CN102917587A - 来那度胺和沙利度胺免疫测定法 - Google Patents

来那度胺和沙利度胺免疫测定法 Download PDF

Info

Publication number
CN102917587A
CN102917587A CN2011800135751A CN201180013575A CN102917587A CN 102917587 A CN102917587 A CN 102917587A CN 2011800135751 A CN2011800135751 A CN 2011800135751A CN 201180013575 A CN201180013575 A CN 201180013575A CN 102917587 A CN102917587 A CN 102917587A
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
lenalidomide
conjugate
thalidomide
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2011800135751A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102917587B (zh
Inventor
S·J·萨拉莫内
J·B·考特尼
H·萨尔德
V·赫奇
A·沃尔科夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Saladax Biomedical Inc
Original Assignee
Saladax Biomedical Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Saladax Biomedical Inc filed Critical Saladax Biomedical Inc
Publication of CN102917587A publication Critical patent/CN102917587A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102917587B publication Critical patent/CN102917587B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9453—Cardioregulators, e.g. antihypotensives, antiarrhythmics
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/815—Test for named compound or class of compounds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及新的缀合物和衍生于来那度胺的免疫原以及由这些免疫原所产生的抗体，它们用于定量和监测生物流体中的沙利度胺和来那度胺的免疫测定法。

Description

来那度胺和沙利度胺免疫测定法
发明领域
本发明涉及用于测定人生物流体中来那度胺(lenalidomide)和沙利度胺(thalidomide)的存在和/或定量它们的量，从而快速确定治疗过程中的最佳药物浓度的免疫测定领域。
发明背景
癌症是用来描述一组恶性肿瘤的术语，所述恶性肿瘤在身体某部分的细胞生长不受控制时共有共同的发育特性。大多数癌症形成为肿瘤，但也可表现在血液中并通过它们生长的其它组织而传播。癌症恶性肿瘤最常用外科手术、化疗和/或放疗的组合来治疗。用于治疗具体癌症的治疗类型取决于几种因素，包括癌症恶性肿瘤的类型以及其被诊断的阶段。
常用化学名为沙利度胺的化疗剂具有下式：
Figure BDA00002128053800011
常用化学名为来那度胺的化疗剂具有下式：
Figure BDA00002128053800012
沙利度胺具有免疫调节、抗炎以及抗血管生成特性。免疫调节和抗炎特性可能与通过编码肿瘤坏死因子α的mRNA的降解抑制肿瘤坏死因子α的过量产生有关(Moreira,J Exp Med,177(6):1675-80,1993)。沙利度胺的其他免疫调节和抗炎特性包括抑制巨噬细胞参与前列腺素合成以及通过外周血单核细胞调节白介素-10和白介素-12的产生。抗炎和抗血管生成特性的组合使得沙利度胺成为具有治疗多种疾病的显著潜力的新型治疗剂(Teo,Clin Pharmacokinet,43(5):311-27,2004)。许多最新临床试验已证明沙利度胺在患有多发性骨髓瘤、肾癌以及多形性胶质母细胞瘤的患者中的疗效(Singhal,N Engl J Med,341(21):1565-71,1999;Marx,J Neurooncol,54(1):31-8,2001)。目前，沙利度胺被批准用于治疗患有新诊断的多发性骨髓瘤的患者和用于麻风结节性红斑的急救治疗(Package-insert-Thalidomide,Celgene Corp.,2009)中。
来那度胺是具有免疫调节、抗增殖以及抗血管生成特性的沙利度胺衍生物。来那度胺通过诱导细胞周期停滞和凋亡对多发性骨髓瘤细胞发挥直接的抗增殖作用(Armoiry，J Clin Pharm Ther,33(3):219-26,2008)。来那度胺被批准用于治疗患有多发性骨髓瘤和与缺失5q细胞遗传异常(deletion 5qcytogenetic abnormality)相关的骨髓增生异常综合征(Package-insert-Revlimid,Celgene Corp.,2009)。
沙利度胺和来那度胺的作用机制和代谢途径仍然未得到充分表征。在体内，这两种药物都可能经历非酶促水解和酶促代谢，从而产生多种代谢物，但是并未发现这些化合物是沙利度胺疗效的原因(Lepper,Curr DrugMetab,7(6):677-85,2006)。
沙利度胺和来那度胺表现出的血浆浓度显著变异性。沙利度胺在HIV患者中药代动力学作用的I期研究已表现出多种最大药物浓度Cmax (2.8±2.6mg/L)和半衰期t1/2(5.9±2.3小时)(Wohl,J Infect Dis,185(9):1359-63,2002)。向健康个体给予沙利度胺导致高达52%的Cmax变异性以及导致高达37%的t1/2变异性(Package-insert-Thalidomide,Celgene Corp.,2009)。来那度胺在患有中枢神经系统肿瘤的患者中的I期试验已表现出高达78%的Cmax变异性和高达122%的t1/2变异性(Fine,Clin Cancer Res,13(23):7101-6,2007)。
由于沙利度胺和来那度胺的效能在较高浓度水平时获得改善，并且这些药物表现出广泛的患者内和患者间药代动力学变异性，因此监测这些药物在血液中的浓度以及调节至靶水平对于提高效能和将毒性减至最小是有用的。沙利度胺和来那度胺的个体内和个体间药代动力学变异性程度受到许多因素的影响，包括：
○年龄
○体重
○器官功能
○药物-药物相互作用
○遗传调节
○顺应性
作为这种变异性的结果，等剂量的同一药物在不同个体中可导致明显不同的临床结果。相同剂量的沙利度胺和来那度胺的效力取决于患者中个体药物清除率和最终血清药物浓度而显著不同。治疗性药物监控(management)会为临床医师对患者药物给药的变化提供洞察力。利用治疗性药物监控，可针对患者使药物剂量适应个别需要，并且有效治疗病症而无不良副作用的机会更高。
沙利度胺和来那度胺的常规治疗性药物监控需要适合一般实验室设备的简单自动化检测。已记载了使用液相色谱(LC)和UV或质谱检测来测定人血液和血浆中的沙利度胺和来那度胺浓度(Tohnya,J Chromatogr B AnalytTechnol Biomed Life Sci,811(2):135-41,2004;Chen,J Clin Pharmacol,47(12):1466-75,2007;Teo,J Clin Pharmacol,39(11):1162-8,1999)。这些方法费力、需要液相-液相或固相提取、使用昂贵的设备、并且不适合常规临床实验室使用。到目前为止，并没有用于测量用来那度胺和/或沙利度胺治疗的患者的人生物流体中的这些化疗剂的免疫测定法。
由上述可以看出，没有用于测定人生物流体中沙利度胺和来那度胺的存在和/或定量它们的量的免疫测定法。通过免疫测定，沙利度胺和来那度胺的常规治疗性药物监控会提供适合标准实验室设备的简单自动化检测。然而，为了提供这样的免疫测定法，必须产生对沙利度胺和来那度胺具有特异性的抗体。用于该测定的衍生物和免疫原必须通过所产生的这些相应抗体赋予沙利度胺和来那度胺特异性反应性。
发明内容
根据本发明，已产生了一类新的抗体，其对沙利度胺和来那度胺有相当大的反应性，并且可用于相同的免疫测定法中来测定用沙利度胺和来那度胺治疗的患者的样品中的这些化疗药物的存在和/或定量它们的量。
已经发现，通过使用作为含有多胺聚合物的免疫原性载体与下式化合物的缀合物的免疫原产生抗体，所述抗体对来那度胺以及来那度胺与沙利度胺的混合物具有特异性，且对沙利度胺和来那度胺两者的药学上无活性的代谢物均无反应性或不与之结合：
Figure BDA00002128053800041
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；
X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
提供与来那度胺或沙利度胺与来那度胺的混合物选择性反应的这些抗体使得能够产生能够特异性检测和定量的免疫测定法，从而监测用沙利度胺或来那度胺治疗的患者的流体样品中的沙利度胺和来那度胺。本发明还包括用于所述免疫测定法的试剂和试剂盒。
发明详述
根据本发明，提供了一类新的抗体，其与来那度胺或来那度胺与沙利度胺的混合物选择性结合，并且不与沙利度胺和来那度胺中任一种的药学上无活性的代谢物交叉反应。已经发现，通过利用式III的这些来那度胺衍生物作为免疫原，提供了本发明的这类新抗体。正是通过利用这些抗体，才研发了用于检测和/或定量血液、血浆或其他身体流体样品中的沙利度胺和来那度胺的免疫测定法，包括用于此类免疫测定法的试剂和试剂盒。
根据本发明，提供了一类新试剂，其可用于这些用以检测和/或定量样品中的沙利度胺和来那度胺的免疫测定法中的任一种。该试剂是载体与具有下式的配体的缀合物：
Figure BDA00002128053800051
其中B、Y和P如上所述，并且X2是能够与所述载体结合的末端官能团。
通过利用这种免疫测定法，可以检测和/或定量用沙利度胺或来那度胺治疗的患者的身体流体样品中的沙利度胺或来那度胺的存在和量。以这种方式，可以在治疗过程中监测用沙利度胺或来那度胺治疗的患者，并且可以通过利用由式III的免疫原和式III-A的缀合物所产生的抗体根据所述监测调整治疗。通过本发明，可以实现用沙利度胺或来那度胺作为治疗剂治疗的患者中的沙利度胺和来那度胺的治疗性药物监控。待检测和/或定量的治疗剂是式I的沙利度胺和式II的来那度胺。
通过提供式III-A的缀合物作为免疫测定法中的试剂并提供与免疫原性载体缀合的式III的免疫原，提供了可用于检测和/或定量化疗剂来那度胺和沙利度胺的免疫测定法中的抗体和试剂。本发明所产生的这些试剂和抗体可用于检测和定量来那度胺或沙利度胺的免疫测定法中。通常，用一种而不是两种这些化疗剂来治疗患者。因此，与来那度胺和沙利度胺两者选择性反应的抗体或试剂可用于这些免疫测定法中来检测来那度胺或沙利度胺。这是事实，因为用来那度胺治疗的患者通常不用沙利度胺治疗，并且用沙利度胺治疗的患者通常不用来那度胺治疗。因此，本发明的试剂和抗体可用于这两种免疫测定法中的任一种来单独地检测和/或定量这两种化疗剂。
如上文所述，可由式III的免疫原产生的抗体与来那度胺和沙利度胺与来那度胺的混合物选择性反应，并且可用于沙利度胺或来那度胺的免疫测定法中。尽管这些抗体与沙利度胺和来那度胺两者选择性反应，但是为了用于沙利度胺的免疫测定法中，基于所述抗体与沙利度胺和来那度胺两者的组合反应性，所述抗体应具有至少约10%优选至少约40%的与沙利度胺的选择性反应性。根据本发明，抗体可通过利用式III的免疫原产生，基于其与来那度胺和沙利度胺两者的反应性，所述抗体具有至少约10%且最多约50%的与沙利度胺的反应性。
另一方面，为了将抗体用于来那度胺的免疫测定法，可以使用由与来那度胺或与来那度胺和沙利度胺两者具有选择性反应性的式III的免疫原所产生的任何抗体。根据本发明，利用式III的免疫原，可以产生基于其与沙利度胺和来那度胺的反应性与来那度胺选择性反应或者与来那度胺和沙利度胺两者选择性反应的抗体。根据本发明，利用式III的免疫原，可以产生与来那度胺而非沙利度胺选择性反应的抗体，即基于其与来那度胺和沙利度胺两者的选择性反应性，具有100%的与来那度胺的选择性反应性的抗体。具有基本上100%的与来那度胺的选择性反应性且基本上不具有与沙利度胺的选择性反应性的抗体特别优选用于来那度胺的免疫测定法中。
本发明的测定法所用的试剂是聚合载体与式III-A的化合物的缀合物。这些缀合物是存在于样品中的沙利度胺或来那度胺的竞争性结合配偶体，用于与本发明的抗体结合。因此，与所述抗体结合的该缀合物试剂的量与样品中沙利度胺或来那度胺的量成反比。根据本发明，所述测定使用任意常规测量方式来检测和测量与所述抗体结合或未结合的所述缀合物的量。通过使用所述方式，能够测定结合或未结合的缀合物的量。通常，通过以下方式测定样品中沙利度胺和来那度胺的量：使由样品中的沙利度胺或来那度胺所产生的结合或未结合的缀合物的测定量与通过用含有已知量的沙利度胺或来那度胺的样品获得的标准曲线或校正曲线测定的结合或未结合的缀合物的值相关，所述已知量位于待检样品的期望的范围内。利用与用于所述样品相同的免疫测定操作来确定这些产生校正曲线的研究。
由式III的化合物制备缀合物以及免疫原。当在缀合物或免疫原中，所述载体和多胺聚合物连接于式III化合物的配体部分时，该配体部分具有下式：
其中X'是-CH2-或功能性连接基；
并且Y、p和B如上文所述。
该配体部分可以连接于所述缀合物或免疫原的载体上的一个或多个活性位点。通常，这些载体含有聚合物，最优选具有反应性氨基的多胺聚合物。在形成缀合物特别是免疫原时，X’优选是能够与氨基反应的官能团。然而，对于免疫测定法所用的试剂而言，X’可以是能够与任意常规载体反应的任意官能团。当用式III化合物制备免疫原时，式III化合物中的X’优选是能够与多胺聚合物结合或连接的任意官能团。
定义
在本说明书全文中，应当理解下列定义：
术语“亚烷基”指含有1-10个碳原子的二价饱和直链或支链烃取代基。
术语“免疫原”和“免疫原性”指能够在生物体中引发、产生或生成免疫应答的物质。
术语“缀合物”指由两个部分连接在一起而形成的任意物质。本发明的代表性缀合物包括通过将小分子(如式III的化合物或式III-A的化合物)和大分子(如载体，优选包含多胺聚合物特别是蛋白质的载体)连接在一起而形成的那些缀合物。在缀合物中，小分子可连接或联接于大分子上的一个或多个活性位点。术语缀合物包括术语免疫原。在用作试剂的缀合物中，载体可以是任意载体，并且X可以是能够与载体连接的任意官能团。在免疫原中，载体是多胺聚合物，并且X是能够与多胺聚合物连接的任意官能团。
“半抗原”是部分或不完全抗原。它们是不含蛋白质的物质，大部分是低分子量物质，其不能刺激抗体形成但是却与抗体反应。后者是通过以下方式形成的：将半抗原与高分子量免疫原性载体偶联，然后将这种偶联产物即免疫原注射到人或动物个体中。本发明的半抗原是来那度胺(II)。
本文所用的“间隔基团”或“间隔子”指通过CH2或功能性连接基连接两个或更多个亚结构如半抗原、载体、免疫原、标记或示踪剂的化学结构的一部分。在本申请的下文中会列举这些间隔基团。间隔基团的原子和间隔基团内链的原子自身经化学键连接。直链或分链的饱和或不饱和碳链是优选的间隔子。这些碳链还可以在链中或在链的末端包括一个或多个杂原子。“杂原子”表示除了碳以外的选自氧、氮以及硫的原子。间隔基团也可以包括环状或芳族基团，作为链的一部分或作为链中一个原子的取代基。
通过计数除了氢以外的原子来确定间隔基团中的原子数量。通过沿着连接的亚结构之间的最短路径计数除了氢以外的原子数量来确定间隔基团内链中的原子数量。功能性连接基可用于活化(例如在其上提供可用的功能位点)半抗原或间隔基团，以合成半抗原与标记或载体或多胺聚合物的缀合物。
本文所用术语“免疫原性载体”是免疫原性物质，通常是蛋白质，其可与半抗原(在此处是上文所述的来那度胺或来那度胺衍生物)连接，由此使得这些半抗原衍生物能够诱导免疫应答并引发能够与这些半抗原和沙利度胺特异性结合的抗体产生。免疫原性载体和连接基会在本申请的下文列举。免疫原性载体物质包括蛋白质、糖蛋白、复合聚氨基多糖(complexpolyamino-polysaccharide)、颗粒以及被识别为外源并且由此引发宿主的免疫应答的核酸。可利用对该制备而言已知的任何常规方式，由多糖制备聚氨基多糖。
多种蛋白质类型还可用作聚(氨基酸)免疫原性载体。这些类型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白等。示例性蛋白质包括牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)等。或者，可以使用合成聚(氨基酸)。
免疫原性载体也可包括聚氨基多糖，其是通过单糖的重复缩合而产生的高分子量聚合物。多糖的实例是淀粉、糖原、纤维素、碳水化合物胶(carbohydrate gum)如阿拉伯树胶、琼脂等。这些多糖还含有聚氨基酸残基和/或脂质残基。
免疫原性载体也可以是单独的或与上述聚(氨基酸)或多糖之一缀合的聚(核酸)。
免疫原性载体也可以包括固体颗粒。颗粒的直径通常为至少约0.02微米(μm)且不超过约100μm，并且通常为约0.05μm至10μm。颗粒可以是有机的或无机的，可膨胀的或不可膨胀的，多孔的或非多孔的，最佳地密度接近于水，通常为约0.7-1.5g/mL，并且由透明、部分透明或不透明的材料构成。颗粒可以是生物材料，如细胞和微生物，包括非限制性实例如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤、链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(E.coli)以及病毒。颗粒也可以由有机和无机聚合物、脂质体、胶乳、磷脂囊泡(phospholipid vesicle)或脂蛋白构成。
“聚(氨基酸)”或“多肽”是由氨基酸形成的聚酰胺。聚(氨基酸)的分子量通常为约2,000道尔顿，无分子量上限，通常小于10,000,000道尔顿且通常不超过约600,000道尔顿。通常存在不同的范围，这取决于是否包括免疫原性载体或酶。
“肽”是是两个或更多个氨基酸通过酰胺(肽)键连接而形成的任意化合物，通常是α-氨基酸的聚合物，其中每个氨基酸残基的α-羧基与直链中下一个残基的α-氨基连接。术语肽、多肽和聚(氨基酸)在本文中以相同的涵义使用，指这类化合物而无大小限制。这类中最大的成员被称为蛋白质。
“标记”、“检测分子(detector molecule)”或“示踪剂”是产生或可被诱导而产生可检测信号的任意分子。标记可与分析物、免疫原、抗体缀合，或与诸如受体的另一分子或可与诸如配体特别是半抗原的受体结合的分子缀合。标记的非限制性实例包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂、发光剂或致敏剂(sensitizer)；非磁性或磁性颗粒、固体支持体、脂质体、配体或受体。
术语“抗体”指抗原的特异性蛋白结合配偶体，并且是排除其他物质而对抗原具有特异性结合亲和性的任意一种或一组物质。上位术语抗体包括多克隆抗体、克隆抗体和抗体片段。
术语“衍生物”指由母体化合物通过一个或多个化学反应而产生的化合物或分子。
术语“载体”指固体颗粒和/或诸如上文所提到的那些免疫原性聚合物的聚合的聚合物(polymeric polymer)。如果载体是固体颗粒，则固体颗粒可以与聚合材料结合、用聚合材料包覆或与聚合材料连接，所述聚合材料优选是提供一个或多个用于与式III的化合物中末端官能团X结合的反应性位点的多胺聚合物。
术语“试剂盒”或“检测试剂盒”指用于进行测定的物质的集合。可以将试剂以包装组合的方式提供于同一个或不同的容器中(取决于它们的交叉反应性和稳定性)，并且可以是液体或冻干形式。可以选择提供于试剂盒中的试剂的量和比例，以便为具体应用提供最佳结果。体现本发明特征的试剂盒包含对式I和式II的化合物具有特异性的抗体。试剂盒还可包含分析物的配体和校正与对照物质。试剂可保持液体形式或可被冻干。
术语“校正与对照物质”指含有已知量的待测量药物的任意标准或参照物质。通过将获得的未知样品的结果与获得的标准品的结果进行比较来计算药物的浓度。这通常通过构建标准曲线而进行。
术语“生物样品”包括但不限于来自存活物或以前是存活物的任意量的物质。这样的存活物包括但不限于人、小鼠、猴子、大鼠、兔、马以及其他动物。此类物质包括但不限于血液、血清、血浆、尿液、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑液组织、软骨细胞、滑液巨噬细胞、内皮细胞以及皮肤。
试剂和免疫原
在建立免疫测定法时，将式IV化合物的缀合物构建为与样品中式I或式II的化合物竞争抗体上的结合位点。在本发明的免疫测定法中，试剂是载体与式IV的化合物的缀合物。在式IV的化合物中，连接间隔子(linkerspacer)构成该分子的“-B-(Y)p-X'-”部分。连接子X'和间隔子“-B-(Y)p-”在制备缀合物和免疫原中是常见的。用于制备用于免疫测定法的缀合物和免疫原的任何常规间隔-连接基均可用于式IV的化合物中。此类常规连接子和间隔子公开于美国专利5,501,987和美国专利5,101,015中。
优选的间隔基团包括上文所提到的间隔基团。特别优选的间隔基团是诸如以下的基团：含有1-10个碳原子的亚烷基、
Figure BDA00002128053800111
其中m和o是0-6的整数，并且n是1-6的整数。亚烷基是特别优选的间隔基团。在这些式中，m为0，n优选是1-6的整数，最优选1或2，并且o优选是0或1。
在式IV的化合物中，X'是-CH2-或将间隔子与载体优选与聚合载体上的氨基连接的官能团。基团X'是式III化合物中末端官能团X的结果，其能够与载体结合，优选与存在于载体中的或用作免疫原的多胺聚合物中的氨基结合。能够与载体结合优选能够与胺反应的任意末端官能团可用作式III化合物中的官能团X。优选地，包括在X内的这些末端官能团是：
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。自由基-N＝C＝R4可以是异氰酸酯或异硫氰酸酯。由OR3所形成的活性酯包括亚氨酸酯，如N-羟基琥珀酰胺、1-羟基苯并三唑和对硝基苯基酯。然而可使用能够与氨基反应的任意活性酯。
通过常规方式，将羧基和活性酯与载体或免疫原性聚合物偶联。诸如蛋白质的多胺聚合物上的氨基产生将间隔子与本发明的聚合物、免疫原或载体和/或缀合物连接的酰胺基。另一方面，载体可包覆有多胺聚合物，以提供用于与配体部分连接的氨基。
在本发明的免疫原和缀合物中，可利用本领域技术人员已知的多种方法产生作为半抗原的含有羧基的式III化合物与载体或免疫原上的多胺聚合物上的氨基之间的化学键。经常优选形成酰胺键。通过使羧基与离去基团试剂(如N-羟基琥珀酰亚胺、1-羟基苯并三唑、邻或对硝基酚、或邻或对硝基苯基氯甲酸酯)反应，首先活化式III化合物中的半抗原的羧酸基团，形成酰胺键。可以使用诸如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等的活化试剂。接着使式III的半抗原中的活化形式的羧基与含有蛋白质载体的缓冲溶液反应。缀合半抗原和载体的各种方法还公开于美国专利3,996,344和美国专利4,016,146中，其援引加入本文。
如果X是式III化合物中的末端异氰酸或异硫氰酸自由基，则当与多胺聚合物的游离胺反应时，这些自由基产生式IV的半抗原的缀合物或免疫原，其中X’是
Figure BDA00002128053800121
在式IV的配体中，X’将半抗原与含有多胺的载体或免疫原性多肽上的氨基在功能上连接。
如果式III化合物中的X是醛基，则可以通过利用还原性氨化的胺键将这些化合物与多胺多肽或载体的氨基连接。将醛与胺缩合的任意常规方法(如通过还原性胺化)均可用于形成这种键。在这种情况下，式IV的配体部分中的X'是-CH2-。可以使用将反应性羧基与氨基缩合的任意常规方法来进行该缩合反应。
当B是式
Figure BDA00002128053800122
的亚甲基羰基时，通过将式II化合物中的氨基与下式的酰氯缩合而产生式III化合物：
Cl-C(=O)-CH2-(Y)p-X  V
使伯胺与酰氯反应的任意常规方法均可用于该缩合步骤中。如果Y是低级亚烷基且B是式III化合物中的上述亚甲基羰基，则通过用诸如戊二酸酐的二羧酸的酸酐处理式II化合物而产生该化合物。使酸酐与伯氨基缩合的任意常规方法均可用于进行该缩合反应。
当B是-CH2-时，可通过使式I化合物与下式的卤代烷反应而产生式III化合物：
卤代CH2-(Y)p-X    VII
其中Y、p以及X如上文所述。
使卤代烷与伯氨基缩合的任意常规方法均可用于进行该缩合反应。
如果B是-C(=O)-NH-CH2，则可通过利用常规方法使式II化合物与下式的卤化物缩合而产生式III化合物：
Figure BDA00002128053800131
其中Y、p以及X如上文所述。
如果B是-C(=O)-O-CH2-，则可通过利用常规方法使式II化合物与下式的化合物缩合而产生式III化合物：
Figure BDA00002128053800132
其中Y、p以及X如上文所述。
在式V、VII、VIII和IX的化合物含有反应性氨基以及反应性羧基的情况下，在形成式III化合物的反应中必须使用胺或酯保护基。通常，通过形成相应的N-三氟乙酰胺、N-叔丁氧羰基氨基甲酸酯(N-t-BOC氨基甲酸酯)、N-苄氧羰基氨基甲酸乙酯或相似的结构来保护胺。如上文所述，一旦完成与式I的结构的缩合反应，则可以利用不改变缀合物的结构的试剂除去胺或酯保护基。此类试剂和方法对本领域技术人员而言是已知的，并且包括弱或强含水或不含水酸、弱或强含水或不含水碱、含氢化物的试剂如硼氢化钠或氰基硼氢化钠和催化氢化。
通过使式III化合物与上文所述载体(优选多胺多肽或包覆有多胺多肽的载体)反应，可以将该化合物转变成本发明的免疫原和/或缀合物试剂。同一种多肽可用作载体并用作本发明的免疫原中的免疫原性聚合物，只要多胺或多肽是免疫活性的。然而，为了形成在免疫测定法中用做试剂的缀合物，这些聚合物不必产生免疫原所需的免疫应答。根据本发明，式III化合物中的X所代表的各种官能团可通过将官能团与载体连接的常规方法而与所述载体缀合。根据一优选实施方案，在式III的化合物中，X是羧酸基团或活化的羧基。
抗体
本发明还涉及式I和式II的化合物及其混合物的新抗体，特别是单克隆抗体，其可以利用上文所述免疫原产生。已经发现，根据本发明所产生的这些抗体与式I化合物和式II化合物及其混合物选择性反应。这些抗体不与式I化合物和式II化合物的非药学上的无活性代谢物反应，所述代谢物会干扰式I化合物和式II化合物中任一个的免疫测定。本发明的抗体不与这些无活性代谢物反应的能力使得这些抗体在提供用于式I化合物或式II化合物的免疫测定法中特别有价值。
本发明涉及这些式I和式II的化合物及其混合物的选择性反应性新抗体。可通过用本发明的免疫原免疫宿主动物来方便地产生本发明的抗血清。合适的宿主动物包括啮齿动物如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，或高等哺乳动物如山羊、绵羊、马等。可以根据用于在动物中引发免疫应答的可接受方案给予初始剂量、取血(bleeding)以及加强注射(booster shot)。通过定期取血，利用常规免疫测定法观察到免疫小鼠的血液样品产生抗式I和II的化合物的免疫应答。这些方法提供了方便的筛选产生具有期望活性的抗血清的宿主和抗体的方式。
利用式III的免疫原并通过下文所公开的筛选方法，可产生具有基本上100%的与来那度胺的选择性反应性且基本上不具有与沙利度胺的选择性反应性或具有基本上与沙利度胺和来那度胺两者的选择性反应性的抗体。该筛选方法可以用来获得与来那度胺和沙利度胺化疗剂两者都反应的抗体、对来那度胺具有特异性和选择性的抗体以及对这些化疗剂具有任意期望的相对反应性的抗体。
在制备这些抗体时，免疫原性载体可与式III的免疫原缀合，并用于免疫宿主动物如小鼠、兔、绵羊或大鼠。可利用包覆有BSA与式III化合物的缀合物的微量滴定板，通过ELISA监测针对式III化合物的免疫应答的产生。一旦产生了足够的免疫应答，则可以分离宿主动物的脾细胞，并使之与无限增殖细胞系融合。对于产生单克隆抗体而言，可以将融合的细胞接种于96孔板中，并使之在存在选择性培养基的情况下生长来选择杂交瘤细胞。可通过ELISA检测杂交瘤上清液和抗血清的抗来那度胺抗体的存在。可通过间接竞争性微量滴定板测定来检测孔中产生阳性ELISA结果的抗体的来那度胺和沙利度胺结合。可根据该测定法计算诸如来那度胺和沙利度胺及其代谢物等分析物的IC50值。测定中分析物的IC50(50%抑制浓度)是样品中分析物的浓度，在该浓度下，测定中的信号是在抑制测定中不存在分析物时测定总信号的50%。根据IC50的比值计算分析物的选择性反应性，其表示为：100%-[IC50-分析物/(ICl 50-来那度胺+ICl 50-沙利度胺)]x 100。对于具有基本上100%的与来那度胺的选择性反应性且基本上不具有与沙利度胺的选择性反应性的抗体，该值会接近100%。根据下述文献中的操作计算IC50：The Immunoassay Handbook,第108-110页，第三版，D.Wild编辑，Elsevier出版，阿姆斯特丹，2005。由上式可以看出。分析物的IC50与分析物的反应性成反比。可以通过以下方法获得与来那度胺和沙利度胺两者均具有期望的相对反应性的孔中的细胞：通过有限稀释法进行筛选和亚克隆来分离产生与沙利度胺和来那度胺具有期望的反应性的单克隆抗体的单个克隆细胞。
通过以下方式方便地产生单克隆抗体：根据方案免疫Balb/c小鼠，随后在细胞融合前三天开始连续三天用其他免疫原腹膜内或静脉内注射小鼠。当然也可以使用抗体领域熟知的其他方案。本文详述的完整免疫方案为式I和II的化合物的抗体的血清抗体应答提供了最佳方案。
从宿主的脾、外周血、淋巴结或其他组织获得的B淋巴细胞可用作产生单克隆抗体的细胞。最优选从脾获得的B淋巴细胞。通过将此类B淋巴细胞与无限增殖细胞系融合来获得能够产生本发明期望的单克隆抗体的杂交瘤，无限增殖细胞系是赋予杂交细胞长期组织培养稳定性的细胞系。在本发明的一优选实施方案中，无限增殖细胞可以是淋巴母细胞或浆细胞瘤细胞如骨髓瘤细胞。通过小鼠骨髓瘤细胞与来自用上述免疫原性缀合物免疫的小鼠的脾细胞融合来形成产生来那度胺和沙利度胺单克隆抗体的鼠杂交瘤。可通过以下方式产生嵌合和人源化单克隆抗体：从杂交瘤细胞克隆表达抗体的基因，并利用本领域现熟知的重组DAN方法将小鼠可变区的亚序列与人恒定区连接或将人框架区与供体小鼠或大鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR’s)结合。实施鼠单克隆抗体人源化的改良方法提供了亲和性增强的抗体，其在国际专利申请内第WO 92/11018号中有述。
可产生仅包含一部分一级抗体结构的多肽片段，该片段具有一种或多种免疫球蛋白活性。可通过以下方式产生这些多肽片段：通过本领域熟知的方法蛋白酶剪切完整抗体，或利用定点诱变将终止密码子插入含有抗体基因的表达载体中的期望位置，以产生Fab片段或(Fab’)2片段。通过将VL和VH区与DNA连接子连接，可以产生单链抗体(参见Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:5879-5883(1988)and Bird等人,Science,242:423-426(1988))。
根据本发明所产生的抗体能够与式II化合物或式I化合物和式II化合物两者选择性反应，而基本上不具有任何与式I化合物和式II化合物的药理学上、治疗上非活性代谢物的交叉反应性。基本上不具有交叉反应性表示相对于其与式I化合物和式II化合物两者的反应性，本发明的抗体具有小于10%优选小于5%的交叉反应性。
根据本发明，可以产生与来那度胺选择性反应且不具有与沙利度胺的选择性反应性的抗体。对来那度胺具有选择性反应性而不具有与沙利度胺的选择性反应性的抗体表示基于其与沙利度胺和来那度胺两者的反应性或结合，所述抗体对来那度胺具有至少95%的活性。为了用于沙利度胺免疫测定法中，所述抗体应当与来那度胺和沙利度胺两者选择性反应，且基于其与式I化合物和式II化合物两者的反应性，所述抗体具有小于10%的与式I化合物和式II化合物的上述药理上、治疗上非活性代谢物的交叉反应性，且基于其与沙利度胺和来那度胺两者的反应性，所述抗体具有至少10%的与沙利度胺的反应性。为了用于来那度胺免疫测定法中，可以使用任意本发明的抗体，所述抗体与来那度胺选择性反应或与来那度胺和沙利度胺两者选择性反应，且基于其与式I和式II的化合物两者的反应性，所述抗体具有小于10%的与式I化合物和式II化合物的上述药理上、治疗上非活性代谢物的交叉反应性。
免疫测定法
根据本发明，由式III化合物的免疫原产生的缀合物和抗体可用作测定患者样品中式I和式II化合物的试剂。该测定通过免疫测定的方式进行。由式III化合物所形成的试剂缀合物与样品中式I或式II的化合物竞争根据本发明所产生的抗体上的结合位点的任意免疫测定法均可用于测定患者样品中式I或式II化合物的存在。在疑似含有来那度胺或沙利度胺的样品中进行此类式I和式II化合物的测定的方式包括将(a)含水培养基样品、(b)根据本发明所产生的式I和式II的化合物的抗体以及(c)由式III化合物所形成的缀合物组合。可通过测量与已知量的添加到样品与抗体的混合物中的缀合物的特异性抗体结合的抑制来测定样品中的式I或式II化合物。将未知样品抑制已知量的缀合物的此类结合的结果与相同测定中利用式I或式II化合物的已知标准溶液获得的结果进行比较。在测定未知样品中式I或式II的化合物的量时，可以任意顺序添加样品、由式III化合物所形成的缀合物以及抗体。
多种方式可用于测量由与抗体结合的式III化合物所形成的缀合物的量。一种方法是缀合物与抗体的结合使荧光团缀合物的旋转速率降低。可以通过美国专利4,269,511和美国专利4,420,568所公开的荧光极化技术检测液体混合物中的荧光团缀合物旋转速率的降低量。
另一方面，所述抗体可被包覆或吸收于纳米颗粒上，使得当这些颗粒与式I或式II的化合物和由式III的化合物所形成的缀合物反应时，这些纳米颗粒形成聚集体。然而，当包覆或吸收于纳米颗粒上的抗体与样品中的沙利度胺或来那度胺反应时，来自样品中的与这些纳米颗粒结合的沙利度胺或来那度胺不引起抗体纳米颗粒的聚集。可通过吸光度在测定混合物中测量聚集或凝集的量。
另一方面，可通过将抗体或式III化合物与诸如微量滴定板的固体支持体或任意其他常规固体支持体包括固体颗粒连接来进行这些测定。将抗体和蛋白质与此类固体颗粒连接是本领域熟知的。任意常规方法均可用于进行此类连接。在许多情况下，为了有助于测量，可以将标记(如放射性标记或酶标记)置于抗体、缀合物或固体颗粒上，作为检测由与抗体结合或未结合的式III化合物所形成的缀合物的量的辅助手段。其他合适的标记包括生色团、荧光团等。
为了方便，可以将本发明的测定组分提供于试剂盒中，所述试剂盒为含有预定量的用于测定式I或式II化合物的新试剂的包装组合。这些试剂包括本发明的抗体以及由式III化合物所形成的缀合物。在进行本发明的免疫测定法时，试剂和形成给定免疫测定法所用的抗体的免疫原中的基团p、X、Y以及B可以是对这些基团中的每个所定义的组内的相同或不同取代基。因此，尽管基团p、X、Y以及B的定义对于缀合物试剂和免疫原而言是相同的，但是这些基团所代表的免疫原和缀合物试剂的具体取代基在给定测定中可以不同。
除了这些必需的试剂以外，可以包括诸如辅助试剂的添加剂，如稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以变动很大，以提供基本优化测定灵敏度的溶液中的试剂浓度。可以将试剂提供于溶液中或作为干粉(通常冻干)提供，包括在溶解后会提供用于进行测定的具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
实施例
在实施例中，用下述缩写表示下述内容：
HATU     O-(7-氮杂苯并三氮唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷
         酸盐
DIPEA    N,N’-二异丙基乙胺
DMF      二甲基甲酰胺
TFA      三氟乙酸
CH2Cl2   二氯甲烷
DMSO     二甲亚砜
NHS      N-羟基琥珀酰亚胺
s-NHS    磺基-N-羟基琥珀酰亚胺
EDC      1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
KLH      钥孔血蓝蛋白
BSA      牛血清白蛋白
PBS      磷酸盐缓冲盐水
NaCl     氯化钠
HRP      辣根过氧化物酶
ANS      8-苯胺基-1-萘磺酸
TMB      3,3′,5,5′-四甲基联苯胺
TRIS     三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐
di H2O    去离子水
磷酸盐缓冲液组合物含有水溶液，其含有：
15.4mM磷酸氢二钠(Na2HPO4)
4.6mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)
pH=7.2±0.10。
在实施例中，下文的路线1-2列出了在实施例中制备并以数字表示的具体化合物。所述路线如下：
路线1
Figure BDA00002128053800191
路线2
Figure BDA00002128053800201
实施例1
制备来那度胺衍生物的氨基甲酰基戊酸衍生物[3](路线1)
将来那度胺[1](1.0g,3.86mmol)与戊二酸酐[2](0.48g,4.25mmol)在无水甲苯中的混合物加热并在氮气下回流3.5小时。添加另一部分戊二酸酐[2](0.18g,1.53mmol)，并将混合物再加热2小时，以产生[3]。将混合物冷却至0°C，以沉淀[3]。过滤沉淀的固体，并用CH2Cl2洗涤，从而获得1.55g粗品化合物[3]。用乙醇(20mL)/H2O(1mL)使该粗品化合物重结晶，从而获得白色固体形式的纯[3](1.30g,90%)。
实施例2
制备来那度胺衍生物的氨基甲酰基-丁酰基氨基-甲基苯甲酸衍生物[7](路线2)
将实施例1中产生的化合物[3](800mg,2.14mmol)在氮气下溶解于无水DMF(20mL)中，向其中加入二异丙基乙胺(DIPEA)(1.27mL,7.27mmol)和胺[10](700mg,2.35mmol)随后添加HATU(1.88g,4.93mmol)。将该反应混合物在25°C下搅拌24小时以产生[6]。用乙酸乙酯稀释烧瓶中的内容物。用1M盐酸、饱和碳酸氢钠以及水洗涤有机相(乙酸乙酯)。然后用硫酸钠干燥乙酸乙酯层，并将其滤除。除去乙酸乙酯溶剂，产生粗产物[6]，将其用100%EtOAc和1-2%MeOH/EtOAc通过快速层析进行纯化，从而获得作为白色固体的纯产物[6](680mg,57%)。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ11.03(s,1H),9.82(s,1H),8.46(t,J=6.0Hz,1H),7.82-7.86(m,3H),7.46-7.52(m,2H),7.35(d,J=8.3Hz,2H),5.14(dd,J=5.0,13.5Hz,1H),4.32-4.38(m,4H),2.86-2.96(m,1H),2.56-2.64(m,2H),2.39(t,J=7.5Hz,2H),2.25(t,J=7.5Hz,2H),1.97-2.05(m,1H),1.82-1.92(m,2H),1.53(s,9H).APCI]-=561。
将该白色固体[6](676mg,1.20mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)中。于0°C及氮气下向该化合物[6]的溶液中加入TFA(3mL)，从而产生[7]。在减压条件下除去二氯甲烷，并用乙醚研磨所得残留物[7]，以分离粗品酸。用含水EtOH使该物质重结晶，从而获得纯品[7](507mg,83%)。
实施例3
由相应酸[3]和[7]制备NHS/s-NHS活化的药物衍生物的一般方法
用EDC和NHS活化来那度胺酸衍生物[3]，从而产生来那度胺的NHS活化的酯[4]，用于最终与蛋白质缀合(实施例4和5a)。用EDC和s-NHS活化来那度胺酸衍生物[7]，从而产生来那度胺的s-NHS活化的酯[8]，用于最终与蛋白质缀合(实施例5b)。
实施例3a
制备NHS活化的酯来那度胺氨基甲酰基戊酸衍生物[4]
将路线1的实施例1中的来那度胺衍生物[3](67.62mg)溶解于7mL添加有NHS(59.60mg)和EDC(93.00mg)的DMSO中。在环境温度及氮气下，将反应混合物搅拌20小时，从而产生来那度胺衍生物的NHS活化的酯[4]。将反应混合物直接用于实施例4和5a中。
实施例3b
制备s-NHS活化的酯来那度胺氨基甲酰基-丁酰基氨基-甲基苯甲酸衍生物[8]
将路线2的实施例2中的来那度胺衍生物[7](16.3mg)溶解于1.6mL添加有s-NHS(25.3mg)和EDC(18.1mg)的DMSO中。在环境温度及氮气下，将反应混合物搅拌20小时，从而产生来那度胺衍生物的s-NHS活化的酯[8]。将反应混合物直接用于实施例5b中。
实施例4
用活化的半抗原[4]制备KLH免疫原
通过将300mg KLH溶解于15mL磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中，随后加入1.5mL DMSO和3.50mL实施例3a中制备的NHS活化的来那度胺衍生物[4]来制备KLH的蛋白质溶液。在室温下将KLH与活化的来那度胺衍生物[4]的反应混合物搅拌20小时，从而产生那度胺-KLH缀合物[5]。接着通过在室温下用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中的10%DMSO透析来纯化来那度胺-KLH缀合物[5]。此后，在室温下，用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)透析来那度胺-KLH缀合物[5]。于4°C用磷酸盐缓冲液进行最后透析。利用紫外-可见光谱法(UV/VIS)表征来那度胺-KLH缀合物[5]。在磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中，将缀合物稀释成2mg/mL的终浓度。
实施例5a
用活化的半抗原[4]制备BSA缀合物
通过将1g BSA溶解于磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中，制备BSA的蛋白质溶液，终浓度为50mg/mL。将DMSO(3.3mL)缓慢加入到BSA的蛋白质溶液中，同时在冰上搅拌，随后加入0.60mL实施例3a中制备的NHS活化的来那度胺衍生物[4]。加入到BSA蛋白质溶液中的NHS活化的来那度胺衍生物[4]的量计算为来那度胺衍生物[4]和BSA的摩尔比为1:1。在室温下，将BSA与活化的来那度胺衍生物[4]的混合物搅拌18小时，从而产生活化的来那度胺酯[4]与BSA的缀合物。然后通过用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中的10%DMSO于室温下透析来纯化该缀合物。之后，在室温下，用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)透析来那度胺-BSA缀合物[5]。于4°C用磷酸盐缓冲液进行最后透析。通过UV/VIS光谱法表征纯化的来那度胺-BSA缀合物[5]。
实施例5b
用活化的半抗原[8]制备BSA缀合物
通过将0.5g BSA溶解于磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中来制备BSA的蛋白质溶液，终浓度为50mg/mL。将实施例3b中制备的s-NHS活化的来那度胺衍生物[8]缓慢加入到BSA的蛋白质溶液中，同时在冰上搅拌。加入到BSA蛋白质溶液的s-NHS活化的来那度胺衍生物[8]的量计算为来那度胺衍生物[8]和BSA的摩尔比为1:1。将BSA与活化的来那度胺衍生物[8]的混合物在室温下搅拌18小时，从而产生活化的来那度胺酯[8]与BSA的缀合物。接着通过用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)中的10%DMSO于室温下透析来纯化该缀合物。之后，在室温下，用磷酸盐缓冲液(50mM,pH 7.5)透析来那度胺-BSA缀合物[9]。于4°C下，用磷酸盐缓冲液进行最后透析。利用UV/VIS光谱法表征纯化的来那度胺-BSA缀合物[9]。
实施例6a
制备来那度胺的多克隆抗体[3]
用100μg/小鼠实施例4中制备的来那度胺-KLH免疫原[5]腹膜内免疫雌性BALB/c小鼠，并在弗氏完全佐剂中乳化。在初次注射100μg/小鼠在弗氏不完全佐剂中乳化的相同免疫原后4周，将小鼠加强一次。加强后20天，通过眼采血，由每个小鼠获得含有多克隆抗体的测试血液(test bleed)。在实施例8和9中，对来自这些含有来那度胺抗体的测试血液的抗血清进行评价。
实施例6b
制备来那度胺的单克隆抗体[3]
将用实施例4中制备的来那度胺-KLH缀合物[5]免疫的实施例6a的小鼠用于产生单克隆抗体。对于单克隆抗抗体，从融合前3天开始，用400μg(融合前3天)、200μg(融合前2天)以及200μg(融合前1天)实施例4中制备的PBS中的来那度胺-KLH缀合物[5]腹膜内注射小鼠。从所选的小鼠中分离脾细胞，并根据Coligan,J.E.等人编辑,Current Protocols in Immunology,2.5.1-2.5.8,(1992),Wiley&Sons,NY的方法，用50%聚乙二醇1500将其与2x 107个SP2/0细胞融合。将融合的细胞接种于十个96孔板中的DMEM/F12(补充有20%FetalClone I、2%L-谷氨酰胺(100mM)以及2%50XHAT)中。2-3周后，通过ELISA(与实施例8b中一样)分析杂交瘤上清液中抗-来那度胺抗体的存在。将产生阳性ELISA结果的孔中的细胞扩展到24孔板中。通过实施例9中所述的间接竞争性微量滴定板测定来检测这些单克隆抗体的来那度胺和沙利度胺结合。根据Coligan,J.E.等人编辑,CurrentProtocols in Immunology,2.5.8-2.5.17,(1992),Wiley&Sons,NY.中所述方法，通过有限稀释法，将ELISA阳性的克隆细胞亚克隆至少一次。
实施例7a
利用来那度胺-BSA缀合物[5]的微量滴定板敏化操作
在聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)中进行测量来那度胺浓度的ELISA方法，对所述板进行了优化用于蛋白质结合，并且每板含有96个孔。通过以下方式用(实施例5a中制备的)来那度胺-BSA缀合物[5]包覆每个孔：将300μL 10μg/mL来那度胺-BSA缀合物[5]加入到0.05M pH 9.6的碳酸钠中，并在室温下孵育3小时。用pH 9.6的0.05M碳酸钠洗涤孔，接着用375μL5%蔗糖、0.2%酪蛋白酸钠溶液在室温下封闭30分钟。除去包覆后溶液，然后在37°C下将平板干燥过夜。
实施例7b
利用来那度胺-BSA缀合物[9]的微量滴定板敏化操作
在聚苯乙烯微量滴定板(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)中进行测量来那度胺浓度的ELISA方法，对所述板进行了优化用于蛋白质结合，并且每板含有96个孔。通过以下方式用(实施例5b中制备的)来那度胺-BSA缀合物[9]包覆每个孔：将300μL10μg/mL来那度胺-BSA缀合物[9]加入到0.05M pH 9.6的碳酸钠中，并在室温下孵育3小时。用pH 9.6的0.05M碳酸钠洗涤孔，接着用375μL5%蔗糖、0.2%酪蛋白酸钠溶液在室温下封闭30分钟。除去包覆后溶液，然后在37°C下将平板干燥过夜。
实施例8a
抗体筛选操作-滴度
该操作用于发现如实施例9中置换的待检测抗体的稀释度。用微量滴定板进行筛选(实施例6所产生的)来那度胺抗体的ELISA方法，所述微量滴定板用实施例7a和7b中制备的来那度胺-BSA缀合物进行了敏化。通过将来自含有多克隆来那度胺抗体的测试血液(与实施例6a中的一样)的鼠血清在含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸缓冲盐水中稀释成1:2,000、1:6,000、1:18,000以及1:54,000(体积/体积)进行抗体筛选测定。向(实施例7a和7b中制备的)来那度胺-BSA敏化孔中的每个孔中加入50μL含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸缓冲盐水和50μL稀释的抗体，并在室温下孵育10分钟，同时振荡。在该孵育过程中，抗体与被动吸收于孔中的来那度胺-BSA缀合物(实施例7a和7b)结合。用0.02M TRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween-80以及0.001%硫柳汞(pH 7.8)将平板的孔洗涤三次，以除去任何未结合的抗体。为了检测与孔中的来那度胺-BSA缀合物结合的来那度胺抗体的量，将100μL山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)加入到每个孔中，所述抗体在含有0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞的PBS中被稀释至特定活性(约1/3000)，能够与鼠免疫球蛋白特异性结合，并且当与底物(在本实施例中为TMB)一起孵育时产生有色产物。在室温下振荡孵育10分钟(在该过程中山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物与孔中的来那度胺抗体结合)后，将平板再次洗涤3次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物。为了使孔中可测量的颜色显色，洗涤后加入100μL TMB(TMB Substrate,BioFx)即HRP的底物，以在室温下振荡孵育10分钟的过程中显色。在显色孵育后，将50μL终止溶液(di H2O中的1.5%氟化钠)加入到每个孔中来终止显色，并且在振荡20秒后测定650nm下的吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中抗体的量与测量的吸光度成比例，并且表示为导致1.5的吸光度的稀释度(滴度)。通过以下方式测定滴度：对测量的抗体的抗体稀释度(x轴)与650nm吸光度(y轴)作图，并插入吸光度为1.5时的滴度。产生1.5吸光度的滴度决定实施例9中所述的间接竞争性微量滴定板测定所用的抗体浓度(稀释度)。
实施例8b
抗体筛选操作–单克隆筛选
用微量滴定板进行筛选(实施例8中产生的)来那度胺抗体的ELISA方法，该微量滴定板用实施例7b中所述的来那度胺-BSA缀合物[9]进行了敏化。向(实施例7b中制备的)来那度胺-BSA敏化的孔中的每个孔中加入50μL含有0.1%BSA和0.01%硫柳汞的磷酸缓冲盐水，接着加入50μL单克隆培养物上清液，并在室温下振荡孵育10分钟。在该孵育过程中，抗体与孔中的来那度胺-BSA缀合物结合。用0.02M TRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween-80以及0.001%硫柳汞(pH 7.8)将平板的孔洗涤3次以除去任何未结合的抗体。为了检测孔中与来那度胺-BSA缀合物结合的来那度胺抗体的量，向每个孔中加入100μL山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(JacksonImmunoresearch)，所述缀合物在含有0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞的PBS中以1/3000进行了稀释，其能够与鼠免疫球蛋白特异性结合，并且当与底物(在本实施例中为TMB)一起孵育时产生有色产物。在室温下振荡孵育10分钟(在该孵育过程中山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物与孔中的来那度胺抗体结合)后，将平板再次洗涤3次以除去未结合的山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物。为了使孔中可测量的颜色显影，洗涤后加入100μL TMB(TMB Substrate,BioFx)即HRP的底物，以在室温下振荡孵育10分钟的过程中显色。显色孵育后，向每个孔中加入50μL终止溶液(diH2O中的1.5%氟化钠)来终止显色，并且在振荡10秒后测定650nm下的吸光度(MolecularDevices Plate Reader)。孔中抗体的量与所测量的吸光度成比例。吸光度比背景大3倍或更多倍的样品被指定为阳性。如实施例8b所述，将吸光度大于0.4的样品或吸光度最高的50个样品扩展到24孔板中。
实施例9
间接竞争性微量滴定板免疫测定法操作
测定来那度胺的抗体的IC50
用微量滴定板进行测定IC50值的ELISA方法，所述微量滴定板如实施例7b中所述用来那度胺-BSA缀合物[9]进行了敏化。将分析物-来那度胺和沙利度胺溶解于DMSO中，并在1-100,000ng/mL浓度范围内稀释于diH2O中。通过用50μL选自用实施例4的免疫原(来那度胺)在实施例6a中产生的多克隆抗体和在实施例8b(来那度胺和沙利度胺)中产生的单克隆抗体之一孵育50μL分析物溶液来进行每一测定。通过将每一孔中抗体的浓度稀释至实施例8a中测定的滴度来进行所有测定。在10分钟的孵育过程(室温下，同时振荡)中，对于孔中的(实施例7b中产生的)来那度胺-BSA缀合物和溶液中的分析物存在抗体结合竞争。在本次孵育后，用0.02M TRIS、0.9%NaCl、0.5%Tween-80以及0.001%硫柳汞(pH 7.8)将平板的孔洗涤3次以除去任何未结合的物质。为了检测与孔中的(实施例7b中产生的)来那度胺-BSA缀合物结合的来那度胺抗体的量，向每个孔中加入100μL山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物(Jackson Immunoresearch)，所述缀合物在含有0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%硫柳汞的PBS中被稀释至预定的特定活性(约1/3000)，其能够与鼠免疫球蛋白特异性结合，并且当与底物(在本实施例中为TMB)一起孵育时产生有色产物。在室温下振荡孵育10分钟(在该孵育过程中山羊抗小鼠抗体-HRP酶缀合物与孔中的来那度胺抗体结合)后，将平板再次洗涤3次以除去未结合的第二缀合物。为了使孔中可测量的颜色显色，洗涤后加入100μL TMB(TMB Substrate,BioFx)即HRP的底物，以在室温下振荡孵育10分钟的过程中显色。在显色孵育后，向每个孔中加入50μL终止溶液(di H2O中的1.5%氟化钠)来终止显色，并且在振荡20秒后测定650nm下的吸光度(Molecular Devices Plate Reader)。孔中抗体的量与所测量的吸光度成比例，并且与样品中来那度胺或沙利度胺的量成反比。通过用孔中的吸光度比孔中的分析物浓度作图来构建剂量-应答曲线，从而测定来那度胺和沙利度胺的IC50值。将含有分析物的孔中的颜色吸光度与没有分析物的孔中的颜色吸光度进行比较，并生成标准曲线。给定分析物的IC50值被定义为具有50%的不含分析物的孔的吸光度所需的分析物的浓度。来那度胺的多克隆抗体的结果列于下表I中。来那度胺的单克隆抗体的结果列于下表II中。
表I
使用包覆有来那度胺-BSA缀合物[9](实施例7b)的平板测定的来那度胺的IC50值和来那度胺的多克隆抗体(实施例6a)的滴度
 血样#   滴度   IC50,ng/mL
 1   51,000   84
 2   66,000   59
 3   28,000   3,400
 4   15,000   2,200
 5   111,000   510
 6   5,200   810
 7   9,300   80
 8   9,400   870
 9   58,000   570
 10   18,000   9
表II
使用包覆有来那度胺-BSA缀合物[9](实施例7b)的平板，利用来那度胺(实施例6b)的单克隆抗体测定的来那度胺和沙利度胺的IC50值
Figure BDA00002128053800281
从这些表中可以看出，本发明的抗体基本上与来那度胺和沙利度胺反应。

Claims (80)

1.用于检测样品中的沙利度胺的免疫测定法，其包括提供含有所述样品、抗体以及载体与具有下式的配体的缀合物的混合物，所述抗体与药学活性化疗药物来那度胺与沙利度胺的混合物选择性反应，并且基于其与所述药学活性化疗药物的混合物的反应性，所述抗体具有至少10%的与沙利度胺的反应性：
Figure FDA00002128053700011
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；并且
X是能够与载体结合的末端官能团；
使所述样品中的沙利度胺和所述缀合物与所述抗体结合，之后测量所述混合物中与所述抗体结合或未结合的所述缀合物，由此可检测所述样品中沙利度胺的存在。
2.如权利要求1所述的免疫测定法，其中所述样品是人类样品。
3.如权利要求2所述的免疫测定法，其中所述人类样品是采自用沙利度胺治疗的患者的样品，并且所述免疫测定法通过测量与所述抗体结合或未结合的缀合物的量来测量所述样品中沙利度胺的量。
4.如权利要求3所述的免疫测定法，其中基于所述抗体与所述化疗药物的反应性，所述抗体具有至少10%的与沙利度胺的选择性反应性。
5.如权利要求1所述的免疫测定法，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式的配体缀合的多胺聚合物：
Figure FDA00002128053700021
其中Y和B如上文所述，并且X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
6.如权利要求5所述的免疫测定法，其中所述抗体与固体支持体连接。
7.如权利要求6所述的免疫测定法，其中所述固体支持体是微量滴定板。
8.如权利要求6所述的免疫测定法，其中所述固体支持体是纳米颗粒。
9.如权利要求1所述的免疫测定法，其中所述抗体是单克隆抗体。
10.如权利要求9所述的免疫测定法，其中所述抗体源自小鼠、兔、绵羊或大鼠。
11.用于检测样品中的来那度胺的免疫测定法，其包括提供含有所述样品、抗体以及载体与具有下式的配体的缀合物的混合物，所述抗体与选自来那度胺和来那度胺与沙利度胺的混合物的药学活性化疗药物选择性反应：
Figure FDA00002128053700031
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；并且
X是能够与载体结合的末端官能团；
使所述样品中的来那度胺和所述缀合物与所述抗体结合，之后测量所述混合物中与所述抗体结合或未结合的所述缀合物的量，由此可检测所述样品中来那度胺的存在。
12.如权利要求11所述的免疫测定法，其中所述样品是人类样品。
13.如权利要求12所述的免疫测定法，其中所述人类样品是采自用来那度胺治疗的患者的样品，并且所述免疫测定法通过测量与所述抗体结合或未结合的缀合物的量来测量所述样品中来那度胺的量。
14.如权利要求13所述的免疫测定法，其中基于所述抗体与所述化疗药物的反应性，所述抗体具有约100%的与来那度胺的选择性反应性。
15.如权利要求11所述的免疫测定法，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式的配体缀合的多胺聚合物：
Figure FDA00002128053700041
其中Y和B如上文所述；并且X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
16.如权利要求15所述的免疫测定法，其中所述抗体与固体支持体连接。
17.如权利要求16所述的免疫测定法，其中所述固体支持体是微量滴定板。
18.如权利要求16所述的免疫测定法，其中所述固体支持体是纳米颗粒。
19.如权利要求12所述的免疫测定法，其中所述抗体是单克隆抗体。
20.如权利要求19所述的免疫测定法，其中所述抗体源自小鼠、兔、绵羊或大鼠。
21.抗体，其与选自来那度胺和来那度胺与沙利度胺的混合物的药学活性化疗药物选择性反应。
22.如权利要求21所述的抗体，其中所述抗体具有不超过12%的与所述药学活性化疗药物的非药学活性代谢物的交叉反应性，所述交叉反应性是相对于所述抗体与所述药学活性化疗药物的结合而言的。
23.如权利要求22所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
24.如权利要求22所述的抗体，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式的配体缀合的多胺聚合物：
Figure FDA00002128053700051
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；并且
X是能够与所述多胺结合的末端官能团。
25.如权利要求24所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
26.如权利要求25所述的抗体，其中所述抗体源自小鼠、绵羊、兔或大鼠。
27.如权利要求22所述的抗体，其中基于所述抗体与所述化疗药物的反应性，所述抗体具有至少10%的与沙利度胺的选择性反应性。
28.如权利要求27所述的抗体，其中基于所述抗体与所述化疗药物的反应性，所述抗体具有48%的与沙利度胺的反应性。
29.如权利要求27所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
30.如权利要求28所述的抗体，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式的配体缀合的多胺聚合物：
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；
X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
31.如权利要求22所述的抗体，其中所述抗体与来那度胺选择性反应。
32.如权利要求31所述的抗体，其中基于所述抗体与所述化疗药物的反应性，所述抗体具有至少约20%的与来那度胺的选择性反应性。
33.如权利要求32所述的抗体，基于所述抗体与化疗药物的选择性反应性，所述抗体具有约100%的与来那度胺的选择性反应性。
34.如权利要求32所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
35.如权利要求32所述的抗体，其中所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原产生，所述免疫原性载体含有与下式的配体缀合的多胺聚合物：
Figure FDA00002128053700062
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；
X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
36.下式的化合物：
Figure FDA00002128053700071
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；
X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
37.如权利要求36所述的化合物，其中p是0。
38.如权利要求37所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700072
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700073
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
39.如权利要求38所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700074
40.如权利要求38所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700075
并且R3是氢。
41.如权利要求38所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700081
并且R3形成反应性酯。
42.如权利要求41所述的化合物，其中所形成的酯是低级烷基酯、亚氨酸酯或酰氨基酯。
43.如权利要求36所述的化合物，其中p是1。
44.如权利要求43所述的化合物，其中B是-C(=O)-CH2-。
45.如权利要求43所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700082
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700083
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
46.如权利要求45所述的化合物，其中Y是含有1-10个碳原子的亚烷基、
Figure FDA00002128053700084
或
Figure FDA00002128053700085
其中n和o是0-6的整数，并且m是1-6的整数。
47.如权利要求46所述的化合物，其中Y是含有1-6个碳原子的低级亚烷基。
48.如权利要求44所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700091
并且R3如上文所述。
49.如权利要求48所述的化合物，其中OR3形成羟基琥珀酰亚胺酯。
50.如权利要求46所述的化合物，其中Y是
Figure FDA00002128053700092
其中m和o如上文所述。
51.如权利要求50所述的化合物，其中X是
Figure FDA00002128053700093
并且R3如上文所述。
52.如权利要求51所述的化合物，其中OR3形成磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯。
53.缀合物，其包含与下式的配体缀合的载体：
Figure FDA00002128053700094
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；
X是能够与载体结合的末端官能团。
54.如权利要求53所述的缀合物，其中所述载体是含有多胺聚合物的免疫原性载体，并且X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
55.如权利要求53所述的缀合物，其中p是0。
56.如权利要求55所述的缀合物，其中X是
Figure FDA00002128053700101
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700102
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
57.如权利要求53所述的缀合物，其中p是1。
58.如权利要求57所述的缀合物，其中Y是含有1-10个碳原子的亚烷基、
Figure FDA00002128053700103
或
其中n和o是0-6的整数，并且m是1-6的整数。
59.如权利要求58所述的缀合物，其中X是
Figure FDA00002128053700105
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700106
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
60.如权利要求57所述的缀合物，其中所述载体是含有多胺聚合物的免疫原性载体，并且X是能够与所述多胺聚合物结合的末端官能团。
61.如权利要求60所述的缀合物，其中Y是含有1-6个碳原子的亚烷基。
62.如权利要求61所述的缀合物，其中X是
Figure FDA00002128053700111
并且R3如上文所述。
63.如权利要求60所述的缀合物，其中Y是
Figure FDA00002128053700112
其中m和o如上文所述。
64.如权利要求63所述的缀合物，其中X是
Figure FDA00002128053700113
并且R3如上文所述。
65.用于测定患者样品中沙利度胺的存在的试剂盒，其包含多种包装于单独的容器中的单独的试剂，所述试剂之一是载体与下式的配体的缀合物：
Figure FDA00002128053700114
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；并且
X是能够与载体结合的末端官能团；
且另一试剂为抗体，所述抗体与药学活性化疗药物来那度胺和沙利度胺的混合物选择性反应，并且基于其与所述药学活性化疗药物的混合物的反应性，所述抗体具有至少10%的与沙利度胺的选择性反应性。
66.如权利要求65所述的试剂盒，其中p是1。
67.如权利要求66所述的试剂盒，其中Y是低级亚烷基。
68.如权利要求67所述的试剂盒，其中X是
Figure FDA00002128053700121
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700122
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
69.如权利要求68所述的试剂盒，其中X是
Figure FDA00002128053700123
并且R3如上文所述。
70.如权利要求69所述的试剂盒，其中Y是
或
Figure FDA00002128053700125
71.如权利要求70所述的试剂盒，其中Y是
Figure FDA00002128053700131
其中m和o如上文所述。
72.用于测定患者样品中来那度胺的存在的试剂盒，其包含多种包装于单独的容器中的单独的试剂，所述试剂之一是载体与下式的配体的缀合物：
Figure FDA00002128053700132
其中B是-C(=O)-CH2-、-C(=O)-NH-CH2-、-C(=O)-O-CH2-或-CH2-；
Y是有机间隔基团；
p是0-1的整数；并且
X是能够与载体结合的末端官能团；
且另一试剂为抗体，所述抗体与选自来那度胺和沙利度胺与来那度胺的混合物的药学活性化疗药物选择性反应。
73.如权利要求72所述的试剂盒，其中p是1。
74.如权利要求73所述的试剂盒，其中Y是低级亚烷基。
75.如权利要求74所述的试剂盒，其中X是
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700134
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
76.如权利要求75所述的试剂盒，其中X是并且R3如上文所述。
77.如权利要求73所述的试剂盒，其中Y是
Figure FDA00002128053700142
或
Figure FDA00002128053700143
78.如权利要求77所述的试剂盒，其中Y是
Figure FDA00002128053700144
其中m和o如上文所述。
79.如权利要求78所述的试剂盒，其中X是
Figure FDA00002128053700145
-N＝C＝R4或
Figure FDA00002128053700146
其中R3是氢，或R3与其连接的氧原子一起形成反应性酯，并且R4是氧或硫。
80.如权利要求79所述的试剂盒，其中X是并且R3如上文所述。
CN201180013575.1A 2010-03-12 2011-02-23 来那度胺和沙利度胺免疫测定法 Expired - Fee Related CN102917587B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12/722,829 US8114621B2 (en) 2010-03-12 2010-03-12 Lenalidomide and thalidomide immunoassays
US12/722,829 2010-03-12
PCT/US2011/025883 WO2011112358A1 (en) 2010-03-12 2011-02-23 Lenalidomide and thalidomide immunoassays

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510145557.9A Division CN104730254A (zh) 2010-03-12 2011-02-23 来那度胺和沙利度胺免疫测定法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102917587A true CN102917587A (zh) 2013-02-06
CN102917587B CN102917587B (zh) 2015-04-29

Family

ID=44560359

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510145557.9A Pending CN104730254A (zh) 2010-03-12 2011-02-23 来那度胺和沙利度胺免疫测定法
CN201180013575.1A Expired - Fee Related CN102917587B (zh) 2010-03-12 2011-02-23 来那度胺和沙利度胺免疫测定法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510145557.9A Pending CN104730254A (zh) 2010-03-12 2011-02-23 来那度胺和沙利度胺免疫测定法

Country Status (9)

Country Link
US (5) US8114621B2 (zh)
EP (1) EP2544540B1 (zh)
JP (1) JP2013522594A (zh)
CN (2) CN104730254A (zh)
AU (1) AU2011224719B2 (zh)
BR (1) BR112012023015A2 (zh)
CA (1) CA2790508A1 (zh)
HK (1) HK1175071A1 (zh)
WO (1) WO2011112358A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9029548B2 (en) * 2011-05-06 2015-05-12 Catabasis Pharmaceuticals, Inc. Fatty acid lenalidomide derivatives and their uses
CN104755928B (zh) 2012-08-21 2017-05-10 詹森药业有限公司 奥氮平的抗体及其用途
TR201816416T4 (tr) 2012-08-21 2018-11-21 Janssen Pharmaceutica Nv Risperidona yönelik antikorlar ve bunların kullanımı.
CA2882490A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. Antibodies to paliperidone and use thereof
US20140057303A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to Olanzapine Haptens and Use Thereof
JP2015529199A (ja) 2012-08-21 2015-10-05 オルソ−クリニカル ダイアグノスティクス，インコーポレイティド パリペリドンハプテンに対する抗体及びその使用
JP6374387B2 (ja) 2012-08-21 2018-08-15 ヤンセン ファーマシューティカ エヌ．ベー． リスペリドンハプテンへの抗体及びその使用
US9962452B2 (en) 2013-02-04 2018-05-08 Zhuhai Beihai Biotech Co., Ltd. Soluble complexes of drug analogs and albumin
US9937259B2 (en) 2014-06-27 2018-04-10 Zhuhai Beihai Biotech Co., Ltd. Abiraterone derivatives and non-covalent complexes with albumin
WO2016065139A1 (en) * 2014-10-24 2016-04-28 Fl Therapeutics Llc 3-substituted piperidine-2, 6-diones and non-covalent complexes with albumin
CA3008809A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Janssen Pharmaceutica Nv Antibodies to risperidone and use thereof
MX2020003190A (es) 2017-09-22 2020-11-11 Kymera Therapeutics Inc Degradadores de proteinas y usos de los mismos.
US11358948B2 (en) 2017-09-22 2022-06-14 Kymera Therapeutics, Inc. CRBN ligands and uses thereof
JP2021508703A (ja) 2017-12-26 2021-03-11 カイメラ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｉｒａｋ分解剤およびそれらの使用
US11512080B2 (en) 2018-01-12 2022-11-29 Kymera Therapeutics, Inc. CRBN ligands and uses thereof
US11485743B2 (en) 2018-01-12 2022-11-01 Kymera Therapeutics, Inc. Protein degraders and uses thereof
US10905684B2 (en) * 2018-06-13 2021-02-02 Biotheryx, Inc. Aminoamide compounds
US20220356185A1 (en) * 2018-07-06 2022-11-10 Kymera Therapeutics, Inc. Mertk degraders and uses thereof
WO2020010177A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Kymera Therapeutics, Inc. Tricyclic crbn ligands and uses thereof
CA3119773A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Kymera Therapeutics, Inc. Irak degraders and uses thereof
WO2021030136A1 (en) * 2019-08-09 2021-02-18 The Regents Of The University Of California ANTIBODY CHEMICALLY INDUCED DIMERIZERS (AbCID) AS MOLECULAR SWITCHES AND USES THEREOF
WO2021127283A2 (en) 2019-12-17 2021-06-24 Kymera Therapeutics, Inc. Irak degraders and uses thereof
US11779578B2 (en) 2019-12-17 2023-10-10 Kymera Therapeutics, Inc. IRAK degraders and uses thereof
CA3162502A1 (en) 2019-12-23 2021-07-01 Yi Zhang Smarca degraders and uses thereof
JP2023518423A (ja) 2020-03-19 2023-05-01 カイメラ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｍｄｍ２分解剤およびそれらの使用
TW202210483A (zh) 2020-06-03 2022-03-16 美商凱麥拉醫療公司 Irak降解劑之結晶型
WO2022072538A1 (en) * 2020-09-30 2022-04-07 Biotheryx, Inc. Antibody-drug conjugates, pharmaceutical compositions thereof, and their therapeutic applications
TW202304525A (zh) * 2021-04-14 2023-02-01 南韓商樂高化學生物科學股份有限公司 蛋白質降解劑偶聯物及其用途

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096841A1 (en) * 2000-12-27 2003-05-22 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
CN101501071A (zh) * 2006-05-31 2009-08-05 Lpath公司 对溶血磷脂酸具有反应性的免疫衍生部分
US20100196392A1 (en) * 2008-07-17 2010-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-system asc amino acid transporter 2 (asct2) antibody

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996344A (en) 1972-05-15 1976-12-07 Biological Developments, Inc. Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies and use
US4016146A (en) 1974-12-10 1977-04-05 Biological Developments, Inc. Phenethylamine antigenic conjugates, their preparation, antibodies, and use
US20060024768A1 (en) * 2004-07-29 2006-02-02 Saladax Biomedical, Inc. Taxol immunoassay
US20060216767A1 (en) * 2005-03-22 2006-09-28 Saladax Biomedical Inc. Docetaxel immunoassay
EP2239573A3 (en) * 2005-03-30 2011-02-08 Saladax Biomedical Inc. Doxorubicin derivatives and conjugates for doxorubicin immunoassay
US8796429B2 (en) 2006-05-31 2014-08-05 Lpath, Inc. Bioactive lipid derivatives, and methods of making and using same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030096841A1 (en) * 2000-12-27 2003-05-22 Robarge Michael J. Isoindole-imide compounds, compositions, and uses thereof
CN101501071A (zh) * 2006-05-31 2009-08-05 Lpath公司 对溶血磷脂酸具有反应性的免疫衍生部分
US20100196392A1 (en) * 2008-07-17 2010-08-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-system asc amino acid transporter 2 (asct2) antibody

Also Published As

Publication number Publication date
CA2790508A1 (en) 2011-09-15
HK1175071A1 (zh) 2013-06-28
AU2011224719A1 (en) 2012-09-06
US20110223611A1 (en) 2011-09-15
WO2011112358A1 (en) 2011-09-15
CN104730254A (zh) 2015-06-24
US20120071632A1 (en) 2012-03-22
CN102917587B (zh) 2015-04-29
US8114621B2 (en) 2012-02-14
AU2011224719B2 (en) 2014-10-23
EP2544540A1 (en) 2013-01-16
US8293492B2 (en) 2012-10-23
JP2013522594A (ja) 2013-06-13
US8440796B2 (en) 2013-05-14
US20130211052A1 (en) 2013-08-15
BR112012023015A2 (pt) 2017-06-06
EP2544540B1 (en) 2015-04-08
EP2544540A4 (en) 2013-08-07
US20140024807A1 (en) 2014-01-23
US20120064549A1 (en) 2012-03-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102917587B (zh) 来那度胺和沙利度胺免疫测定法
JP5031585B2 (ja) ５−フルオロ−ウラシル免疫測定法
CN102625702B (zh) 伊马替尼免疫测定法
JP4896959B2 (ja) ドキソルビシン免疫測定法
JP4889054B2 (ja) ドセタキセル免疫測定方法
CN102917592A (zh) 利培酮免疫测定
CN101052877B (zh) 环磷酰胺抗体和免疫测定
WO2012021907A2 (en) Vincristine immunoassay
CN103782167B (zh) 吉西他滨免疫测定
JP4486994B2 (ja) ブスルファンイムノアッセイ

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20150429

Termination date: 20180223

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee