CN101501071A - 对溶血磷脂酸具有反应性的免疫衍生部分 - Google Patents
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Abstract
描述了制备对生物活性脂质靶具有反应性的单克隆抗体及其衍生物的组合物和方法。这些组合物包括衍生的脂质,每一个组合物都包含有一个极性头基团团和至少一个烃链(例如,溶血脂质诸如溶血磷脂酸或鞘氨醇-1-磷酸)的生物活性脂质,其中碳原子用悬垂反应基团进行衍生;通过连接衍生的脂质与载体部分(即,载体蛋白、聚乙二醇、胶体金、藻酸盐或有机硅珠)制备免疫原;通过用所述免疫原免疫动物来产生单克隆抗体和衍生物;含有所述抗体和抗体衍生物的治疗和诊断组合物。还描述了制备所述衍生脂质、免疫原以及单克隆抗体和衍生物的方法,检测所述抗体一旦产生的方法,和使用所述抗体和衍生物的治疗和检测方法。
Description
政府资助
本发明至少部分由美国政府依据拨款申请NCI 2R44CA110298-2提供的基金资助。因此,美国政府在本文所述的发明中具有的某些权利。
相关申请
本专利申请要求2006年5月31日提交的美国临时专利申请序列号60/810,185(代理人案号LPT-3100-PV),2006年8月4日提交的美国临时专利申请序列号60/835,569(代理人案号LPT-3100-PV2)和2007年4月16日提交的美国临时专利申请序列号60/923,644(代理人案号LPT-3100-PV3)的优先权。出于任何和所有目的,将这些申请以引用方式整体并入本文。
背景技术
本发明涉及单克隆抗体,和生产抗免疫原抗体的方法,所述免疫原包括在人和/或动物疾病中起信号分子作用的生物活性脂分子。可用于本发明的一类具体的信号传导生物活性脂质是溶血脂质(lysolipid)。尤其优选的信号传导溶血脂质是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)和多种溶血磷脂酸(LPA)。可以进一步修饰本发明的抗体以使它们适用于具体的动物物种(包括人),而不引起中和免疫应答。通过递送含有所述抗体(单独地或与其他治疗剂和/或治疗组合)的药物组合物,所述抗体、及其衍生物和变体可用于治疗和/或预防多种疾病或障碍。此外,所述抗体还可用于检测生物样品中的生物活性信号传导脂质,由此为许多目的提供有用的信息,所述目的包括但不限于疾病的诊断和/或预后,新治疗形式的发现和开发,所述治疗形式修饰具体靶向的脂质的产生和/或作用。受本发明组合物作用的疾病或病况包括,但不限于以过度增殖、血管生成、炎症、纤维化和/或细胞凋亡作为其部分潜在病理的疾病。
发明背景
1.介绍
下述描述包括对理解本发明有用的信息。不承认任何所述信息为现有技术,或与目前要求保护的发明有关,或者任何明确引用或暗示引用的出版物为现有技术或甚至与目前要求保护的发明具体相关。
2.背景
A.生物活性信号传导脂质
目前认为脂质及其衍生物是医学研究的重要靶标,但并不仅仅为细胞膜中的简单结构元件、增溶剂、维生素或激素的原料、或作为β-氧化、醣酵解或其他代谢过程的能量来源。尤其是,某些生物活性脂质发挥在动物和人疾病中重要的信号传导介体的作用。虽然质膜的大多数脂质只起结构作用,但它们中的小部分涉及胞外刺激向细胞内的传送。“脂类的信号传导”指使用生物活性脂质作为第一或第二信使的许多细胞信号传导通路中任一个,包括脂类信号分子与其自身特异性受体的直接相互作用。脂质信号传导通路由多种胞外刺激激活,所述胞外刺激的范围从生长因子到炎性细胞因子;并调节细胞命运决定,诸如细胞凋亡、分化和增殖。关于生物活性脂质信号传导的研究为科学研究的热门领域,因为越来越多的生物活性脂质被鉴定并且其作用被表征。
生物活性脂质的实例包括衍生自花生四烯酸的类二十烷酸(包括类二十烷酸代谢物,诸如HETE、大麻素(cannabinoids)、白三烯、前列腺素、脂氧素、环氧二十碳三烯酸和异类二十烷酸)、非-类二十烷酸大麻素介体、磷脂及其衍生物(诸如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG)和心磷脂)以及溶血磷脂诸如溶血磷脂酰胆碱(LPC)和多种溶血磷脂酸(LPA)。生物活性信号传导脂质类介体还包括鞘脂类,诸如神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸酯、鞘氨醇、二氢鞘氨醇、鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。鞘脂类及其衍生物代表一组对重要的细胞过程具有多效效应的胞外和胞内信号传导分子。生物活性信号传导脂质的其他实例包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、二脂酰甘油(DG)、硫苷脂、神经节苷脂和脑苷脂。
如预期的,生物学脂质(即,天然存在特别是存在于活的有机体内的脂质)通常是非-免疫原性的或非常弱的免疫原性的。就其本身而言,传统上认为脂质是对于基于抗体的治疗和诊断/预后方法的弱靶标。本文包括的一篇文献报导了一种单克隆抗体,其靶向与载体蛋白偶联的磷脂酰丝氨酸(PS)的衍生形式。磷脂酰丝氨酸是质膜氨磷脂。膜脂质侧的丧失,特别是磷脂酰丝氨酸在细胞表面的出现,导致改变的表面性质的表达,所述表面性质其调节细胞功能并影响细胞与其环境的相互作用[Zwaal and Schroit,(1997)Blood,89:1121-1132]。例如,在细胞凋亡过程中PS从细胞膜的内叶(其正常位置)重新分配到外叶。
Diaz,Balasubramanian和Schroit[Bioconj.Chem.(1998)9:250-254]公开了引起针对PS的特异性免疫应答的脂质抗原的制备。PS与蛋白载体(BSA)通过脂质的脂肪酰基侧链的共价偶联保护PS头基团作为表位的完整性。Schroit(美国专利6,300,308、美国专利6,806,354)公开了与磷脂酰丝氨酸(PS)或磷脂酰胆碱(PC)/多肽或PS/多肽缀合物特异性结合的抗体,所述抗体通过给动物施用PS/多肽缀合物或PC/多肽缀合物来制备。还公开了PS、PC/多肽或PS/多肽缀合物的检测方法。还公开了通过给动物施用含有PS/多肽偶联组合物的药学组合物来制备特异性结合PS的抗体的方法,以及在施用了所述缀合物的动物中治疗癌症的方法,即,作为癌症疫苗。还公开了通过β2-糖蛋白I/脂质复合物(即,非共价相连的脂质和糖蛋白)免疫动物来引入自身免疫性以用于癌症治疗。作者断言若干自身免疫应答针对β2-糖蛋白I/脂复合物(引用Schousboe,(1979)Biochim.Biophys.Acta,579:396-408),因此抗-复合物应答的产生可能代表在癌症治疗中的实质性突破。
Thorpe,Schroit等人描述了单克隆抗体(3G4),其在血清或血清蛋白β2-糖蛋白I(β2-GPI)存在下结合阴离子磷脂。Luster等人,J.Biol.Chem.281:29863-29871。首先描述为特异性靶向阴离子磷脂的抗体,其定位于小鼠肿瘤中的血管内皮细胞。Ran等人(2005)Clin.Cancer Res.11:1551-1562。随后,显示所述抗体与在肿瘤血管上的阴离子磷脂和β 2-GPI的复合物结合,使得与PS结合的抗体依赖于β2-GPI。Huang等人(2005)Cancer Res.65:4408-4416。所述抗体通过β 2GPI的二聚化来增强β 2-GPI与内皮细胞的结合。事实上,人造β 2-GPI二聚体甚至能在抗体不存在时与内皮细胞膜结合。Luster等人,J.Biol.Chem.281:29863-29871。3G4的人源化形式(Tarvacin,Bavituximab)在临床试验中用于治疗癌症和病毒病。
Thorpe等人(WO 2004/006847)公开了与PS结合并且与抗体3G4竞争结合PS的抗体、其片段或免疫缀合物。Thorpe等人(US6,818,213、US 6,312,294和US 6,783,760)公开了与氨基磷脂结合并具有连接的治疗剂的治疗性缀合物。
Baldo等人(美国专利5,061,626)公开了血小板活化因子(PAF)的抗体,用于生产抗体的PAF类似物和使用PAF或PAF类似物的免疫测定。PAF是胆碱缩醛磷脂,其中甘油的C-2(sn2)位置用乙酰基而不是长链脂肪酸进行酯化。
Vielhaber等人报导表征了两种据认为对神经酰胺具有特异性的抗体试剂,一个是IgM-富集的多克隆小鼠血清和另一个是IgM单克隆抗体。发现所述单克隆抗体对鞘磷脂具有特异性并且发现抗血清在纳摩尔范围内与多种神经酰胺类反应(Vielhaber,G.等人,(2001)Glycobiology 11:451-457)。Krishnamurthy等人最近报导了抗神经酰胺的兔IgG的制备,还引证了商购可获得的抗神经酰胺抗体试剂的缺乏(J.Lipid Res.(2007)48:968-975)。
B.溶血脂质
由于在一个或两个可能的乙酰化位置没有乙酰基,溶血脂质为含有极性头基团和单一烃支架的低分子量脂质。相对于在sn-3的极性头基团,所述烃链可以在sn-2和/或sn-1位置(术语“溶血的(lyso)”最初涉及溶血,已经被IUPAC重新定义为指脱酰作用)。参见“Nomenclature of Lipids,www.chem.qmul.ac.uk/iupac/lipid/lipln2.html。这些脂质代表信号传导的生物活性脂质,和其生物学和医学的重要亮点,其可以通过靶向用于治疗、诊断/预后或研究目的的脂信号传导分子来实现(Gardell,等人(2006),Trendsin Molecular Medicine,vol 12:65-75)。医学上重要的溶血脂质的两个具体实例为LPA(甘油支架)和S1P(鞘氨醇类支架)。其他溶血脂质包括鞘氨醇、溶血磷脂酰胆碱(LPC)、鞘氨醇磷脂酰胆碱(溶鞘磷脂)、神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸酯,二氢鞘氨醇(二氢鞘氨醇(dihydrosphingosine))、二氢鞘氨醇-1-磷酸和N-乙酰-神经酰胺-1-磷酸酯。相反,在C-1(sn1)含有O-烷基(-O-CH2-)或O-烯基醚且在C-2含有酰基的缩醛磷脂,不属于溶血脂质类。
所选的LPA、S1P和二氢S1P的结构表示如下。
LPA不是一个单一的分子实体,而是具有多种长度和多种饱和度的脂肪酸的内源性结构变体的集合(Fujiwara,等人(2005),J BiolChem,vol.280:35038-35050)。LPA的结构支架衍生自基于甘油的磷脂诸如磷脂酰胆碱(PC)或磷脂酸(PA)。在溶血鞘脂诸如S1P的情况下,神经酰胺支架在sn-2处脂肪酸缺失。S1P、二氢S1P(DHS1P)和鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC)的支架结构基于衍生自神经鞘磷脂的鞘氨醇。
LPA和S1P通过结合同一类的多跨膜区G蛋白偶联受体(GPCR)来调节多种细胞信号传导通路(Chun J,Rosen H(2006),CurrentPharm Des,vol.12:161-171,and Moolenaar,WH(1999),Experimental Cell Research,vol.253:230-238)。所述S1P受体被命名为S1P1、S1P2、S1P3、S1P4和S1P5(以前为EDG-1、EDG-5/AGR16、EDG-3、EDG-6和EDG-8)和所述LPA受体被命名为LPA1、LPA2、LPA3(以前为EDG-2、EDG-4和EDG-7)。已经鉴定该家族的第四个LPA受体为LPA(LPA4),并且也已经报导了这些溶血磷脂的其他推定受体。
C.溶血磷脂酸(LPA)
早就知道LPA为真核和原核细胞中磷脂生物合成的前体,但是LPA仅仅在最近才以信号传导分子出现,其由激活的细胞(特别是血小板)快速产生和释放,通过作用于特定的细胞-表面受体来影响靶细胞(例如,参见Moolenaar,等人(2004),BioEssays,vol.26:870-881,和van Leewen等人(2003),Biochem Soc Trans,vol 31:1209-1212)。除了在内质网中被合成和加工成更复杂的磷脂外,LPA可以通过水解细胞激活后预先存在的磷脂来生成;例如,所述sn-2位置通常因脱酰作用而缺失脂肪酸残基,只留下sn-1羟基酯化为脂肪酸。此外,由于许多肿瘤类型上调自体毒素,所以生产LPA的一个关键的酶,即自体毒素(溶血PLD/NPP2),是致癌基因的产物(Brindley,D.(2004),J CellBiochem,vol.92:900-12)。已经报导人血浆和血清中的LPA浓度,包括使用敏感和特异性的LC/MS程序进行的测定(Baker,等人(2001),Anal Biochem,vol 292:287-295)。例如,在允许保持在25℃一个小时的新鲜制备的人血清中,估计LPA浓度约为1.2μM,其中LPA类似物16:0、18:1、18:2和20:4为主要的种类。类似地,在允许保持在25℃一个小时的新鲜制备的人血清中,估计LPA浓度约为0.7μM,其中18:1和18:2的LPA为主要的种类。
LPA影响广泛范围的生物应答,从诱导细胞增殖、刺激细胞迁移和突触回缩、间隙连接闭合、甚至粘液菌趋化性(Goetzl,等人(2002),Scientific World Journal,vol.2:324-338)。随着对越来越多的细胞系统进行了LPA应答性测试,关于LPA生物学的知识不断增长。例如,现在知道,LPA除了刺激细胞生长和增殖外,LPA促进在创伤修复和再生中作为重要事件的细胞张力和细胞表面的纤维连接蛋白(fibronectin)结合(Moolenaar,等人(2004),BioEssays,vol.26:870-881)。最近,抗-凋亡活性也归因于LPA,最近还报导了过氧化物酶体增殖物受体γ为LPA的受体/靶标(Simon,等人(2005),J BiolChem,vol.280:14656-14662)。
已经证明LPA为抗体生成的困难靶标,虽然在科学文献中有关于生产抗LPA的多克隆鼠抗体的报导(Chen等人(2000)Med ChemLett,vol 10:1691-3)。
D.鞘氨醇-1-磷酸
S1P为细胞增殖的介体并通过激活生存通路来防止细胞凋亡(Maceyka,等人(2002),BBA,vol.1585:192-201,和Spiegel,等人(2003),Nature Reviews Molecular Cell Biology,vol.4:397-407)。提议CER/SPH水平和S1P之间的平衡提供了可变电阻机制(rheostat mechanism),其决定细胞是否被定向至死亡通路或被保护免于细胞凋亡。可变电阻机制的关键调节酶为鞘氨醇激酶(SPHK),其作用是将促死亡的生物活性信号传导脂质(CER/SPH)转变为促生长的S1P。S1P有两种命运:S1P被S1P裂解酶(一种将S1P切割为磷酸乙醇胺和十六醛的酶)降解,或较不常见地,被S1P磷酸酯酶水解为SPH。
S1P被大量生产并储存于血小板中,血小板含有高水平的SPHK并缺少降解S1P的酶。当血小板被激活时,分泌S1P。此外,其他细胞类型,例如肥大细胞还被认为能分泌S1P。一旦S1P被分泌,认为其以高浓度被结合在载体蛋白(诸如血清白蛋白和脂蛋白)上。发现血浆中S1P以高浓度存在,已经报导其浓度为0.5-5μM。还暗示了S1P的细胞内作用(例如,参见SpiegelS,Kolesnick R(2002),Leukemia,vol.16:1596-602;Suomalainen,等人(2005),Am JPathol,vol.166:773-81)。
细胞表面S1P受体的普遍表达使得S1P影响细胞应答的不同系列,包括增殖、粘连、收缩、运动力、形态发生、分化和存活。应答的系列似乎取决于细胞和组织系统内的S1P受体的重叠的或截然不同的表达模式。此外,最近已经证实S1P和生长因子信号通路之间的串扰,后者包括血小板衍生生长因子(PDGF),血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(例如,参见Baudhuin,等人(2004),FASEB J,vol.18:341-3)。涉及S1P的多种细胞过程的调节尤其对神经元信号传导、血管张力(vascular tone)、创伤愈合、免疫细胞运输(trafficking)、繁殖和心血管功能等等具有特别的影响。这些系统中S1P的内源性水平的改变可能具有有害的影响,引起若干病理生理学病症,包括癌症、心力衰竭、以及传染性和自身免疫性疾病。
最近Sabbadini博士发明的治疗癌症的新方法涉及降低S1P的生物有效的胞外水平(单独或与常规抗癌治疗组合),包括施用化疗试剂,诸如蒽环类。为此,描述了对S1P具有特异性的抗体的制备。例如,参见共同拥有的美国专利申请序列号10/820,582。能选择性地从血清中吸收S1P的所述抗体作为中和胞外S1P的分子海棉起作用。还参见共同拥有的美国专利号6,881,546和6,858,383以及美国专利申请序列号10/028,520、10/029,372和11/101,976。因为还证明S1P是促-血管生成的,所以对抗体效力的一个额外好处是其通过限制血液供应来使生长中的肿瘤缺乏营养和氧的能力。
关于抗-S1P方法尤其特别的是,虽然已经提出基于鞘脂的抗癌策略,其靶向鞘脂代谢途径的关键酶,诸如SPHK,但之前没有强调脂质介体S1P本身,大部分是由于直接减轻该脂质靶标的困难,尤其是第一产生抗脂质靶标(诸如S1P)的抗体的困难,其次检测实际上针对S1P靶标而产生的抗体的困难。如已经注意到的,关于针对其他脂质靶的治疗和诊断方法,存在类似的困难。本发明通过提供可专利的方法,尤其是通过提供抗生物活性脂质的单克隆抗体的产生来提供有效的解决这两个困境的方法。
3.定义
在详细描述本发明前,对在本发明上下文中使用的若干术语进行定义。除了这些术语外,如果需要在说明书的其他地方对其他术语进行定义。除非本文中另有明确定义,在本说明书中使用的术语具有其技术领域上公认的含义。
“抗-S1P抗体”指结合S1P的任何抗体或抗体衍生的分子。
“生物活性脂质”指脂信号传导分子。生物活性脂质与结构脂质(即,膜结合磷脂)不同在于它们介导胞外和/或胞内信号传导并因此涉及通过调节分化、迁移、增殖、分泌、存活和其他过程来控制许多细胞类型的功能。在体内,可以在细胞外液中发现生物活性脂质,其中它们可以与其他分子例如血清蛋白(诸如白蛋白和脂蛋白)复合,或“游离”形式(即,不与其他分子种类复合)。作为胞外介体,一些生物活性脂质通过激活膜结合的离子通道或GPCR或酶或因子来改变细胞信号传导,其反过来又激活导致细胞功能或存活改变的复杂信号传导系统。作为胞内介体,生物活性脂质通过直接与胞内成分,诸如酶、离子通道或结构元件(诸如肌动蛋白)直接相互作用来起作用。生物活性脂质的代表性实例包括LPA和S1P。
生物活性脂质的实例包括鞘脂诸如神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸盐、鞘氨醇、二氢鞘氨醇、鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC)和鞘氨醇-1-磷酸(S1P)。鞘脂及其衍生物和代谢物的特征在于鞘氨醇类支架(衍生自神经鞘磷脂)。鞘脂及其衍生物和代谢物代表对重要的细胞过程具有多效效应的一组胞外和胞内信号传导分子。它们包括硫苷脂、神经节苷脂和脑苷脂。其他生物活性脂质的特征在于基于甘油的支架;例如溶血磷脂,诸如溶血磷脂酰胆碱(LPC)和多种溶血磷脂酸(LPA),以及磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、磷脂酸、血小板活化因子(PAF)、心磷脂、磷脂酰甘油(PG)和二脂酰甘油(DG)。然而其他生物活性脂质衍生自花生四烯酸;这些包括类二十烷酸(包括类二十烷酸代谢物诸如HETE、大麻素、白三烯、前列腺素、脂氧素、环氧二十碳三烯酸和异类二十烷酸),非-类二十烷酸大麻素介体。还可以根据本发明使用其他生物活性脂质,包括其他磷脂及其衍生物。
在本发明的一些实施方案中,与基于鞘氨醇的生物活性脂质(具有鞘氨醇类支架的那些,诸如鞘氨醇和S1P)相反,靶向基于甘油的生物活性脂质(具有甘油衍生支架的那些,诸如LPA)以产生抗体是优选的。在其他实施方案中,靶向花生四烯酸-衍生生物活性脂质以产生抗体是想要的,且在其他实施方案中优选花生四烯酸-衍生的和甘油-衍生生物活性脂质,但不优选鞘氨醇类-衍生生物活性脂质。在本发明上下文中,所述花生四烯酸-衍生的和甘油-衍生生物活性脂质均可以指“非-鞘氨醇类生物活性脂质”。
特别排除在根据本发明的生物活性脂质种类以外的是磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸,以及其最初作为细胞膜内叶和/或外叶的结构成员其作用的代谢物和衍生物。
“生物标记物”是体内具有特定分子特征的特异性生化药剂,所述特征使其可用于测量疾病进展或治疗效果。
例如,S1P为用于某些过度增殖和/或心血管病况的生物标记物。
“载体”指适用于与半抗原偶联的部分,由此为半抗原赋予免疫原性。载体的一类代表性的非限制性种类为蛋白质,其实例包括白蛋白、匙孔血蓝蛋白、血凝素(hemaglutanin)、破伤风毒素和白喉类毒素。在本领域中,已知根据本发明使用的其他载体的类别和实例。这些以及后来发现或发明的天然存在的或合成的载体可适用于根据本发明的应用。
术语“化疗试剂”指抗癌和其他抗增殖试剂。简单地说,“化疗试剂”指意图破坏细胞和组织的化学试剂。所述试剂包括但不限于:DNA破坏试剂和抑制DNA合成的试剂:蒽环类(多柔比星、柔红霉素donorubicin、表柔比星epirubicin)、烷基化试剂(苯达莫司汀、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、达卡巴嗪、六甲蜜胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、氮芥、美法仑、米托坦、丝裂霉素、哌泊溴烷、丙卡巴肼、链佐星、塞替派和曲他胺)、铂衍生物(顺铂、卡铂、顺二氨二氯基铂)、和拓扑异构酶抑制剂(Camptosar);抗-代谢物诸如卡培他滨、氯脱氧腺苷、阿糖胞苷(cytarabine)(及其活化形式,ara-CMP)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、达卡巴嗪、氟尿苷、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、5-DFUR、吉西他滨、羟基脲、6-巯嘌呤、甲氨蝶呤、喷司他丁、三甲氧蝶呤、6-硫鸟嘌呤);抗血管生成剂(贝伐珠单抗、沙利度胺、舒尼替尼、来那度胺、TNP-470、2-甲氧雌二醇、雷珠单抗、索拉非尼、厄洛替尼、硼替佐米、培加他尼、内皮抑制素);血管干扰剂(类黄酮/黄酮、DMXAA、康普瑞汀衍生物诸如CA4DP、ZD6126、AVE8062A等);生物制剂诸如抗体(赫赛汀、阿瓦斯丁、Panorex、Rituxin、泽娃灵(Zevalin)、麦罗塔(Mylotarg)、坎帕斯(Campath)、百克沙(Bexxar)、爱必妥(Erbitux));内分泌治疗:芳香酶抑制剂(4-hydroandrostendione、依西美坦、氨鲁米特、阿那曲唑、来曲唑(letozole))、抗雌激素(他莫昔芬、托瑞米芬(Toremifine)、Raoxifene、氟维司群(Faslodex))、类固醇诸如地塞米松;免疫调节剂:细胞因子,诸如IFN-β和IL2),整合蛋白的抑制剂,其他粘附蛋白和基质金属蛋白酶);组蛋白去乙酰化酶抑制剂,如N-辛二酰苯胺异羟肟酸;信号传导抑制剂诸,如酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼(Gleevec);热休克蛋白抑制剂,如17-N-烯丙基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素;类视黄醇,诸如所有的反式视黄酸;生长因子受体或生长因子自身的抑制剂;抗有丝分化化合物和/或微管解聚试剂,诸如紫杉类(紫杉醇、多西他赛、泰索帝、BAY59-8862)、诺维本、长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨;抗炎试剂,诸如COX抑制剂和细胞周期调节剂,例如,检查点调节剂和端粒酶抑制剂。
术语“联合治疗”指涉及提供至少两种不同治疗以获得需要的治疗效果的治疗方案。例如,联合治疗可能涉及施用两种或多种化学上不同的活性成分,例如快速作用的化疗试剂和抗-脂质抗体。备选地,联合治疗可能涉及施用抗-脂质抗体和/或一种或多种化疗试剂,单独或与其他治疗(诸如放射疗法和/或手术)一起递送。在施用两种或多种化学上不同的活性成分的情况下,应理解活性成分可以作为同一组合物的部分或作为不同的组合物被施用。当作为单独的组合物施用时,可以同时或不同时,通过相同或不同的途径,使用相同或不同的给药方案来施用包含不同的活性成分所组合物,均根据具体情况要求和由主治医师来决定。类似地,当一种或多种抗脂质抗体种类,例如抗-LPA抗体,单独或与一种或多种化疗试剂偶联,例如与放射和/或手术组合时,所述药物可以在手术或放射治疗之前或之后递送。
“衍生生物活性脂质缀合物”指与载体共价缀合的衍生生物活性脂质。所述载体可以是蛋白分子或可以是诸如聚乙二醇、胶体金、佐剂或有机硅珠之类的部分。衍生生物活性脂质缀合物可用作免疫原以产生根据本发明的抗体应答,并且相同或不同的生物活性脂质缀合物可用作检测试剂以检测由此产生的抗体。在一些实施方案中,当用于检测时,所述衍生生物活性脂质缀合物与固相载体相连。
“表位”或“抗原决定簇”指与衍生自抗体的抗体抗原结合部分反应的抗原部分。
“半抗原”是非-免疫原性的物质,但能与抗体或衍生自抗体的抗原结合部分反应。换句话说,半抗原具有抗原性但没有免疫原性。
术语“过度增殖障碍”指与不受控制的增殖细胞相关的疾病和障碍,包括但不限于导致癌症和良性肿瘤的器官和组织细胞的不受控制生长。与内皮细胞相关的过度增殖障碍能导致血管生成疾病,诸如血管瘤、子宫内膜异位、肥胖症、年龄相关性黄斑变性和多种视网膜病,以及引起再狭窄(由动脉硬化症治疗中支架引起的)的内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。涉及成纤维细胞的过度增殖障碍(即,纤维发生)包括但不限于过度疤痕形成(即,纤维化)障碍,诸如年龄相关性黄斑变性,与心肌梗塞相关的心脏重构和心力衰竭,诸如通常由手术或损伤、疤痕瘤和纤维瘤以及支架引起的过度创伤愈合。
“免疫原”是能诱导特异性免疫应答,特别是在已经施用所述免疫原的动物中诱导抗体应答的分子。在本发明中,免疫原是与载体缀合的衍生生物活性脂质,即“衍生生物活性脂质缀合物”。所述用作免疫原的衍生生物活性脂质缀合物可用作捕获材料以检测应答免疫原而产生的抗体。因此,所述免疫原还可用做检测试剂。备选地,所述用作捕获材料的衍生生物活性脂质缀合物可以具有不同于免疫原中的接头和/或载体部分。
“抑制”,特别在生物现象的情况下,指降低、压制或延迟。例如,导致“抑制肿瘤产生”的治疗可以指肿瘤完全没有形成,或与未治疗的对照相比它们形成得更慢,或在数量上更少。
在本发明的上下文中,“液体组合物”指以其如制造商为最终使用者(即,医生或护士)提供的填满形式或成品形式,与固体相反为液体或溶液的组合物。在此处,“固体”指不是液体或溶液的组合物。例如,固体包括通过冻干法、冷冻-干燥、沉淀和类似方法制备的干燥组合物。
“单一疗法”指基于递送一种治疗有效的化合物的治疗方案,无论以随时间的单一剂量或若干剂量施用。
“瘤形成”指异常和不受控制的细胞生长。“赘生物”或肿瘤是异常的、无节制的和紊乱的细胞生长的增殖,并且通常指癌症。赘生物可以是良性或恶性的。如果赘生物具有破坏性生长、侵袭和转移的性质,其是恶性的或癌性的。侵袭指赘生物通过浸润或破坏周围组织的局部扩散,通常突破限定组织边界的基底膜,由此经常进入机体的循环系统。转移通常指肿瘤细胞通过淋巴或血液循环系统的散布。转移还指肿瘤细胞通过经由浆膜腔、或蛛网膜下腔或其他空间的直接扩展的迁移。通过转移过程,肿瘤细胞迁移至身体的其他区域在远离最初出现地点的地方形成的赘生物。
根据本发明“可专利的”的组合物、方法、机器或制品指在进行分析时,所述主题满足所有关于专利性的法定要求。例如,关于新颖性,非显而易见性等,如果后来的研究揭露一个或多个权利要求包括一个或多个能否定新颖性,非显而易见性等的实施方案,所述由“可专利的”实施方案的定义限制的权利要求,特别排除非专利性实施方案。其从属权利要求也被理解为提供最宽的合理范围,同时保持其有效性。此外,以如下方式理解权利要求,(1)保持其合理性和(2)如果在修改一个或多个专利性的法定要求的情况下,或如果评估从提交该申请时是否满足专利性的特定法定要求的标准变化的情况下或以专利公布时一个或多个从属权利要求的合理性受到质疑的情况下,提供最宽的合理解释。
术语“药学可接受的盐”指保留本发明试剂和化合物的生物效力和性质的盐,其不是生物学或其他方面不良的。在许多情况下,本发明的试剂和化合物能由于带电基团(例如,带电氨基和/或羧基或与其类似的基团)的存在而形成酸式和/或碱式盐。药学可接受的酸加成盐可以由无机和有机酸制备,而药学可接受的碱可以由无机和有机碱制备。关于药学可接受的盐的综述(参见Berge,等人(1977)J.Pharm.Sci.,vol.66,1-19)。
“大量”指多于一个。
术语“单独的”、“纯化的”、“分离的”等指包含在装样品的容器中的一个或多个样品成分为,或已经物理上与该容器中存在的一个或多个其他样品成分分开或在存在于该管中的一个或多个其他样品成分存在下稀释。在分离或纯化步骤中除去或稀释的样品成分,包括化学反应产品、不反应的化学试剂、蛋白质、碳水化合物、脂质和非结合的分子。
术语“种类”在本文的多种情况下使用,例如,化疗试剂的具体种类。在每种情况下,该术语指在具体情况下所指的那类化学上不同的分子的群体。
“特异性相连”、“特异性结合”等指两个分子间特异性的、非随机的相互作用,所述相互作用取决于允许分子间合适的化学或分子相互作用的结构、疏水/亲水、和/或静电特性的存在。可以说抗体“结合”其靶抗原的表位或与其靶抗原的表位具有“反应性”(或等效地,针对其靶抗原的表位具有反应性)。在本领域中,抗体通常被表述为“抗”或“针对”其抗原以简单表示抗体与抗原结合。
此外,“稳定的”指两个分子(例如,肽和TLR分子)之间的相互作用足够稳定,得以维持所述分子用于所需的目的或操作。例如,肽和TLR分子之间“稳定的”相互作用指其中所述肽开始并维持与TLR分子的结合以足够长的时间以实现所需的效果。
“受试者”或“患者”指需要能被本发明的分子影响的治疗的动物。可以根据本发明治疗的动物包括脊椎动物,哺乳动物(诸如牛科、犬科、马科、猫科、绵羊科、猪科、和灵长类(包括人和非人灵长类)动物)是特别优选的实例。
“替代标记物(surrogate marker)”指对体内生物活性的实验量度,其间接指示对疾病状态的治疗效果。用于过度增殖和/或心血管病况的替代标记物的实例包括SPHK和/或S1PR。
“治疗有效量”(或“有效量”)指当给需要所述治疗的受试者施用时,足以实现治疗的活性成分(例如本发明的试剂)的量。因此,本领域的普通技术人员可以容易地确定本发明组合物的治疗有效量。在癌症治疗的情况下,“治疗有效量”指这样一个量,其在与癌细胞存活或代谢相关的一个或多个参数中产生客观上可测量的变化,所述参数包括与具体癌症相关的一个或多个基因表达的增加或减少,肿瘤负荷的降低,癌细胞的裂解,生物样品中一种或多种癌细胞死亡标记物(例如,活检和体液(诸如全血、血浆、血清、尿等)的等分试样)的检测,诱导细胞凋亡或其他细胞死亡通路的诱导等。当然,所述治疗有效量根据具体的受试者和被治疗的病况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、所选的具体化合物、采取的给药方案、施用时间、施用方式等而变化,所有这些均能被本领域的普通技术人员容易地确定。可以理解在联合治疗的情况下,具体活性成分的治疗有效量不同于以单一疗法(即,仅采用一种化学实体作为活性成分的治疗方案)施用时,该活性成分的治疗有效量。
术语“治疗”或“处理”指疾病或障碍的任何处理,包括预防疾病或障碍或保护免受疾病或障碍(即,使得临床症状不出现);抑制疾病或障碍(即,停滞、延迟或压制临床症状的出现;和/或减轻疾病或障碍(即,引起临床症状的衰退))。应当理解,不是一直都能区别“预防”和“压制”疾病或障碍,因为最终诱发事件是未知的或潜在的。因此,应当理解术语“预防”组成一类包括“预防”和“压制”的“治疗”。因此所述术语“保护”也包括“预防”。
术语“治疗方案”指使用化疗试剂和细胞毒素剂、放射疗法、手术、基因疗法、DNA疫苗和疗法、siRNA疗法、抗血管生成疗法、免疫疗法、骨髓移植、适体和其他生物制剂(诸如抗体和抗体变体)、受体诱骗和其他基于蛋白的治疗剂对疾病或障碍的任何治疗。
发明概述
本发明的目的是提供可专利的组合物,和用于产生与生物活性脂质反应的抗体(尤其是单克隆抗体)及其衍生物的方法,所述生物活性脂质与动物尤其是哺乳动物(特别是人)中的疾病过程有关、相关或以其他方式与其有牵连。
因此,本发明的一个方面涉及用于生产可专利免疫原的可专利中间体,所述免疫原可用于产生可专利的对生物活性脂质具有反应性的抗体。这类可专利的化合物包括衍生生物活性脂质,其各自包含具有极性头基团和至少一个烃链的生物活性脂质,其中在烃链中的碳原子用保护或未保护的悬垂反应基团进行衍生[即,巯基(硫醇)、羧酸基、氰基、酯、羟基、链烯基、炔基、酰基氯或卤素原子]。代表性生物活性脂质包括溶血脂质,例如鞘脂和鞘脂代谢物诸如神经酰胺、神经酰胺-1-磷酸、N-乙酰基-神经酰胺-1-磷酸、鞘氨醇-1-磷酸(S1P)、鞘氨醇、鞘氨醇磷脂酰胆碱(SPC)、二氢鞘氨醇和二氢鞘氨醇-1-磷酸。其他生物活性脂质包括溶血脂质(诸如溶血磷脂酸(LPA)),以及溶血磷脂酸代谢物或前体(诸如溶血磷脂酰肌醇(LPI)或溶血磷脂酰胆碱(LPC))。关于LPA,示例性反应基团定位包括将反应基团悬挂到烃链中的碳原子上或溶血磷脂酸部分的甘油支架的sn-1位置上。特别优选的衍生生物活性脂质包括LPA和S1P的巯基衍生物。
本发明的相关方面涉及由根据本发明的衍生生物活性脂质而产生的免疫原。通常,所述免疫原包括与载体共价连接的衍生生物活性脂质。合适载体部分的实例包括载体蛋白(诸如匙孔血蓝蛋白(KLH)和白蛋白)、聚乙二醇、胶体金、佐剂或有机硅珠。根据本发明优选的免疫原包括与KLH或白蛋白共价连接的LPA的巯基衍生物。在基于鞘脂的免疫原的情况下,优选的免疫原实施方式包括与KLH或白蛋白共价连接的巯基S1P衍生物。
通过衍生生物活性脂质与载体部分的反应来制备本发明的免疫原,所述反应在允许所述载体与所述生物活性脂质之间的共价连接通过悬垂反应基团发生以产生生物活性脂质-载体免疫原的具体种类的条件下进行。然后在作为免疫方法的一部分给宿主动物施用前,优选地分离或纯化所述免疫原,所述免疫涉及所需免疫原的一次或若干次施用(典型地通过注射)。在该方面的优选实施方式中,用合适的保护基团保护衍生生物活性脂质的悬垂反应基团,在用于共价连接载体和生物活性脂质的化学反应之前或作为其的一部分除去所述保护基团并且所述衍生生物活性脂质被“去保护”。
如上面讨论的,本发明的另一方面涉及制备对生物活性脂质具有反应性的单克隆抗体的方法。在所述方法中,用如本文所述的生物活性脂质免疫原对免疫活性宿主动物(例如,啮齿类动物诸如小鼠、大鼠、豚鼠或兔)进行免疫。免疫作用后,宿主发起针对生物活性脂质的抗体应答,导致对免疫原中具体生物活性脂质种类具有反应性的抗体的产生。所得的抗体是多克隆或优选单克隆的。对于单克隆抗体,产生所需抗体的细胞系优选是克隆和永生的,以有利于以所需量产生所需的脂质特异性抗体。在优选的实施方式中,所需的单克隆抗体,例如对LPA有反应性的单克隆抗体用于产生抗体衍生物,诸如嵌合的或人源化抗体或抗体片段。在一些实施方式中,完全人源化抗体可以通过对经改造包含一些或全部感受态人系统的动物(例如,小鼠或大鼠)进行免疫来产生。
已知,对于抗体生成来说脂质通常为一类非常难处理的分子。本发明的一方面认为该问题至少部分归因于检测对具体靶标脂质种类具有反应性的抗体的困难性。然而,通过使用具体靶标生物活性脂质的衍生形式(诸如溶血脂质或神经鞘脂或鞘脂代谢物),可以很好地克服该问题。
在一些优选的实施方式中,所述衍生生物活性脂质可用于鉴定对具体生物活性脂质的表位具有反应性的抗体,所述生物活性脂质存在于产生待检测的抗体的免疫原中。为了实现该作用,可以将具体的衍生生物活性脂质或衍生生物活性脂质缀合物与固体支持物相连,优选地是分析仪器的固相,诸如ELISA板、Biacore芯片等。与固体支持物的连接使得在抗体结合和检测过程中洗掉生物活性脂质的可能性最小化。
本发明的另一方面涉及药学组合物或兽医学组合物,其包含载体和根据本发明的分离的免疫衍生部分,例如单克隆抗体或抗体片段、变体或衍生物。优选的载体包括药学可接受的那些,尤其是当所述组合物打算用于人治疗用途时。对于非人的治疗应用(例如,在治疗宠物、家畜、鱼或家禽),可以使用兽医学可接受载体。
本发明的相关方面涉及使用或治疗的方法,包括防止或预防性治疗和施用。所述方法通常涉及给需要治疗性或预防性处理的受试者(例如,哺乳动物,特别是人患者)施用一定量的对物活性脂质靶有反应活性的免疫衍生部分,其有效实现所需的治疗。在一些实施方式中,所述生物活性脂质靶是非鞘氨醇类生物活性脂质。治疗有效的免疫衍生部分的一个优选实例是对溶血脂质(诸如LPA)有反应性的人源化的单克隆抗体。根据本发明的免疫衍生部分,优选作为治疗组合物的一部分的施用途径,可以根据是否需要局部或全身治疗和治疗区域而变化。施用可以是局部的(包括经皮、眼部和粘膜(包括阴道、子宫内和直肠)递送,肺部递送,气管内、鼻内和表皮递送),口服的或肠胃外的。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或输注;或颅内,例如鞘内或心室内施用。
本发明的其他方面涉及多种诊断、预后和/或研究可行的方法。一个所述方面涉及衍生脂质类似物在检测来自动物或抗体文库的体液或组织样品中抗天然生物活性脂质的自身抗体的存在中的用途。另一个所述方面涉及检测除鞘脂或其代谢物以外的靶生物活性脂质方法。通常,所述方法涉及免疫衍生部分与对其具有反应性的靶生物活性脂质结合。例如可以在允许免疫衍生部分与靶生物活性脂质(如果样品中存在的话)结合的条件下,通过将已知或怀疑含有靶生物活性脂质的样品(例如,活检或流体或体液样品,例如血液、血清、血浆、尿、唾液、眼泪、脑脊髓液、细胞培养物等)与免疫衍生部分接触来获得结合的检测。
为了执行所述诊断方法,需要试剂,并且采用根据本发明的衍生脂质类的诊断试剂代表了本发明的另一方面。在拥有这些试剂的情况下,可以准备使用这些试剂的诊断性分析。
在下述部分中更详细地讨论本发明的这些和那些方面以及实施方式。
附图说明
本专利申请包含至少一个以彩色绘制的图。在提出要求和支付必须的费用后可以提供本专利申请带有彩色附图的副本。
图1.制备典型巯基化-S1P类似物的有机合成方案,所述巯基化-S1P类似物用作本发明免疫原的关键组分,以及用作ELISA和BiaCore试验的沉积材料(laydown material)的关键组分。
图2.制备用于合成图3中的巯基化-LPA类似物的巯基化-相关脂肪酸的有机合成方案。
图3.制备巯基化-LPA类似物的有机合成方案,所述巯基化-LPA类似物为本发明免疫原的关键组分,以及为ELISA和其他试验的沉积材料的关键组分。
图4.抗-S1P mAb对S1P是特异性的和灵敏的,且不识别结构上类似的生物活性脂质。面板A.S1P、SPH、LPA、SPC和其他结构上类似的生物脂与平板上的S1P竞争与所述mAb的结合的竞争性ELISA。只有游离的S1P或DH-S1P能竞争结合,证实抗-S1P mAb的特异性。SPC仅轻微地竞争结合。面板B.用于评估特异性的生物活性脂质的结构。
图5.抗-S1P mAb于硫代-S1P结合动力学的BiaCore分析限定于Biacore马来酰亚胺表面CM5传感器芯片上。将抗-S1P mAb的多种稀释溶液应用于流动池(flow cell)以产生感应图。
图6.鼠SphingomabTM的小鼠VH和VL结构域的氨基酸序列。用框线显示CDR残基。
图7.鼠SphingomabTM的VH和VL结构域的核苷酸和氨基酸序列。
图8.该图显示鼠SphingomabTM和来源于鼠SphingomabTM的嵌合、SIP-结合抗体的结合研究的ELISA结果。
图9.直接ELISA显示鼠和嵌合mAbs与ELISA板的结合,所述ELISA板涂敷有实施例6中所述的巯基化S1P类似物。数据显示嵌合mAb(cα-S1PIgG)与完全鼠mAb(mα-S1PIgG)相比,如果不大于后者的话,具有与其类似的结合性能。
本领域的技术人员应该理解,下述说明详细描述本发明某些优选的实施方式,因此仅仅是代表性并不描述本发明的实际范围。在详细描述本发明之前,应该理解本发明不限于所述的具体分子、系统和方法,因为这些都可以变化。还应理解本文所用的术语仅仅出于描述具体实施方式的目的,不意图限制所附权利要求所限定的本发明范围。
发明详述
本发明涉及组合物,以及生产和鉴定抗生物活性脂质分子的抗体的方法,所述生物活性脂质分子作为信号传导分子在人和/或动物疾病中起作用。本发明还涉及这些抗体本身,以及其在治疗上、诊断上和作为研究试剂的使用方法。
1.生产和鉴定抗体的方法
已知,对于抗体生产来说脂质通常为一类非常难处理的分子。抗体产生通常被描述为两个过程:必须提供合适的免疫原,其将在动物中产生所需的抗体应答,以及产生的抗体(如果存在的话),必须是可检测的。
如上讨论的,有效的抗体生产要求抗体产生和抗体检测。如在下述实施例中公开的,使用衍生生物活性脂质作为免疫原实现靶向特定生物活性脂质的抗体的产生。在所述实施例中,使用制造商推荐的方案将巯基化生物活性脂质(例如,S1P)类似物与匙孔血蓝蛋白(KLH)或与无脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)经由SMCC(Pierce,Rockford IL)偶联。SMCC为与一级氨和巯基反应的异型双功能交联剂,并且代表优选的交联剂。对于马来酰亚胺-活化蛋白,还可以使用碘代乙酰胺(IOA)。
然而,还可以使用其他本领域中已知的免疫原和生产抗体的方法。例如,通过采用脂质体的免疫(Maneta-Peyret等人,1988,1989;Benerji and Alving,1990)或通过对蛋白(Tamamura等人,1971;Maneta-Peyret等人,1989),对细菌(Umeda等人,1989),对丙烯酰胺(Maneta-Peyret等人,1988,1989)和对金[Tomii等人,(1991)JpnJ.Med Sci.Biol.44:75-80]的单聚磷脂吸附来产生抗磷脂种类的抗体。在许多情况下,生物活性脂质以乳化剂或脂质体复合物呈递导致IgMs与IgG相比,具有有限的特异性、敏感性和/或生物活性。例如,表征了两种商购可获得的预测对神经酰胺具有特异性的试剂,一种是富含IgM的多克隆小鼠血清和另一种是IgM单克隆抗体。发现所述单克隆抗体对神经鞘磷脂具有特异性,并发现所述抗血清在纳摩尔范围内与多种神经酰胺类反应。Vielhaber,G.等人,(2001)Glycobiology 11:451-457。在不同的方法中,Ran等人[(2005)Clin.Cancer Res.11:1551-1562]使用被过氧化物处理过的b.End3内皮细胞(旨在引起阴离子磷脂向细胞外表面的迁移)作为免疫原来引发产生对阴离子磷脂特异性的抗体。因此已知许多方法,通过其可以引发对所需抗原性靶标的抗体应答;只要所产生的抗体能被检测并证明能与所需的生物活性脂质反应,可以在本发明中使用这些方法的任何一个。
虽然抗体产生是必需的,但如果抗体不能被检测的话,不是充分的。因此,本发明的一个方面基于如下理解,即之前其他人生产生物活性脂质抗体的失败至少归因于检测步骤的缺点。在下述实施例中,检测问题通过使用衍生生物活性脂质得到很好的解决。使用衍生生物活性脂质来检测和鉴定对具体生物活性脂质的表位具有反应性的抗体,所述生物活性脂质存在于用于生产待检测的抗体的免疫原中;用于检测的衍生形式的生物活性脂质包含产生抗体的相同表位。为了实现该功能,衍生的脂质可以与分析仪器的固体支持物相连,诸如ELISA板、BiaCore传感器芯片等。在一些实施方式中,衍生生物活性脂质直接与固体支持物共价缀合。例如,所述衍生脂质可以与下述实施例中所述的活化BiaCore芯片共价缀合。在其他实施方式中,所述衍生生物活性脂质与载体部分共价缀合,产生“衍生生物活性脂质缀合物”,然后其与固体支持物结合。例如,如在下述实施例中所述的,将与BSA共价缀合的衍生脂质用作ELISA的沉淀材料(捕获材料)。在任一实施方式中,衍生生物活性脂质与固体支持物的连接提供了稳定的检测手段,其不太可能如一些检测方法的风险那样被洗掉。可以以多种方式实现抗体的检测。在本发明优选的实施方式中,所述检测通过ELISA,BiacoreTM无标记相互作用分析系统,或其他基于固体支持物途径的检测手段,其中所述衍生生物活性脂质与所述固体支持物相连。其他固体支持物的实例包括但不限于亲和柱、玻璃珠或合成珠,多孔板等。
用于检测步骤的所述衍生生物活性脂质缀合物可以是用作免疫原的相同衍生生物活性脂质缀合物,或所述衍生生物活性脂质可以与不同于缀合物中用作免疫原的载体缀合。在一些实施方式中,例如对于ELISA沉淀,优选在检测步骤中使用不同于用作免疫原的衍生生物活性脂质缀合物以使交联反应最小化。例如,载体可以是BSA(优选无脂肪酸,特别是在检测步骤)、KLH或其他本领域已知的载体。用于缀合衍生生物活性脂质与蛋白载体的交联剂例如可以是SMCC或IOA。在一个优选的实施方式中,所述免疫原是S1P-IOA-KLH,并且S1P-SMCC-BSA(无脂肪酸的BSA)是ELISA中的捕获沉淀材料,其中S1P指与交联剂(在该情况下为IOA或SMCC)反应以与蛋白载体(在该情况下为KLH或BSA)形成共价键的衍生S1P。
2.化合物
术语“抗体”(“Ab”)或“免疫球蛋白”(Ig)指能结合抗原或表位的,衍生自免疫球蛋白基因或其片段的肽、多肽,模仿免疫球蛋白基因或其片段的肽、多肽,由免疫球蛋白基因或其片段编码的肽、多肽。例如,参见,Fifth Edition,C.A.Janeway,P.Travers,M.,Walport,M.J.Shlomchiked.,ed.Garland Publishing(2001)。抗体分子或免疫球蛋白为分子量大约为150kDa的大糖蛋白分子,通常由两种不同类的多肽链组成。一种多肽链,称为“重”链(H),约50kDa。另一种多肽,称为“轻”链(L),约25kDa。每个免疫球蛋白分子通常由两条重链和两条轻链组成。两条重链通过二硫键相连,其数量在不同免疫球蛋白同种型的重链之间变化。每条轻链通过一个共价二硫键与一条重链相连。在任何给定的天然存在的抗体分子中,所述的两条重链和两条轻链是相同的,具有两个相同的抗原结合位点,因此被认为是二价的,即具有同时结合两个相同分子的能力。
来自任何脊椎动物物种的抗体分子的“轻”链,根据其恒定区的氨基酸序列可以被归属为两个明显不同的类型,kappa(k)和lambda(λ)。两种类型的轻链的比例在物种间变化。例如,小鼠中平均k与λ之比为20:1,而在人中其为2:1,在牛中为1:20。
来自任何脊椎动物物种的抗体的“重”链,根据其恒定区的氨基酸序列可以被归属为五个明显不同类型(称为同种型)中的一个。一些同种型具有若干亚型。免疫球蛋白的五种主要类型为免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白E(IgE)。IgG是最丰富的同种型并具有若干亚类(在人中有IgG1、2、3和4)。所述Fc片段和铰链区的区别在于不同同种型的抗体,由此确定其功能性质。然而,所述结构域的整体组织在所有同种型中是类似的。
如本文所使用的,“抗体片段”和其语法型变体指包括抗原结合位点或完整抗体可变区的完整抗体的部分,其中所述部分可以不含完整抗体的Fc区的重链恒定区(例如,CH2、CH3和CH4)。备选地,在所述“抗体片段”中可以包括重链恒定区的部分(例如,CH2、CH3和CH4),抗体片段的实例为保留抗原结合性并包括Fab、Fab′、F(ab′)2、Fd和Fv片段的那些;二聚体;三聚体;单链抗体分子(sc-Fv);由抗体片段形成的微型抗体(minibodies),纳米抗体(nanobodies)和多特异性抗体。例如,Fab片段还包含轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。
术语“可变区”指抗体分子或其片段的N-端序列。通常,四个链的每一个在其氨基端部分都具有一个贡献抗原结合位点的可变(V)区,和确定同种型的的恒定(C)区。轻链通过许多非共价相互作用以及通过二硫键与重链结合,且重链和轻链的V区在抗体分子的各自臂中配对以产生两个相同的抗原结合位点。认为一些氨基酸残基在轻链和重链可变区之间形成一个界面(参见Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,Fifth Edition,NationalInstitute of Health,Bethesda,Md.(1991);Clothia等人,J.Mol.Biol.,vol.186:651(1985))。
值得注意的是,可变性是在抗体的整个可变区中分布不一致,但集中在三个片段,其中两个在轻链被称为“互补决定区”(CDRs)或“高变区”,以及重链可变区。可变区的更高度保守部分称为“框架区”(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包括由三个CDR连接的四个FR区。每个链中的CDR通过FR区与其他链的CDR紧靠在一起,促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Edition,National Institute ofHealth,Bethesda,Md.(1991))。总得来说,所述6个CDR促成抗体分子的结合性质。然而,即使单一可变区(或仅包括三个对抗原特异性的CDR的半个Fv)具有识别并结合抗原的能力(参见Pluckthun,inThe Pharmacology of单克隆抗体,vol.113,Rosenburg and Mooreeds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994))。
术语“恒定区”指抗体重链或轻链的C-端区域。通常,所述恒定区不直接涉及抗体分子对抗原的结合性质,但展现多种效应子功能,诸如抗体参与抗体依赖性细胞毒性。此处,“效应子功能”指通过Fc结构域和免疫系统蛋白之间的分子相互作用,由免疫细胞的募集介导的抗体的不同生理效应(例如,调理作用、细胞裂解、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞脱颗粒,和其他过程)。重链的同种型决定抗体的功能性质。重链的羧端部分赋予其独特的功能性质,而这些功能性质与轻链无关。
术语“变体”指与抗体天然的氨基酸序列不同在于至少一个氨基酸残基修饰的氨基酸序列。天然或亲本或野生型氨基酸序列指在自然中发现的抗体的氨基酸序列。抗体分子的“变体”包括但不限于在轻链和/或重链的可变区或恒定区内的变化,包括在Fc区、Fab区、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域和铰链区中。
术语“特异性”指抗体对其靶表位的选择性结合。通过比较在给定调整条件下,对目的抗原的结合与对不相关抗原或抗原类似物或抗原混合物的结合,可以测试抗体分子的结合特异性。优选地,根据本发明的抗体与不相关抗原或甚至靶抗原的类似物没有显著结合。此处,术语“抗原”指被抗体分子或与抗原结合的免疫衍生部分识别并结合的分子。被抗体结合的抗原的特异性部分被称为“表位”。“半抗原”指只有在与载体,例如蛋白、聚乙二醇(PEG)、胶体金、有机硅珠等连接时,在大多数情况下能引发免疫应答的小分子(即,用作抗原)。所述载体还可以是自身不能引发免疫应答的那些。
在最广义范围下使用的术语“抗体”,包括单克隆、多克隆、多特异性(例如,双特异性,其中抗体的每一个臂与相同或不同抗原的不同表位具有反应性)、微型抗体、杂缀合物、二价抗体、三价抗体、嵌合和合成抗体,以及特异性结合具有所需结合性质和/或生物活性的抗原的抗体片段。
术语“单克隆抗体”(mAb)指抗体、或类似抗体的群体(获自实质上同质抗体的群体),且不应理解为需要通过任何特定的方法来产生所述抗体。例如单克隆抗体可以通过Kohler G.and Milstein C.(1975),Nature,vol.256:495-497首次描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法来制备。
术语“嵌合”抗体(或免疫球蛋白)指包含重和/或轻链的分子,所述重和/或轻链与来源于具体物种或属于具体抗体类型或亚类的抗体的对应序列相同或同源,而链的其他部分与与来源于其他物种或属于其他抗体类型或亚型的抗体的对应序列以及所述抗体的片段相同或同源,只要它们展现所需的生物活性(Cabilly,等人,infra;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,vol.81:6851(1984))。
术语“人源化抗体”指还包含以来自非人(即,鼠)抗体的某些选择性序列代替人序列的人抗体。人源化抗体包括不显著改变其结合和/或生物活性的保守氨基酸取代或来自相同或不同物种的非天然残基。所述抗体为含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上,人源化抗体为人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体),诸如具有所需性质的小鼠、大鼠、骆驼、牛、山羊或兔的CDR残基代替。此外,人源化抗体可以包括既不在受体抗体也不在引入的CDR或框架序列中存在的残基。进行这些修饰以进一步优化和最大化抗体性能。因此,通常来说,人源化抗体包含所有可变区中的至少一个,在一方面包括两个,其中所有的或所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些,且所有的或基本上所有的FR区域为人免疫球蛋白序列的那些。所述人源化抗体任选地还包括至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)或人免疫球蛋白恒定区(Fc)。例如,参见Cabilly,等人,U.S.Pat.No.4,816,567;Cabilly,等人,欧洲专利申请号0,125,023 B1;Boss,等人,U.S.Pat.No.4,816,397;Boss,等人,欧洲专利申请号0,120,694 B1;Neuberger,等人,WO 86/01533;Neuberger,等人,欧洲专利申请号0,194,276 B1;Winter,U.S.Pat.No.5,225,539;Winter,欧洲专利申请号0,239,400 B1;Padlan,等人,欧洲专利申请号0,519,596A1;Queen,等人(1989),Proc.Nat′1 Acad.Sci.USA,vol.86:10029-10033)。
术语‘完全人源性’抗体指在遗传改造(即,转基因)小鼠(例如,来自Medarex)中产生的抗体,当呈递免疫原时,能产生不需要CDR移植的人抗体。这些来自动物诸如小鼠,其中非人抗体基因被压制并被人抗体基因表达代替的抗体是完全人源性的(100%人蛋白序列)。申请人认为当给这些可能产生相关CDR的人框架的转基因小鼠或其他动物呈递生物活性脂质时,可能产生抗生物活性脂质的抗体。
术语“双特异性抗体”指具有至少两个不同表位的结合性质的抗体或单克隆抗体。在一个实施方案中,所述表位来自相同的抗原。在另一个实施方案中,所述表位来自两个不同的抗原。制备双特异性抗体的方法在本领域中是已知的。例如,可以使用两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达重组产生双特异性抗体。备选地,可以使用化学连接来制备双特异性抗体。本领域技术人员能使用这些或其他本领域中已知的方法来制备双特异性抗体。双特异性抗体包括双特异性抗体片段。本发明包括的双特异性抗体的一个实例是对S1P表位和LPA表位具有结合性质的抗体,因此其能识别和结合S1P和LP1。本发明包括的双特异性抗体的另一个实例是对来自生物活性脂质的表位和来自细胞表面抗原的表位具有结合性质的抗体。因此所述抗体能识别和结合生物活性脂质并能识别和结合细胞,例如,出于靶向目的。
术语“异源缀合抗体”指两个共价连接的抗体。可以使用合成蛋白质化学中已知的方法制备所述抗体,包括使用交联剂。如本文所使用的,术语“缀合物”指通过一个或多个抗体片段或结合部分与一个或多个聚合物分子共价连接形成的分子。
术语“生物活性”指能结合所需表位并以一些方式发挥生物学作用的抗体或抗体片段。生物学作用包括但不限于生长信号的调节、抗细胞凋亡信号的调节、细胞凋亡信号的调节、效应子功能级联的调节和其他配体相互作用的调节。
术语“重组DNA”指经人工改造、产生或修饰的核酸和由其表达的基因产物。“重组的”多肽或蛋白是通过重组DNA技术,例如,由用编码的所需多肽或蛋白的外源DNA构建体转化的细胞产生多肽或蛋白。“合成的”多肽或蛋白是通过化学合成制备的那些。
术语“表达盒”指在与所述序列相容的宿主中能影响结构基因(即,蛋白编码序列,诸如本发明抗体)表达的核酸分子。表达盒包括至少一个与多肽编码序列盒任选的其他序列可操作连接的启动子,例如,转录终止信号。还可以使用其他在影响表达中必需的或有帮助的调节元件,即,增强子。因此,表达盒包括质粒、表达载体、重组病毒、重组“裸DNA”载体的任何形式等。
“载体”或“质粒”或“表达载体”指能瞬时或稳定维持在细胞中以实现一个或多个重组基因表达的核酸。载体可以包括单独或与其他化合物复合的核酸。载体任选地包括病毒或细菌核酸和/或蛋白,和/或膜。载体包括但不限于可与DNA片段连接并对其进行复制的复制子(例如,RNA复制子,噬菌体)。因此,载体包括但不限于RNA、自主自我复制环状或线状DNA或RNA,并包括表达和非表达质粒。“质粒”可商购获得,在非限制的基础上公众可获得,或用发表的方法如所报导的由可获得的质粒构建。此外,表达载体还可以包含为检测转化的宿主细胞提供表型性状的基因,诸如二氢叶酸还原酶或对真核细胞培养物的新霉素抗性、或诸如在大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素抗性。
术语“启动子”包括能驱动细胞中编码序列转录的所有序列。因此,用于本发明构建体的启动子包括顺式作用转录控制元件和涉及调节或调整基因转录的时机和/或速度的调节序列。例如,启动子可以是顺式作用转录控制元件,包括增强子、启动子、转录终止子、复制起点、染色体整合序列、5′和3′非翻译区或内含子序列,其涉及转录调节。适用于本发明的转录调节区包括但不限于人巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子/启动子、SV40早期增强子/启动子、大肠杆菌lac或trp启动子和已知控制真核或原核细胞或其病毒中基因表达的其他启动子。
A.鞘脂的抗体
本发明提供制备针对某些生物活性脂质(包括鞘脂)的抗体的方法。术语“鞘脂"指如http//www.lipidmaps.org所定义的鞘脂,包括下述:鞘脂碱基[包括sphing-4-enines(鞘氨醇)、二氢鞘氨醇、4-羟基二氢鞘氨醇(植物鞘氨醇)、鞘氨醇碱基同源物和变体、鞘脂碱基1-磷酸、溶鞘磷脂和溶鞘糖脂;N-甲基化鞘脂碱基和鞘脂碱基类似物];神经酰胺[包括N-乙酰鞘氨醇(神经酰胺)、N-乙酰二氢鞘氨醇(二氢神经酰胺)、N-乙酰-4-羟基二氢鞘氨醇(植物神经酰胺),乙酰神经酰胺和神经酰胺1-磷酸];鞘磷脂[包括神经酰胺磷脂酰胆碱(神经鞘磷脂),神经酰胺磷酸乙醇胺和神经酰胺磷酸肌醇;鞘磷脂;中性鞘糖脂[包括简单的Glc系列(GlcCer,LacCer等,GalNAcb1-3Gala1-4Galb1-4Glc-(Globo系列),GalNAcb1-4Galb1-4Glc-(Ganglio系列),Galb1-3GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-(Lacto系列),Galb1-4GlcNAcb1-3Galb1-4Glc-(Neolacto系列),GalNAcb1-3Gala1-3Galb1-4Glc-(Isoglobo系列),GlcNAcb1-2Mana1-3Manb1-4Glc-(Mollu系列),GalNAcb1-4GlcNAcb1-3Manb1-4Glc-(Arthro系列),Gal-(Gala系列)或其他中性鞘糖脂];酸性鞘糖脂[包括神经节苷脂、磺酸鞘糖脂(sulfoglycosphingolipid)(硫苷脂),葡糖醛酸鞘脂(glucuronosphingolipid),磷酸鞘糖脂(phosphoglycosphingolipid)和其他酸性鞘糖脂;碱性鞘糖脂;两性鞘糖脂;鞘砷脂(arsenosphingolipid)和其他鞘脂。
抗-鞘脂抗体用于治疗或预防如下面详细描述的,障碍(诸如过度增殖障碍)和心血管或脑血管疾病和障碍。在具体的实施方式中,本发明涉及制备S1P抗体及其变体的方法,其包括S1P本身{定义为鞘氨醇-1-磷酸[sphingene-1-phosphate;D-赤式-鞘氨醇-1-磷酸;sphing-4-enine-1-磷酸;(E,2S,3R)-2-氨基-3-羟基-十八碳-4-enoxy]膦酸](CAS 26993-30-6)},或DHS1P{定义为二氢鞘氨醇-1-磷酸[sphinganine-1-phosphate;[(2S,3R)-2-氨基-3-羟基-十八烷氧]膦酸;D-赤式-二氢-D-鞘氨醇-1-磷酸](CAS19794-97-9)}。SPC的抗体{定义为鞘氨磷酰胆碱,溶鞘磷脂,鞘氨磷脂酰胆碱,鞘氨醇磷酰胆碱,四乙基溴化铵(ethanaminium);2-((((2-氨基-3-羟基-4-十八碳烯)氧)羟基氧膦基)氧)-N,N,N-三甲基-,氯化物,(R-(R*,S*-(E))),2-[[(E,2R,3S)-2-氨基-3-羟基-十八-4-enoxy]-羟基-磷酰基]氧乙基1-三甲基-氯化铵(CAS10216-23-6)]}也可以是有用的。
1.优选的抗-S1P单克隆抗体。
描述了特异性单克隆抗-S1P抗体(抗-S1P mAb)。该抗体可用作治疗性分子海绵以选择性吸收S1P,并由此降低促-血管生成因子,促成纤维化因子和促肿瘤因子的有效胞外浓度。这可以导致肿瘤体积和转移潜力降低,以及同时阻断新血管形成,否则其可能喂养生长的肿瘤。该抗体(和具有等效活性的分子)还可用于治疗其他受S1P影响的过度增殖障碍,包括不想要的内皮细胞增殖,如在年龄相关性黄斑变性以及许多癌症中发生的。此外,S1P保护细胞免受细胞凋亡的能力可以被试剂(诸如导致标准促细胞凋亡化疗药物的功效增加的抗体)逆转。
B.其他生物活性信号传导脂质的抗体
本文所述的方法可用于制备抗除鞘脂(例如,SPC、神经酰胺、鞘氨醇、二氢鞘氨醇、S1P和二氢-S1P)外,许多其他胞外和胞内生物活性脂质的单克隆抗体。其他生物活性脂质类型包括白三烯、类二十烷酸、类二十烷酸代谢物(诸如HETE、前列腺素、脂氧素、环氧二十碳三烯酸和异类二十烷酸)、非-类二十烷酸大麻素介体,磷脂及其衍生物(诸如磷脂酸(PA)和磷脂酰甘油(PG))、心磷脂和溶血磷脂诸如溶血磷脂酰胆碱(LPC)和溶血磷脂酸(LPA)。简而言之,本发明适用于在重要细胞过程中具有多效效应的任何所需胞外和/或胞内信号传导生物活性脂质。生物活性脂质的其他实例包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰乙醇胺(PEA)、二脂酰甘油(DG)、硫苷脂、神经节苷脂、红细胞糖苷脂和脑苷脂。
C.缀合物
本文所述的单克隆抗体或其抗原结合片段,可以在体外单独使用或可以以非衍生或非缀合形式给受试者施用。在其他实施方式中,所述抗体、衍生物和变体可以是被衍生或与一个或多个分子实体连接。其他分子实体包括天然存在的、重组的或合成的肽、多肽和蛋白,非肽化学化合物(诸如同位素)、小分子治疗剂等。优选的小分子包括放射性标记、荧光剂和小分子化疗试剂。优选的蛋白包括生长因子、细胞因子和抗体(包括相同的抗体和所述抗体的衍生物或变体)。可以通过合适方法连接活性成分,其中考虑所述活性成分和预期应用等等。例如,本发明的单克隆抗体可以通过化学偶联、基因融合、非共价连接或其他合适方法与其他分子功能性连接。
因此本发明设想在一个或多个本发明单克隆抗体或其变体或衍生物与另一活性成分之间形成缀合物。所述缀合物可以是共价的或非共价的,且可以在活性成分之间经由接头或直接发生。所述缀合物的实例包括与同类或不同类的另一个治疗性单克隆抗体连接的本发明一个或多个单克隆抗体(或其抗原结合区)。备选地,本发明单克隆抗体或抗体衍生物或变体可以与不同类的治疗剂连接,例如小分子化疗试剂或放射性同位素。在一些实施方式中,两种或多种不同治疗剂的每一个的一个或多个(其中至少一个是本发明化合物)可以通过多价支架连接。
作为缀合物的备选,本发明的单克隆抗体或抗体衍生物或变体可以简单地与一个或多个不同治疗剂连接。例如,本发明单克隆抗体与适合与给受试者施用的递送载体(例如,脂质体、微团、纳米颗粒等)中的一个或多个其他类型治疗剂组合。
本发明还设想将本发明的单克隆抗体或抗体衍生物或变体(例如,针对具体的靶生物活性脂质具有反应性的一个或多个CDR)与蛋白或多肽缀合。例如,将来自免疫球蛋白重链或轻链可变区的一个或多个CDR可以移植到单克隆抗体中。
3.应用
本发明涉及用于治疗或预防过度增殖障碍的组合物和方法,所述过度增殖障碍诸如癌症、纤维化和血管生成、和心血管疾病、心脏病已经其他疾病、障碍或身体外伤和/或脑血管病和障碍,其中给患者施用治疗剂,所述治疗剂改变不想要、有毒和/或生物活性脂质、或其前体或代谢物的活性或浓度。本发明的治疗方法和组合物通过改变某些不需要的或有毒的脂质的绝对、相对和/或可利用浓度和/或活性来起作用。因此“有毒的”指疾病过程中具体脂质的参与,例如作为信号传导分子。
不希望受任何特定的理论限制,认为不适当浓度的脂质(诸如LPA)和/或其代谢物引起或促使多种疾病和障碍的形成,包括心脏病、神经性疼痛、癌症、血管生成、炎症和脑血管疾病,其中包括中风样内耳病理(例如,参见Scherer,等人(2006),CardiovascularResearch,vol.70;79-87)。同样地,本组合物和方法可用于治疗这些疾病和障碍,尤其是通过降低具体靶脂质(例如LPA)的有效体内浓度。根据本发明进行治疗的几类疾病描述于下。
A.过度增殖疾病和障碍
i.癌症
一种治疗策略是降低肿瘤促进剂(S1P)的胞外生物有效水平,单独或与常规抗癌治疗组合,包括施用化疗试剂,诸如蒽环类。最后,形成对S1P特异的单克隆抗体(mAb),其可以选择性的吸收来自血清的S1P,用作分子海绵来中和胞外S1P。由于证明S1P是促-血管生成的,针对抗体效力的另一好处来自抗体的饥饿生长中肿瘤的血液供应的能力。因此,另一个基于鞘脂的抗-肿瘤策略涉及组合CER和SPH产生的已知活化剂(多柔比星和相关蒽环类糖苷,放射疗法等),结合降低S1P水平的策略。
尽管已经提出基于鞘脂的抗癌方案(其靶向鞘脂代谢通路的关键酶,诸如SPHK),但没有强调S1P本身,很大程度上是因为攻击该靶标和相关靶标的困难。如本文所述,已经产生对S1P具有高特异性的单克隆抗体,其识别生理范围内的S1P并能通过分子组合来中和S1P。使用该抗体(及其衍生物)将剥夺生长中的肿瘤细胞的重要生长和存活因子。此外,当与常规癌症治疗(诸如手术、放射疗法和/或施用细胞毒性抗癌药)组合使用时,基于所述抗体的癌症治疗的使用也是有效。细胞毒素剂的实例,例如包括蒽环类药物、长春碱、丝裂霉素、博来霉素、细胞毒素核苷、紫杉烷类、埃坡霉素、盘皮海绵内酯、蝶啶类药物、diynenes和鬼臼毒素。那些类的成员例如包括,多柔比星、洋红霉素、柔红霉素、氨基蝶呤、甲氨蝶呤(methotrexate)、氨甲蝶呤(methopterin)、二氯甲氨蝶呤、丝裂霉素C、甲基丝裂霉素、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物、诸如依托泊甙、磷酸依托泊甙或替尼泊苷、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱、紫杉醇等。其他抗肿瘤药物包括雌莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、博莱霉素、吉西他滨、异环磷酰胺、美法仑、六甲密胺、塞替派、阿糖胞苷、idatrexate、三甲氧蝶呤、达卡巴嗪、左旋门冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、托泊替康、ara-C、比卡鲁胺、氟他胺、亮丙瑞林、吡啶并苯并吲哚衍生物、干扰素和白介素。其他细胞毒性药物在本领域中是熟知的。基于抗体的联合治疗可以通过使细胞对细胞凋亡敏感而最小化其毒性副作用来提高化疗试剂的功效,虽然单独施用抗体在延迟疾病进展中也是有效的。确实,抗-S1P mAb在人癌症的小鼠模型中和同种异体移植小鼠模型中延迟肿瘤进展的能力证实在治疗人和动物肿瘤中可利用抗-S1P抗体方法。此外,在异种移植模型中能治疗所述几种人癌症类型(例如,卵巢癌、乳腺癌、肺癌和黑素瘤)的发现,证实了抗-S1P抗体方法不局限于一种癌细胞或组织类型。
LPA介导多种细胞应答,包括细胞增殖、分化、血管生成和运动性。大量的实验发现说明胞外LPA通过刺激肿瘤细胞增殖、存活、侵入并通过诱导血管生成和转移,在几种人癌症进展中起关键作用。此外,LPA保护多种肿瘤细胞类型免受细胞凋亡。LPA与卵巢癌和乳腺癌长期有关[Fang,X.,等人,(2002)Biochim Biophys Acta,1582:257-64];在患者的血液和腹水中均发现LPA水平提高,其与肿瘤进展、血管生成和转移潜能有关。此外,主要负责LPA生产的酶,自体毒素(ATX)与人肿瘤(包括黑素瘤、肺癌、成神经细胞瘤、肝细胞癌、和多形性成胶质细胞瘤)的转移和侵入性质有关。因此认为LPA为癌症治疗的创新并有前途的靶标[Mills,G.B.and W.H.Moolenaar(2003)Nat Rev Cancer,3:582-91]。
认为用抗-LPA抗体(诸如本文所公开的)中和LPA将是癌症治疗中新的抗-血管生成和抗转移治疗方法。认为抗LPA的单克隆抗体作为“海绵”选择性结合LPA并由此降低体内胞外有效水平。认为这导致肿瘤发生和肿瘤生长的降低以,及同时阻断血管形成和转移潜能。此外,LPA保护细胞免受细胞凋亡的能力有可能由于抗体中和而丧失,由此提高标准促凋亡的化疗药物的功效。
ii.血管生成
血管生成指从已存在的血管形成新血管的过程。现在认为与实体瘤和循环肿瘤相关的血管生成是肿瘤发生的一个关键成分,因为目前肿瘤生长取决于新血管形成这个观点已被科学界广泛接受。S1P和LPA似乎对血管生成过程是重要的。
LPA是GROα(一种被认为通过其促-血管生成作用促进肿瘤发生的原癌基因)的主要的调节剂(Lee,等人(2006),CancerRes,vol.66:2740-8)。LPA还增强基质金属蛋白酶-2(一种在进行血管生成过程中,在细胞迁移中被识别的作用因子)的表达(Wu,等人(2005),Endocrinology,vol.146:3387-3400)。
S1P刺激DNA合成和人静脉内皮细胞(HUVEC)的趋化运动性,同时诱导多细胞结构分化(关键的早期血管形成)。S1P还促进骨髓衍生的内皮细胞前体向新血管形成位点迁移,且过表达S1P受体的细胞对抗血管生成药(沙利度胺和新伐司他)具有抗性。因此,S1P,以及特别是S1受体是血管生成和新血管形成所需的。最后,在S1P和其他促-血管生成生长因子(诸如VEGF、EGF、PDGF、bFGF和IL-8)之间发生串扰。例如,S1P反式激活EGF和VEGF2受体,而VEGF上调S1P受体表达(Igarashi,等人(2003),PNAS(USA),vol.100:10664-10669)。
应当理解,血管生成的临床控制是治疗癌症和其他血管生成依赖性疾病(诸如年龄相关性黄斑变性(AMD)和子宫内膜异位)的关键成分。抗-血管生成治疗剂还是特别有吸引力的,因为涉及肿瘤血管生成的血管内皮细胞不向肿瘤细胞那么早就突变;因此,与肿瘤细胞相比,血管内皮细胞较不可能获得对延长治疗的抗性,使它们成为有用的治疗靶标。
有几种证据表明S1P是潜在显著的促-血管生成生长因子,其在肿瘤血管生成中是重要的,所述证据包括:在多种使用HUVEC的体外试验中,抗-S1P抗体能中和S1P-诱导的管腔形成、血管内皮细胞的迁移并防止细胞死亡;将表达升高S1P水平的乳腺癌MCF-7细胞注射到裸鼠的乳腺脂肪垫中导致血管生成-依赖性肿瘤的增加,所述肿瘤比当使用对照细胞时更大和更多;抗-S1P抗体能急剧降低原位鼠黑素瘤同种异体移植模型中的肿瘤相关的血管生成;S1P增加向植入小鼠的Matrigel栓中的新毛细管生长,该作用能被抗-S1P抗体的全身施用中和;在鼠Matrigel栓试验中,体内施用抗-S1P抗体能完全中和促-血管生成生长因子-诱导的血管生成(例如,由bFGF和VEGF);S1P刺激体外和体内的bFGF和VEGF从肿瘤细胞释放,该作用能被抗-S1P抗体逆转;S1P增强大量不同类型癌细胞的体外运动性和侵入,其中包括多形性成胶质细胞瘤细胞;以及抗-S1P抗体显著降低与AMD动物模型相关的新血管形成。
S1P在血管生成-依赖性肿瘤中的重要性使得S1P成为一个优秀的癌症治疗靶标。确实,胞外S1P的抗体中和可能导致哺乳动物(包括人)中癌症进展的显著降低,这是用支持肿瘤生长所需的营养和氧的共同丧失来抑制血管形成的结果。因此,抗-S1P抗体具有几种作用机制,包括:(1)对肿瘤细胞生长的直接作用;(2)对血管内皮细胞的间接抗-血管生成作用;和(3)预防其他促-血管生成生长因子的释放和作用的间接抗-血管生成作用。因此,除了提供抗血管生成治疗外,抗-S1P抗体还能用作抗转移治疗剂。
血管生成的控制是治疗除癌症外的其他血管生成-依赖性疾病的关键成分,诸如老年性黄斑变形、早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、子宫内膜异位和类风湿性关节炎(Carmeliet,P.(2005),Nature,vol.Vol.438(15):932-6)。
抗-血管生成治疗剂还是特别有吸引力的,因为涉及肿瘤血管生成的血管内皮细胞不像癌细胞那么早就突变;因此,与肿瘤细胞相比,血管内皮细胞较不可能获得对延长治疗的抗性,使它们成为有用的治疗靶标。SIP抗体及其衍生物还在治疗与S1P活性相关的其他过度增殖障碍中是有用的,诸如由异常内皮细胞增殖引起的那些,如伴随与AMD相关的血管生成所发生的。
iii.纤维发生和结疤
(a)S1P、成纤维细胞和重建过程
很清楚心脏成纤维细胞,特别是心肌成纤维细胞是应答细胞死亡和心肌梗塞(MI)的炎症的疤痕形成中的关键细胞元件。心肌成纤维细胞胶原基因表达是重建的标志和疤痕形成所必需的。除了S1P的其他活性外,S1P还是炎性介体,除了激活血小板、刺激血管生成和促进平滑肌功能外,其通过激活成纤维细胞迁移和增殖来对伤口愈合具有重要贡献。因此,可能由损伤的心肌局部产生的S1P部分地造成与心脏重构和心力衰竭相关的不适应的伤口愈合,特别是通过活化心脏中的心肌成纤维细胞。
细胞对S1P的应答通常有三种:防止细胞死亡;刺激增殖;和促进迁移应答。因此,S1P活性或与具体障碍、细胞系等的关系可以通过采用用于该目的的配合分析来评估。有证据表明成纤维细胞以三种方式应答S1P以促进伤口愈合。例如,在下述实施例部分中的几个实施例中,陈述了证明S1P通过提高心脏心肌成纤维细胞的活性来促进重建(增殖、迁移和胶原基因表达)。
抗-S1P抗体或抗体衍生物还预防与手术过程相关的过度结疤(Excess scarring)。受伤或手术后的过度结疤,不是胎儿皮肤组织而是成年人的一个问题(Adzick and Lorenz(1994),Ann Surg,vol.220:10-18),其归因于受伤后成人皮肤组织中过多的TGF-β。暗示S1P为TGF-β信号传导系统的潜在活化剂。因此,预期抗S1P抗体限制受伤或手术后的过多疤痕。
(b)通过LPA和S1P防止细胞死亡
LPA是一种保护癌细胞免受细胞凋亡的试剂。因此,如上面详细讨论的,例如抗LPA的抗体使癌细胞对化学疗法更易感。事实上,这已经在本文下面描述的使用新近开发的抗-LPA单克隆抗体的实施例中得到证实。
与许多细胞类型类似,通过加入S1P能直接保护成纤维细胞免受细胞凋亡,并且SPHK的抑制剂增强细胞凋亡,且S1P阻断细胞色素C的释放和所得胱天蛋白酶的激活。此外,用SPHK1转染的成纤维细胞显示出防止细胞凋亡,该效果可能取决于SPHK1向质膜的转移。已经很好确定了SPHK1上调Akt,由此调节Bc1-2家族成员并防止细胞凋亡。鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中的Akt磷酸化也需要S1P3。同样,SPHK的上调并导致S1P水平的增加保护心脏成纤维细胞免受细胞凋亡。
神经酰胺,S1P的上游代谢物,降低线粒体的膜电势,与诱导死亡的线粒体蛋白的转录升高相一致。由于可变电阻机制,S1P可具有相反的作用并保护心脏心肌成纤维细胞(即,在心脏中完全分化的成纤维细胞)免受细胞凋亡。确实,S1P甚至激活自体吞噬作为保护机制。中和抗-S1P抗体(或结合并用于隔离S1P的其他分子)能逆转这些影响。
B.疼痛
认为生物活性脂质在疼痛(包括神经性疼痛和与化学治疗相关的疼痛)的发病机理中起重要作用。
使用多种药理学和遗传学方法,包括使用缺少LPA1受体的小鼠,确立了LPA信号传导在神经性疼痛的形成中的显著作用(参见,即,Ueda,等人(2006),Pharmacol Ther,vol.109:57-77;Inoue,等人(2004),Nat Med.,vol.10:712-8)。具有神经损伤的野生型动物形成行为上的痛觉异常和痛觉过敏,这与背神经后根中的脱髓鞘以及脊髓背角中的蛋白激酶C异构体和在背神经后根神经中枢中的21钙通道亚单位的表达增加平行。鞘内注射LPA诱导与在神经连接后观察到的那些类似的行为、形态和生化变化。相反,缺少能激活Rho-Rho激酶路径的单一LPA受体(LPA-1,还称为EDG-2)的小鼠在外周神经损伤后不形成神经病理性疼痛的信号。Rho和Rho激酶的抑制剂也防止这些神经性疼痛信号。这些结果暗示受体介导的LPA信号传导在起始神经病理性疼痛中是关键的,并且抗LPA的抗体很有可能减轻患有该病况的个体中的神经性疼痛[Moulin,DE(2006),Pain Res Manag,vol.11,Suppl A:30A-6A]。
在其他疼痛的情况下,与化学疗法相关的疼痛是许多小分子化疗试剂的主要剂量限制性毒性。确实,已经报导了许多化学治疗诱导的疼痛的案例。例如,使用紫杉醇(Taxol)(一种来自太平洋紫杉树紫杉属短叶苏木(Taxus brevifolia)的抗肿瘤药)治疗多种癌症,包括卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。然而紫杉醇的效力受到高生发率的严重痛性外周神经病(例如麻痹和灼痛)的产生所限。抗与所述疼痛相关的生物活性脂质的单克隆抗体,例如LPA(或含有其脂质结合部分的该抗体的衍生物),可以与紫杉醇联合施用以减轻与化疗试剂相关的疼痛。作为减轻该剂量限制性毒性的结果,当与所述单克隆抗体或抗体衍生物联合施用时,待施用的紫杉醇的量可以更高(并因此甚至更有效)。在一些实施方案中,所述化疗试剂(或其他药物)可以与抗体或抗体衍生物缀合或以其他方式与抗体或抗体衍生物相连,例如,通过将小分子化疗试剂与抗体共价相连,通过将小分子化疗剂与连有单克隆抗体或至少一个衍生自单克隆抗体的结合生物活性脂质的结构域的多价支架相连等,所述单克隆抗体对靶生物活性脂质具有特异性反应性。
C心血管疾病和障碍
缺血性心脏病是美国的第一位死亡原因。每年约有一百五十万人遭受心脏病发作(心肌梗塞),其中约有三分之一(即,约500,000)是致命的。此外,约六百七十五万美国人患有心绞痛(心脏缺血最常见的表现形式)。仅在美国总共有超过一千三百万患者患有缺血性心脏病。“缺血”是一种与向身体局部供应氧合血流不足相关的病况,通常由供应其的血管的收缩或阻塞引起。缺血在流向组织的血流降低到临界水平之下时发生。这种血流的降低可能由下述原因产生:(i)由栓子(血块)引起的血管阻塞;(ii)由于动脉硬化症引起的血管阻塞;(iii)血管破裂(出血性中风);(iv)由于急性血管收缩引起的血管阻塞;(v)心肌梗塞(当心脏停止时,流向器官的血液减少,由此导致缺血);(vi)外伤;(vii)手术,在手术期间需要减少或停止流向组织或器官的血液以实现手术目的(即,血管成形术、心脏和肺/心脏移植);(viii)与某些试剂接触,例如,多巴酚丁胺或腺苷(Lagerqvist,等人(1992),Br.HeartJ.,vol.68:282-285);或(ix)作为心脏毒性的抗肿瘤试剂和其他化疗试剂,诸如多柔比星。
即使血液流速(体积/时间)是足够的,由于缺氧仍然可能发生缺血,即,其中血液的氧含量不足以满足受影响区域的正常细胞需氧量的病况。在定义上,缺氧血与含氧量正常的血截然不同,即,其血液中氧含量不足以满足正常细胞需氧量。缺氧病况由,但不限于下述原因产生,不利影响心脏泵血的心力衰竭的形式,诸如高血压、心律不齐、败血性休克、外伤、心肌症和充血性心脏病。
当心脏血流受限制(缺血)和/或当给心肌供应的氧被减少(缺氧)使得供应量不能满足心脏对氧的要求时,发生心肌缺血障碍。冠心病(CAD)由动脉硬化引起,特别是动脉硬化症,是缺血的最常见原因,并具有诸如稳定或不稳定心绞痛之类的症状。CAD能导致急性心肌梗塞(AMI)和心脏性猝死。导致心力衰竭的缺血病况的范围指急性冠状动脉综合征(ACS)。再灌注损伤通常是缺血的结果,特别是当使用抗凝血剂、溶解血栓剂或抗心绞痛药时,或当通过血管成形术或通过冠状动脉移植法手术打开心血管时。
目前,对急性心肌梗塞和其他心脏病的治疗包括,但不限于机械装置和与其相关方法,例如,冠状动脉血管成形术;溶解血栓剂诸如链激酶、tPA及其衍生物。这些治疗的佐剂包括β-受体阻滞药、阿司匹林和肝素,以及糖蛋白(GP)IIb/IIIa抑制剂。GP IIb/IIIa抑制剂降低血小板凝聚和血栓形成。实例包括单克隆抗体(例如,阿昔单抗)、环肽(例如,依替巴肽)、和非肽类拟肽(nonpeptidepeptidomimetics)(例如,替罗非班(tirofibian)、拉米非班、珍米洛非班、西拉非班和来达非班(lefradafibian))。
预防性治疗包括降低患者胆固醇水平的那些,例如通过饮食控制和药物干预。他汀类是一种用于降低胆固醇水平的试剂。认为他汀类通过抑制HMG-CoA还原酶的活性来起作用,该还原酶反过来又增加胆固醇受体的肝脏产生。肝脏胆固醇受体结合胆固醇并将其从血液中除去。所述试剂包括洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀和氟伐他汀。这些和其他他汀类减慢冠心病的进程,并能诱导患者中动脉粥样硬化病变的退化,虽然没有完全理解使用所述药物的副作用的范围。
应当理解,对生物活性脂质有反应性的单克隆抗体和衍生物,以及其他片段和变体单独或与其他治疗方法(包括用药物和/或手术的治疗)组合可用于实现心脏治疗。此处,“心脏治疗”指预防和/或治疗心肌疾病、紊乱或物理外伤,包括心肌缺血、AMI、CAD和ACS、以及外伤或心脏细胞和组织受损,其可能在引起哺乳动物(特别是人)中缺血或缺血/再灌注受损的干扰心脏病学或其他手术或医疗过程或治疗过程中发生,或作为干扰心脏病学或其他手术或医疗过程或治疗的结果发生。
除了心脏和大脑,抗-S1P方法还可用于其他基于血管的、类中风病况,诸如多种内耳病理(Scherer,等人(2006),Cardiovasc Res,vol.70:79-87)。
D.脑血管疾病和障碍
经历脑缺血的患者通常遭受从瞬时神经功能缺损到不可逆损伤(中风)或死亡的残废。脑缺血,即,流向中枢神经系统的血流减少或停止,可以表征为局部或全身的。局部脑缺血指由在脑血管中由颅内或颅外的脑动脉中的部分或完全闭塞引起的血流减少或停止。所述闭塞通常导致中风、特征在于持续至少24小时的神经功能缺损的急性发作的综合征,反映局部涉及中枢神经系统并是脑循环干扰的结果。其他局部脑缺血的原因包括由蛛网膜下出血或医源性干涉引起的血管痉挛。
全身性脑缺血指由全身性循环衰竭引起的脑血管中的血流减少,其迅速导致向组织供应的氧和营养的减少。因此,全身性脑缺血由严重的心脏功能衰退引起,且更通常地由AMI引起,虽然干扰原因包括由急性心肌炎或心搏停止或延长的心肺旁路后的心肌收缩抑制引起的泵衰竭;机械性异常,诸如严重的心脏瓣膜狭窄、大量主动脉瓣返流或二尖瓣返流,以及急性获得性室间隔缺损;以及来自心律不齐,诸如心室颤动,或来自介入操作,诸如颈动脉血管成形术、支架、动脉内膜切除术、心脏导管插入术、电生理研究和血管成形术。
通过用细胞死亡后导致胞内Na+和Ca++的增加来对临界细胞进行去极化,中风和/或MI后的缺血损伤典型地导致细胞死亡。控制该过程的一种通道是瞬时受体电位蛋白(Transient Receptor PotentialProtein,一种非电压依赖性通道),且最近将S1P鉴定为通过GPCR-依赖性机理的该通道的激活剂。此外,瞬时受体电位蛋白,鞘氨醇激酶1和鞘氨醇激酶2与Egr-1共享启动子区域,Egr-1被认为是一种调节心血管病理的重要总开关(Khachigian,LM(2006),Circ Res,vol.98:186-91)并且Sp1是一种在神经细胞死亡中起关键作用的转录因子(Simard,等人(2006),NatMed.,vol.12:433-40)。基于这些发现,预期抗S1P的抗体能减轻由缺氧后的缺血引起的细胞死亡。
本领域的技术人员能容易地鉴定患有中风的患者或处于患中风、脑缺血、头部外伤或癫痫症风险的患者。例如,处于患有中风风险的患者包括患有高血压或进行大手术的那些。传统上,急性缺血性中风的紧急处理主要由普通的支持治疗组成,例如水合作用、监视神经状态、血压控制和/或抗血小板或抗凝血治疗。给中风患者施用肝素的效果有限且不稳定。在一些情况下,在一段时间内缺血问题会自己解决,这是由于如下事实:在几天的时间内一些血栓被吸收到循环中或碎裂并传播到远处。组织纤溶酶原激活剂(t-PA)已经被批准用于治疗急性中风,虽然所述全身性治疗与脑内出血和出血性并发症的风险增加有关。除了施用溶解血栓剂和肝素外,目前在市场上对于患有阻塞性局部脑缺血的患者来说没有其他治疗选择。血管痉挛可能部分地对血管舒张剂有应答性。神经血管手术的新开发领域(涉及在颈动脉中放置微创装置以物理上除去不良病变)在将来可以为这些患者提供治疗选择,虽然这类操作可能导致自身血管痉挛。
应当理解,对生物活性脂质具有反应性的抗体、抗体-衍生物及其他免疫衍生部分可单独或与其他治疗方法(包括用药物和/或手术治疗)联合用于实现脑血管治疗。此处“脑血管治疗”指涉及针对预防和/或治疗与脑缺血和/或缺氧有关的疾病和障碍的治疗。特别关注的是由全身缺血引起的脑缺血和/或缺氧,所述全身缺血由引起哺乳动物(特别是人)中缺血或缺血/在灌注脑血管损伤的心脏病、以及外伤或手术或医疗过程或治疗引起。
E.结合生物活性脂质的抗体的诊断性和治疗性应用
由于已阐明了多种生物活性脂质在疾病中的作用,还能预见生物活性脂质的抗体结合剂在诊断和治疗诊断(theranostics)中的新作用。根据本发明,提供了使用与固体支持物结合的衍生脂质来增强生物活性脂质的检测的方法。除了在抗体产生和表征以及在研究中的使用这些检测方法外,增强的生物活性脂质的检测还提供对与生物活性脂质相关疾病的有价值的诊断方法。当与其他技术组合时,提供了设计最佳患者治疗的治疗诊断方法。一个非限制性实例是抗-S1P抗体在诊断和治疗诊断方法中的用途,涉及S1P作为癌症生物标记物的角色。还预想使用靶向LPA或其他活性脂的抗体,并用于其他疾病适应症的诊断和治疗诊断方法。
最近,科学文献显示S1P是有效的致瘤生长因子,其可能从肿瘤细胞释放,且S1P可能是早期癌症检测的新生物标记物。在多种癌肿类型中,负责生产S1P的酶SPHK被显著上调(French,Schrecengost等人2003)。与相邻的正常组织相比,在恶性乳腺癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、子宫癌、肾癌和直肠癌中SPHK活性被上调2-3倍。这些研究者还显示SPHK表达在患者间变化,表明一些患者的肿瘤比患有同样肿瘤类型的其他患者更依赖于S1P。检索商购可得的基因组数据库(ASCENTA,Genelogic Inc.,GaithersburgMD)证实SPHK的相对表达通常在多种恶性肿瘤中显著提高。
最近的出版物还显示S1P是新的癌症生物标记物[Xu,Y.等人,(1998)JAMA280:719-723;Shen,Z.等人,(2001)Gynecol Oncol83:25-30;Xiao,Y.J.等人,(2001)Anal Biochem290(2):302-13;Sutphen(2004)Cancer Epidemiology13(7)1185-91]。例如,Sutphen等人还显示血清S1P水平在早期卵巢癌患者中升高(Sutphen 2004)。从所述数据可以推测乳腺癌患者也可以在其对S1P的依赖性上显示出一些可变性。总之,这些初步观察提示可以预测对个体患者(如果该患者的活检组织、血液、尿或其他组织或液体样品显示升高的S1P水平)的抗-S1P治疗剂,例如,抗-S1P mAb治疗剂的成功。
S1P在生物液体中的潜在用途已经被下述专利公开:US6,534,323,US 6,534,322;US 6,210,976;US 6,858,383;US6,881,546;US 7,169,390和US 6,500,633,通常均以临时申请进行命名。
即使人源化抗体具有低毒性和大的治疗指数,对患者和卫生服务来说它们是非常昂贵的。因此,抗-S1P mAb治疗剂的直接应用于最可能对该治疗有应答的那些来说会降低风险和最小化成本,从而提供最佳的患者受益。
下面概述的是用于改善疾病管理的生物脂质诊断和治疗诊断的几个推荐的应用。
1.S1P可用做生物标记物来预测个体患者的治疗功效,特别是当结合基于鞘脂的基因组时。基于最近的发现,我们推测S1P依赖性肿瘤除了大量的S1P血清来源外,能产生其自身的S1P。高度攻击性肿瘤利用生产其自身生长因子的策略,而我们认为S1P是一种生长因子。因此,来自个体患者的血清、血浆或尿测量总S1P将是患者结果的一个预测。此外,S1P生产集中在肿瘤自身和肿瘤微环境中(例如,间质流体)。下文的实施例11描述了抗-S1P mAb在肿瘤切片的免疫组织化学方法用于估计肿瘤自身的S1P产生中的用途。SPHK的上调证实是有用的,但由于激酶是一种酶,认为与如果依赖于激酶自身的RNA或蛋白表达相比,通过S1P产生测量的信号更高。此外,假定其肿瘤S1P受体和SPHK表达的上调的患者更可能具有依赖S1P作为生长因子的肿瘤。认为这些患者将最受益于我们推定的抗-S1P mAb疗法。因此,来自通过定量PCR分析活检组织的,对S1P受体和SPHK的相对表达的生物分析将提供强的治疗诊断平台。该治疗诊断平台由血清S1P标记物分析结合作为疾病替代标记物的S1P-相关蛋白标记物的基因组学或蛋白组学定量组成。该新的多标记物分析将提供用于预测对基于抗S1P mAb(SPHINGOMABTM)治疗的个体应答性的强大平台。
2.S1P可用作替代标记物来滴定治疗方案。来自用抗S1P mAb治疗的患者的血清S1P浓度具有被用作评估治疗过程的替代标记物的潜力。使用患者血清、血浆或尿样品的基于ELISA的平台允许准确测量S1P生物标记物水平和更精确测定个体的抗-S1P mAb给药方案。可以将替代标记物水平与标准的临床终点联合使用来测定医疗方案的功效。
3.S1P可用作用于早期检测癌症的筛选工具。由于进展阶段和治疗成功之间的强烈相关,癌症的早期检测是引起关注的。由于大多数患者无症状这一个事实,卵巢癌一期是非常难检测的。到诊断出卵巢癌时,大多数患者已处于疾病晚期。在较早阶段的检测对患者结果显然是有利的。如上所述,卵巢癌患者的血清含有2倍高的S1P,且该升高用我们目前的ELISA平台是容易检测的。由于许多实体瘤类型,包括卵巢癌,显示升高的SPHK表达,推测患有这些癌症的许多患者将显示升高的血液和/或尿S1P,这允许临床医师更早干预疾病进展。
本文描述的衍生生物活性脂质还可用于检测患者液体或组织样品中的抗体水平。不局限于下述,检测血液中抗-鞘脂抗体的存在的免所述疫分析可用于间接测试患有慢性缺血病况、癌症或自身免疫障碍(诸如多发性硬化)的患者中增加的鞘脂。该分析基于如下推测:鞘脂的血液水平的升高导致患者产生抗-鞘脂抗体,类似于在患有结肠直肠癌的患者中观察到的抗-乳糖基鞘氨醇抗体(JozwiakW.& J.Koscielak,Eur.J.Cancer Clin.Oncol.18:617-621,1982)和在麻疯病患者的血清中检测到的抗-半乳糖脑苷脂抗体(Vemuri N.等人,Leprosy Rev.67:95-103,1996)。
F.研究
本发明生物活性信号传导脂质质靶标可立即用于高通量筛选分析中,用于筛选候选化合物以鉴定具有所需活性的那些,即,抑制能催化产生不需要的生物活性信号传导脂质的反应的酶或阻断生物活性信号传导脂质与其受体的结合。由此鉴定的化合物可用作常规的“前导化合物”或其自身可用作治疗剂。本发明的筛选方法包括使用筛选分析从不同分子的文库中鉴定一个或多个具有所需活性的化合物。“筛选分析”是经设计用于识别、分离和/或确定在具有预选的活性的集合中的化合物结构的选择性分析。所述集合可以是根据本领域中已知的方法制备的传统组合文库,或可以是商购获得的并可以是对潜在的生物活性信号传导活性预选的大量有机结构或结构。“鉴定”是指分离具有所需活性的化合物,并确定其化学结构(包括但不限于分别确定多肽的氨基酸序列和核酸的核苷酸序列),和另外地或备选地,纯化具有所筛选活性的化合物。设计生化和生物分析在广泛范围的系统(从蛋白-蛋白相互作用、酶催化、小分子-蛋白结合到细胞功能)内测试活性。所述分析包括自动、半自动分析和高通量筛选分析。
实施例
本发明通过过参考下述详细的实施例来进一步进行描述。在任何情况下,这些实施例都不应理解为对本发明的限制。
实施例1 制备S1P的代表性巯基化类似物的合成方案
该实施例中描述的合成方法通过主要使用初级常规有机化学连续加入结构元件来制备抗原。在图1中提供该实施例中描述的方法的图示,在下面的合成描述中的化合物编号指图1中的编号结构。
该合成方法开始于商购获得的15-羟基十五炔,1,通过甲基磺酰氯激活所述15-羟基基团以促进羟基置换以产生磺酸酯,2。用叔丁基硫醇取代所述磺酸酯得到保护的硫醚,3,其用Garner’s醛缩合得到4。温和地将炔基部分还原为烯(5),然后通过酸催化打开噁唑烷(oxazolidene)环得到S-保护和N-保护的硫醇取代鞘氨醇,6。在最后一步中,用二碳酸二叔丁酯再衍生化来减轻在酸催化开环期间N-BOC基的损失。
应当理解,化合物6本身可用作制备半抗原的抗原以产生针对鞘氨醇的抗体,或,备选地,作为两种不同的合成方法的起始材料来制备巯基化S1P类似物。在一个方法中,用磷酸三甲酯对化合物6进行磷酸化得到化合物7。用三甲基溴硅烷处理化合物7除去来自磷酸酯的甲基和来自伯胺的叔丁氧羰基,得到在硫上只有叔丁基作为唯一保护基团的化合物8。为了除去该基团,用NBS代替叔丁基以形成二硫化物,9,然后对其进行还原得到巯基化S1P类似物,10。
另一方法涉及直接用NBSC1处理化合物6形成二硫化物,11,然后对其进行还原形成N-保护的巯基化S1P类似物,12。用温和的酸处理该化合物得到巯基化的鞘氨醇类似物,13,对其进行酶催化地磷酸化(例如,鞘氨醇激酶)得到巯基化S1P类似物,10。
对所述的合成方法进行改变是可能的,尤其是关于保护和去保护试剂的选择,例如,在实施例3中描述的使用三甲基二硫化三氟甲基磺酸盐(trimethyl disulfide triflate)对硫醇进行去保护。
化合物2.将DCM(400mL)加入到装有1(10.3g,45.89mmol)的500mL RB烧瓶中,并将所得溶液冷却到0℃。接下来,一次性加入TEA(8.34g,82.60mmol,9.5mL),然后在10分钟内逐滴加入MsCl(7.88g,68.84mmol,5.3mL)。允许在室温下搅拌反应半个小时或直到起始材料消失(Rf=0.65,5:1己烷:EtOAc)。用NH4Cl(300mL)淬灭该反应,并用DCM(2 X 200mL)萃取。用MgSO4干燥有机层,过滤并将滤液蒸发得到固体(13.86g,99.8%的产率)。1H NMR(CDCl3)δ 4.20(t,J=6.5Hz,2H),2.98(s,3H),2.59(td,J=7Hz,3Hz,2H),1.917(t,J=3Hz,1H),1.72(五重峰,J=7.5Hz,2H),1.505(五重峰,J=7.5Hz,2H),1.37(brs,4H),1.27(brs,14H).13C{1H}NMR(CDCl3)δ 85.45,70.90,68.72,46.69,38.04,30.22,30.15,30.14,30.07,29.81,29.76,29.69,29.42,29.17,26,09,19.06,9.31。在化合物2的HRMS分析(ES-TOF)中观察到的主要离子为m/z=325.1804(C16H30O3S的计算值:M+Na+325.1808)。
化合物3.向1L RB三颈烧瓶中装入叔丁硫醇(4.54g,50.40mmol)和THF(200mL),然后置于冰浴中。在30分钟内加入n-BuLi(31.5mL,1.6M,在己烷中)。接下来,在2分钟内加入溶于THF(100mL)的化合物2(13.86g,45.82mmol)。允许反应搅拌1小时或直至起始材料消失(Rf=0.7,1:1己烷/EtOAc)。用饱和NH4Cl(500mL)淬灭反应并用EtO2(2 X 250mL)萃取,用MgSO4干燥,过滤,并蒸发滤液得到黄色的油状物(11.67g,86%的产率)。1H NMR(CDCl3)δ 2.52(t,J=7.5Hz,2H),2.18(td,J=7Hz,2.5Hz,2H),1.93(t,J=2.5Hz,1H),1.55(五重峰,J=7.5Hz,2H),1.51(五重峰,J=7Hz,2H),1.38(brs,4H),1.33(s,9H),1.26(s,14H).13C{1H}NMR(CDCl3)δ 85.42,68.71,68.67,54.07,42.37,31.68,30.58,30.28,30.26,30.19,30.17,29.98,29.78,29.44,29.19,29.02,19.08。
化合物4.将装有化合物3(5.0g,16.85mmol)的250mLSchlenk烧瓶抽真空并用氮气填充三次,然后加入无水THF(150mL)。将所得溶液冷却到-78℃。接下来,在2分钟内加入n-BuLi(10.5mL,在己烷中1.6M)。并在-78℃下搅拌反应混合物18分钟,然后除去冷却槽20分钟。继续干冰浴。15分钟后,然后在五分钟内加入于无水THF(10mL)中的Garner’s醛(3.36g,14.65mmol)。20分钟后,除去冷却槽。在2.7小时后薄层色谱(TLC)显示Garner’s醛已经消失。用饱和NH4Cl水溶液(300mL)淬灭反应并用Et2O(2 X 250mL)萃取。用Na2SO4干燥合并的Et2O相,过滤并蒸发滤液得到粗化合物4和其同-非对映异构体(未显示在图1中),为黄色油状物(9.06g)。然后在下一步中无需进一步纯化直接使用该材料。
化合物5.为了还原化合物4中的三键,将所述油状物在氮气下溶于无水Et2O(100mL)中。在室温下,将RED-A1(20mL,在甲苯中65%)缓慢加入到所得的溶液中以控制氢气(H2)的放出。在室温下搅拌反应过夜或到当TLC显示起始材料消失时(Rf=0.6,在1:1EtOAc:己烷中)并用冷MeOH或NH4Cl水溶液缓慢淬灭以控制H2的放出。用硅藻土(Celite)垫过滤所得的白色悬浮液并用EtOAc(2 X 400mL)萃取滤液。用MgSO4干燥合并的EtOAc萃取相,过滤并蒸发滤液得到粗化合物5及其同-非对映异构体(未显示在图1中),为黄色油状物(7.59g)。
化合物6.将含有化合物5的油状物溶于MeOH(200mL)中,加入PTSA水合物(0.63g),并在室温下搅拌溶液1天,然后在50℃下搅拌2天,此时,TLC显示所有起始材料(5)已经消失。然而,存在一些极性材料,说明酸已经部分切掉BOC基团。通过加入饱和的NH4Cl水溶液(400mL)来结束反应,并用醚(3 x 300mL)萃取。用Na2SO4干燥合并的醚相,过滤并蒸发滤液至干燥,得到5.14g的油状物。为了对所形成的氨进行再保护,将所述粗产物溶于CH2Cl2(150mL),并向其加入BOC2O(2.44g)和TEA(1.7g)。当TLC(1:1己烷/EtOAc)显示在基线上不再有材料时,加入饱和NH4Cl水溶液(200mL),在分离有机相后,用CH2Cl2(3 X 200mL)萃取混合物。用Na2SO4干燥合并的萃取相,过滤并将滤液浓缩至干燥,得到黄色油状物(7.7g),其在硅胶柱上使用梯度的己烷/EtOAc(多至1:1)进行色谱分析以分离非对映异构体。通过使用1:1PE/EtOAc的TLC,反式异构体(化合物6)的Rf为0.45。对于顺式异构体(未显示在图1中),其Rf为0.40。化合物6的产量为2.45g(根据Garner’s醛,总产率为39%)。反式异构体的1H NMR(CDCl3)δ 1.26(brs,20H),1.32(s,9H),1.45(s,9H),1.56(五重峰,2H,J=8Hz),2.06(q,2H,J=7Hz),2.52(t,2H,J=7Hz),2.55(brs,2H),3.60(brs,1H),3.72(ddd,1H,J=11.5Hz,7.0Hz,3.5Hz),3.94(dt,1H,J=11.5Hz,3.5Hz),4.32(d,1H,J=4.5Hz),5.28(brs,1H),5.54(dd,1H,J=15.5Hz,6.5Hz),5.78(dt,1H,J=15.5Hz,6.5Hz).13C{1H}NMR(CDCl3)δ 156.95,134.80,129.66,80.47,75.46,63.33,56.17,42.44,32.98,31.70,30.58,30.32,30.31,30.28,30.20,30.16,30.00,29.89,29.80,29.08,29.03。
C27H53NO4S的分析计算值:C,66.48;H,10.95;N,2.87.实验值:C,65.98;H,10.46;N,2.48.
化合物7.向溶于无水吡啶(2mL)的醇化合物6(609.5mg,1.25mmol)的溶液中加入CBr4(647.2mg,1.95mmol,1.56当量)。在冰浴中冷却烧瓶,并在2分钟内逐滴加入P(OMe)3(284.7mg,2.29mmol,1.84当量)。4分钟后,除去冰浴,并在12小时后用醚(20mL)稀释该混合物。用HCl水溶液(10mL,2N)洗涤所得混合物以形成乳液,其在用水(20mL)稀释后分离。用醚(2 x 10mL),然后EtOAc(2 x 10mL)萃取水相。合并醚萃取物和第一次的EtOAc萃取物,并用HCl水溶液(10mL,2N)、水(10mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)洗涤。用最后的EtOAc萃取物反萃取水性洗涤液。用MgSO4干燥合并的有机相,过滤并浓缩滤液得到粗产物(1.16g),其通过快速色谱在二氧化硅(3 x22cm柱)上使用CH2Cl2然后CH2Cl2-EtOAc(1:20,1:6,1:3和1:1产品开始洗脱,6:4,7:3)进行纯化。前期级分含有56.9mg的油状物。后期级分提供透明无色的油状产物(化合物7,476.6mg,64%)
C29H58NO7PS(595.82)的分析计算值:C,58.46;H,9.81;N,2.35.实验值:C,58.09;H,9.69;N,2.41.
化合物8.对含有化合物7(333.0mg,0.559mmol)和搅拌棒的烧瓶抽真空并用氮气填充。用注射器注入乙腈(4mL,由CaH2蒸馏得到)并将含有溶液的烧瓶在并冰浴中冷却。使用注射器,在1分钟内加入(CH3)3SiBr(438.7mg,2.87mmol,5.13当量)。35分钟后,用另一部分乙腈(1mL)清洗烧瓶的上部并除去冰浴。在另一80分钟后,取出等分试样,通过在其上吹扫氮气来干燥溶液,残余物在CDCl3中通过1H NMR进行分析,其只显示归于P-OCH3部分的痕量峰。20分钟后,向反应混合物中加入水(0.2mL),然后加入用于分析等分试样的CDCl3溶液,并在旋转蒸发仪上浓缩所述混合物到ca.0.5mL体积。按份使用丙酮(3mL)将所述残余物转移到校准的测试管中,形成浅棕色溶液。按份加入水(3mL)。加入0.3mL后,观察到浑浊。加入总共1mL后,形成胶状沉淀。另外加入0.6mL水,变得更浑浊且胶状分离,但最后一部分水似乎没有改变混合物的外观。总之,在数小时内完成该过程。离心该管并通过移液管除去上清液。所述固体不再是胶状的,在真空下用P4O10干燥,得到化合物8(258.2mg,95%),为一水合物。
C22H46NO5PS+H2O(485.66)的分析计算值:C,54.40;H,9.96;N,2.88.实验值:C,54.59;H,9.84;N,2.95。
化合物9.在手套箱中将化合物8(202.6mg,0.417mmol)加入到含搅拌棒、无水THF(3mL)和冰醋酸(3mL)的测试管中。加入NBSC1(90mg,0.475mmol,1.14当量),并在半小时后,得到澄清溶液。在总共9小时后,蒸发等分试样至干燥,并在CDCl3中用1H NMR分析残余物。对应于CH2StBu和CH2SSAr的峰显示反应约完成了75%,将该谱与CDCl3中纯NBSC1的谱比较显示在该反应中没有试剂残留。因此,加入另一部分(24.7mg,0.130mmol,0.31当量),3个小时后加入另一个部分(19.5mg,0.103mmol,0.25当量)。在另一小时后,将所得混合物转移至新的测试管中,使用THF(2mL)清洗并加入水(1mL)。
化合物10.将PMe3(82.4mg,1.08mmol,加入的2-硝基苯亚磺酰氯总量的1.52倍)加入到上述化合物9的澄清溶液中。所述混合物变暖和浑浊,并随着时间有沉淀形成。4.5小时后,加入甲醇,并离心该管。固定沉淀有困难,其占据管底部1cm。使用移液管除去澄清的黄色上清液。加入甲醇(5mL,用氮气除氧),离心该管,并用移液管除去上清液。重复该循环3次。当浓缩时,最后的甲醇洗涤仅留下4.4mg的残余物。在真空下用P4O10干燥大块的固体残余物,得到化合物10(118.2mg,68%)为一盐酸盐。
C18H38NO5S+HCl(417.03)的分析计算值:C,51.84;H,9.43;N,3.36.实验值:C,52.11;H,9.12;N,3.30.
化合物11.化合物6(1.45g,2.97mmol)溶于AcOH(20mL),并一次性加入的NBSC1(0.56g,2.97mmol)。搅拌反应3小时或直至起始材料消失,通过TLC[产物Rf=0.65,起始材料Rf=0.45,1:1EtOAc/己烷]观察产物出现。在高真空线下浓缩反应至干燥,并将残余物溶于THF/H2O(100mL of 10:1)中。
化合物12.将Ph3P(0.2.33g,8.91mmol)一次性加入到含有化合物11的上述溶液中,搅拌反应3小时或直至起始材料消失。在高真空系下将粗反应混合物浓缩至干燥,得到含化合物12的残余物。
化合物13.将含化合物12的上述残余物溶于DCM(50mL)和TFA(10mL)中。室温下搅拌混合物5小时并浓缩至干燥。将残余物加载到装有硅胶的柱上并用纯DCM,接下来用含有5%MeOH的DCM,然后用含有10%MeOH的DCM进行色谱分析得到最终产物,化合物13,为粘性白色固体(0.45g,来自5的产率为46%)。1H NMR(CDCl3)δ 1.27(s),1.33(brm,),1.61(p,2H,J=7.5Hz),2.03(br d,2H,J=7Hz),2.53(q,2H,J=7.5Hz),3.34(br s,1H),3.87(br d,2H,J=12Hz),4.48(br s,2H),4.58(br s,2H),5.42(dd,1H,J=15Hz,5.5Hz),5.82(dt,1H,J=15Hz,5.5Hz),7.91(brs,4H).13C{1H}NMR(CDCl3)δ 136.85,126.26,57.08,34.76,32.95,30.40,30.36,30.34,30.25,30.19,30.05,29.80,29.62,29.09,25.34。
实施例2 制备巯基化脂肪酸的合成方案
在本实施例中描述的合成方法详细描述了并入到更复杂脂质结构的巯基化脂肪酸的制备,所述脂质结构能进一步与蛋白或其他载体复合,并施用至动物以引发免疫应答。所述方法采用常规有机化学。在图2中提供该实施例中采用的方法的图示,在下面的合成描述中所述的化合物编号指图2中的编号结构。
描述了两种合成。第一种合成,对于C-12巯基化脂肪酸而言,起始于商购的12-月桂酸,化合物14。然后用叔丁基硫醇代替溴以产生保护的C-12巯基化脂肪酸,化合物15。第二种合成,对于C-18巯基化脂肪酸而言,起始于商购的9-溴-壬醇(化合物16)。化合物16中的羟基通过二氢吡喃基的加成得到保护,且所得的化合物,17,经由格氏反应(Grignard reaction)通过激活一半溴化材料进行二聚化,接下来加入另一半。对在酸催化下除去二氢吡喃保护基后产生的18-羟基十八醇(化合物18)选择性地进行单溴化以形成化合物19。在该反应过程中,约一半的醇基团通过形成甲烷磺酸酯被激活以进行亲核取代。然后所述醇被氧化而形成18-溴羧酸,化合物20,然后用叔丁硫醇处理以置换溴并形成保护的巯基化C-18脂肪酸,化合物21。
保护的巯基化脂肪酸,各自为叔丁基硫醚,可以被合并入复合脂,并例如使用实施例1和3中描述的脱保护方法之一除去保护基。然后将所得的游离硫醇用于与蛋白或其他载体复合,之后用该半抗原接种动物。
A.C-12巯基化脂肪酸的合成
化合物15.将叔丁硫醇(12.93g,143mmol)加入到干燥的Schlenk烧瓶中,并使用Schlenk方法使该系统处于氮气下。加入无水,脱气的THF(250mL)并在冰浴中冷却烧瓶。在十分钟内通过注射器缓慢加入n-BuLi(55mL,在己烷中2.5M,137.5mmol)。在0℃下搅拌混合物1小时。加入固体的溴酸(bromoacid),化合物14(10g,36mmol),并在60℃下对反应加热和搅拌24小时。用2M HCl(250mL)淬灭反应,并用醚(2 x 300mL)萃取。合并的醚层用硫酸镁干燥,过滤,并通过旋转蒸发浓缩滤液得到米色粉末状的硫醚酸,化合物15(10g,99%的产率)。1H NMR(CDCl3,500MHz)δ 1.25-1.35(br s,12H),1.32(s,9H),1.35-1.40(m,2H),1.50-1.60(m,2H),1.60-1.65(m,2H),2.35(t,2H,J=7.5Hz),2.52(t,2H,J=7.5Hz)。在HRMS(ES-TOF)中观察到的主要离子在m/z 311.2020,M+Na+的计算值为311.2015。
B.C-12巯基化脂肪酸的合成
化合物17.向干燥Schlenk烧瓶中装入化合物16(50g,224.2mmol)并溶于从钠/二苯甲酮蒸馏出的无水脱气THF(250mL)中。在冰浴中冷却烧瓶,然后加入PTSA(0.5g,2.6mmol)。然后在五分钟内缓慢加入干燥脱气DHP(36g,42.8mmol)。使混合物变暖到室温并搅拌过夜,用TLC(10:1 PE:EtOAc)监测直到根据溴醇(bromoalcohol)点完全消失确认反应完成。然后加入TEA(1g,10mmol)淬灭PTSA。然后用冷的碳酸氢钠溶液洗涤混合物,并用EtOAc(3 X 250mL)萃取。然后用硫酸镁干燥有机层,并浓缩得到68.2g的粗产物,通过柱色谱(10:1PE:EtOAc)纯化该粗产物得到60g(99%的产率)无色油状物。1H NMR(CDCl3,500MHz)δ 1.31(br s,6H),1.41-1.44(m,2H),1.51-1.62(模糊的多重峰,6H),1.69-1.74(m,1H),1.855(五重峰,J=7.6Hz,2H),3.41(t,J=7Hz,2H),3.48-3.52(m,2H),3.73(dt,2H,J=6.5Hz),3.85-3.90(m,2H),4.57(t,2H,J=3Hz)。
化合物18.将镁片(2.98g,125mmol)与碘晶体一起加入到火焰干燥的Schlenk烧瓶中。然后加入从钠中蒸馏出的无水THF(200mL)并使用Schlenk技术对该系统进行脱气。然后在10分钟内缓慢将化合物17(30g,97mmol)加入到镁中,并将溶液置于65℃的油浴中,搅拌过夜。根据TLC用丙酮淬灭等分试样,确认反应完成,并观察到在10:1PE:EtOAc混合物中RF的变化。然后通过套管将格氏溶液在氮气下转移到另外含有化合物17(30g,97mmol)的三颈瓶中。然后将含有所得混合物的烧瓶在冰浴中冷却到0℃,然后通过注射器加入Li2CuCl4(3mL,1M)的溶液。在几分钟内反应混合物变成深蓝色。搅拌该混合物过夜。第二天早上,根据TLC(10:1 PE:EtOAc)确认反应完成,用饱和的NH4Cl溶液淬灭反应,然后在醚(3 X 250mL)中萃取。用硫酸镁干燥醚层并浓缩得到粗产物(40g),将粗产物溶于MeOH中。然后加入浓HCl(0.5mL),导致白色乳液的形成,将其搅拌3小时。然后过滤白色乳液得到16g(58%的产率)的纯二醇,化合物18。1H NMR(CDCl3,200MHz)δ 1.26(br s,24H),1.41-1.42(m,4H),1.51-1.68(m,4H),3.65(t,4H,J=6.5Hz)。
化合物19.在氮气下,将所述对称二醇,化合物18(11g,38.5mmol)加入到干燥Schlenk烧瓶中,然后加入从钠蒸馏出的无水THF(700mL)。对所述系统进行脱气并将烧瓶置于冰浴中。由注射器加入二异丙基乙胺(6.82mL,42.3mmol),然后缓慢加入MsCl(3.96g,34.4mmol),搅拌该混合物1小时。用饱和NaH2PO4溶液(300mL)淬灭反应,然后用EtOAc(3 X 300mL)萃取。然后合并有机层,用MgSO4干燥,浓缩得到14g二醇、单甲磺酸盐和二甲磺酸盐的混合物。NMR显示CH2OH:CH2OM质子的1:0.8混合物。然后将所述混合物溶于无水的THF(500mL)中,脱氧,并向其加入LiBr(3.5g,40.23mmol)。回流该混合物过夜,之后用水(150mL)淬灭反应,并用EtOAc(3 X 250mL)萃取。然后用MgSO4干燥有机层,并浓缩得到溴化产物的混合物,然后通过快速色谱(DCM)纯化得到白色粉末状的化合物19(3.1g,25%的产率)。1H NMR(CDC l3,500MHz)δ 1.26(br s,26H),1.38-1.46(m,2H),1.55(五重峰,2H,J=7.5Hz),1.85(五重峰,2H,J=7.5Hz),3.403(t,2H,J=6.8Hz),3.66(t.2H,J=6.8Hz)。
化合物20.向圆底烧瓶中装入化合物19(2.01g,5.73mmol),并将固体溶于试剂级的丙酮(150mL)。同时,通过将CrO3(2.25g,22mmol)溶于H2SO4(4mL)中制备Jones试剂,然后缓慢加入10mL冷水并搅拌溶液10分钟。然后在五分钟内将冷的Jones试剂缓慢加入到圆底烧瓶中,之后搅拌溶液1小时。所得的橙色溶液在几分钟内变为绿色。然后用水(150mL)淬灭混合物,在醚(3 X 150mL)中萃取两次。然后用硫酸镁干燥醚层,并浓缩得到白色粉末状的化合物20(2.08g,98%的产率)。1H NMR(CDCl3,200MHz)δ 1.27(br s,26H),1.58-1.71(m,2H),1.77-1.97(m,2H),2.36(t,2H,J=7.4Hz),3.42(t,2H,J=7Hz)。
化合物21.将叔丁硫醇(11.32g,125mmol)加入到干燥的Schlenk烧瓶中并溶于从钠中蒸馏出的无水THF(450mL)。通过向烧瓶中充入氮气泡来对溶液脱氧,然后将烧瓶置于冰浴中。然后在10分钟内经由注射器缓慢加入n-BuLi的己烷溶液(70mL,1.6M)。搅拌混合物1小时,然后加入化合物20(5.5g,16.2mmol)并在60℃回流该溶液过夜。第二天取出等分试样,用NMR分析,确认反应完成。用HCl(200mL,2M)淬灭反应并用醚(3 X 250mL)萃取。然后用硫酸镁干燥醚层,过滤并将滤液浓缩得到白色固体状的产物,化合物21(5g,90%的产率)。1H NMR(CDCl3,200MHz)δ 1.26(br s,26H),1.32(br s,9H),1.48-1.70(m,4H),2.35(t,2H,J=7.3Hz),2.52(t,2H,J=7.3Hz).13C NMR(CDCl3,200MHz)δ 24.69,28.35,29.05,29.21,29.28,29.39,29.55,29.89,31.02(3C),33.98,41.75,179.60。
实施例3 制备LPA的巯基化类似物的合成方案
在本实施例中描述的合成方法得以制备巯基化LPA。然后将所述LPA类似物能进一步与载体,例如蛋白载体复合,然后将其施用至动物以引发对LPA的免疫原性应答。所述方法采用有机化学和酶反应,在图3中提供该方法的合成图示,在下面的合成描述中所述的化合物编号指图3中的编号结构。
起始材料为实施例2中的化合物15,和对映异构体纯的甘油磷脂酰胆碱(化合物22)。合并这两种化合物得到二-乙酰化产物,化合物23,使用DCC来促进酯化。在一个合成方法的变化形式中,首先用磷脂酶-A2处理所得的二-乙酰化的甘油磷脂酰胆碱以除出去在甘油骨架的sn-2位处的脂肪酸以产生化合物24。该物质进一步用另一种酶(磷脂酶-D)处理以除去胆碱并形成化合物26。在另一个合成方法的变化形式中,在磷脂酶-A2处理之前,用磷脂酶-D处理产生化合物25,然后用磷脂酶-D处理化合物25得到化合物26。两种变化形式得到相同产物——磷脂酸衍生物,化合物26。然后除去在化合物26中的叔丁基保护基团,首先使用三甲基二硫化三氟甲基磺酸盐以产生化合物27,然后用二硫化物还原以产生所需的LPA衍生物,化合物28。本领域技术人员应当理解,在实施例1中所描述的硝基苄基亚磺酰反应顺序还可用于产生化合物28。
化合物23.向火焰干燥的Schlenk烧瓶中加入硫醚酸,化合物15(10g,35.8mmol),化合物22(甘油磷脂酰胆碱-CdCl2复合物,4.25g,8.9mmol),DCC(7.32g,35.8mmol)和DMAP(2.18g,17.8mmol),之后对烧瓶抽真空并用氮气填充。加入最小量的无水脱气的DCM(100mL),得到絮状混合物。用金属箔盖住烧瓶,然后搅拌直到根据TLC(silica,10:5:1DCM:MeOH:浓NH4OH)显示反应完成。化合物16的不溶性排除了用TLC监测其消失,但当判断Rf0.1的产物点的强度不再增强时,停止反应。这通常需要3至4天,且在一些情况下,加入更多的DCC和DMAP。完成后,过滤反应混合物,并将滤液浓缩得到黄色油状物,采用使用上述的溶剂系统的快速色谱对其进行纯化得到3.6g(50%的产率)含有化合物23和单乙酰化产物(比例为5:1)的混合物的透明蜡状物,如根据比较(CH3)3N-,-CH2StBu和-CH2COO-部分的峰的积分所估计。通过HRMS(ESI-TOF)分析油状物得到在m/z 820.4972主离子峰,M+Na+的计算值=C40H80NNaO8PS2 +820.4960。
A.合成变体1-磷脂酶-A2处理
化合物24.将如上所述的化合物23和单乙酰化产物的混合物(3.1g,3.9mmol)溶于Et2O(400mL)和甲醇(30mL)中。加入硼酸盐缓冲液(100mL,pH7.40.1M,0.072mM的CaCl2),随后加入磷脂酶-A2(来自蜂毒,130单位,Sigma)。所得混合物搅拌10小时,此时TLC(二氧化硅,MeOH:水4:1-之前的溶剂系统(10:5:1DCM:MeOH:浓NH4OH)证实是无效的)显示起始材料(Rf=0.7)消失和一个新点(Rf=0.2)的出现。分离有机层和水层,并用醚(2 x 250mL)洗涤水层。用DCM:MeOH(2:1,2 x 50mL)的混合物从水层中萃取产物。然后通过旋转蒸发浓缩有机层得到白色蜡状产物(1.9g,86%的产率),其NMR显示为纯产物(化合物24)。1H NMR(CDCl3,500MHz)δ 1.25-1.27(brs,12H),1.31(s,9H),1.35-1.45(m,2H),1.52-1.60(m,4H),2.31(t,2H,J=7.5Hz),2.51(t,2H,J=7.5Hz),3.28(br s,9H)3.25-3.33(br s,2H),3.78-3.86(m,1H),3.88-3.96(m,2H),4.04-4.10(m,2H),4.26-4.34(m,2H)。用HRMS(ESI-TOF)对蜡状物的分析在m/z550.2936得到主要离子m/z 550.2936,M+Na+的计算值为550.2943(C24H50NNaO7PS2 +),和m/z 528.3115,MH+的计算值为528.3124(C24H51NO7PS2 +)。
C24H50NO7PS+2H2O(563.73)的分析计算值:C,51.13;H,9.66;N,2.48.实验值:C,50.90;H,9.37;N,2.76。
化合物26.溶血化合物24(1.5g,2.7mmol)溶于仲丁醇(5mL)和Et2O(200mL)的混合物中,并对所得的絮状混合物进行超声直到絮状物消散。加入缓冲溶液(200mL,pH5.8,0.2M NaOAc,0.08MCaCl2),接下来加入甘蓝提取物(80mL来自皱叶甘蓝的提取物(其含有磷脂酶-D),含有9mg蛋白/mL)。搅拌该反应1天并用TLC(C18RP SiO2,5:1ACN:water)监测,起始材料和产物的Rf分别是0.3和0.05。为了推动反应完成,根据需要加入额外的甘蓝提取物(50mL),并再搅拌该反应一天。再重复该过程2次以上,根据完成转化的需要。当反应完成,在旋转蒸发仪上浓缩该混合物以除去醚,然后加入EDTA溶液(0.5M,25mL),并在5:4的MeOH:DCM(300mL)混合物中萃取产物。浓缩有机层,接下来从DCM和丙酮中重结晶残余物得到纯产物(0.9g,75%的产率).1H NMR(CDCl3,200MHz)δ 1.25-1.27(brs,12H),1.33(s,9H),1.52-1.60(m,4H),2.34(t,2H,J=7.5Hz),2.52(t,2H,J=7.5Hz),3.6-3.8(br s,1H),3.85-3.97(br s,2H),4.02-4.18(m,2H)。
化合物27.用甲醇洗涤保护的样品LPA,化合物26(0.150g,0.34mmol)并加入到手套箱的小瓶中。然后将其悬浮在AcOH:THF(1:1,10mL)的混合物中,其甚至在超声1小时后也没有完全溶解。然后加入固体[Me2SSMe]OTf(0.114g,0.44mmol)。将其搅拌18小时。通过取出等分试样来监测反应,在真空下将其浓缩至干燥,并在CD3OD中重新溶解或悬浮残余物以观察最接近硫的CH2峰的1H NMR位移。起始材料在2.52ppm处有峰,而在该结合点形成的非对称二硫化物在约2.7ppm处有峰。没有进一步分离或表征该材料(化合物27)。
化合物28.用水(100μL),接下来立即用PMe3(0.11g,1.4mmol)处理含化合物27的混合物。搅拌3小时后,通过真空除去溶剂得到不溶的白色固体。加入甲醇(5mL),离心混合物,并移出母液。真空浓缩得到120mg(91%产率)的化合物28,为米色固体。化合物28为巯基化LPA半抗原,所述半抗原可以经由二硫键形成与载体(例如白蛋白或KLH)缀合。化合物28的表征:1H NMR(1:1CD3OD:CD3CO2D,500MHz)δ 1.25-1.35(br s,12H),1.32-1.4(m,2H),1.55-1.6(m,4H),2.34(t,2H,J=7),2.47(t,2H,J=8.5),3.89-3.97(brs,2H),3.98-4.15(m,2H),4.21(m,1H)。溶于甲醇的样品的负离子ES的主要的离子产生在m/z=385.1。
实施例4 S1P的抗体
一类治疗抗体特异性结合不需要的鞘脂以实现有益效果,例如,(1)降低不需要的、毒性的鞘脂的有效浓度(和/或其代谢前体的浓度),所述鞘脂能促进不需要的作用,诸如心脏中毒、致瘤或血管生成作用;(2)抑制不需要的、毒性的、致瘤或血管生成的鞘脂与细胞受体的结合,因此和/或降低可用于结合所述受体的鞘脂的浓度。所述治疗效果的实例包括但不限于,使用抗-S1P抗体来降低体内可利用的S1P的血清浓度,由此阻断或至少限制S1P的致癌和血管生产作用以及其在MI后的心力衰竭、癌症或纤维发生疾病的作用。
合成巯基化S1P(图1的化合物10)以包含能使S1P的关键结构特征与载体部分(诸如KLH)交联的反应基团(例如,巯基)。在免疫前,使用标准方法,使硫代-S1P类似物经由IOA或SMCC与蛋白载体(例如,KLH)交联。SMCC是能与伯胺和巯基反应的异型双功能交联剂,且代表优选的交联剂。
用50μg的免疫原(SMCC促进的巯基化-S1P和KLH的缀合物)/注射,对Swiss Webster或BALB-C小鼠进行免疫,在两个月内共4次。在第二、三和四次免疫后两个星期收集血清样品,通过直接ELISA筛选抗-S1P抗体的存在。随后,将来自显示具有高的抗体滴度的动物的脾用于生产杂交瘤/标准融合过程。培养所得的杂交瘤以融合,之后收集细胞上清液用于ELISA分析。在被免疫的55小鼠中,有8只为良好的应答者,显示对S1P具有反应性的抗体的显著血清滴度。然后根据规定过程,使用这些小鼠的脾和骨髓瘤细胞来进行融合。然后通过直接ELISA筛选所得的1,500个杂交瘤,得到287个阳性杂交瘤。在由直接ELISA筛选的这287个杂交瘤中,159个显示显著的滴度。然后将所述159杂交瘤的每一个扩展到24-孔板中。然后,重新筛选所述扩展杂交瘤的细胞调节基质以鉴定能分泌目标抗体的稳定杂交瘤。在最高60滴度的稳定杂交瘤上进行竞争ELISA。
在被筛选的55只小鼠和将近1,500个杂交瘤中,发现一个杂交瘤展现证明为有限稀释克隆的性能特征,如最终产生真正的单克隆抗体所要求的。该过程产生47个克隆,大部分对产生S1P抗体来说是阳性的。在这47个克隆中,有6个在24-孔板中被扩展,随后通过竞争ELISA进行筛选。在保持阳性的4个克隆中,选择一个来起始S1P单克隆抗体的大规模生产。用这些细胞注射SCID小鼠,所得腹水为蛋白A-纯化的(50%产量)并分析内毒素水平(<3EU/mg)。对于第一轮腹水产生,对50只小鼠进行注射,产生总共125mL的腹水。所述抗体为IgG1κ的同种型,且根据HPLC认为是>95%纯。在含有150mM氯化钠(pH7.2)的20mM磷酸钠中制备所述抗体并在-70℃下贮存。
阳性杂交瘤克隆(命名为克隆306D326.26)保藏于ATCC(安全保藏号SD-5362),并表示抗S1P的第一鼠mAb。所述克隆还包含抗体重链和轻链的可变区,所述可变区可用于产生“人源化”抗体变体,以及构建嵌合抗体所需的序列信息。
通过使用实施例1中描述的巯基化SIP类似物(即,化合物10)作为抗原的直接ELISA,对S1P-特异性抗体的血清和细胞上清液进行筛选。如下面所述,除了在初次孵育中用等体积的PBS/0.1%Tween-20(PBST)稀释50ul的样品(血清或细胞上清液)外,进行标准ELISA。在96-孔高结合力的ELISA板(Costar)中进行ELISA,所述板用与在结合缓冲液(33.6mM Na2CO3,100mM NaHCO3;pH9.5)中的BSA缀合的0.1μg化学合成的化合物10涂敷。在37℃下孵育巯基化-S1P-BSA1小时,并在4℃下在ELISA板孔中孵育过夜。然后用PBS(137mM NaCl,2.68mM KCl,10.14mM Na2HPO4,1.76mM KH2PO4;pH7.4)洗涤所述板四次,并在室温下用PBST封闭1小时。对于初次孵育步骤而言,75uL样品(含有待测量的S1P)与25uL在PBST中稀释的0.1ug/mL抗-S1PmAb一起孵育,并加入到ELISA板的孔中。每个样品在一式三份的孔中进行。在室温下孵育1小时后,用PBS洗涤ELISA板四次,并室温下用每孔100ul的0.1ug/mL HRP羊抗小鼠二抗(JacksonImmunoresearch)孵育1小时。然后用PBS洗涤平板四次并与四甲基联苯胺(Sigma)接触1-10分钟。通过加入等体积的1MH2SO4停止检测反应。通过使用EL-X-800ELISA平板读数仪(Bio-Tech)来测量450nm处样品的光密度。
对于交联反应,如上所述进行竞争ELISA,除了下述改变外(图4)。初次孵育由竞争剂(S1P,SPH,LPA等)和生物素缀合的抗-S1P mAb组成。使用EZ-Link Sulfo-NHS-生物素化试剂盒(Pierce)进行纯化的单克隆抗体的生物素化。按照试剂盒方法确定生物素的并入,且范围为7-11个生物素分子/抗体。如下制备竞争剂:在氩气下对脂质原料进行超声和干燥,然后在DPBS/BSA[1mg/ml无脂肪酸的BSA(Calbiochem)于DPBS(Invitrogen 14040-133)]中重构。根据需要在PBS/0.5%Triton X-100中稀释纯化的抗-S1P mAb。混合竞争剂和抗体溶液以产生3份竞争剂对应一份抗体。使用HRP-缀合的链霉亲和素二抗(Jackson Immunoresearch)来产生信号。
在图4中显示的竞争ELISA数据的另一方面显示抗-S1P mAb不能区分巯基化-S1P类似物(化合物10)和在竞争实验中加入的天然S1P。还证实所述抗体不识别任何氧化产物,因为构建所述类似物不含任何双键(这对在实施例3所述的LPA类似物而言也是正确的)。还针对含有双键的天然产物测试抗-S1P mAb,允许其在室温下保持48小时。根据之前报导的方法(Deutschman,等人(July 2003),Am Heart J.,vol.146(1):62-8),进行天然S1P的反相HPLC,且结果显示保留时间没有区别。此外,图4中显示的单克隆抗体对多种脂质的结合特点的比较表明所述抗体识别的表位不涉及天然S1P的双键区域中的烃链。另一方面,单克隆抗体识别的表位是在鞘氨醇碱基骨架含有氨基醇加游离磷酸酯的区域上。如果游离的磷酸酯与胆碱连接(与SPC的情况类似),那么所述结合稍微降低。如果将氨基酯化成脂肪酸(与C1P的情况类似),没有观察到抗体结合。如果鞘氨醇氨基醇骨架用甘油骨架代替(与LPA的情况类似),所述SIP-特异性单克隆显示没有结合。这些表位定位数据表明S1P上只有一个被所述单克隆抗体识别的表位,且这个表位由S1P的独特极性头基团限定。
在使用ELISA测试的类似实验中,评估合适的对照材料以确保该抗-S1P单克隆抗体不识别蛋白载体或交联剂。例如,在缀合巯基化-S1P与BSA时,将正常的交联剂SMCC换为IOA,作为ELISA的沉淀材料。当使用IOA时,所述抗体的结合特点几乎与使用BSA-SMCC-巯基化-S1P时相同。类似地,将KLH换为BSA作为与巯基化-S1P复合的蛋白,作为沉淀材料。在该实验中,所述抗体的结合特点也没有显著区别。
结合动力学:由于脂质的性质,传统上S1P对其受体或其他部分的结合动力学是有问题的。许多问题与脂质的不溶性有关。对于BIAcore测量法,这些问题通过将S1P直接固定到BIAcore芯片上来解决。然后抗体在芯片表面流动并测量光密度的变化以确定抗体对S1P的结合特点。为了避免抗体的二价结合性质,以低密度在芯片上涂敷S1P。此外,用多种密度的S1P(7、20和1000RU)涂敷芯片且抗体结合数据大体上符合1:1相互作用模型。图5证实光密度的变化由在三个不同的S1P密度下单克隆抗体与S1P的结合引起。总之,确定单克隆抗体对S1P的亲和力是非常高的,在约88皮摩尔(pM)至99nM的范围内,这取决于是否使用单价或二价结合模型来分析结合数据。
实施例5 S1P单克隆抗体的可变区的克隆和表征
A.简介
生物产品的制备是复杂的,部分是因为与蛋白本身可变性相关的复杂性。对于单克隆抗体(mAbs),可变性可以定位于蛋白骨架或悬挂于这些糖基化蛋白的烃部分。例如,异质性可以归因于可变化的二硫化物配对的形成、脱酰胺和异天冬氨酰残基的形成、甲硫氨酸和半胱氨酸的氧化、N-端谷氨酸残基与焦谷氨酸的环化和由哺乳动物羧肽酶的部分酶切C-端赖氨酸。另一方面,在细胞培养过程中引入的碳水化合物的异质性包括海藻糖的分化加成、备选的甘露糖的支链连接和端唾液酸化作用的差异存在。此外,可以进行诱变来改变糖基化类型。氧化也是关注源。例如,重组人源化单克隆抗体HER2当接触强光和高温时在液体制剂中进行氧化。有趣地,据报导所述氧化是制剂依赖性的(Lam,等人(1997),Pharm.Sci.,vol.86:1250-1255),且据报导在在填充过程中与不锈钢容器或不锈钢成分接触后,制剂中NaCl的存在引起在更高温度下的氧化增加。确定在Fc区的重链中第255位的甲硫氨酸为主要的氧化位点。通过补充有甲硫氨酸和硫代硫酸盐的基质消除氧化,其由制剂中金属离子和过氧化物杂质的存在下产生的自由基引起。诸如这些原因,通常将过程工艺应用于抗体分子以改善其性质,诸如在异质系统中的表达增强、对蛋白酶的抗性,降低的聚合和增强的稳定性。
该实施例报导了抗S1P的鼠mAb的克隆。该抗体,命名为SphingomabTM,是IgG1单克隆抗体。总的方案由克隆轻链(VL)和重链(VH)的鼠可变区组成。306D VH的共有序列显示恒定区片段与γ2b同种型一致。克隆鼠可变区与轻链的恒定区(CL)和重链的恒定区(CH1、CH2和CH3),得到嵌合抗体构建体。同样,SphingomabTM是独特的,是因为在CDR2区的重链的第50位上的Fab区中游离半胱氨酸的存在。替换这个残基将大大有利于制备和生产过程,以及提高产率。确实,为了改善抗体分子的生物物理性质,通过构建一系列包含所需置换的构建体来进行许多氨基酸残基对50位的半胱氨酸残基的置换。然后在哺乳动物细胞中表达这些构建体,且在ELISA测试中比较不同抗体变体与S1P的结合。与嵌合抗体相比,所得的具有Cys50Ser和Cys50Arg置换的突变体在与S1P的结合中展示轻微的降低,而用Phe或Ala置换Cys没有改变与S1P的结合。
B.材料和方法
1.抗体基因克隆
在DMEM(Dulbecco′s Dulbecco’s Modified Eagle Medium含有GlutaMAXTMI,4500mg/L右旋葡萄糖,丙酮酸钠;Gibco/Invitrogen,Carlsbad,CA,111-035-003),10%FBS(SterileFetal Clone I,Perbio Science),和1X谷氨酸/青霉素/链霉素(Gibco/Invitrogen)中培养来自抗-S1P杂交瘤细胞系306D326.1(ATCC#SD-5362)的克隆。使用基于RNeasy Mini试剂盒(Qiagen,Hilden Germany)的程序从107个杂交瘤细胞中分离出总的RNA。根据制造商的方法使用RNA来产生第一链cDNA(1SL链合成试剂盒,Amersham Biosciences)。
通过使用MHV7引物(MHV7:5’-ATGGRATGGAGCKGGRTCTTTMTCTT-3’[SEQ ID NO:1])结合IgG2b恒定区引物MHCG1/2a/2b/3合物(MHCG1:5’-CAGTGGATAGACAGATGGGGG-3’[SEQ ID NO:2];MHCG2a:5’-CAGTGGATAGACCGATGGGGC-3[SEQ ID NO:3];MHCG2b:5’-CAGTGGATAGACTGATGGGGG-3’[SEQ ID NO:4];MHCG3:5’-CAAGGGATAGACAGATGGGGC-3’[SEQ ID NO:5])的PCR来扩增免疫球蛋白重链可变区(VH)cDNA。使用TOPO-TA试剂盒和序列,将反应产物连接到载体(Invitrogen)中。然后通过PCR扩增来自该载体的所述重链的可变区并作为Hind III和Apa I片段插入并与含有HCMVi启动子、前导序列和γ-1恒定区的表达载体pG1D200(参见美国专利号7,060,808)或pG4D200(id.)相连以产生质粒pG1D200306DVH。306D VH的共有序列(图6;SEQ ID NO:6)显示恒定区片段与γ2b同种型一致。
类似的,使用MKV20引物(5’-GTCTCTGATTCTAGGGCA-3’[SEQID NO:7])结合κ恒定区引物MKC(5’-ACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’[SEQ ID NO:8])来扩增所述免疫球蛋白κ链可变区(VK)。使用TOPO-TA试剂盒和序列将所述反应的产物连接到载体中。然后通过PCR扩增轻链的可变区,然后作为Bam HI和Hind III片段插入到包含HCMV启动子、前导序列和人γ恒定区的表达载体pKN100中(参见,美国专利号7,060,808),以生产质粒pKN100306DVK。
将重链和轻链质粒pG1D200306DVH与pKN100306DVK转化到DH4a细菌中并贮存于甘油中。根据制作商所述制备大规模的质粒DNA(Qiagen,不含内毒素的MAXIPREPTM试剂盒)。使用Qiagen’sQIAprep Spin Miniprep试剂盒或EndoFree Plasmid Mega/Maxi试剂盒纯化的DNA样品,用ABI 3730 x 1自动测序仪进行测序,其还将荧光信号翻译为其对应的核碱基序列。在5’和3’端设计引物使得所获得的序列重叠。引物长度为18-24个碱基,且优选地它们含有50%GC含量并没有预期的二聚体或二级结构。来自SphingomabTM的小鼠VH和VL结构域的氨基酸序列显示于图6(分别为SEQ ID NOS:6和9)。在图6中,将所述CDR残基(参见Kabat,EA(1982),Pharmavol Rev,vol.34:23-38)用方框框出,并显示于下表1。
表1:小鼠VH和VL结构域的小鼠Sphingoma bTM CDR序列
VL CDR | CDR |
ITTTDIDDDMN(SEQ ID NO:10) | CDR1 |
EGNILRP(SEQ ID NO:11) | CDR2 |
LQSDNLPFT(SEQ ID NO:12) | CDR3 |
VH CDR | |
DHTIH(SEQ ID NO:13) | CDR1 |
CISPRHDITKYNEMFRG(SEQ ID NO:14) | CDR2 |
GGFYGSTIWFDF(SEQ ID NO:15) | CDR3 |
几个嵌合抗体VH和VL的结构域的完整核苷酸和氨基酸序列显示于图7。在图7中,根据Kabat方法(Kabat,等人(1991),NIHNational Technical Information Service,pp.1-3242),对氨基酸序列进行编号,和对CDR进行标识。
2.COS7表达
对于在非人哺乳动物系统中的抗体表达,通过电穿孔(0.7ml,107个细胞/ml),使用每个质粒10ug,将质粒转染到非洲绿猴肾成纤维细胞的细胞系COS 7。将转染细胞置于8ml的生长培养基中,持续4天。在瞬时共转染的COS细胞条件培养基中以1.5μg/ml表达嵌合306DH1 x 306DVK-2抗体。使用S1P ELISA测量该抗体与S1P的结合。
如下在定量ELISA中测定所述嵌合抗体的表达水平。用100μl稀释于PBS的0.4μg/ml羊抗人IgG抗体(Sigma,St.Louis,MO)的等分试样涂敷微量滴定板(Nunc MaxiSorp immunoplate,Invitrogen),并在4℃下孵育过夜。然后用200μl/孔的洗涤缓冲液(1 x PBS,0.1%TWEEN)洗涤所述板三次。将200μL的每一个稀释的血清样品或融合上清液的等分试样转移到毒素涂敷的板上并在37℃下孵育1小时。用洗涤缓冲液洗涤6次后,向每一个孔中以1:5000的稀释度加入羊抗人κ轻链过氧化物酶缀合物(Jackson ImmunoResearch)。在室温下反应1小时,用洗涤缓冲液洗涤平板六次,并向每个孔中中加入150μL的K-BLUE底物(Sigma),在室温下于黑暗中孵育10分钟。通过加入50μl的RED STOP溶液(SkyBioLtd.)来停止反应并使用Microplater Reader 3550(Bio-Rad Laboratories Ltd.)来测量在655nm处的吸收。抗体结合测试的结果显示于图8。
3.293F表达
对于在人系统中的抗体表达,将质粒转染到人胚胎肾细胞系293F(Invitrogen),使用293fectin(Invitrogen)和293F-FreeStyle培养基(Invitrogen)培养。以0.5g/mL转染轻链和重链质粒。在106个细胞/mL的细胞密度下进行转染。转染后3天,通过在25℃,1100rpm下离心5分钟来收集上清液。通过定量ELISA(参见下面)定量表达水平,嵌合抗体的表达水平在~0.25-0.5g/mL之间变化。
4.定量ELISA
用稀释于1M碳酸盐缓冲溶液(pH9.5)的片段特异性的兔抗鼠,IgG,F(ab’)2(Jackson Immuno Research)或片段特异性的兔抗人,IgGF(ab’)2(Jackson Immuno Research)涂敷微量滴定ELISA板(Costar),在37℃下持续1小时。用PBS洗涤平板并在37℃下用PBS/BSA/Tween-20封闭1小时。对于初次孵育,将稀释的非特异性鼠IgG或人IgG,全分子(用于标准曲线)和待测量的样品加入到孔中。用1:40,000稀释的100ul/孔的HRP缀合的羊抗鼠(H+L)(JacksonImmuno Research)或1:50,000稀释的HRP缀合的羊抗人(H+L)(Jackson Immuno Research)洗涤平板并在37℃下孵育1小时。洗涤后,用四甲基联苯胺(Sigma)检测酶促反应并通过加入1MH2SO4来停止。使用Thermo Multiskan EX测量在450nm处的光密度(OD)。将原始数据转移到GraphPad软件用于分析。
5.直接ELISA
用在37℃下稀释于1M碳酸盐缓冲溶液(pH9.5)1小时的S1P涂敷微量滴定ELISA板(Costar)过夜。用PBS(137mM NaCl,2.68mM KCl,10.1mM Na2HPO4,1.76mM KH2PO4;pH7.4)洗涤平板并用PBS/BSA/Tween-20在室温下封闭1小时或在4℃下过夜。对于初次孵育(室温下1小时),采用下述设定的稀释度:0.4μg/mL,0.2μg/mL,0.1μg/mL,0.05μg/mL,0.0125μg/mL,和0μg/mL,并向每孔加入100μl,以建立使用抗-S1P mAb和用于测试结合的样品的标准曲线。用1:20,000稀释的100μl/孔的HRP缀合的羊抗鼠(JacksonImmuno Research)或1:50,000稀释的HRP缀合的羊抗人(H+L)(Jackson Immuno Research)洗涤平板并在37℃下孵育1小时。洗涤后,用四甲基联苯胺(Sigma)检测酶促反应并通过加入1M H2SO4来停止。使用Thermo Multiskan EX测量在450nm处的光密度(OD)。将原始数据转移到GraphPad软件用于分析。
下表2显示突变体与嵌合抗体的比较分析。为了得到这些结果,通过与HRP缀合的对鼠或人IgG特异性的第二抗体检测结合的抗体。测量显色反应并以光密度(OD)报导。抗体的平板浓度为0.1ug/ml。检测到第二抗体与S1P-涂敷的基质没有相互作用。
表2:
实施例6 抗S1P的嵌合mAb
如本文所使用的,术语“嵌合”抗体(或“免疫球蛋白”)指包括与衍生自具体物种或属于具体抗体种类或子类的抗体中的对应序列相同或同源的重链和/或轻链的分子,而链的其余部分与衍生自其他物种或属于其他抗体种类或子类的抗体中的对应序列以及所述抗体片段相同或同源,只要它们展示所需的生物活性(Cabilly等人,supra;Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851(1984))。
使用来自具有人IgG1免疫球蛋白的Fc区的具体杂交瘤(ATCC安全保藏序号SD-5362)的鼠抗体的S1P活性结合区的可变区(Fv)产生抗S1P的嵌合抗体。所述Fc区含有所述人抗体的CL、ChL和Ch3结构域。不局限于特定的方法,嵌合抗体还可以由人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgM的Fc区产生。本领域的技术人员应当理解,“人源化”抗体可以通过用人抗体框架区(例如,Fr1,Fr4等),诸如IgG1框架区,移植鼠抗-S1P mAb的互补决定区(CDR,例如CDR1-4)。图9显示在使用巯基化-S1P作为沉淀材料的直接ELISA测量法中嵌合和全鼠mAbs的结合。
对于显示于图9的直接ELISA实验,抗S1P的嵌合抗体与全鼠单克隆抗体具有类似的结合特征。在涂敷有0.1ug化学合成的巯基化S1P的96-孔高结合ELISA板(Costar)中进行ELISA,所述的巯基化S1P与结合缓冲溶液(33.6mM Na2CO3,100mM NaHCO3;pH9.5)中的BSA缀合。在ELISA板中,在37℃下孵育所述巯基化S1P-BSA 1小时或在4℃下孵育过夜。然后用PBS(137mM NaCl,2.68mM KCl,10.14mMNa2HPO4,1.76mM KH2PO4;pH7.4)洗涤平板四次并在室温下用PBST封闭1小时。对于初次孵育步骤,75uL的样品(含有待测量的S1P)与25μL 0.1μg/mL稀释于PBST的抗-S1P单克隆抗体一起孵育并加入到ELISA板的孔中。每一个样品在一式三份的孔中进行。在室温下孵育1小时后,用PBS洗涤ELISA板四次并与100ul/孔的0.1ug/mL HRP羊抗鼠二抗(Jackson Immunoresearch)在室温下孵育1小时。然后用PBS洗涤平板四次并与四甲基联苯胺(Sigma)接触1-10分钟。通过加入等体积的1M H2SO4来停止反应。通过使用EL-X-800 ELISA平板读数器(Bio-Tech)在450nm处测量来测定样品的光密度(OD)。
与实施例4中描述的实验类似,测量免疫动物的血清或产生抗体的细胞(如杂交瘤)的细胞条件培养基(即,上清液)中的抗体滴度的优选方法涉及用靶配体(例如,S1P、LPA等的巯基化类似物)涂敷ELISA板,所述配体与蛋白载体诸如BSA共价相连。
不局限于特定的方法或实施例,可以产生抗其他脂质靶诸如LPA、神经酰胺、硫苷脂、脑苷脂、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、eicosinoids和其他白三烯等的嵌合抗体。此外,如果需要的话,许多这些脂质还可以被糖基化和/或乙酰化。
实施例7 对鞘氨醇激酶(SPH激酶)基于抗体的测试
鞘氨醇激酶(SPH激酶或SPHK)催化SPH向S1P的转化。已经描述了编码人SPH-激酶的基因序列(Melendez等人,Gene251:19-26,2000)。已经描述了SPH激酶的三个人同源物(SKA、SKB和SKC)(公布的PCT专利申请WO 00/52173)。还描述了鼠SPH激酶(Kohama等人,J.Biol.Chem.273:23722-23728,1998;和公布的(PCT专利申请WO 99/61581)。公布的PCT专利申请WO 99/61581报导了编码鞘氨醇激酶的核酸。公布的PCT专利申请WO 00/52173报导了编码鞘氨醇激酶同源物的核酸。还报导了其他SPH激酶。例如,参见Pitson等人,Biochem J.350:429-441,2000;公布的PCT申请WO 00/70028;Liu等人,J.Biol.Chem.,275:19513-19520,2000;PCT/AU01/00539,公布为WO 01/85953;PCT/US01/04789,公布为WO 01/60990;和PCT/EP00/09498,公布为WO 01/31029。
SPH激酶的抑制剂包括但不限于N,N-二甲基鞘氨醇(Edsall等人,Biochem.37:12892-12898,1998);D-苏式-二氢鞘氨醇(Olivera等人,Nature 365:557-560,1993);和鞘脂碱基(Jonghe等人,“Structure-Activity Relationship of Short-Chain SphingoidBases As Inhibitors of Sphingosine Kinase”,Bioorganic &Medicinal Chemistry Letters 9:3175-3180,1999)。
用于评估这些和其他已知或潜在的SPH激酶抑制剂的SPH激酶分析包括由Olivera等人,Methodsin Enzymology,311:215-223,1999;Caligan等人,Analytical Biochemistry,281:36-44,2000公开的那些。
认为SPH激酶的抑制引起其底物SPH的聚集,其类似于S1P,在一些情况下可能是不需要的鞘脂。为了避免或除去这些不想要的影响,可以施用(i)刺激利用SPH作为底物的试剂,只要所述酶不是产生S1P作为反应产物(例如,神经酰胺合成酶;参见下问)的酶;或(ii)抑制产生SPH作为产物的酶的试剂。
不局限于具体的方法,抗-S1P抗体(例如,单克隆抗-S1P抗体)可用作体外SPH激酶活性分析的试剂。例如,在PBS和激酶底物——SPH(例如与无脂肪酸的BSA复合)的存在下,可以将纯化的SPHK加入到微滴定板的孔中。然后将所得的反应产物,S1P,进行使用抗-S1P抗体(例如,描述于上述实施例4的单克隆抗-S1P抗体)的ELISA。在所述试验中,测试化合物对SPHK的抑制导致比对照反应更低的S1P的水平,所述对照反应不包括SPHK抑制化合物。所述分析经配置用于高通量,并因此可用作SPHK活性调节剂的高通量筛选分析的基础。
实施例8 S1P裂解酶或SPP活性的基于抗体的试验
刺激催化降解S1P的反应(即,利用S1P作为反应物的反应)将刺激S1P分子的降解。所述酶包括但不限于:
S-1-P裂解酶:S1P裂解酶催化S1P向乙醇胺-P(还已知为t-2-十六醛)和棕榈醛的转化(Veldhoven等人,Adv.Lipid Res.26:67-97,1993;Van Veldhoven,Methods in Enzymology,311:244-254,1999)。报导了酵母(Lanterman等人,Biochem.J.332:525-531,1998)、鼠(Zhou等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.242:502-507,1998)和人(published PCT专利申请WO 99/38983)S1P裂解酶基因。公布的PCT专利申请WO 99/16888报导了S1P裂解酶DNA和蛋白序列。美国专利号6,187,562和公布的PCT专利申请WO 99/38983还报导了S1P裂解酶。
可以研发功能获得分析来发现能激活裂解酶或提高编码其的基因的表达的小分子化合物。不局限于具体方法,可以在ELISA模式中使用抗-S1P抗体来测量仪体外或基于细胞模式中加入的SPH所产生的S1P。可以进一步研究确定为刺激S1P裂解酶活性的化合物(直接对该酶刺激或间接通过提高编码该酶的基因的表达水平(例如,通过基因激活,增强S1P裂解酶mRNA稳定性等),因为所述化合物证实在减低患者的S1P胞外浓度中是有用的,在所述患者中S1P水平与毒性有关,诸如在治疗癌症、心脏病、脑血管疾病、自身免疫性紊乱、炎性紊乱、血管生成疾病、纤维化疾病和年龄相关性黄斑变性中。
S1P磷酸酯酶:S1P磷酸酯酶(也成为SPP磷酸水解酶)是一种催化S-1-P向鞘氨醇转化的哺乳动物酶(Mandala等人,Proc.Nat.Acad.Sci.95:150-155,1998;Mandala等人,Proc.Nat.Acad.Sci.97:7859-7864,2000;Mandala,Prostaglandins & other Lipidmediator,64:143-156,2001;Brindley等人,Methods in Enzymology,311:233-244,1999)。已经从酵母中分离出两种S-1-P磷酸酯酶,LBP1和LBP2(Mandala等人,J.Biol.Chem.272:32709-32714,1997);PCT/UW01/03879,公布为WO01/57057。
于S1P裂解酶类似,可以研发功能获得分析来发现能激活S1P磷酸酯酶或提高编码其的基因的表达的化合物。例如,可以在ELISA模式中使用抗-S1P抗体来测量在体外或细胞模式中加入的SPH所产生的S1P。可以进一步研究确定为刺激S1P磷酸酯酶活性的化合物,直接对该酶刺激或间接通过提高编码该酶的基因的表达(例如,通过基因激活,增强S1P磷酸酯酶mRNA稳定性等),因为所述化合物证实在减低患者S1P胞外浓度中是有用的,在所述患者中S1P水平与毒性有关,诸如在治疗癌症、心脏病和脑血管疾病、自身免疫性紊乱、炎性紊乱、血管生成疾病、纤维化疾病和年龄相关性黄斑变性中。
实施例9 抗LPA的单克隆抗体的产生和表征
抗体生产
虽然已经在文献中报导了抗天然存在的LPA的多克隆抗体(ChenJH,等人,Bioorg Med Chem Lett.2000 Aug 7;10(15):1691-3),但没有描述单克隆抗体。使用类似于实施例4中描述的方法生产抗LPA的单克隆抗体,C-12硫代-LPA类似物(在实施例3中的化合物28)为半抗原的关键成分,所述半抗原通过所述类似物经由SH反应基团与蛋白载体(KLH)交联形成(其经由采用IOA或SMCC作为交联剂的标准化学交联)。为此,使用实施例4中所述的方法用硫代-LPA-KLH半抗原(在该情况下,巯基化-LPA:SMCC:KLH)来免疫小鼠以产生抗-S1P单克隆抗体。在针对LPA类似物进行免疫的80只小鼠中,选择显示抗LPA的最高滴度的5只动物(使用ELISA进行确定,其中使用SMCC将与在半抗原中所用的相同的LPA类似物(化合物28)与BSA缀合并在ELISA板上沉淀)发展到杂交瘤阶段。
收获这5只小鼠的脾并通过标准技术产生杂交瘤。简言之,一只小鼠产生杂交瘤细胞系(命名为504A)。在所有涂布有杂交瘤的504A系列中,根据通过之前描述的筛选ELISA所测量的,66个显示阳性抗体产物。
下表3显示在从两个小鼠的脾中产生的杂交瘤的细胞上清液中的抗体滴度,所述小鼠对LPA类似物半抗原有应答,在所述半抗原中巯基化LPA类似物使用异型双功能交联剂与KLH交联。这些数据证实抗-LPA抗体不与所述交联剂或蛋白载体反应。重要的是,所述数据显示杂交瘤产生抗LPA抗体,而不是抗S1P抗体。
表3:LPA杂交瘤
小鼠# | 3rd血液滴度1:312,500的OD | 来自24孔的上清液 | LPA结合(1:20)的OD | S1P结合(1:20)的OD | 交联反应w/S1P* |
12 | 1.2420.709 | 1.A.631.A.652.B.72.B.632.B.832.B.1042.B.IB72.B.3A6 | 1.1971.5452.3572.3022.7122.572.3872.227 | 0.2310.1760.3020.2290.1750.1640.1630.134 | 低无低低无无无无 |
*与来自24孔上清液的S1P
的交联反应
高=在[1:20]时OD>
1.0-2.0
中=在[1:20]时0.4-1.0
低=在[1:20]时0.4-0.2
无=在[1:20]时OD<0.2
通过ELISA(与12:0和18:1LPA的直接结合和竞争ELISA)监测小鼠中抗-LPA mAb的形成。至少在一半免疫小鼠中观察到显著的免疫应答,并选择具有最高抗体滴度的五只小鼠来起始脾融合后的杂交瘤细胞系的形成。
在初筛由这5个融合产生的超过2000杂交瘤细胞系后,总共29个分泌抗-LPA的杂交瘤细胞系对18:1 LPA具有高的结合性。在这些杂交瘤细胞系中,24个被进一步亚克隆并在一系列ELISA分析中进行表征。在保持阳性的24个克隆中,选择6个杂交瘤克隆用于进一步表征。它们的选择基于它们的较好的生化和生物性质。
直接结合动力学
通过ELISA测量6个抗-LPA mAb(B3,B7,B58,A63,B3A6,D22)与12:0和18:1LPA(0.1uM)的结合。从使用纯mAb的6个递增浓度(0到0.4ug/ml)的滴定曲线来计算EC50值。EC50代表具有最大结合的50%的有效抗体浓度。Max表示最大结合(表示为OD450)。结果显示于表4中。
表4-抗-LPA mAb的直接结合动力学
使用BIAcore 3000 Biosensor仪器确定6个前导备选物的动力学参数ka(结合速率常数),kd(离解速率常数)和KD(结合平衡常数)。在本研究中,将LPA固定在传感器表面并将抗-LPA mAb在溶液中沿着表面流动。如所示的,6个结合LPA的mAb都具有类似的KD值(范围为0.34-3.8pM)和类似的动力学参数。
抗-LPA鼠mAb显示对LPA的高亲和力
将LPA固定在传感器芯片上,其密度在150共振单元范围内。将每一个mAb的稀释液经过固定的LPA,并通过结合/离解相位的非线性回归来获得动力学常数。误差由在一式两分的操作中利用至少三次测定的标准偏差给出。表观亲和力通过KD=ka/kd测定,ka=结合速率常数(M-1s-1),kd=离解速率常数(s-1)。
表5-抗-LPA mAb对LPA的亲和力
mAbs ka(M-1s-1) k d (s -1 ) K D (pM)
A63 4.4±1.0 x 105 1 x 10 -6 2.3±0.5
B3 7.0±1.5 x 10 5 1 x 10 -6 1.4±0.3
B7 6.2±0.1 x 10 5 1 x 10 -6 1.6±0.1
D22 3.0±0.9 x 10 4 1 x 10 -6 33±10
B3A6 1.2±0.9 x 10 6 1.9±0.4 x 10 -5 16±1.2
6种抗-LPA mAb的特异性谱
已经鉴定许多LPA亚型是具有生物活性的,并优选mAb识别所有亚型到治疗相关的程度。使用其中向抗体固定的脂混合物中加入竞争脂质的竞争分析来评估抗-LPA mAb的特异性。用6个mAb来进行竞争ELISA分析以评估其特异性。在ELISA板上捕获18:1LPA。在BSA(1mg/ml)-PBS中连续稀释每一个竞争脂质(直至10uM),然后用mAb(3nM)孵育。然后将混合物转移到LPA涂敷的孔中并用第二抗体测量结合抗体的量。将数据标准化为最大信号(A450)并表达为抑制百分比。按一式三分进行分析。IC50:最大抑制达到一半时的浓度;MI:最大抑制(在抑制剂不存在下的结合百分比);---:由于弱的抑制而没有估计。高的抑制结果表示抗体对竞争脂质的识别。如表6所述,所有的抗-LPAmAb识别不同的LPA亚型。
表6.六种抗-LPA mAb的特异性谱。
有趣地是,抗-LPA mAb能区别12:0(月桂酰),14:0(肉豆蔻酰),16:0(棕榈酰),18:1(油酰),18:2(亚麻酰)和20:4(花生酰)LPA。不饱和脂质的EC50排序为18:2>18:1>20:4而饱和脂质的EC50排序为14:0>16:0>18:0。具有高特异性的mAb是最终药物开发所需要的。就其与LPA相关的生物脂质(诸如二硬酯酰-磷脂酸,溶血磷脂酰胆碱,S1P,神经酰胺和神经酰胺-1-磷酸盐)的结合来评估抗-LPA mAb的特异性。证实六个抗体均对二硬酯酰PA和LPC(LPA的直接代谢前体)没有教练反应性。
实施例10 抗-LPA单克隆抗体的抗癌活性
癌细胞增殖
LPA是有效的生长因子,其通过经由GPCR-受体的Gi,Gq和G12/13的刺激和下游信号传导事件的激活来支持细胞存活和增殖。测试细胞系对LPA(0.01mM至10mM)的增殖应答。通过使用来自Chemicon(Temecula CA)(Panc-1)细胞增殖分析试剂盒和来自Pierce(Caki-1)的Cell-Blue滴度来分析细胞增殖。每一个数据点是三个独立实验的平均值。LPA以剂量依赖性方式提高7个人-衍生的肿瘤细胞系的增殖,包括SKOV3和OVCAR3(卵巢癌),Panc-1(胰腺癌),Caki-1(肾癌细胞),DU-145(前列腺癌),A549(肺癌)和HCT-116(直肠结肠腺癌)细胞和一个大鼠衍生的肿瘤细胞系,RBL-2H3(大鼠白血病细胞)。即使肿瘤衍生的细胞通常具有高的增殖基线水平,LPA似乎进一步增大在大多数细胞系中的增殖。评估抗-LPA mAb(B7和B58)抑制在所选人癌细胞系中的LPA-诱导增殖的能力。显示LPA诱导的增殖的增加通过加入抗-LPA mAb而减轻。
抗-LPA mAb使肿瘤细胞对化疗试剂敏感
研究当与临床相关水平的化疗试剂,紫杉醇(Taxol)接触时,LPA保护卵巢肿瘤细胞抗细胞凋亡的能力。用1%FBS(S),紫杉醇(0.5mM),+/-抗-LPA mAb处理SKVO3细胞24小时。LPA保护SKVO3细胞免受Taxol-诱导的细胞凋亡。根据制造商(Promega)所建议的,通过测量胱天蛋白酶活性来分析细胞凋亡。如预期的,LPA保护大多数所测试的癌细胞系免受紫杉醇-诱导的细胞死亡。当将抗-LPA抗体加入到选择的LPA应答细胞中,所述抗-LPA抗体阻断LPA保护细胞免受由细胞毒性化疗试剂诱导的死亡的能力。此外,抗-LPA抗体能除去血清提供的保护。估计血清包含约5-20mM LPA。在SKOV3细胞中紫杉醇诱导的胱天蛋白酶-3,7激活,并且向细胞中加入血清保护细胞免受细胞凋亡。紫杉醇-诱导的胱天蛋白酶激活通过向培养基中加入所有三种抗-LPAmAb增强。这表示通过选择性抗体介导中和血清中存在的LPA除去LPA的保护和抗凋亡作用。
抗-LPA mAb抑制LPA-介导的肿瘤细胞迁移
转移癌的一个重要特征是肿瘤细胞规避接触抑制并远离其来源的组织。显示LPA促进几种癌细胞类型中的转移潜能。因此,通过使用细胞单层划痕分析,测试了抗-LPA mAb在几种人癌细胞系中阻断LPA-依赖性细胞迁移的能力。将细胞接种再96孔平板中并培养至融合。饥饿24小时后,用移液管尖端刮孔的中心。在本领域接受的“划痕分析”中,细胞通过向划痕迁移并接近伤口的固定模式应答刮痕伤口。通过数字摄影在所需的时间点以10x的放大倍率监测迁移和伤口靠近的进行。没有处理的细胞(NT),用含或不含(w/o)mAb B7(10μg/ml)或同种型匹配的非特异性抗体(NS)(10μg/ml)的LPA(2.5mM)处理的细胞。在未处理的细胞中,在划痕后,单层边缘之间存在大的缺口。相反,在相同的时间点,LPA-处理的细胞仅有小的缺口,且一些细胞正在越过缺口进行接触。在用LPA和抗-LPA抗体B7处理的细胞中,在该时间点的缺口比只用LPA处理的细胞大几倍,虽然没有未处理的对照细胞的缺口那么大。这显示抗-LPA抗体对肾细胞癌(Caki-1)细胞的LPA-刺激的迁移具有抑制租用。采用mAbs B3和B58获得类似的数据。这表明抗-LPA mAb能降低最初来源于转移癌的细胞系的LPA-介导的迁移。
抗-LPA mAb抑制来自肿瘤细胞的促致癌细胞因子的释放
LPA通过提供促生长肿瘤微环境和促进血管生成来参与癌的建立和进展。特别地,在癌细胞中观察到促生长因子(诸如IL-8和VEGF)的增加。IL-8强烈与癌进展和预后牵连。IL-8可能通过促进心血管形成和诱导嗜中性粒细胞和内皮细胞的趋化性来影响癌症。此外,IL-8的过表达与许多人癌症类型中的抗药显型的形成有关。
测试与非特异性抗体(NS)相比,三种抗-LPA mAb(B3,B7和B58)降低体外IL-8产生的能力。将Caki-1细胞播种于96孔板中并生长直至融合。在过夜血清饥饿后,用含有或不含有抗-LPA mAb B3,B7,B58或NS(非特异性的)的18:1 LPA(0.2mM)处理细胞。24小时后,收集在递增浓度的抗-LPA mAb B3,B7和B58下,用或不用LPA处理的肾癌细胞(Caki-1)的培养上清液,并使用商购可获得的ELISA试剂盒(Human Quantikine Kit,R&DSystems,Minneapolis,MN)分析IL-8水平。在用抗-LPA mAb预处理的细胞中,IL-8表达以剂量依赖性方式显著降低(0.1-30μg/mL mAb),而LPA在非处理的细胞中以平均100%的程度增加IL-8表达。用其他熟知的促-血管生成因子(VEGF)获得类似的结果。还在其他癌细胞系诸如胰腺细胞系Panc-1中观察到抗-LPA mAb抑制IL-8的释放。这些数据显示促-血管生成因子释放的阻断是这些抗-LPA mAb的附加和潜在的重要影响。
抗-LPA mAb已知体内血管生成
使用Matrigel Plug分析一个抗-LPA mAb(B7)减轻体内血管生成的能力。该分析使用Matrigel,一种包括衍生自鼠肿瘤的基膜的肿瘤残余物的专利混合物。当将Matrigel,或其衍生生长因子-还原的(GFR)Matrigel,皮下(sc)注射到动物中时,其凝固并形成一个‘栓(plug)’。如果在放置前混合促-血管生成因子与基质,所述栓将被最终形成血管的血管内皮细胞侵入。Matrigel可以单独制备或与重组生长因子(bFGF,VEGF)或肿瘤细胞混合来制备,然后皮下注射到六周龄裸(NCrNu/Nu)雌性小鼠的腹侧。在该实施例中,将Caki-1(肾癌)细胞引入到Matrigel中并产生足够水平的VEGF和/或IL8和LPA。从用盐水或10mg/kg抗-LPA mAb-B7处理的鼠中制备含5 x 105Caki-1细胞的Matrigel栓,每3天在Matrigel植入之前1天开始。对栓进行内皮CD31染色,接下来定量在栓中形成的微血管。定量数据为来自3个栓的至少16个视野/切片的平均+/-SEM。与来自盐水处理的小鼠的栓相比,来自用抗-LPA mAbB7处理的小鼠的栓显示在血管形成的显著降低,如通过CD31的内皮染色所测定的。与用盐水处理的动物相比,染色血管的定量显示在来自用mAbB7处理的动物的含Caki-1的栓中血管生成降低大于50%。作为抗-LPAmAb治疗的结果,在肿瘤细胞血管生成中这是一个统计学显著的降低(通过学生T检验测定,mAb B7对盐水的p<0.05)。
抗-LPA mAb降低肾和胰腺异种移植物中肿瘤的进展
已经显示(如上)所述抗-LPA抗体有效降低多个人肿瘤细胞系中LPA-诱导的肿瘤增殖、迁移、保护细胞免受细胞死亡和细胞因子的释放是。然后在肾癌和胰腺癌的异种移植模型中测试mAbs B58和B7。下面为证实抗-LPA抗体方法的潜在抗致癌效应的初级结果。
使用标准方法通过向4周龄的雌性裸(NCr Nu/Nu)小鼠的左腹侧内皮下注射Caki-1和Panc-1人肿瘤细胞来形成肿瘤。对于Caki-1,10天后,对于Panc-1,30天后,当形成实体瘤(~200mm3)时,将小鼠随机分配到治疗组中。通过腹膜内(i.p.)施用25mg/kg的抗-LPAmAbs或载体(盐水溶液)来起始治疗。在研究期间,每三天施用抗体。对于caki-1肿瘤,治疗由25mg/kg的抗-LPA mAb B58组成,对于Panc-1或盐水,治疗由25mg/kg的mAb B7组成。数据为用于caki-1研究的7个盐水处理的小鼠和6个B58-处理小鼠的平均+/-SEM,以及用于panc-1研究的4个盐水处理小鼠和5个B7-处理小鼠的平均+/-SEM。每隔一天用电子卡尺测量肿瘤体积,并用公式W2 x L/2测定肿瘤体积。在盐水组中,在肿瘤到达1500mm3后处死动物。记录最终的肿瘤体积和重量。
在初步实验中,在肿瘤达到大约400-500mm3后,抗-LPA mAb降低肿瘤体积的能力是明显的。此时,来自对照动物的肿瘤继续生长,而来自抗-LPA mAb-处理的动物的肿瘤在两个异种移植模型中展现较慢的生长速率。当与来自盐水处理的动物的肿瘤重量相比,数据显示抗-LPA mAb还降低caki-1和panc-1肿瘤的最终肿瘤重量。
抗-LPA mAb调节具有肿瘤的动物中促-血管生成细胞因子的循环
水平
所述抗-LPA mAbs(B58和B7)还影响促-血管生成细胞因于的循环水平。在用抗-LPA mAb7(Panc-1)处理的动物中,在任何抗体处理的动物中,白介素-8(IL-8)的血清水平是不可检测的,而分别在85天和63天后在Panc-1和Caki-1异种移植中IL-8血清水平是可检测的。更重要地,肿瘤大小和IL-8水平之间存在强相关性(r=0.98)。在具有Caki-1肿瘤的动物中,当与用盐水处理(r=0.55)比较时,用抗-LPA mAb58(r=0.34)处理还降低人IL-8的血清水平。如上面提到的,认为细胞因子循环水平的降低是由于直接抑制细胞因子从肿瘤细胞本身释放所致。这些数据表明抗-LPA mAb降低肿瘤进展的能力,同时还降低促-血管生成化合物的循环水平。
抗-LPA mAb降低在转移瘤的小鼠模型中的肿瘤进展
肿瘤进展的一个重要特点是肿瘤转移并在远的地点形成继发性肿瘤结节的能力。上文描述的体外研究证实LPA诱导肿瘤细胞以规避接触抑制并促进在关于细胞运动性的划痕实验中的迁移的能力。在这些研究中,所述抗-LPA mAb还抑制LPA的肿瘤生长促进效应因子。抗-LPA mAb抑制体内肿瘤转移的功效。肿瘤转移的现象在动物模型中难以模拟。许多研究者使用“实验性”转移模型,其中将肿瘤细胞直接注射到血流中。
血管形成是一个转移的整体过程,因为血管数的增加意味着细胞得以移动更短的距离来到达循环。基于抗-LPA mAb能阻断转移过程中的几个整体步骤这个发现,认为抗-LPA mAb抑制体内肿瘤细胞转移。
研究:使用高转移的鼠黑素瘤(B16-F10)来检测三种抗-LPA mAb对体内转移的治疗作用。该模型证实对自体毒素的cPA抑制剂是高度敏感的。4周龄的雌性(C57BL/6)小鼠接受经由尾静脉注射B16-F10鼠黑素瘤肿瘤细胞(100uL,5 x 104个细胞/动物)。每三天通过腹膜内注射给小鼠(10只/组)施用25mg/kg的抗-LPA mAb(B3或B7)或盐水。18天后,收获肺部并分析。所述肺部器官是黑素瘤细胞的优选转移位点,并因此紧密地就转移结节进行评估。经由气管用10%的缓冲福尔马林膨胀肺,以同时膨胀和固定,使得即使是小的病灶在组织学检查中也能被检测。将肺分成5个叶,并通过尺寸(大>5mm;中1-4mm;小<1mm)来分类肿瘤,并在解剖显微镜下计数。在检查肺部后,肿瘤的数量在抗体处理的动物中明显降低。对于用mAb B3处理的动物,大肿瘤降低21%,中肿瘤降低17%和小肿瘤降低22%。对于用mAb B3处理的动物的小肿瘤数目与用盐水处理的动物的小肿瘤数目,学生T检验的统计学分析给出p<0.05。
如在上述实施例中所示,现在显示LPA的致肿瘤作用延伸到肾癌(例如,Caki-1)和胰腺癌(Panc-1)细胞系。在两种细胞系中,LPA诱导肿瘤细胞增殖、迁移和促-血管生成剂和/或促转移剂(诸如VEGF和IL-8)的释放。现在显示三种高亲和性和特异性的单克隆抗-LPA抗体在一组体外细胞分析和血管生成和转移的体内肿瘤模型中展现功效。
实施例11 肿瘤活检材料的免疫组织化学
本实施例的目的是证实针对S1P产生的mAb能用于检测活检材料中的S1P。该免疫组织化学(IHC)方法评估S1P(认为其由肿瘤自身产生)在肿瘤中的水平,并比测试鞘氨醇激酶的蛋白或RNA表达更敏感和更具有特异性。此外,IHC方法不受S1P信号的减少,因为分泌自肿瘤的S1P稀释到胞外空间(即,血浆隔室)中。分析了在来自小鼠Matrigel/异种移植模型中的U937人肿瘤切片(冷冻的,10μm厚)中的S1P含量。U937细胞(人淋巴瘤细胞系;ATCCcatno#CRL-1593.2)在10.5mg/ml浓度下与Matrigel基质混合。将600μL含U937的Matrigel混合物(30 x 106个细胞/栓,600μl体积)植入4-6周nu/nu雌性小鼠的右腹侧,并允许生长30天。处死动物并切除Matrigel栓,埋入OTC中并在干冰和异戊烷中闪冻(flash frozen)。然后使用低温恒温器切成5um切片。然后将切片室温下固定在10%中性缓冲福尔马林(Sigma,St.LouisMO;catalognumber:HT50-1-1;lot#025K4353)中20分钟,然后切片。室温下用于PBS中的100mM甘氨酸(pH7.4)洗涤切片5分钟,用PBS/0.1%Tween20洗涤两次。室温下在1%BSA/PBS/0.05%Tween中封闭切片20分钟。在1%/BSA/PBS/0.05%Tween中稀释(如所示的,1:25或1:50)第一抗体(例如,鼠抗-S1P mAb)并室温下与肿瘤切片孵育3小时。然后在轻轻搅拌下用PBS/0.1%Tween洗涤切片3次。稀释的第二抗体(FITC-缀合的抗小鼠Ab(1∶250)和RRX-缀合的抗-大鼠Ab(1:2500或1:500)与肿瘤切片在1%BSA/PBS/0.05%Tween中在室温下孵育1小时。然后用PBS/0.05%Tween以5分钟的间隔洗涤切片6次。通过室温下与稀释于PBS的DAPI(1:5000)孵育20分钟,用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二乳酸盐(DAPI,10mg;Sigma,St.LouisMO;catalognumber D3571,lot 22775)对切片进行对比染色。然后用PBS以5分钟的间隔洗涤两次并用DI H2O洗涤一次,并在Gelvitol封片介质中封片并晾干。使用的第一抗体是稀释为1.0mg/ml的LT1002(LH-2;15mg/ml)抗-S1P mAb,并在1%/BSA/PBS/0.05%Tween中1:25的工作浓度下添加。使用的第二抗体是:在1%/BSA/PBS/0.05%Tween中以1∶250稀释的荧光素(FITC)-缀合的兔抗-鼠IgG(H+L)(JacksonImmunoResearch,West Grove PA;catalog # 315-095-003;lotnumber:67031)Ab。用DeltaVision去卷积显微镜系统(AppliedPrecision,Inc.,Issaquah,WA.)系统捕获图像。所述系统包括安装在Nikon TE-200倒置表面荧光显微镜上的Photometrics CCD。通常,获取间隔~0.2um的8-10个光学切片。设定曝光时间使得相机响应在每个荧光团的线性范围。镜片包括20x和10x。使用在Silicon Graphics Octane工作站上的SoftWorxsoftware(AppliedPrecision,Inc)对数据设定进行去卷积和分析。
使用该IHC方法,能在肿瘤活检图像中容易看到S1P,使用抗-S1P mAb为第一抗体。相反,在对照样品中不存在S1P染色,在该样品中省略第一抗体。
不受理论或这些实施例的限制,认为生物标记物S1P的测量法可以与S1P受体和鞘氨醇激酶的基因表达的测量结合,两者可用作可替代的癌症标记物。在本领域中已知的基因表达分析的方法的实例包括DNA阵列或微阵列(Brazma和Vilo,FEBS Lett.,2000,480,1724;Celis,等人,FEBS Lett.,2000,480,216)、SAGE(基因表达的串联分析)(Madden,等人,Drug Discov.Today,2000,5,415425)、READS(限制性内切酶扩增消化的cDNA)(Prashar和Weissman,Methods Enzymol.,1999,303,25872)、TOGA(总的基因表达分析)(Sutcliffe,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2000,97,197681),蛋白质阵列和蛋白质组学(Celis,等人,FEBS Lett.,2000,480,216;Jungblut,等人,Electrophoresis,1999,20,210010),表达序列标签(EST)测序(Celis,等人,FEBS Lett.,2000,480,216;Larsson,等人,J.Biotechnol.,2000,80,14357),差减RNA指纹技术(SuRF)(Fuchs,等人,Anal.Biochem.,2000,286,9198;Larson,等人,Cytometry,2000,41,203208),差减克隆,差异显示(DD)(Jurecic和Belmont,Curr.Opin.Microbiol.,2000,3,31621),比较基因组杂交(Carulli,等人,J.Cell Biochem.Suppl.,1998,31,28696),FISH(荧光原位杂交)技术(Going和Gusterson,Eur.J.Cancer,1999,35,1895904)和质谱方法(To,Comb.Chem.High Throughput Screen,2000,3,23541)。
***
在本公开的启发下,在无需过度实验可以得到和执行本文所述和要求保护的所有的组合物和方法。而本发明的组合物和方法以优选实施方案的方式进行描述,对于本领域的技术人员来说明显的是,可以对所述组合物和方法进行改变。认为所有的这些对本领域技术人员来说显而易见的类似替换和修饰在所附权利要求所限定的本发明的精神和范围内。
在本说明书中的所有专利、专利申请和出版物表示本发明所属领域的普通技术人员的水平。所有专利、专利申请和出版物(包括对其要求优先权或其他利益的那些)通过引用方式并入本文,其程度如同每个出版物都被单独且明确地表明以引用方式并入本文。
本文中示例性地描述的本发明可以在缺少本文中没有明确公开的任何元素下实行。因此,例如,在本文的每一种情况下,术语“包括”,“基本上由......组成”和“由......组成”中的任一个可以用另外两个术语的任一个替代。所使用的术语和表达用作说明书的术语且不受限制,且不意图在所述术语和表达的使用中排除任何所示和所描述的等价性质,或其部分,但认为多种修饰可能在本发明所要求保护的范围内。因此,应该理解尽管本发明具体由优选实施方案和任选特征公开,本文所公开的概念的修饰和改变取决于本领域的技术人员,且认为所述修饰和变化在所附权利要求所限定的本发明的范围内。
Claims (19)
1.一种对溶血磷脂酸具有反应性的分离的免疫衍生部分。
2.根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,其中所述免疫衍生部分选自多克隆抗体;单克隆抗体;嵌合抗体;多克隆、单克隆或嵌合抗体的片段;多克隆、单克隆或嵌合抗体的变体;和多克隆、单克隆或嵌合抗体的衍生物。
3.一种组合物,其包含载体,任选地是药学可接受载体和根据权利要求1的分离的免疫衍生部分。
4.一种对溶血磷脂酸具有反应性的分离的单克隆抗体,任选地包含在组合物中,所述组合物进一步包含载体,任选地是药学可接受载体。
5.一种方法,选自:
(a)一种降低受试者中溶血磷脂酸有效浓度的方法,包括给受试者施用足以降低溶血磷脂酸有效浓度的量的、根据权利要求1的免疫衍生部分,其中所述免疫衍生部分任选地是单克隆抗体,由此降低溶血磷脂酸的有效浓度;和
(b)一种降低受试者中溶血磷脂酸有效浓度的方法,包括给受试者施用足以降低所述溶血磷脂酸有效浓度的量的、根据权利要求1的免疫衍生部分,其中所述免疫衍生部分是单克隆抗体,其中所述溶血磷脂酸有效浓度被降低。
6.根据权利要求5,(a)部分的方法,其中所述受试者是哺乳动物,任选地是人,且其中所述免疫衍生部分任选地选自多克隆抗体;单克隆抗体;嵌合抗体;多克隆、单克隆或嵌合抗体的片段;多克隆、单克隆或嵌合抗体的变体;和多克隆、单克隆或嵌合抗体的衍生物。
7.根据权利要求5的方法,其中所述免疫衍生部分作为组合物的一部分被施用,所述组合物进一步包含载体,任选地是药学可接受载体。
8.一种方法,选自:
(a)一种治疗方法,包括给需要治疗性或预防性治疗的受试者施用有效完成所述治疗的量的、根据权利要求1的免疫衍生部分,其中所述免疫衍生部分任选地是单克隆抗体;
(b)一种治疗方法,包括给需要治疗性或预防性治疗的受试者施用有效完成所述治疗的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,其中所述免疫衍生部分是单克隆抗体;
(c)一种抑制癌细胞增殖的方法,包括使癌细胞接触有效抑制所述癌细胞增殖的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;
(d)一种抑制体内癌细胞增殖的方法,包括给已知或怀疑患有癌症的受试者施用有效抑制包括所述癌的细胞增殖的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;
(e)一种抑制癌细胞迁移的方法,包括使癌细胞接触有效抑制所述癌细胞迁移的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;
(f)一种抑制体内癌细胞迁移的方法,包括给已知或怀疑患有癌症的受试者施用有效抑制包括所述癌的细胞迁移的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;
(g)一种抑制患有肿瘤的动物中肿瘤转移的方法,包括给所述动物施用有效抑制所述肿瘤转移的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;
(h)一种抑制已知或怀疑患有肿瘤的动物中肿瘤转移的方法,包括给所述动物施用对溶血磷脂酸具有反应性的分离的免疫衍生部分,使得所述肿瘤的转移被抑制,其中所述肿瘤任选地选自肾癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、成神经细胞瘤、肝细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌和白血病;
(i)一种抑制肿瘤中血管生成的方法,包括给已知或怀疑患有肿瘤的动物施用对溶血磷脂酸具有反应性的分离的免疫衍生部分,使得所述肿瘤中的血管生成被抑制,其中所述肿瘤任选地选自肾癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、成神经细胞瘤、肝细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌和白血病;
(j)一种增加细胞的细胞凋亡的方法,任选地在体内,包括使细胞,任选地是癌细胞接触有效增加所述细胞的细胞凋亡的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体;和
(k)一种增强细胞毒素剂对细胞的抗凋亡作用的方法,任选地在体内,包括使细胞,任选地是癌细胞接触有效增强细胞毒素剂对细胞的抗凋亡作用的量的、根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体。
9.根据权利要求8的方法,其中所述受试者是哺乳动物,任选地是人,且其中所述免疫衍生部分选自多克隆抗体;单克隆抗体;嵌合抗体;多克隆、单克隆或嵌合抗体的片段;多克隆、单克隆或嵌合抗体的变体;和多克隆、单克隆或嵌合抗体的衍生物。
10.根据权利要求8的方法,其中所述免疫衍生部分作为组合物的一部分被施用,所述组合物进一步包含载体,任选地是药学可接受载体。
11.根据权利要求8,(a)或(b)部分的方法,其中所述治疗是癌症治疗。
12.根据权利要求8,(c)、(d)、(e)、(f)、(j)或(k)部分的方法,其中所述癌细胞选自肾癌细胞、胰腺癌细胞、黑素瘤细胞、肺癌细胞、成神经细胞瘤细胞、肝细胞癌细胞、多形性成胶质细胞瘤细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、结肠直肠癌细胞和白血病细胞。
13.一种治疗癌症的方法,包括给患有或怀疑患有癌症的动物,任选地是人或非人哺乳动物施用治疗有效量的根据权利要求1的分离的免疫衍生部分,任选地是单克隆抗体,使得所述动物中溶血磷脂酸的有效浓度降低。
14.根据权利要求13的方法,其中,所述癌症选自肾癌、胰腺癌、黑色素瘤、肺癌、成神经细胞瘤、肝细胞癌、多形性成胶质细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌和白血病。
15.根据权利要求14的方法,进一步包括施用细胞毒素剂。
16.一种施用方法,包括给需要用根据权利要求1的分离的免疫衍生部分治疗的受试者,任选地是人或非人哺乳动物,施用所述免疫衍生部分,其中所述分离的免疫衍生部分任选地以组合物施用,所述组合物进一步包含载体,任选地是药学可接受载体。
17.根据权利要求16的方法,其中所述免疫衍生部分选自多克隆抗体;单克隆抗体;嵌合抗体;多克隆、单克隆或嵌合抗体的片段;多克隆、单克隆或嵌合抗体的变体;和多克隆、单克隆或嵌合抗体的衍生物。
18.根据权利要求16的方法,其中所述施用选自:局部(任选地是经选自经皮,表皮眼部、子宫内、阴道、直肠、肺部、气管内或鼻内施用的局部途径)、口服和肠胃外施用(任选地是经选自静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或颅内施用的肠胃外途径)。
19.根据权利要求16的方法,其包括肠胃外施用包含对溶血磷脂酸具有反应性的单克隆抗体和药学可接受载体的组合物。
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