)(如Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为P9582)；所述TLR9配体具体可为CpG寡核苷酸(如InvivoGen公司产品，其产品目录号为tlrl-2216)。
在(2)中，所述肿瘤坏死因子α(如peprotech公司产品，其产品目录号为300-01A)和干扰素γ(如peprotech公司产品，其产品目录号为300-02)混合物中，所述肿瘤坏死因子α和所述干扰素γ的质量配比为1:1。相应的，在所述肿瘤坏死因子α和干扰素γ混合物的工作液中，所述肿瘤坏死因子α和所述干扰素γ的质量浓度配比为1:1，两者的工作浓度均为50ng/ml。
I型干扰素信号通路抑制剂或抑制I型干扰素产生的物质在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(c1)在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达；
(c2)制备具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明的又一个目的是提供一种具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明所提供的具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品，其活性成分为I型干扰素信号通路抑制剂或能够抑制I型干扰素产生的物质。
在本发明中，所述I型干扰素信号通路抑制剂具体为如下(a)-(c)中的任一种：所述抑制I型干扰素产生的物质具体为如下(d)：
(a)JAK-STAT信号通路抑制剂、PI3K-AKT信号通路抑制剂或NF-κB信号通路抑制剂；
(b)siSTAT1、siSTAT3、siAKT、siJAK1、siTYK2或siIFNAR1；
所述siSTAT1为序列表中序列1所示的双链RNA分子；所述siSTAT3为序列表中序列2所示的双链RNA分子(核酸分子)；所述siAKT为序列表中序列3所示的双链RNA分子(核酸分子)；所述siJAK1为序列表中序列4所示的双链RNA分子(核酸分子)；所述siTYK2为序列表中序列5所示的双链RNA分子(核酸分子)；所述siIFNAR1为序列表中序列6所示的双链RNA分子(核酸分子)；
(c)IFN-α中和性抗体(如Peprotech公司产品，其产品目录号为500-P32AG)或IFN-β的中和性抗体(如Peprotech公司产品，其产品目录号为500-P32B)；
(d)siIRF3或siIRF7；
所述siIRF3为序列表中序列7所示的双链RNA分子(核酸分子)；所述siIRF7为序列表中序列8所示的双链RNA分子(核酸分子)。
在本发明的一个实施例中，上述(a)中，所述JAK-STAT信号通路抑制剂具体为Pyridone6(如Calbiochem公司产品，其产品目录号为420099)；所述PI3K-AKT信号通路抑制剂具体为LY294002(如Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为L9908)；所述NF-κB信号通路抑制剂具体为BAY-11-7082(如Sigma-Aldrich公司产品，其产品目录号为B5556)。
在本发明中，所述I型干扰素具体可为IFN-α(如Peprotech公司产品，其产品目录号为300-02AA)或IFN-β(如Peprotech公司产品，其产品目录号为300-02BC)。
在本发明中，所述ATX蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9所示，所述ATX蛋白的编码基因具体为序列表中序列10。
在本发明中，所述免疫细胞具体可为如下中的任一种：THP-1细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(monocyte)、非单核细胞(Non-monocyte)或单核细胞来源的树突状细胞(monocyte derived dendritic cell，moDC)。
实验证明，I型干扰素(IFN-α和IFN-β)可以通过JAK-STAT、PI3K-AKT和NF-κB通路诱导免疫细胞中ATX的表达。这些通路的抑制剂以及相关基因siRNA能够抑制I型干扰素诱导的ATX表达。同时，本发明的发明人还发现感染免疫中TLR的激活可以诱导ATX的表达，而且这种感染相关的ATX诱导表达是由I型干扰素介导的。IFN-β的中和性抗体、IFNAR1的siRNA以及IFN-β信号通路的抑制剂均能够抑制TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR9配体CpG寡核苷酸以及TLR3配体poly(I:C)诱导的ATX表达。此外，与炎症反应和自身免疫相关的细胞因子TNF-α和IFN-γ能够协同促进ATX的表达，这一过程同样依赖于I型干扰素的产生和I型干扰素下游通路。这些发现不仅揭示了I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达的新功能，而且阐释了免疫反应过程中ATX表达调控的机制，对I型干扰素的临床应用和ATX-LPA通路相关疾病的干预治疗具有重要意义。
附图说明
图1为I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达。A：THP-1人单核细胞；B：PBMC、monocyte以及Non-monocyte；C：人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、T细胞系Jurkat、以及几种肿瘤细胞系(HEK293、SW480、A549和MCF-7)。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图2为PI3K抑制剂LY、JAK抑制剂P6、NF-κB抑制剂BAY能够抑制I型干扰素诱导的ATX的表达。A：THP-1细胞；B：PBMC；C：单核细胞。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图3为siAKT、siJAK、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3都可以抑制I型干扰素诱导的ATX的表达。A：siAKT；B：siJAK和siTYK2；C：siSTAT1和siSTAT3。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图4为TLR的激活导致ATX的表达上调。A：THP-1细胞；B：moDC细胞。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图5为siIRF3或者siIRF7抑制TLR介导ATX的表达。A：siIRF3/poly(I:C)；B：siIRF3/LPS；C：siIRF7/CpG。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图6为LPS、CpG和poly(I:C)诱导I型干扰素的表达。
图7为IFN-α和IFN-β特异性中和性抗体对TLR介导的THP-1细胞中ATX表达的影响。A：poly(I:C)；B：LPS；C：CpG。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图8为IFN-α和IFN-β特异性中和性抗体对TLR介导的moDC细胞中ATX表达的影响。A：poly(I:C)；B：LPS。图中，*表示在P<0.05水平上差异显著，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图9为siIFNAR1抑制TLR介导ATX的表达。
图10为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)协同促进ATX表达。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
图11为TNF-α和IFN-γ上调ATX的表达依赖于I型干扰素。A：TNF-α对THP-1细胞中IFN-β的表达具有促进作用；B：当IFN-β特异的中和性抗体存在时，TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达的作用被显著抑制；C：通过转入siIFNAR1敲低细胞中IFNAR1的表达，阻断I型干扰素的信号通路，能够抑制TNF-α和IFN-γ上调ATX表达的作用。图中，**表示在P<0.01水平上差异显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
THP-1人单核细胞：购自ATCC公司，目录号：TIB-202。用含有10％(体积分数)的胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640(Gibco)培养基培养，培养基中加入2mM L-谷氨酰胺(Gibco)，100μg/ml链霉素(Gibco)和100U/ml青霉素(Gibco)。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)：购自sciencell公司，目录号：8000。T细胞系Jurkat：购自ATCC公司，目录号：TIB-152。肿瘤细胞系HEK293、SW480、A549和MCF-7，均购自ATCC公司，目录号分别为：CRL-1573、CCL-228、CCL-185和HTB-22。
Trizol：Invitrogen公司；M-MLV：Promega公司；RNAse抑制剂：Promega公司；BCA蛋白定量试剂盒：Thermo公司；iQ SYBR：Green supermix Bio-Rad公司；转染试剂lipofectamine2000：Invitrogen公司；BSA：Amresco公司；LPS：Sigma-Aldrich公司(产品目录号为L2880)；CpG：InvivoGen公司(产品目录号为tlrl-2216)；poly(I:C)：Sigma-Aldrich公司(产品目录号为P9582)；JAKs抑制剂Pyridone6(P6)：Calbiochem公司(产品目录号为420099)；PI3K抑制剂LY294002：Sigma-Aldrich公司(产品目录号为L9908)；NF-κB抑制剂BAY-11-7082：Sigma-Aldrich公司(产品目录号为B5556)；干扰素-β(IFN-β)中和性抗体：Peprotech公司(产品目录号为500-P32B)；干扰素-α(IFN-α)中和性抗体：Peprotech公司(产品目录号为500-P32AG)；ECL发光显色试剂盒：Millipore公司；Human IFN-α：Peprotech公司(产品目录号为300-02AA)；Human IFN-β：Peprotech公司(产品目录号为300-02BC)；Human IL4：Peprotech公司200-04；Human GM-CSF：Peprotech公司300-03；TNF-α：peprotech公司(产品目录号为300-01A)；IFN-γ：peprotech公司(产品目录号为300-02)。
实施例1、I型干扰素可以诱导免疫细胞中ATX的表达
一、I型干扰素在THP-1人单核细胞中对ATX表达的诱导作用
用I型干扰素IFN-α和IFN-β分别处理THP-1人单核细胞，通过实时定量反转录PCR(qRT-PCR)和western blot分别检测ATX mRNA和蛋白的表达水平。具体如下：
1、用I型干扰素IFN-α和IFN-β分别处理THP-1人单核细胞
分别将IFN-α(或IFN-β)加入培养有THP-1人单核细胞的细胞培养基中，使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。处理时间设置三个时间梯度：0h、2h和4h。
2、实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测
A.RNA提取
(1)收集细胞样品，用PBS溶液洗涤2遍，然后离心去上清。
(2)在沉淀中加入1ml的Trizol溶液，吹打混匀，室温静置5分钟。
(3)加入氯仿(每1ml trizol加0.2ml的氯仿)，盖紧离心管，用手剧烈摇荡15秒。
(4)室温静置5分钟，12000g4℃离心15分钟。
(5)将上层水相转移到新的离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀后放置10分钟。
(6)12000g，4℃离心10分钟，弃上清。
(7)加入1ml的75％(体积分数)乙醇洗涤一次，7500g4℃离心5分钟，弃上清，沉淀烘干10分钟。
(8)加入20μl DEPC水溶解沉淀，放置于60℃水浴锅溶解10分钟。
(9)通过分光光度计测量RNA浓度，将制备好的样品冻于-80℃冰箱储存。
B.qRT-PCR
(1)反转录获得cDNA
取2μg RNA，加入2μl d(T)引物，70℃10分钟，立即放在冰上冷却。按照以下体系进行混合：加入M-MLV5×缓冲液5μl，dNTPs10mM1μl，RNasinRibonucleaseinhibitor0.5μl，M-MLV逆转录酶1μl，补入DEPC水至终体积25μl，将混合溶液放于42℃水浴中反应1小时，72℃灭活10分钟，冻存于-20℃冰箱储存。
(2)荧光定量PCR检测
根据IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)的操作手册，利用Bio-Rad的iCycleiQreal-time PCR仪器对目的基因ATX进行检测，结果通过Bio-Rad iQ5分析软件进行检测。以GAPDH基因作为内参。
扩增ATX基因的引物对如下：
ATX-F：5’-GACTATGACTATGATGGCTTAC-3’；
ATX-R：5’-GATGATGCTGTAGTAGTGAGT-3’。
扩增GAPDH基因的引物对如下：
GAPDH-F：5’-TTAGCACCCCTGTCCAAGG-3’；
GAPDH-R：5’-CCTACTCCTTGGAGGCCATG-3’。
反应体系：2×RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25μl；上游引物F1μl，下游引物R1μl；cDNA模板2μl。
定量PCR仪扩增反应条件设置：50℃2min；95℃10min；95℃15s--60℃60s(40个循环)；溶解曲线生成的反应程序为:95℃15s,60℃15s,95℃15s。
数据处理：用IQ5软件获得数据，用EXCEL软件对数据进行处理分析。通过T-Test检验进行统计学差异分析。
3、western blot检测
A.蛋白提取
(1)收集细胞，1500rpm离心5分钟，弃除上清，用预冷的PBS清洗细胞沉淀两次；
(2)吸干残余的PBS，加入适量的细胞裂解液RIPA，吹打混匀，冰浴裂解30分钟；
(3)12000rpm4℃离心20分钟，取上清转移到新的离心管中；
B.BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度
(1)将溶液A和溶液B根据体积比50：1配置成BCA工作液，充分混匀；
(2)将蛋白标准品等比稀释至不同的浓度梯度
(3)在200μl BCA工作液中加入20μl测量样品，充分混匀，37℃反应30分钟；
(4)用分光光度计选用BCA测量模式进行测量，绘制标准曲线。
C.Western蛋白印迹
1)电泳
配置SDS-PAGE蛋白胶，取40μg样品蛋白加入上样缓冲液中，沸水浴5分钟，12000rpm离心2分钟，冷却后离心取上清上样。先用80V恒压电泳，等溴酚蓝进入分离胶后换成120V电压进行电泳。
2)全湿法转膜
将PVDF膜用甲醇活化15秒，然后放入蒸馏水中浸泡5分钟，再放入转膜缓冲液中浸泡15分钟。按照Bio-Rad湿转仪方法进行转膜，100V60分钟。
3)孵育抗体及显色
(1)取出PVDF膜，用TBST洗涤一次，放入封闭液(5％(5g/100ml)BSA)中室温孵育1小时；
(2)用TBST洗涤3次，每次5分钟，放入一抗(anti-human ATX，采用序列9所示的ATX蛋白作为免疫原免疫兔子获得的多克隆抗体)稀释液中室温孵育1小时；
(3)用TBST洗涤3次，每次5分钟，放入二抗(羊抗兔IgG抗体，购自自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5306)稀释液中室温孵育30分钟；
(4)取出膜，用TBST洗涤3次，ECL发光显色。
4、结果
结果显示，IFN-α和IFN-β均可以诱导THP-1人单核细胞中ATX的表达(图1中A)。
二、I型干扰素在人外周血免疫细胞中对ATX表达的诱导作用
从人外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后从PBMC中分离单核细胞(monocyte)和非单核细胞(Non-monocyte)。分别用IFN-α和IFN-β处理上述三种细胞，通过qRT-PCR检测ATX mRNA的表达。具体如下：
1、三种细胞的分离
采新鲜抗凝健康人外周血，肝素抗凝后，用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。
将单个核细胞(PBMC)培养于37℃5％CO2培养箱中，贴壁3小时后，把上清移出到另一塑料培养瓶中，以37℃预温的RPMI1640培养基轻洗去除非贴壁的细胞并倒入培养瓶中，贴壁细胞即为单核细胞(monocyte)，非贴壁细胞即为非单核细胞(Non-monocyte)。
2、用IFN-α和IFN-β分别处理上述三种细胞
待处理细胞：步骤1分离得到的外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(monocyte)和非单核细胞(Non-monocyte)。
将IFN-α(或IFN-β)加入培养有待处理细胞的细胞培养基中，使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时，IFN-β的处理时间为4小时。实验同时设置了未经I型干扰素处理的阴性对照。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参见步骤一2进行。
4、结果
结果显示，IFN-α和IFN-β均可以诱导PBMC、monocyte以及Non-monocyte中ATX的表达(图1中B)。
三、I型干扰素在其他细胞中对ATX表达的诱导作用
本发明的发明人还用I型干扰素处理了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、T细胞系Jurka，以及几种肿瘤细胞系(HEK293、SW480、A549和MCF-7)，通过qRT-PCR检测ATX mRNA的表达。具体的处理方法参见步骤二2进行。qRT-PCR检测ATX mRNA的表达参见步骤二3进行。
结果显示，I型干扰素并不能够诱导这些细胞中ATX的表达(图1中C)。
上述结果表明，I型干扰素可以诱导免疫细胞中ATX的表达，而这种作用具有较强的细胞特异性。
实施例2、阻断JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB通路可以抑制I型干扰素诱导ATX的表达
一、三个信号通路抑制剂P6、LY和BAY的作用
I型干扰素通过与细胞表面的I型干扰素受体(IFNAR)相结合，进而激活JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB等通路。本发明的发明人通过qRT-PCR检测了相关通路的抑制剂对IFN-α和IFN-β诱导ATX的表达影响。具体操作如下：
待处理细胞：THP-1人单核细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和单核细胞(monocyte)。
供试信号通路抑制剂：JAK-STAT信号通路的抑制剂Pyridone6(P6)、PI3K-AKT信号通路的抑制剂LY294002(LY)以及NF-κB信号通路的抑制剂BAY-11-7082(BAY)。
向培养有待处理细胞的细胞培养基中加入供试信号通路抑制剂，使供试信号通路抑制剂的终浓度均为10μM；半小时后，再向其中加入IFN-α(或IFN-β)，使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时，IFN-β的处理时间为4小时。
通过qRT-PCR检测ATX mRNA表达水平(参见实施例1步骤二3进行)。
结果表明，JAK-STAT信号通路的抑制剂Pyridone6(P6)、PI3K-AKT信号通路的抑制剂LY294002(LY)以及NF-κB信号通路的抑制剂BAY-11-7082(BAY)都能显著抑制I型干扰素诱导的ATX表达(图2)。
二、siAKT、siJAK1、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3的作用
本发明的发明人还通过RNAi技术敲低相关信号通路中重要组分，进一步验证这些通路在IFN-α和IFN-β诱导ATX表达中的作用。具体如下：
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siSTAT1：5’-GCUUCUUGGUCCUAACGCC-3’(序列1)；
siSTAT3：5’-CCACUUUGGUGUUUCAUAA-3’(序列2)；
siAKT：5’-GCUGGAGAACCUCAUGCUG-3’(序列3)；
siJAK1：5’-GACAUGAUAUUGAGAACGA-3’(序列4)；
siTYK2：5’-GCAUCCACAUUGCACAUAA-3’(序列5)；
阴性对照(NC)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染及IFN-α或IFN-β的处理
A.siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。
(1)根据吉玛公司说明书，将合成的siRNA加入150μl无RNase水溶解至浓度(20μM)，分装冻存于-80℃。
(2)根据Lipofectamine2000说明书进行siRNA转染，具体步骤如下：转染前用2ml新鲜培养基重悬1.5-2×105个细胞，加入到35mm培养皿中；用250μl Opti-MEM培养基稀释siRNA至终浓度为25nM或50nM；同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将siRNA和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到细胞培养基中，混匀。
B.IFN-α或IFN-β的处理
转染48小时后，向其中加入IFN-α(或IFN-β)，使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时，IFN-β的处理时间为4小时。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参，检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司，目录号：sc-47778)，二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)。
检测AKT蛋白的一抗为anti-human AKT(购自Cell Signaling Technology公司，目录号：9272)；检测JAK1蛋白的一抗为anti-human JAK1(购自Santa CruzBiotechnology公司，目录号：sc-7228)；检测TYK2蛋白的一抗为anti-human TYK2(购自Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：sc-169)；检测STAT1蛋白的一抗为anti-human STAT1(购自Cell Signaling Technology公司，目录号：9172s)；检测STAT3蛋白的一抗为anti-human STAT3(购自Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：sc-482X)；检测各蛋白所用的二抗根据一抗进行选择，为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗体(购自自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5306)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
结果显示，siAKT、siJAK1、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3都能够抑制IFN-α和IFN-β诱导的ATX表达(图3)。
上述结果表明，阻断JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB通路可以抑制I型干扰素诱导ATX的表达。
实施例3、TLR的激活可以导致ATX的表达上调
一、THP-1细胞中TLR配体对ATX表达的影响
Toll-like receptor(TLR)作为一类模式识别受体，是机体识别异物侵染的重要感受器。本发明的发明人检测了TLR配体对ATX表达的影响。具体操作如下：
1、TLR配体处理THP-1细胞
供试TLR配体有TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)和TLR9配体CpG寡核苷酸。
(1)LPS处理
将LPS加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，使其终浓度为0.1μg/ml。处理16小时。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
(2)poly(I:C)和CpG寡核苷酸处理
A.poly(I:C)处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml；同时用250μlOpti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，混匀。
B.CpG寡核苷酸处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释CpG至终浓度为1μM；同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，混匀。
poly(I:C)和CpG寡核苷酸的处理时间均为6小时。
实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)和TLR9配体CpG寡核苷酸都可以诱导THP-1细胞中ATX的表达(图4中A)。
二、单核细胞来源的树突状细胞中TLR配体对ATX表达的影响
1、单核细胞来源的树突状细胞的获得
从人外周血中分离到单核细胞(具体分离方法参见前文)，调整细胞浓度为1×106个/L，接种于6孔培养板，0.002L/孔，加入rhGM-CSF(50μg/L)、rhIL-4(50μg/L)，然后置37℃、5％CO2培养箱内培养，第3天采取半量换液并补加细胞因子，继续培养至第6天，获得成熟的树突状细胞，即为单核细胞来源的树突状细胞(monocytederived dendritic cell，moDC)。该moDCs中只表达TLR3和TLR4，不表达TLR9。
2、TLR配体处理moDC细胞
供试TLR配体有TLR4配体细菌脂多糖(LPS)和TLR3配体poly(I:C)。
(1)LPS处理
将LPS加入到培养有moDC细胞的细胞培养基中，使其终浓度为0.1μg/ml。处理16小时。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
(2)poly(I:C)处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml；同时用250μlOpti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到细胞培养基中，混匀，处理时间为6h。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，当用LPS和poly(I:C)分别处理moDCs时，均可以显著上调moDCs细胞中ATX的表达(图4中B)。
上述结果表明，TLR3、TLR4和TLR9等TLR的激活可以诱导免疫细胞中ATX的表达。
实施例4、TLR激活导致ATX表达上调依赖I型干扰素自分泌途径
TLR的激活可以诱导I型干扰素的表达，其中TLR3和TLR4是通过IRF3介导的I型干扰素的表达，而TLR9是通过IRF7介导I型干扰素的表达。
一、siIRF3和siIRF7对TLR激活诱导ATX的表达影响
本发明的发明人通过转入siIRF3或siIRF7，分别敲低IRF3和IRF7的表达，研究其对TLR激活诱导ATX的表达影响。具体操作如下：
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siIRF3：5’-ccacuuugguguuucauaa-3’(序列7)；
siIRF7：5’-gccucuaugacgacaucga-3’(序列8)；
阴性对照(NC)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染，转染48小时后，再参照实施例3步骤一1用TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)或TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参，检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司，目录号：sc-47778)，二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)。
检测IRF3蛋白的一抗为anti-human IRF3(购自Cell Signaling Technology公司，目录号：11904P)；检测IRF7蛋白的一抗为anti-human IRF7(购自Cell SignalingTechnology公司，目录号：13014S)；检测各蛋白所用的二抗根据一抗进行选择，为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗体(购自自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5306)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
5、结果
结果显示，siIRF3可以抑制TLR4配体LPS和TLR3配体poly(I:C)处理THP-1细胞时ATX的表达上调(图5中A和B)；siIRF7可以抑制TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞时ATX的表达上调(图5中C)。
二、TLR配体诱导I型干扰素的表达
1、TLR配体处理THP-1细胞
参照实施例3步骤一1进行。LPS的处理时间为2h，poly(I:C)和CpG寡核苷酸的处理时间均为6h。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测IFN-α和IFN-βmRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
其中扩增IFN-α基因的引物对如下：
IFN-α-F：5’-GATGGCCGTGCTGGTGCTCA-3’；
IFN-α-R：5’-TGATTTCTGCTCTGACAACCTCCC-3’。
其中扩增IFN-β基因的引物对如下：
IFN-β-F：5’-AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3’；
IFN-β-R：5’-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3’。
结果显示：TLR4只可以介导IFN-β的表达，而不能介导IFN-α的表达；而TLR3和TLR9既可以介导IFN-α的表达也可以介导IFN-β的表达(图6)。
三、IFN-α和IFN-β的中和性抗体对TLR介导的THP-1细胞中ATX表达的影响
1、IFN-α或IFN-β的中和性抗体处理细胞
(1)LPS/IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体，使其终浓度为1μg/ml，30min后，再向其中加入LPS，使其终浓度为0.1μg/ml，LPS处理16小时。实验同时设置未经处理的细胞以及经IgG处理的细胞作为对照。
(2)poly(I:C)或CpG寡核苷酸/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
A.poly(I:C)/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)，使其终浓度为1μg/ml，30min后，用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml；同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，混匀。poly(I:C)/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6h。
B.CpG寡核苷酸/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)，使其终浓度为1μg/ml，30min后，用250μl Opti-MEM培养基稀释CpG寡核苷酸至终浓度为1μM；同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，混匀。CpG寡核苷酸/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6h。
实验同时设置未经处理的细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，通过加入IFN-α或IFN-β的中和性抗体阻断相应I型干扰素的作用，发现IFN-β的中和性抗体在THP-1细胞中能够抑制TLR3、4、9活化导致的ATX表达上调，而IFN-α的中和性抗体则没有显著的效果(图7)。
四、IFN-α和IFN-β中和性抗体对TLR介导的moDC细胞中ATX表达的影响
1、IFN-α或IFN-β的中和性抗体处理细胞
(1)LPS/IFN-β中和性抗体处理
向培养有moDC细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体，使其终浓度为1μg/ml，30min后，再向其中加入LPS，使其终浓度为0.1μg/ml，LPS处理16小时。实验同时设置未经处理的细胞以及经IgG处理的细胞作为对照。
(2)poly(I:C)/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有moDC细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)，使其终浓度为1μg/ml，30min后，用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml；同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000，轻轻混合，室温放置5分钟；将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合，室温放置20分钟，然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，混匀。poly(I:C)/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6小时。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，通过加入IFN-α或IFN-β的中和性抗体阻断相应I型干扰素的作用，发现在moDC细胞中IFN-β中和性抗体和IFN-α中和性抗体均能够抑制TLR3配体poly(I:C)诱导ATX的表达，其中IFN-β中和性抗体的抑制作用更为显著(图8中A)；IFN-β中和性抗体能够抑制moDC细胞中TLR4配体LPS诱导ATX的表达(图8中B)。
五、siIFNAR1抑制TLR介导ATX的表达
I型干扰素通过结合位于细胞表面的I型干扰素受体(IFNAR)来发挥作用。IFNAR由两个亚基组成，即IFNAR1和IFNAR2。本发明的发明人通过RNAi敲低细胞中IFNAR1的表达，研究其对TLR激活诱导ATX的表达影响。具体操作如下：
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siIFNAR1：5’-CUGGGAUGGAUAAUUGGAU-3’(序列6)
阴性对照(NC)：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染，转染48小时后，再参照实施例3步骤一1用TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)或TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞。
参照实施例2步骤二2进行。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参，检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司，目录号：sc-47778)，二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)。
检测IFNAR1蛋白的一抗为anti-human IFNAR1(购自Santa Cruz Biotechnology公司，目录号：sc-7391)；二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司，目录号：ZDR-5307)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
5、结果
结果显示，siIFNAR1能够抑制LPS、poly(I:C)和CpG寡核苷酸处理时THP-1细胞中ATX的表达上调(图9)。
上述结果表明，TLR配体诱导ATX表达上调依赖I型干扰素的产生，阻断I型干扰素产生的途径或者阻断I型干扰素发挥功能的信号通路都能够抑制TLR激活导致的ATX表达上调。
实施例5、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)能够协同上调ATX的表达
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)两种细胞因子，参与多种生命活动，与自身免疫疾病密切相关。有多篇文章报道，ATX与自身免疫疾病相关。因此，本发明的发明人分别用TNF-α和IFN-γ单独或者组合处理THP-1细胞，检测对ATX表达影响。具体操作如下：
1、TNF-α和/或IFN-γ处理THP-1细胞
将TNF-α和/或IFN-γ分别单独或者组合加入到THP-1细胞的培养基中，使TNF-α的终浓度为50ng/ml，IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。处理时间为16h。实验同时设置未经处理的细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，TNF-α和IFN-γ单独处理对ATX表达的上调作用较小。而TNF-α和IFN-γ共同处理是则能使ATX的表达显著地升高(图10)。
上述结果说明，TNF-α和IFN-γ能够协同诱导ATX的表达。
实施例6、TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达依赖于I型干扰素的作用
有报道表明，TNF-α能够促进I型干扰素的表达(主要是IFN-β)，而I型干扰素和II型干扰素(IFN-γ)具有协同作用。
一、TNF-α对I型干扰素的诱导作用
1、TNF-α处理THP-1细胞
将TNF-α加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中，使其终浓度为50ng/ml。处理时间为2h。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测IFN-α和IFN-βmRNA的表达
参照实施例4步骤二2进行。
结果显示，TNF-α对THP-1细胞中IFN-β的表达具有促进作用(图11中A)。
二、IFN-β中和性抗体抑制TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达
1、TNF-α和IFN-γ/IFN-β中和性抗体处理细胞
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体，使其终浓度为1μg/ml，30min后，将TNF-α和IFN-γ组合加入其中，使TNF-α的终浓度为50ng/ml，IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。TNF-α和IFN-γ的处理时间为16h。实验同时设置未经IFN-β中和性抗体处理的对照组，以及采用IgG替代IFN-β中和性抗体处理的对照组。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示，当IFN-β特异的中和性抗体存在时，TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达的作用被显著抑制(图11中B)。
三、siIFNAR1抑制TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达
1、siRNA的合成
同实施例4步骤五1。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染，转染48小时后，再将TNF-α和IFN-γ组合加入到其中，使TNF-α的终浓度为50ng/ml，IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。TNF-α和IFN-γ的处理时间为16h。实验同时设置未转染的对照组。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
参照实施例4步骤五4进行。
5、结果
结果显示，通过转入siIFNAR1敲低细胞中IFNAR1的表达，阻断I型干扰素的信号通路，能够抑制TNF-α和IFN-γ上调ATX表达的作用(图11中C)。
上述结果表明，阻断I型干扰素的通路能够抑制TNF-α和IFN-γ诱导的ATX表达。
Claims (10)
1.I型干扰素在如下任一中的应用：
(a1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达；
(a2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品。
2.能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质在如下任一中的应用：
(b1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达；
(b2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品。
3.一种具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品，其活性成分为I型干扰素或能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质。
4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质为如下中任一种：
(1)Toll-like受体的配体；
(2)肿瘤坏死因子α和干扰素γ混合物。
5.根据权利要求4所述的应用或产品，其特征在于：所述Toll-like受体的配体为TLR4配体、TLR3配体或TLR9配体；
所述TLR4配体具体为细菌脂多糖；所述TLR3配体具体为poly(I:C)；所述TLR9配体具体为CpG寡核苷酸。
6.I型干扰素信号通路抑制剂或抑制I型干扰素产生的物质在如下任一中的应用：
(c1)在免疫细胞中抑制ATX蛋白表达；
(c2)制备具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白表达的功能的产品。
7.一种具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白表达的功能的产品，其活性成分为I型干扰素信号通路抑制剂或能够抑制I型干扰素产生的物质。
8.根据权利要求6所述的应用或权利要求7所述的产品，其特征在于：所述I型干扰素信号通路抑制剂为如下(a)-(c)中的任一种：所述抑制I型干扰素产生的物质为如下(d)：
(a)JAK-STAT信号通路抑制剂、PI3K-AKT信号通路抑制剂或NF-κB信号通路抑制剂；
所述JAK-STAT信号通路抑制剂具体为Pyridone6；所述PI3K-AKT信号通路抑制剂具体为LY294002；所述NF-κB信号通路抑制剂具体为BAY-11-7082；
(b)siSTAT1、siSTAT3、siAKT、siJAK1、siTYK2或siIFNAR1；
所述siSTAT1为序列表中序列1所示的双链RNA分子；所述siSTAT3为序列表中序列2所示的双链RNA分子；所述siAKT为序列表中序列3所示的双链RNA分子；所述siJAK1为序列表中序列4所示的双链RNA分子；所述siTYK2为序列表中序列5所示的双链RNA分子；所述siIFNAR1为序列表中序列6所示的双链RNA分子；
(c)IFN-α中和性抗体或IFN-β的中和性抗体；
(d)siIRF3或siIRF7；
所述siIRF3为序列表中序列7所示的双链RNA分子；所述siIRF7为序列表中序列8所示的双链RNA分子。
9.根据权利要求8所述的应用或产品，其特征在于：所述I型干扰素为IFN-α或IFN-β。
10.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述ATX蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |