CN101979090A - 一种治疗肿瘤的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗肿瘤的药物。该药物由组蛋白去乙酰化酶抑制剂和溶血磷脂酸抑制物组成;所述溶血磷脂酸抑制物为抑制溶血磷脂酸与溶血磷脂酸受体结合的物质或抑制溶血磷脂酸生成的物质。本发明表明:HDACi可以在多种肿瘤细胞中通过抑制HDAC3和HDAC7的活性上调ATX表达。HDACi诱导产生的ATX通过催化LPC生成LPA,减弱了HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用。如果通过RNAi的方法抑制ATX表达,或者加入ATX-LPA信号通路抑制剂BrP-LPA阻断ATX-LPA信号,HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用都会进一步增强。本发明研究提出了溶血磷脂酸抑制物和HDACi联合用药治疗肿瘤的新思路。本发明在肿瘤治疗中有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肿瘤的药物。
背景技术
组蛋白去乙酰化酶(HDAC)家族由18个成员组成,被分为四个亚家族。其中家族I的成员定位于细胞核内,家族∏的成员可以在细胞质-细胞核间穿梭。HDAC同时还可以调节细胞内除组蛋白之外的很多蛋白的乙酰化。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)是近年来被广泛关注、应用的抗肿瘤药物。HDACi可以通过阻滞细胞周期进程、诱导分化和凋亡等多种手段杀伤肿瘤。研究者已经发现,HDACi诱导了肿瘤细胞中很多促凋亡基因的表达,从而导致肿瘤细胞死亡。这些HDACi还可以导致肿瘤细胞中的死亡受体及其配体的表达,而正常细胞中这些基因不能被HDACi上调。已有十余种HDACi进入了临床试验阶段,比如说SAHA、VPA和PXD-101等。但是,人们也发现一些肿瘤细胞对HDACi有抗性,但是机理还不明确。
Autotaxin(ATX),是核苷焦磷酸酶/磷酸二酯酶家族中的一员。ATX作为一个分泌蛋白,广泛存在于血浆、脑脊液等生物体液中,它可以催化溶血磷脂酰胆碱(LPC)生成溶血磷脂酸(LPA)。在ATX缺失的小鼠中,LPA不能产生,从而导致小鼠胚胎致死;而在ATX杂合体小鼠血浆中LPA浓度减半,这一实验进一步表明ATX是生物体内产生LPA的脂酶。目前认为ATX的生物学功能依赖于其产生LPA的能力。LPA是一个多功能磷脂分子,它通过其特异的G蛋白偶联受体(已发现9种LPA受体,其中对受体1-3的研究最为充分)将信号传递进细胞内,促进细胞增殖、分化以及存活。LPA受体通过G蛋白(Gi,Gq,G12/13)激活包括磷脂酶C,PI3K,Ras-MAPK,Rac和Rho等多条信号通路。
人ATX有三种剪接体,其中在血浆中,肿瘤组织中表达的ATX为ATX-β,氨基酸序列的Genebank accession number:AAH34961.1。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂-TSA是一种应用广泛的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可以促进胞内蛋白乙酰化,全称为Trichostatin A([R-(E,E)]-7-[4-(Dimethylamino)phenyl]-N-hydroxy-4,6-dimethyl-7-oxo-2,4-heptadienamide),分子式为C17H22N2O3,,结构式如式I:
组蛋白去乙酰化酶抑制剂-NaB是一种应用广泛的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可以促进胞内蛋白乙酰化,全称为Butyric acid sodium salt分子式为CH3CH2CH2COONa,,结构式如式II:
组蛋白去乙酰化酶抑制剂-VPA是一类应用广泛的组蛋白去乙酰化酶抑制剂,可以促进胞内蛋白乙酰化,目前VPA泛指其钠盐,通过抑制HDAC活性,杀伤肿瘤,应用于临床,全称为Valproic acid sodium salt(2-propylpentanoic acid sodium,Sodium2-propylpentanoate,Sodium valproate),分子式为C8H15NaO2,为(CH3CH2CH2)2CHCOO-Na+。
HDAC3是I型组蛋白去乙酰化酶,定位于细胞核中,人HDAC3的氨基酸序列的Genebank accession number:AAC52038.1。
HDAC7是II型组蛋白去乙酰化酶,穿梭于细胞核-细胞质中,调控多种蛋白乙酰化,人HDAC7的氨基酸序列的Genebank accession number:AAF63491.1。
BrP-LPA是一种ATX-LPA信号通路抑制剂,可以抑制ATX活性(94%10μM),以及LPA受体的活性(LPA1:1.5μM,LPA2:1.4μM,LPA3:1.2μM,LPA4:0.27μM)。其全称:1-Bromo-3(S)-hydroxy-4-(palmitoyloxy)butyl]phosphonate,分子式为:C20H39BrNaO6P,结构式如式III。
受体LPA1又名EDG2,其氨基酸序列的Genebank accession number:AAP84359.1。
受体LPA2又名EDG4,其氨基酸序列的Genebank accession number:AAF43409.1。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种预防和/或治疗肿瘤的组合物。
本发明所提供的预防和/或治疗肿瘤的组合物,由组蛋白去乙酰化酶抑制剂和溶血磷脂酸抑制物组成;所述溶血磷脂酸抑制物为阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质或抑制溶血磷脂酸生成的物质。
上述组合物中,所述阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质为抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质或抑制细胞中溶血磷脂酸受体活性的物质或者溶血磷脂酸受体拮抗剂;所述抑制溶血磷脂酸生成的物质为阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质。
上述组合物中,所述阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质优选为抑制ATX表达的物质或者抑制ATX活性的物质。
所述抑制ATX表达的物质优选为如下分子(具体可是单链的分子):GUGGACCAAUCUUCGACUATT;
所述抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质优选为如下(1)和/或(2)所示分子(具体可是单链的分子):(1)GAAAUGAGCGCCACCUUUATT;(2)GGUCAAUGCUGCUGUGUACTT。
上述组合物中,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA;所述溶血磷脂酸抑制物为BrP-LPA;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞或人乳腺癌细胞(是否应该放宽)。
上述组合物中,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂和所述溶血磷脂酸抑制物独立包装或混合包装。
上述组合物中,所述结肠癌细胞优选为SW480细胞和/或colo320细胞;所述人乳腺癌细胞优选为MDA-MB-231细胞和/或MDA-MB-435细胞。所述ATX为ATX-β。
由组蛋白去乙酰化酶抑制剂和溶血磷脂酸抑制物组成的组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用也属于本发明的保护范围。其中,所述溶血磷脂酸抑制物为阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质或抑制溶血磷脂酸生成的物质。
上述应用中,所述阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质为抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质或抑制细胞中溶血磷脂酸受体活性的物质或者溶血磷脂酸受体拮抗剂;所述抑制溶血磷脂酸生成的物质为阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质。
上述应用中,所述阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质优选为抑制ATX表达的物质或者抑制ATX活性的物质。
所述抑制ATX表达的物质优选为如下分子:GUGGACCAAUCUUCGACUATT;
所述抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质优选为如下(1)和/或(2)所示分子:(1)GAAAUGAGCGCCACCUUUATT;(2)GGUCAAUGCUGCUGUGUACTT。
上述应用中,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA;所述溶血磷脂酸抑制物为BrP-LPA;所述肿瘤细胞为结肠癌细胞或人乳腺癌细胞。
上述应用中,所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂和所述溶血磷脂酸抑制物独立包装;
上述应用中,所述结肠癌细胞优选为SW480细胞和/或colo320细胞;所述人乳腺癌细胞优选为MDA-MB-231细胞和/或MDA-MB-435细胞。所述ATX为ATX-β。
HDAC3和/或HDAC7在制备抑制细胞中ATX表达的产品中的应用也属于本发明的保护范围;HDAC3和HDAC7在抑制细胞中ATX表达中的应用也属于本发明的保护范围。
抑制细胞中ATX表达应用中,所述细胞为肿瘤细胞;所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA。
抑制细胞中ATX表达应用中,所述肿瘤细胞为结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、人肺癌细胞、卵巢癌细胞和/或前列腺癌细胞。
抑制细胞中ATX表达应用中,所述人乳腺癌细胞为MDA-MB-231,MCF-7、MDA-MB-468或MDA-MB-435;所述宫颈癌细胞为Hela;所述人肺癌细胞为A549;所述卵巢癌细胞为A2780,HEY或OCC1;所述前列腺癌细胞为PC3或Du145;所述结肠癌细胞为SW480细胞、colo320或HT-29。所述ATX为ATX-β。
组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备促进细胞中ATX表达的产品中的应用也属于本发明的保护范围;组蛋白去乙酰化酶抑制剂在促进细胞中ATX表达中的应用也属于本发明的保护范围。
上述促进细胞中ATX表达的应用中,所述细胞为肿瘤细胞;所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA。
上述促进细胞中ATX表达的应用中,所述肿瘤细胞为结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、人肺癌细胞、卵巢癌细胞和/或前列腺癌细胞。
上述促进细胞中ATX表达的应用中,所述人乳腺癌细胞为MDA-MB-231,MCF-7、MDA-MB-468或MDA-MB-435;所述宫颈癌细胞为Hela;所述人肺癌细胞为A549;所述卵巢癌细胞为A2780,HEY或OCC1;所述前列腺癌细胞为PC3或Du145;所述结肠癌细胞为SW480细胞、colo320或HT-29。所述ATX为ATX-β
本发明表明:HDACi可以在多种肿瘤细胞中通过抑制HDAC3和HDAC7的活性上调ATX表达。HDACi诱导产生的ATX通过催化LPC生成LPA,减弱了HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用。如果通过RNAi的方法抑制ATX表达,或者加入ATX-LPA信号通路抑制剂BrP-LPA阻断ATX-LPA信号,HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用都会进一步增强。本发明研究提出了溶血磷脂酸抑制物(所述溶血磷脂酸抑制物为抑制溶血磷脂酸与溶血磷脂酸受体结合的物质或抑制溶血磷脂酸生成的物质)和HDACi联合用药治疗肿瘤的新思路。本发明在肿瘤治疗中有广阔的应用前景。
附图说明
图1为TSA等组蛋白去乙酰化酶抑制剂诱导肿瘤细胞中ATX表达。
图2为HDACi通过抑制HDAC3和HDAC7的活性上调ATX表达。
图3为外源高表达HDAC7降低肿瘤细胞中ATX表达。
图4为ATX-LPA信号通路抑制HDACi诱导的肿瘤细胞凋亡。
图5为ATX-LPA信号通路抑制剂BrP-LPA进一步增强了HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
本文中检测的是肿瘤细胞,表达的全部为ATX-β,但是抑制剂针对的是所有ATX,HDACi也可以诱导所有ATX表达。
5-Aza-2’-deoxycytidine(Aza),trichostatin A(TSA),sodium butyrate(NaB),Valproicacid(VPA)购自sigma(Saint Louis,MI,USA)。ATX-LPA信号通路抑制剂1-Bromo-3(S)-hydroxy-4-(palmitoyloxy)butylphosphonate(BrP-LPA),ATX荧光底物FS-3购自Echelon Bioscience(Salt Lake City,USA)。18∶1 LPC,18∶1 LPA购自Avanti PolarLipid Inc(Albaster,AL)。所有siRNA均由上海genepharma公司合成,用lipofectamine2000(Invitrogen)转染入细胞。
Vehicle是溶解LPC,LPA的溶剂,为氯仿/甲醇2∶1混合物,氯仿、甲醇均购自北京北化精细化学品有限责任公司。
公开过MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468、MDA-MB-435、PC3、Du145细胞的文献:Cyr61 is up-regulated in prostate cancer and associated with the p53 gene status,Journal of Cellular Biochemistry Volume 106,Issue 4,pages 738-744,1March 2009。
公开过A2780,HEY,OCC1细胞的文献:Lysophosphatidic acid activates telomerase in ovarian cancer cells through hypoxia-inducible factor-1α and the PI3K pathway.Journalof Cellular Biochemistry Volume 105,Issue 5,pages 1194-1201,1 December 2008。
公开过Hela,A549,colo320,HT-29,SW480细胞的文献:Autotaxin Is Overexpressed in Glioblastoma Multiforme and Contributes to Cell Motility of Glioblastoma by Converting Lysophosphatidylcholine TO Lysophosphatidic June 23,2006 The Journal of Biological Chemistry,281,17492-17500.
公众可从北京师范大学获得如下细胞:人乳腺癌细胞:MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468、MDA-MB-435;宫颈癌细胞:Hela;人肺癌细胞:A549;卵巢癌细胞:A2780,HEY,OCC1;前列腺癌细胞:PC3,Du145。结肠癌细胞系colo320,HT-29或SW480。
基因敲除的方法:在genepharma公司合成siRNA,利用lipofectamine2000(invitrogen)转入肿瘤细胞48小时,提取细胞RNA,检测ATX表达。靶基因对应的siRNA靶序列分别为:
ATX:GUGGACCAAUCUUCGACUA;
LPA1:GAAAUGAGCGCCACCUUUA;
LPA2:GGUCAAUGCUGCUGUGUAC;
HDAC1:GCUUCAAUCUAACUAUCAA;
HDAC3:GCCGGUUAUCAACCAGGU A;
HDAC4:CGUCAACAUGGCUUUCACC;
HDAC7:UCACUGACCUCGCCUUCAA;
对照组(NC):UUCUCCGAACGUGUCACGU.
直接向细胞中转入如下序列的单链分子,进行基因敲除实验:
ATX:GUGGACCAAUCUUCGACUATT;
LPA1:GAAAUGAGCGCCACCUUUATT;
LPA2:GGUCAAUGCUGCUGUGUACTT;
HDAC1:GCUUCAAUCUAACUAUCAATT;
HDAC3:GCCGGUUAUCAACCAGGU ATT;
HDAC4:CGUCAACAUGGCUUUCACCTT;
HDAC7:UCACUGACCUCGCCUUCAATT;
对照组(NC):UUCUCCGAACGUGUCACGUTT.
实验中所用细胞培养基为:SW480,MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468,Hela,A549,MDA-MB-435细胞培养于DMEM培养基中(10%胎牛血清);A2780,HEY,OCC1,PC3,Du145和colo320细胞培养于RPMI-1640培养基中(10%胎牛血清)。在检测LPC,LPA对细胞凋亡的影响实验中,为排除血清中LPC,ATX和LPA对实验的干扰,细胞培养于无血清培养基中(含有250μg/mlBSA)。细胞培养条件37℃、5%CO2。
ATX溶血磷脂酶D活性检测:取50μl浓缩30倍的细胞上清与10μM的ATX荧光底物FS-3混合,在37度反应4小时,检测荧光强度(494nm excitation,520nmemission)。检测到的荧光强度即为ATX的溶血磷脂酶D活性,将对照组的相对活性定位1,其它组的活性与对照组的荧光强度比值,即为ATX的相对活性。
RNA提取及RT-PCR:利用Trizol(Invitrogen)提取肿瘤细胞RNA,并用反转录酶试剂盒合成cDNA(Promega)。利用特异引物进行Real-time RT-PCR检测,选取GAPDH为内参。
检测ATX、LPA1和LPA2的引物如下,所有引物也可用于Real-time RT-PCR检测。
ATX:sense-TATGCTTCGGAAAGAAATGGAG;
antisense-ATGTTCAAT GTCACGCACCCT;
GAPDH:sense-TTAGCACCCCTGTCCAAGG;
antisense-CCTACTCCTTGGAGGCCATG;
HDAC3:sense-TGATGACCAGAGTTACAAGCAC;
antisense-GGGCAACATTTCGGACA;
HDAC7:sense-GGATTTGATGCTGCTGAGGG;
antisense-CCACAGAGAGGGACGCCAG;
LPA1:sense-CGGCGGGTAGTGGTGGTC;
antisense-GTCGCGGTAGGAGTAAATGATG;
LPA2:sense-GTCGAGCCTGCTTGTCTTCC;
antisense-CCAGGAGCAGTACCACCTG.
Western检测ATX表达中使用的一抗为本实验室自己制备,制备方法参考如下两片文献:(1)Lipopolysacchide Induces Autotaxin Expression in Human Monocytic THP-1Cells,Biochemical and Biophysical Research Communications Volume 378,Issue 2,9January 2009,Pages 264-268。(2)Autotaxin多克隆抗体的制备《细胞与分子免疫学杂志》2008年12期。抗原为:Genebank accession number:AAH34961.1所示的ATX 58-157位氨基酸与His6融合后在E.coli BL21中进行原核表达纯化后的蛋白,用其免疫家兔得到抗体。
下述实施例中加药物处理时,药物浓度均是药物在培养体系中的浓度(即培养体系中药物终浓度)。
检测细胞凋亡率的方法为:收集细胞,将细胞固定于70%冷酒精中24小时。之后利用PI染色,利用流式细胞术检测细胞Sub-G1期比例,定量凋亡细胞比例。
数据统计:两组数值间的差异利用t检验,(*)p<0.005,(**)p<0.001。
实施例1、肿瘤细胞对HDACi的抗性机理
一、HDACi诱导ATX在肿瘤细胞中表达
(一)为了检测肿瘤细胞中ATX的表达是否受到表观遗传修饰,利用甲基化酶抑制剂(Aza)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(TSA)处理ATX不表达的结肠癌SW480细胞。
培养SW480细胞至单层(约70%满),加TSA,处理24小时,用Trizol裂解细胞,提取RNA;利用RT-PCR检测ATX mRNA表达。
设如下处理组:
Aza-TSA-:不加药。
Aza+TSA-:加Aza(5μM),不加TSA。
Aza-TSA+:不加Aza,加TSA(100nM)。
Aza+TSA+:加Aza(5μM),加TSA(100nM)。
结果:TSA可以诱导ATX表达(图1a)。Aza不诱导ATX表达。说明肿瘤细胞中调控ATX的表达不受到甲基化调控,主要受乙酰化调控。
(二)不同浓度TSA处理SW480细胞,RT-PCR和Western检测ATX表达;
培养SW480细胞至单层,加不同浓度TSA(0、1、10、100、250nM),处理24小时,裂解细胞,提取RNA和细胞总蛋白;利用RT-PCR检测ATX mRNA表达,Western检测ATX表达。
结果:TSA诱导ATX mRNA和蛋白在SW480细胞中表达呈剂量梯度(图1b)。
(三)TSA处理SW480细胞不同时间,Real-time RT-PCR和Western检测ATX表达
培养SW480细胞至单层,加不同浓度TSA(100nM),处理6、12、24小时,裂解细胞,提取RNA和细胞总蛋白;利用RT-PCR检测ATX mRNA表达,Western检测ATX表达。
结果:TSA诱导ATX mRNA和蛋白在SW480细胞中表达呈时间梯度(图1c)。
(四)TSA处理SW480细胞不同时间,利用ATX荧光底物FS-3检测ATX活性
培养SW480细胞至单层,加TSA(100nM),处理0、6、12、24小时,裂解细胞;利用ATX荧光底物FS-3检测ATX活性。
结果:ATX溶血磷脂酶D的活性(即催化LPA生成的活性)也随着药物处理时间的增长逐渐升高(图1d)。
(五)不同HDACi VPA(1mM),NaB(1mM),TSA(100nM)处理SW480细胞24小时,利用Real-time RT-PCR检测ATX表达
培养SW480细胞至单层,分别加不同种HDACi(TSA 100nM,VPA 1mM,NaB 1mM),处理24小时,裂解细胞,提取RNA;利用RT-PCR检测ATX mRNA表达。
结果:TSA,VPA和NaB均可以诱导ATX在SW480细胞中表达(图1e)。
(六)TSA处理不同肿瘤细胞24小时,RT-PCR检测ATX表达
培养不同肿瘤细胞至单层,加TSA(100nM),处理24小时,裂解细胞,提取RNA;利用RT-PCR检测ATX mRNA表达。
肿瘤细胞分别为:人乳腺癌细胞:MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468;宫颈癌细胞:Hela;人肺癌细胞:A549;卵巢癌细胞:A2780,HEY,OCC1;前列腺癌细胞:PC3,Du145。
按照如上方法检测VPA和NaB在如上肿瘤细胞中诱导ATX表达。
结果:TSA(图1f),VPA和NaB可以在多种肿瘤细胞中诱导ATX表达。
以上实验均设3次重复,结果均一致。
实验一证明,HDACi诱导ATX在肿瘤细胞中表达。
二、HDACi通过抑制HDAC3和HDAC7的活性上调ATX表达
(一)基因敲除实验
1、敲除SW480细胞中HDAC分子后,再RT-PCR检测ATX表达。按照敲除的HDAC分子种类,共设如下组:HDAC1和HDAC4、HDAC1和HDAC7、HDAC3和HDAC4、HDAC3和HDAC7。结果如图2a。
2、敲除SW480细胞中HDAC3和HDAC7后,用Real-time RT-PCR和Western检测ATX表达。结果如图2b。
3、在不同肿瘤细胞中敲除HDAC3和HDAC7,用Real-time RT-PCR检测ATX表达。以未敲除的为对照。结果图2c。
结果:敲除HDAC3和HDAC7的细胞中ATX表达显著上调。敲除其它HDAC均不能上调ATX表达(图2a,图2b)。在Hela,MDA-MB-231,A2780和Du145等肿瘤细胞中,敲除HDAC3和HDAC7后,ATX表达显著上调(图2c)。
以上实验均设3次重复,结果均一致。
(二)过表达实验
1、检测肿瘤细胞中HDAC7的表达与ATX表达呈现负相关
Western检测13种肿瘤细胞中HDAC3,HDAC7的表达,RT-PCR检测ATX表达。
结果:在很多肿瘤细胞中HDAC7的表达与ATX表达呈现负相关。例如,在HDAC7低表达的MDA-MB-435和colo320细胞中,ATX高表达;反之,在HDAC7高表达的肿瘤细胞中,ATX均低表达(图3a)。图3A中,1-3,乳腺癌细胞MDA-MB-231,MCF-7,MDA-MB-468;4,宫颈癌细胞Hela;5,肺癌细胞系A549;6-8,卵巢癌细胞系A2780,HEY,OCC1;9-10前列腺癌细胞PC3和Du145;11,乳腺癌细胞系MDA-MB-435;12-13,结肠癌细胞系colo320,HT-29)。
2、过表达
在Du145,colo320和MDA-MB-435中外源表达HDAC7,Real-time RT-PCR检测ATX表达。
在Du145,colo320和MDA-MB-435细胞中转染HDAC3siRNA或者对照siRNA,48小时后转染HDAC7表达质粒,利用real-time RT-PCR检测ATX表达。
外源表达HDAC7的方法:将HDAC7表达质粒(pCMX-1F-mHDAC7(wild type))利用lipofectamine2000(Invitrogen)转入肿瘤细胞,48小时后检测ATX表达。HDAC7表达质粒在如下文献中公开过,公众可从北京师范大学获得:Li,X.,Song,S.,Liu,Y.,Ko,S.H.,and Kao,H.Y.(2004)The Journal of biological chemistry 279(33),34201-34208。
结果:在ATX高表达的肿瘤细胞中过表达HDAC7,可以下调ATX(图3b)。同时,HDAC7调控ATX表达依赖于HDAC3的表达(图3c)。
以上实验均设3次重复,结果均一致。
实验二表明,HDAC3和HDAC7可以联合抑制许多肿瘤细胞中ATX表达。HDACi通过抑制HDAC3和HDAC7上调了ATX表达。
三、HDACi诱导的ATX产生拮抗HDACi诱导的细胞凋亡
(一)HDACi诱导肿瘤细胞凋亡
不同浓度的TSA(0、50、100、250、500nM)处理SW480细胞24小时,检测细胞凋亡率。结果:SW480细胞是一个HDACi敏感的肿瘤细胞,30%的细胞在TSA(250nM,24hrs)处理后发生凋亡(图4a)。
(二)在LPC,LPA存在的条件下,TSA处理SW480细胞24小时,检测细胞凋亡率
培养SW480细胞至单层,加药物处理24小时,收集细胞;检测细胞凋亡率。
设如下处理组:
TSA-LPC-LPA-:不加任何药物。
TSA-LPC+LPA-:加LPC,100μM。
TSA-LPC-LPA+:加LPA,5μM。
TSA+LPC-LPA-:加TSA,250nM。
TSA+LPC+LPA-:加TSA,250nM。加LPC,100μM。
TSA+LPC-LPA+:加TSA,250nM。加LPA,5μM。
结果:当加入ATX的底物LPC(100μM)或者催化产物LPA(5μM)后,凋亡被抑制(图4b)。
(三)抑制ATX的细胞经TSA处理后的细胞凋亡
在genepharma公司合成siRNA,利用lipofectamine2000(invitrogen)转入SW480细胞48小时后,利用TSA与不同脂类(不加入脂类,LPC,LPA)共处理SW480细胞24小时,检测细胞凋亡。
实验设如下处理:
siNC+siATX-TSA-Vehicle+:转染siNC(25nM),加Vehicle。
siNC-siATX+TSA-Vehicle+:转染siATX(25nM),加Vehicle。
siNC+siATX-TSA+Vehicle+:转染siNC(25nM),加Vehicle,加TSA(250nM)。
siNC-siATX+TSA+Vehicle+:转染siATX(25nM),加Vehicle,加TSA(250nM)。
siNC+siATX-TSA-LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100μM)。
siNC-siATX+TSA-LPC+:转染siATX(25nM),加LPC(100μM)。
siNC+siATX-TSA+LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100uM),加TSA(250nM)。
siNC-siATX+TSA+LPC+:转染siATX(25nM),加LPC(100uM),加TSA(250nM)。
siNC+siATX-TSA-LPA+:转染siNC(25nM),加LPA(5μM)。
siNC-siATX+TSA-LPA+:转染siATX(25nM),加LPA(5μM)。
siNC+siATX-TSA+LPA+:转染siNC(25nM),加LPA(5μM),加TSA(250nM)。
siNC-siATX+TSA+LPA+:转染siATX(25nM),加LPA(5μM),加TSA(250nM)。
结果:图4C中上图为了检测RNAi效果,即转染ATX siRNA组,TSA诱导的ATX表达被明显减弱。
在有ATX底物LPC存在的条件下,siATX组凋亡细胞明显多于对照组;在没有脂类分子存在的情况,或者存在ATX产物LPA的情况下,siATX组与对照组没有区别。用ATX siRNA抑制ATX表达后,LPC阻止细胞凋亡的能力降低,而LPA还可以阻滞HDACi诱导的细胞凋亡(图4c)。从而说明,HDACi诱导ATX表达后,ATX通过催化LPC生成LPA,减弱HDACi诱导细胞凋亡的能力。如果在HDACi诱导肿瘤细胞凋亡的同时,抑制ATX的表达,即抑制LPA的产生,会增强HDACi诱导肿瘤凋亡的能力。
(四)SW480细胞中LPA受体表达及抑制
1、利用Real-time RT-PCR检测SW480细胞中LPA受体表达。
2、利用siRNA敲除受体LPA2,在有LPC或LPA存在的情况下,TSA处理SW480细胞24小时,检测肿瘤细胞凋亡率。
设如下处理组:
siNC+siLPA2-TSA-LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100μM)。
siNC-siLPA2+TSA-LPC+:转染siLPA2(25nM),加LPC(100μM)。
siNC+siLPA2-TSA+LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100μM),加TSA(250nM)。
siNC-siLPA2+TSA+LPC+:转染siLPA2(25nM),加LPC(100μM),加TSA(250nM)。
siNC+siLPA2-TSA-LPA+:转染siNC(25nM),加LPA(5μM)。
siNC-siLPA2+TSA-LPA+:转染siLPA2(25nM),加LPA(5μM)。
siNC+siLPA2-TSA+LPA+:转染siNC(25nM),加LPA(5μM),加TSA(250nM)。
siNC-siLPA2+TSA+LPA+:转染siLPA2(25nM),加LPA(5μM),加TSA(250nM)。
结果:SW480细胞主要表达LPA受体LPA2,利用siRNA敲除LPA2,在有LPC或LPA存在的情况下,LPC和LPA抑制HDACi诱导细胞凋亡的能力下降,凋亡明显增多(图4d);说明阻断外源LPA与受体LPA2结合,可使肿瘤细胞凋亡增多;或阻断(细胞微环境中,脂类催化反应在胞外进行)LPC产生的LPA与受体LPA2结合,可使肿瘤细胞凋亡增多;即阻断LPA信号通路(即阻断LPA信号进入细胞)也可增加肿瘤细胞凋亡。
(五)MDA-MB-231细胞中LPA受体表达及抑制
1、利用Real-time RT-PCR检测MDA-MB-231细胞中LPA受体表达。
2、利用siRNA分别敲除ATX或受体LPA1,在有LPC的情况下,TSA处理MDA-MB-231细胞24小时,检测肿瘤细胞凋亡率。
设如下处理组:
siNC+siATX-siLPA1-TSA-LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100μM)。
siNC-siATX+siLPA1-TSA-LPC+:转染siATX(25nM),加LPC(100μM)。
SiNC-siATX-siLPA1+TSA-LPC+:转染siLPA1(25nM),加LPC(100μM)。
SiNC+siATX-siLPA1-TSA+LPC+:转染siNC(25nM),加LPC(100μM),加TSA(250nM)。
SiNC-siATX+siLPA1-TSA+LPC+:转染siLPA1(25nM),加LPC(100μM),加TSA(250nM)。
SiNC-siATX-siLPA1+TSA+LPC+:转染siLPA1(25nM),加LPC(100μM),加TSA(250nM)。
结果:在MDA-MB-231细胞,主要表达LPA受体LPA1。敲除ATX或LPA1,LPC抑制细胞凋亡的能力也显著下降,凋亡明显增多(图4e)。敲除ATX,说明抑制了由ATX介导的LPC生成LPA的途径,降低了LPA的产生(即降低了肿瘤细胞微环境内LPA的浓度),从而使凋亡增多。敲除LPA1,说明阻断(细胞微环境中,脂类催化反应在胞外进行)LPC途径产生的LPA与受体LPA1结合,可使肿瘤细胞凋亡增多。HDACi诱导的肿瘤细胞凋亡也可以被LPC,LPA抑制。
实验三中各实验均设3次重复,结果均一致。
用VPA或NaB替换TSA进行实验三中(一)至(五)实验,均得到与TSA一样的结果。即VPA,NaB等HDACi诱导的肿瘤细胞凋亡也可以被LPC,LPA抑制。当在不同肿瘤细胞中敲除ATX或者LPA受体之后,这种抑制作用也随之解除。
实验三说明HDACi诱导ATX在肿瘤细胞中表达是一种肿瘤自身的抗药性机制,ATX通过催化LPC生成LPA帮助肿瘤细胞存活。敲除ATX以及相应LPA受体的表达可以增强HDACi杀伤肿瘤细胞的能力。
实施例2、使用ATX-LPA信号通路抑制剂BrP-LPA联合HDACi用药提高HDACi杀伤肿瘤的能力
已有研究表明,10μM BrP-LPA(ATX-LPA信号通路抑制剂)可以抑制ATX活性(94%10μM),以及LPA受体的活性(LPA1:1.5μM,LPA2:1.4μM,LPA3:1.2μM,LPA4:0.27μM)。
1、用SW480细胞做实验
BrP-LPA预处理SW480细胞1小时,在没有脂类分子,LPC或者LPA存在的基础上,TSA处理SW480细胞24小时,检测肿瘤细胞凋亡。
实验设如下各组:
BrP-LPA-TSA-Vehicle+:不用药物处理,加Vehicle。
BrP-LPA+TSA-Vehicle+:用BrP-LPA处理(10μM),加Vehicle。
BrP-LPA-TSA+Vehicle+:用TSA处理(250nM),加Vehicle。
BrP-LPA+TSA+Vehicle+:用BrP-LPA(10μM)和TSA(250nM)处理,加Vehicle。
BrP-LPA-TSA-LPC+:不用药物处理,加LPC(100μM)。
BrP-LPA+TSA-LPC+:用BrP-LPA处理(10μM),加LPC(100μM)。
BrP-LPA-TSA+LPC+:用TSA处理(250nM),加LPC(100μM)。
BrP-LPA+TSA+LPC+:用BrP-LPA(10μM)和TSA(250nM)处理,加LPC(100μM)。
BrP-LPA-TSA-LPA+:不用药物处理,加LPA(5μM)。
BrP-LPA+TSA-LPA+:用BrP-LPA处理(10μM),加LPA(5μM)。
BrP-LPA-TSA+LPA+:用TSA处理(250nM),加LPA(5μM)。
BrP-LPA+TSA+LPA+:用BrP-LPA(10μM)和TSA(250nM)处理,加LPA(5μM)。
2、方法与实验1中相同,不同的是实验细胞为MDA-MB-435细胞。
3、方法与实验1中相同,不同的是实验细胞为colo320细胞。
结果:BrP-LPA单独处理SW480细胞不能诱导细胞凋亡,但当BrP-LPA与TSA共同处理肿瘤细胞之后(LPC或LPA存在的基础上),与TSA单独处理组相比,肿瘤细胞死亡率进一步提高;在有LPC和LPA存在的条件下,BrP-LPA增强了HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用(图5a)。在ATX高表达的肿瘤细胞colo320和MDA-MB-435中,这些细胞本身具有一定的HDACi抗性,但当利用BrP-LPA与HDACi联合用药之后,肿瘤细胞凋亡率显著升高;在有LPC和LPA存在的条件下,BrP-LPA增强了HDACi对肿瘤细胞的杀伤作用(图5b和图5c)。
利用BrP-LPA与HDACi其余两种抑制剂VPA和NaB共同处理多种肿瘤细胞,得到与图5相类似的结果。说明利用ATX-LPA信号通路抑制剂与HDACi联合用药可以进一步提高HDACi杀伤肿瘤的功效。
各实验均设3次重复,结果均一致。
ATX是体内产生LPA的脂酶,而LPA作为一个重要的生物活性磷脂可以促进细胞的增殖、存活和迁移。ATX-LPA信号通路在肿瘤的发生发展过程中起到关键作用。研究者发现,ATX在一些肿瘤细胞中高表达,对于它们的侵袭和迁移都有关键作用。但是,在其它很多肿瘤细胞中ATX低表达。本发明研究发现,HDAC3和HDAC7可以在许多肿瘤细胞中联合抑制ATX表达,TSA等HDACi通过抑制HDAC3和HDAC7的活性上调ATX的表达。
HDAC调节肿瘤的发生发展,而HDAC抑制某些基因的表达被认为是一个重要的癌症发生机制。因此HDAC抑制剂被广泛应用于肿瘤的治疗。但是一些肿瘤对于HDACi具有抗药性,这也成为了HDACi治疗肿瘤的一大瓶颈。本发明研究揭示了一种肿瘤细胞对于HDACi的抗药性机制,即被HDACi诱导产生的ATX通过催化LPC生成LPA,LPA通过不同肿瘤细胞特异的LPA受体将信号传递进细胞,保护肿瘤细胞免于凋亡。如果利用ATX-LPA信号通路抑制剂BrP-LPA联合TSA、NaB和VPA等HDACi用药,可以提高HDACi杀伤肿瘤细胞的功效。
Claims (10)
1.一种预防和/或治疗肿瘤的组合物,由组蛋白去乙酰化酶抑制剂和溶血磷脂酸抑制物组成;所述溶血磷脂酸抑制物为阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质和/或抑制溶血磷脂酸生成的物质。
2.由组蛋白去乙酰化酶抑制剂和溶血磷脂酸抑制物组成的组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的产品中的应用;所述溶血磷脂酸抑制物为阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质和/或抑制溶血磷脂酸生成的物质。
3.根据权利要求1所述的组合物或权利要求2所述的应用,其特征在于:
所述阻断溶血磷脂酸信号进入细胞的物质为抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质或抑制细胞中溶血磷脂酸受体活性的物质或者溶血磷脂酸受体拮抗剂;
所述抑制溶血磷脂酸生成的物质为阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质。
4.根据权利要求1或3所述的组合物或权利要求2或3所述的应用,其特征在于:
所述阻断ATX介导溶血磷脂酸生成途径的物质为抑制ATX表达的物质或者抑制ATX活性的物质;
所述抑制ATX表达的物质或者抑制ATX活性的物质为如下分子:GUGGACCAAUCUUCGACUATT;
所述抑制细胞中溶血磷脂酸受体表达的物质为如下(1)和/或(2)所示分子:(1)GAAAUGAGCGCCACCUUUATT;(2)GGUCAAUGCUGCUGUGUACTT;
所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA;
所述溶血磷脂酸抑制物为BrP-LPA;
所述肿瘤细胞为结肠癌细胞或人乳腺癌细胞。
5.根据权利要求1或3或4所述的组合物或权利要求2或3或4所述的应用,其特征在于:所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂和所述溶血磷脂酸抑制物独立包装或混合包装;
所述结肠癌细胞优选为SW480细胞和/或colo320细胞;所述人乳腺癌细胞优选为MDA-MB-231细胞和/或MDA-MB-435细胞。
6.HDAC3和/或HDAC7在制备抑制细胞中ATX表达的产品中的应用;HDAC3和/或HDAC7在抑制细胞中ATX表达中的应用。
7.组蛋白去乙酰化酶抑制剂在制备促进细胞中ATX表达的产品中的应用;组蛋白去乙酰化酶抑制剂在促进细胞中ATX表达中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用,其特征在于:所述细胞为肿瘤细胞;
所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为TSA、NaB和/或VPA。
9.根据权利要求6-8中任一所述的应用,其特征在于:所述肿瘤细胞为结肠癌细胞、人乳腺癌细胞、宫颈癌细胞、人肺癌细胞、卵巢癌细胞和/或前列腺癌细胞。
10.根据权利要求6-9中任一所述的应用,其特征在于:
所述人乳腺癌细胞为MDA-MB-231,MCF-7、MDA-MB-468或MDA-MB-435;所述宫颈癌细胞为Hela;所述人肺癌细胞为A549;所述卵巢癌细胞为A2780,HEY或OCC1;所述前列腺癌细胞为PC3或Du145;所述结肠癌细胞为SW480细胞、colo320或HT-29。
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