CN102625702B - 伊马替尼免疫测定法 - Google Patents

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Abstract

衍生自伊马替尼的新型缀合物和免疫原，以及由这些免疫原产生的单克隆抗体可用于对生物液体中伊马替尼或其药理活性盐进行定量和监测的免疫测定法。

Description

伊马替尼免疫测定法
发明领域
本发明涉及免疫测定法的领域，用于确定人类生物液体中伊马替尼(imatinib)或其药理活性盐的存在和/或对伊马替尼或其药理活性盐进行定量，以在化疗期间快速确定最佳药物浓度。
发明背景
癌是用于描述一组恶性肿瘤的术语，所述恶性肿瘤具有当身体一部分的细胞开始失控生长时其会发展的共同特性。大部分癌形成为肿瘤，但也可以在血液中显现并循环通过其生长的其他组织。最常用的是手术、化疗、和/或放疗的组合来治疗癌症恶性肿瘤。用于治疗特定癌症的治疗类型取决于几个因素，包括癌症恶性肿瘤的类型和其被诊断出来时的阶段。
具有如下化学式的伊马替尼：
及其盐，特别是伊马替尼甲磺酸盐(mesylate)，是用于治疗急性变期、加速期或慢性期的费城染色体阳性慢性骨髓白血病的较常用的化疗剂之一(Gleevecpackageinsert，NovartisPharmaceuticals，2004年7月)。
伊马替尼已显示出在波谷浓度(troughconcentration)具有高至16倍的患者间变异性，而且该变异性能影响其效力(Picardet.al.Blood2007：109；3496-3499，Larsonetal.Blood2008，111：4022-4028，Demetriet.al.JClinOncol2009，27：3141-3147)。
优选的伊马替尼盐是有如下化学式的伊马替尼甲磺酸盐：
由于在较高波谷水平(troughlevel)伊马替尼的效力有改善，并且该药物显示广泛的患者内药代动力学变异性，监测血液中的该药物浓度并调整至目标水平将会对提高效力并最小化毒性有价值。据报道，个体内和个体间的伊马替尼及其盐的药代动力学变异性程度为16倍，并受许多因素影响，包括：
ο器官功能
ο遗传调节
ο疾病状态
ο年龄
ο药物-药物相互作用
ο药物摄入时间
ο顺应性
作为此变异性的结果，不同个体中相等剂量的相同药物可导致显著不同的临床效果。相同剂量的伊马替尼或其盐的有效性依据患者中的个体药物清除和最终血清药物浓度而有显著变化。治疗性药物监控(management)能使临床医生了解药物施用中患者的差异。经治疗性药物监控，药物剂量可对患者进行个性化，有效治疗癌症并且没有有害副作用的机会要高得多。
此外，伊马替尼或其盐的治疗性药物监控在以实际规定的剂量和实现有效血清浓度水平的化疗施用中是确保顺应性的很好的工具(Henk，etal.ProcASCO2006，abst.6083，Feng，etal.ProcASCO2006，abst.6038)。伊马替尼或其盐的常规治疗性药物监控需要使用适合一般实验室设备的简单自动化测试。已经描述了使用液相色谱(LC)-串联质谱来确定人血液和血浆中的伊马替尼、伊马替尼盐或其化疗代谢物的浓度(Guetens，JPharmBiomedAnal.，33(5)：879-892003；Bakhtiar，JChromatrographyB，768(2)：325-340，2002；Titier，Ther.Drug.Monit.，(27)5：634-640，2005)。也已经开发了确定伊马替尼、伊马替尼盐或其化疗代谢物纯度的LC方法(Vivekanand，JPharmBiomedAnal.，28(6)：1183-94，2002)，但还没有用于确定在生物液体中的水平。这些方法是劳动密集的，使用昂贵的仪器并且不适合常规临床实验室使用。已开发了用于测定伊马替尼的酶测定法，示于美国专利7,300,768号中。然而，还没有用于在使用此种化疗剂治疗的患者的人生物液体中确定伊马替尼的存在或对其进行定量的简单免疫测定法。
从上述可以看出，还没有用于确定人生物液体中伊马替尼或其药理活性盐的存在和/或对其进行定量的免疫测定法。通过免疫测定法对伊马替尼和其药理活性盐进行的常规治疗性药物监控会提供适合标准实验室设备的简单自动化测试。然而，为了提供这样的免疫测定法，必须生产特异于伊马替尼及其药理活性盐的抗体。此种测定中使用的衍生物和免疫原必须通过所产生的这些相应抗体而赋予伊马替尼及其药理活性盐特异的反应性，而与治疗活性的或非活性的或者药理活性或非活性的伊马替尼及其盐的代谢物实质上没有任何交叉反应。为了有效的监测药物水平，抗体应当特异于伊马替尼及其药理活性盐，并与N-去甲基伊马替尼不交叉反应。
在使用伊马替尼及其盐治疗的患者样品中产生的伊马替尼活性代谢物是N-去甲基伊马替尼，其具有化学式：
正是这种药理活性代谢物阻碍了通过使用伊马替尼及其盐治疗的患者样品中的免疫测定而对伊马替尼及其盐进行的准确确定。因此，长期以来期望能提供特异于伊马替尼及其药理盐而不与N-去甲基伊马替尼交叉反应的抗体。
发明简述
依照本发明，生产了一类新的抗体，其实质上与伊马替尼及其药理活性盐选择性反应，以选择性地结合伊马替尼及其药理活性盐，而与其药理活性伊马替尼代谢物，N-去甲基伊马替尼不具有任何实质的交叉反应性。对于选择性反应性，其是指该抗体仅与伊马替尼及其药理活性盐反应，而实质上不与药理活性伊马替尼代谢物，N-去甲基伊马替尼反应。所述N-去甲基伊马替尼代谢物阻碍了通过免疫测定法对人生物液体中伊马替尼及其药理活性盐的存在和量进行准确的确定。
已经发现可以通过使用含免疫原性聚合物的载体与如下化学式的化合物或其药理活性盐的缀合物作为免疫原，其中的聚合物具有反应性硫醇基或氨基官能团：
其中Y为有机间隔基团；
X为能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数，
来生产特异于伊马替尼或其药理活性盐并且实质上不与N-去甲基伊马替尼反应或结合的抗体。此外这些抗体实质上不显示与任何其治疗活性或非活性伊马替尼代谢物的交叉反应性。
提供这些实质上与伊马替尼及其药理活性盐选择性反应，而不与N-去甲基伊马替尼交叉反应的抗体，使得能够产生免疫测定法，其可以特异性地检测以及定量，以便在使用伊马替尼或其药理活性盐治疗的患者的液体样品中监测伊马替尼或其药理活性盐。本发明也包括了用于所述免疫测定法的试剂和试剂盒。伊马替尼活性代谢物，N-去甲基伊马替尼的存在是伊马替尼或其药理活性盐免疫测定中不准确读数的主要原因。
发明详述
依据本发明，提供了一类新的抗体，其实质上与伊马替尼或其药理活性盐选择性反应，而实质上不与上文中提到的其代谢物反应或交叉反应。已经发现通过使用这些化学式IV的伊马替尼衍生物作为免疫原，可以提供本发明的这类新抗体。通过使用这些抗体，而已开发出一种免疫测定法，包括用于这样免疫测定法的试剂和试剂盒，以用于检测和/或定量血液、血浆或其他体液样品中的伊马替尼及其药理活性盐。通过使用此种免疫测定法，可以检测和/或定量使用该化疗剂治疗的患者的体液样品中的伊马替尼或其药理活性盐的存在和量。通过这种方式，可以在治疗期间监测使用伊马替尼或其药理活性盐治疗的患者，并根据所述监测而调整其治疗。通过本发明的方法，可以在使用伊马替尼或其药理活性盐作为化疗剂进行治疗的癌症患者中实现伊马替尼或其药理活性盐的治疗性药物监控。
要检测的化疗剂是化学式I的伊马替尼或其药理活性盐。这些盐包括酸加成盐例如与诸如无机酸的盐，如盐酸、硫酸或磷酸，或者与适合的有机羧酸或磺酸的盐，例如脂肪族单或二羧酸，如三氟乙酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、羟基马来酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸或草酸，或氨基酸，如精氨酸或赖氨酸，芳香羧酸，如苯甲酸，2-苯氧基苯甲酸、2-乙酸氧基苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸，芳香脂肪族羧酸，如扁桃酸或肉桂酸，杂环羧酸，如烟酸或异烟酸，脂肪族磺酸，如甲-、乙-或2-羟基乙-磺酸，或芳香族磺酸，例如苯-、p-甲苯-或萘-2磺酸，优选的酸是甲烷磺酸。
本发明测定法中使用的试剂为具有反应性硫醇基或氨基官能团的载体与化学式IV的化合物之间的缀合物。对于结合本发明的抗体，这些缀合物与存在于样品中的伊马替尼及其药理活性盐是竞争性结合配偶体。因此，与抗体结合的缀合物试剂的量会与样品中伊马替尼及其药理活性盐的量成反比。依据本发明，所述测定法使用任何常规的测量手段来检测并测量与抗体结合或未结合的所述缀合物的量。通过使用所述手段，可以确定结合或未结合的缀合物的量。通常，通过将所测得的由样品中的伊马替尼或其药理活性盐产生的结合或未结合的缀合物的量，与从标准或校准曲线确定的结合或未结合的缀合物的值相关联，来确定样品中伊马替尼或其药理活性盐的量，标准或校准曲线使用含有已知量的伊马替尼或其药理活性盐的样品来获得，其中的已知量在要检测样品的预期范围内。产生校准曲线的研究使用与对样品所用的相同的免疫测定过程来确定。
定义
本说明书中应理解如下定义：
本申请中使用的术语“Ph”是指苯基根。术语“亚烃基(alkylene)”是指含有从1到10个碳原子的二价饱和直链或支链烃取代基。
术语“免疫原”和“免疫原性的”是指能够在生物体中引发、产生、或发生免疫反应的物质。
术语“缀合物”是指由分离的部分连接在一起形成的任何物质。依据本发明，代表性的缀合物包括小分子和大分子连接在一起形成的那些，小分子如化学式IV的化合物，大分子如具有一个或多个反应性硫醇基或氨基官能团的载体，这样的载体可以是聚胺聚合物，特别是蛋白质。在缀合物中小分子可以在大分子的一个或多个活性位点上连接。术语缀合物包括术语免疫原。
“半抗原”是部分的或不完整的抗原。其为无蛋白物质，大多是低分子量物质，不能够刺激抗体形成，但却能与抗体反应。后者是通过将半抗原与高分子量免疫原性载体偶合，并进而将此偶合产物即免疫原，注入人或动物对象来实现的。本发明的半抗原为伊马替尼或其药理活性盐。
本发明中使用的“间隔基团”或“间隔物”是指化学结构的一部分，其通过功能性连接基团连接两个或更多个亚结构，如半抗原、载体、免疫原、标记或示踪物。这些间隔基团将在本申请下文中进行列举。间隔基团的原子和间隔基团内的链的原子自身是通过化学键连接的。优选的间隔物为直链或支链的，饱和或不饱和的碳链。这些碳链也可以在链中或在链末端包括一个或多个的杂原子。“杂原子”表示非碳原子，其选自由氧、氮和硫所组成的组。间隔基团也可以包括环形基团或芳香基团作为链的一部分或作为链上一个原子上的取代基。
间隔基团中原子的数目通过计数除了氢之外的原子而确定。间隔基团内的链的原子的数目按沿被连接的亚结构间最短途径的非氢原子的计数而确定。功能性连接基团可以用于激活(例如在半抗原或间隔基上提供可用的功能位点)来合成半抗原与标记或载体或聚胺聚合物的缀合物。
本发明中使用的术语“免疫原性载体”，是免疫原性物质，通常是蛋白或经修饰以包含反应性硫醇基或氨基的蛋白，其可以在一个或多个位置与半抗原(在此处的情况下为伊马替尼)结合，由此使这些半抗原衍生物诱导免疫应答，并激发能与这些半抗原特异性结合的抗体的产生。免疫原性载体和连接基团在本申请下面列举。免疫原性载体物质包括被识别为外源并由此引起宿主免疫应答的蛋白、糖蛋白、复合多氨基-多糖、颗粒、以及核酸。多氨基-多糖可以使用任何已知的常规制备方法从多糖制备。
也可以使用各种蛋白类型作为多聚(氨基酸)免疫原性载体。这些类型包括白蛋白、血清蛋白、脂蛋白等。示例性的蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白、牛甲状腺球蛋白(BTG)等。或者，也可以使用合成的多聚(氨基酸)。
免疫原性载体也可以包括多聚氨基-多糖，其是通过重复的单糖缩合而构建的高分子量聚合物。多糖的例子有淀粉、糖原、纤维素、碳水化合物胶如阿拉伯树胶、琼脂等。多糖也包含多聚氨基酸残基和/或脂质残基。
免疫原性载体也可以是单独的多聚(核酸)，或与上面提到的多聚(氨基酸)或多糖缀合的多聚(核酸)。
免疫原性载体也可以包括固体颗粒。颗粒一般至少约0.02微米(μm)而不大于100μm，通常直径约0.05μm到10um。颗粒可以是有机或无机的、可膨胀或不可膨胀的、多孔或非多孔的，最佳为接近水的密度，一般为从约0.7到1.5g/mL，并且由透明、部分透明、或不透明材料组成。颗粒可以是生物材料如细胞和微生物，包括非限制性例子如红细胞、白细胞、淋巴细胞、杂交瘤细胞、链球菌(Streptococcus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(E.coli)、和病毒。颗粒也可以由有机和无机聚合物，脂质体、乳胶、磷脂囊泡、或脂蛋白所构成。
“多聚(氨基酸)”或“多肽”是由氨基酸所形成的聚酰胺。一般多聚(氨基酸)范围从约2,000分子量开始，没有分子量上限，通常小于10,000,000而且经常不大于600,000道尔顿。基于是否包括免疫原性载体或酶，而经常有不同的范围。
“肽”是通过酰胺(肽)键连接两个或更多个氨基酸所形成的任何化合物，经常是α-氨基酸聚合物，其中每个氨基酸残基(除去NH2末端)的α-氨基与线性链中下一个残基的α-羧基连接。术语肽、多肽、和多聚(氨基酸)在本发明中同义使用，是指无大小限制的此类化合物。此类中最大的成员被称为蛋白质。
“标记”、“检测分子”、或“示踪物”是可以产生，或可以被诱导产生可检测信号的任何分子。标记可以缀合至分析物、免疫原、抗体，或者缀合至另外的分子如受体或能与受体结合的分子如配体，特别是半抗原。标记的非限制性例子包括放射性同位素、酶、酶片段、酶底物、酶抑制剂、辅酶、催化剂、荧光团、染料、化学发光剂、发光剂、或致敏剂(sensitizer)；非磁性或磁性颗粒，固体支持物、脂质体、配体、或受体。
术语“抗体”是指抗原的特定蛋白结合配偶体，是对抗原有特异亲和性而排除其他物质的任何物质、或物质组。上位术语抗体涵盖多克隆抗体、单克隆抗体和抗体片段。
术语“衍生物”是指通过一个或多个化学反应而从亲代化合物制得的化合物或分子。
术语“载体”是指固体颗粒和/或聚合的聚合物，其具有反应性硫醇基或氨基官能团如上面所提及的免疫原性聚合物。当载体是固体颗粒时，固体颗粒可以与聚胺聚合物结合、使用聚胺聚合物包被或以其他方式附着至聚胺聚合物上，以提供一个或多个反应位点来结合化学式IV的化合物的末端官能团X。另一方面，可以通过将抗体包被到固体颗粒上来实施本发明的免疫测定法。
术语“试剂盒(reagentkit)”或“测试盒(testkit)”是指实施测定法中所使用的材料的组合。试剂可以在包装的组合中提供，可以在相同或单独的容器中，这取决于其交叉反应性和稳定性，可以液体或冻干的形式提供。可以选择试剂盒中所提供的试剂的量和比例以给出特定应用的最佳结果。体现本发明特征的试剂盒包括特异于伊马替尼或其药理活性盐的抗体。试剂盒还可包括分析物的配体以及校准和对照材料。试剂可以保存为液体形式或可以被冻干。
短语“校准和对照材料”是指含有已知量的被测药物的任何标准或参考材料。通过将未知样本获得的结果与从标准获得的结果比较从而计算药物的浓度。这通常通过构建校准曲线完成。
术语“生物样品”包括，但不限于，来自存活物或之前存活物的任意量的物质。这样存活物包括，但不限于，人、小鼠、猴、大鼠、兔、马、和其他动物。这样的物质包括，但不限于，血液、血清、血浆、尿液、细胞、器官、组织、骨、骨髓、淋巴、淋巴结、滑膜组织(synovialtissue)、软骨细胞、滑膜巨噬细胞(synovialmacrophage)、内皮细胞、和皮肤。
试剂和免疫原
在基于抗体的免疫测定法中，构建伊马替尼的缀合物以便与样品中的伊马替尼及其药理活性盐竞争抗体上的结合位点。在本发明的免疫测定法中，化学式IV的试剂是在式I的伊马替尼酰胺桥上所形成的氮取代的伊马替尼衍生物。在化学式IV的化合物中，接头间隔物构成此分子的“X-Y”部分。此接头X和间隔物-“Y”在制备免疫测定法的缀合物和产生抗体的免疫原中是常规的。任何用于制备免疫测定法的缀合物和产生抗体的免疫原的常规间隔物-接头基团均可以用于化学式IV的化合物。这样的常规接头和间隔物在美国专利5,501,987号和美国专利5,101,015号中有公开。
缀合物以及免疫原，是从化学式I的化合物制备的。在载体与半抗原的缀合物或免疫原中，载体在载体聚合部分所含有的一个或多个反应性氨基或硫醇基的一个或多个位置被连接到有如下化学式的半抗原：
其中X’是能够通过所述氨基或硫醇基结合到所述载体上的功能性接头基团，而p和Y如上所述；
优选的间隔基团包括本发明前面提及的间隔基团。特别优选的间隔基团例如是含有1到10个碳原子的亚烃基基团，
其中n和o为从0到6的整数，而m为从1到6的整数，且亚烃基是特别优选的间隔基团。
在化学式IV-A的化合物中，X’是连接间隔物的官能团，优选是通过聚合载体上的反应性氨基或硫醇基。X’基是化学式IV的化合物中末端官能团X与载体或免疫原的聚合物上反应性氨基或硫醇基结合的结果。任何能够与氨基或硫醇基反应的末端官能团均可被用作化学式IV的化合物中的官能团X。优选包括于X中的这些末端官能团为：
其中R3为氢或连同其附着的氧原子形成反应性酯，而R4为氧或硫。-N＝C＝R4基根可以是异氰酸酯(isocyanate)或异硫氰酸酸酯(isothiocyanate)。由OR3形成的活性酯包括亚胺酯(imidoester)，如N-羟基琥珀酰胺、1-羟基苯并三唑和p-硝基苯基酯。然而可以使用任何能与胺基反应的活性酯。
当化学式IV的化合物中X为
时，这些化合物优选与聚合的或免疫原性的载体的自由氨基反应。另一方面，当化学式IV的化合物中X为化学式
的马来酰亚胺根(maleimideradical)时，该化合物优选与可能存在于包括免疫原的聚合或蛋白载体上的硫醇基(或SH)反应，以产生马来酰亚胺官能团作为化学式IV-A的化合物中的X’。
依据本发明的实施方式，其中X’是附着于聚合蛋白上的化学式IV化合物的马来酰亚胺，所述聚合蛋白经修饰以将反应性氨基转变为硫醇基。这可以通过将聚合蛋白载体的自由氨基与如下化学式的化合物反应完成，
其中R15是硫醇保护基；
R3如上；和
V是从1到4的整数。
以这种方式，硫醇基SH-变成结合至载体剩余部分的载体的官能团。将蛋白的反应性氨基转化的反应在水介质中进行，通过在水介质中将含有蛋白的载体与化学式VI的化合物混合来进行。在此反应中，温度和压力不是关键，反应可以在室温和大气压力下进行。一般优选从10℃到25℃的温度。下一步，在硫醇基修饰的载体与化学式IV的化合物反应之前，通过常规方法从得到的化学式V的化合物与蛋白载体的反应产物上去除载体的硫醇保护基。
任何去除硫醇保护基的常规方法可以被用于实施该反应。然而，在使用去除硫醇基的方法时，必须注意反应物是可溶于水介质载体的，并且不会以任何方式破坏或损害载体中所含的聚胺聚合物。去除此保护基团的优选方法是通过使用二硫苏糖醇作为还原所得的缩合产物的物质。该还原可以简单地通过向反应介质中加入还原性物质来进行，而不使用较高的压力和温度来进行。该还原可以在室温和大气压力下进行。任何常规的硫醇基保护物质可被用于化学式VI的化合物。硫醇保护基是本领域公知的，2-吡啶二硫(2-pyridyldithio)是优选的保护基。
虽然上述方法代表了将含聚胺聚合物的载体上的末端反应性氨基转化为硫醇基的一种途径，任何常规的进行这种转换的方法也可以使用。将含聚胺聚合物的载体上的末端反应性氨基转化为硫醇基的方法本领域公知并可以在本发明中使用。
在具有末端反应性硫醇基的含聚胺聚合物的载体与化学式IV的化合物的反应中，其中X是能够结合载体携带的末端硫醇基的官能团，该反应可以通过常规的方法进行。在优选的实施方式中，化学式IV的化合物中X携带的马来酰亚胺与聚胺聚合物载体携带的硫醇基反应。任何公知的通过马来酰亚胺双键添加硫醇的方法可以被用于生产通过硫醇桥缀合的化学式VIA的缀合物。
羧基和活性酯通过常规方法连接到载体或免疫原性聚合物上。聚胺聚合物上的胺基，如蛋白，产生了对间隔物和聚合物、免疫原或载体和/或本发明的缀合物进行连接的酰胺基。
在本发明的免疫原和缀合物中，含羧基的伊马替尼半抗原与载体或免疫原所含聚胺聚合物上反应性氨基之间的化学键，可以使用多种本领域技术人员已知的方法建立。经常优选形成酰胺键。将羧基与离去基团试剂(如N-羟基琥珀酰胺、1-羟基苯并三唑和p-硝基苯基酯等)反应激活化学式IVA化合物的羧酸基团来形成酰胺键。可以使用激活试剂如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺等。化学式VIA的伊马替尼半抗原中羧基的激活形式随后与缓冲液中所含的带反应性氨基的载体反应。
另一方面，X是化学式IV的化合物中的末端异氰酸酯或异硫氰酸酸酯基团，当与聚胺聚合物的自由胺反应时，这些基团产生化学式IV-A的缀合物或免疫原，其中X’是在聚胺载体或免疫原性多肽上带有氨基。
当化学式IV的化合物中X含有醛基根时，这些化合物可以通过还原胺化而经胺键连接到载体上聚胺多肽的自由氨基上。任何缩合醛与胺的常规方法如通过还原胺化可以被用于形成这种连接。在该情况下，化学式IV的配体部分的X’是-CH2-。
通过将化学式I的伊马替尼和如下化学式的卤化物反应形成化学式IV的化合物：
卤-CH2-(Y)p-X
VII
其中p、Y和X如上。为形成化学式IV的化合物。在将化学式VII的化合物缩合到化学式I的伊马替尼的该酰胺位置时，可以使用任何将卤化物与酰胺上氮反应的常规方法。使用化学式VII的化合物中的卤化物提供了有效的方法来通过与化学式I的化合物上的酰胺基缩合形成这样的替代的酰胺。
当化学式I的化合物为其盐形式时，在与化学式V的化合物反应以形成化学式IV的化合物之时前必须将该盐转化为其游离碱。这可以通过常规方法如盐的中和来进行。当盐是碱性盐时，可以通过加入酸而在水介质中完成中和。当盐是酸加成盐时，可以通过加入碱而在水介质中完成中和。
通过将这些化合物与含有聚胺或多肽的载体反应，化学式IV的化合物可以被转化为本发明的免疫原和/或缀合物试剂。如果聚胺或多肽是有免疫活性，相同的多肽可以被用作载体和用作本发明免疫原中的免疫原性聚合物。然而，为形成缀合物，这些聚合物不需要如免疫原所需的那样产生免疫应答。依据本发明，通过将官能团附着于聚合物中含有的氨基，化学式IV的化合物中X所表示的各种官能团可以与含有聚合物的载体缀合，聚合物有反应性氨基。依据优选的实施方式，在化学式IV的化合物中当附着是通过载体上的反应性氨基时，X是羧酸基团或其活性酯。
抗体
本发明也涉及新的抗体，包括使用前述免疫原生产的伊马替尼或其药理活性盐的单克隆抗体。依据本发明，已经发现按照本发明生产的这些抗体与伊马替尼或其药理活性盐选择性反应，而不与干扰伊马替尼或其药理活性盐免疫测定的N-去甲基伊马替尼反应。本发明抗体不与N-去甲基伊马替尼反应的能力使这些抗体能提供一种免疫测定，用于检测患者液体样品中伊马替尼或其药理活性盐的存在或对其定量。
本发明涉及新的伊马替尼或其药理活性盐的抗体和单克隆抗体。本发明的抗血清可以方便地通过使用本发明的免疫原免疫宿主动物来产生。适合的宿主动物包括啮齿类，例如，如，小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，或更高级的哺乳类动物，如山羊、绵羊、马等。可以依据在动物中引发免疫反应的可接受方案施用初始剂量、取血和加强注射，例如，在优选的实施方案中，在6个月时段内，小鼠接收腹腔注射100μg免疫原/鼠的初始剂量，以及两次或更多的50-100μg免疫原/鼠的随后加强注射。通过定期取血，观察被免疫的小鼠的血液样品以使用常规免疫测定法来发展对伊马替尼或其药理活性盐的免疫应答。这些方法提供了筛选能产生具有所需能力的抗血清的宿主的简便方法。也将这些抗体针对伊马替尼或其药理活性盐主要代谢物进行筛选，显示其实质上不与这些化合物结合。
单克隆抗体通过免疫Balb/c小鼠简便地生产，免疫按上述时间表，随后在细胞融合前四天开始给小鼠连续三天腹腔或静脉注射100μg免疫原。其他抗体领域内公知的方案当然也可以被使用。本发明详细描述的完整免疫方案为伊马替尼或其药理活性盐抗体的血清抗体反应提供了最佳方案。
从宿主的脾脏、外周血、淋巴结或其他组织获得的B淋巴细胞可以被用作生产单克隆抗体的细胞。最优选的是从脾脏获得的B淋巴细胞。通过融合这样的B淋巴细胞与永生化细胞系来获得能够产生本发明所需单克隆抗体的杂交瘤细胞，永生化细胞系在杂交细胞中提供长期组织培养稳定性。在本发明优选的实施方案中，永生化细胞可以是淋巴母细胞或浆细胞瘤细胞如骨髓瘤细胞，其本身是产生抗体的细胞但也是恶性的。通过融合小鼠骨髓瘤细胞和从伊马替尼或其药理活性盐-蛋白缀合物免疫的小鼠获得的脾细胞，来形成产生伊马替尼或其药理活性盐单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞。可以通过从杂交瘤细胞克隆表达抗体的基因，并使用目前本领域公知的重组DNA方法将小鼠可变区子序列掺入人恒定区，或者组合人的框架区和来自供体小鼠或大鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR’s)，这样来产生嵌合的和人源化的单克隆抗体。进行小鼠单克隆抗体人源化的改进的方法能提供增强亲和力的抗体，其在国际专利申请WO92/11018中有显示。
可以生产仅包括抗体基本结构的一部分的多肽片段，这些片段拥有一种或多种免疫球蛋白活性。可以通过使用本领域公知的方法水解完整抗体，来产生这些多肽片段，或者通过使用定点突变在含有抗体基因的表达载体上需要的位置插入终止子来产生Fab片段或(Fab’)2片段。可以通过将VL和VH区与连接DNA结合来生产单链抗体(见Hustonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：5879-5883(1988)和Birdetal.，Science，242：423-426(1988))。
本发明的抗体对伊马替尼及其药理活性盐有选择性，而与N-去甲基伊马替尼实质上没有交叉反应性。此外，这些抗体与任何治疗活性或非活性伊马替尼代谢物实质上不显示交叉反应性。实质上没有交叉反应性意味着，相对伊马替尼及其药理活性盐，本发明的抗体与这些代谢物，特别是N-去甲基伊马替尼具有小于15％，优选小于10％的交叉反应性。
免疫测定
依照本发明，从化学式IV的这些化合物免疫原产生的缀合物和抗体可以被用作确定患者样品中伊马替尼或其药理活性盐的试剂。可以通过免疫测定的方法来进行这样的确定。从化学式IV的化合物形成的缀合物试剂与样品中的伊马替尼或其药理活性盐竞争依据本发明产生的抗体上结合位点的任何免疫测定法，可以用于确定患者样品中伊马替尼或其药理活性盐的存在。在怀疑含有伊马替尼或其药理活性盐的样品中进行这样的用于伊马替尼或其药理活性盐的测定法的方式，包括组合(a)水介质样品、(b)依照本发明产生的伊马替尼及其药理活性盐的抗体以及(c)从化学式IV的化合物或其混合物所形成的缀合物。可以通过测定加入到样品与抗体混合物的已知量缀合物对于特定抗体结合的抑制，来确定样品中伊马替尼或其药理活性盐的量。将未知样品中已知量缀合物此种结合抑制的结果，与使用伊马替尼或其药理活性盐的已知标准溶液进行相同检测得到的结果相比较。在确定未知样品中的伊马替尼或其药理活性盐的量时，样品、从化学式IV的化合物形成的缀合物以及抗体可以以任意顺序加入。
可以使用各种方法测定结合至抗体的从化学式IV的化合物形成的缀合物的量。一种方法借助缀合物与抗体的结合引起荧光基团缀合物的轮换率(rateofrotation)降低。液体混合物中荧光团缀合物的轮换率降低的量可以通过荧光偏振技术，如美国专利4,269,511和美国专利4,420,568中所公开的来检测。
另一方面，抗体可以被包被或吸附到纳米颗粒上，以便当这些颗粒与从化学式IV的化合物形成的伊马替尼或其药理活性盐缀合物反应时，这些颗粒形成聚合体。然而，当包被或吸附抗体的纳米颗粒与样品中的伊马替尼或其药理活性盐反应时，来自样品的伊马替尼或其药理活性盐结合到这些颗粒不引起抗体纳米颗粒聚合。测定法混合物中聚合体或凝集体的量可以通过吸光度来测量。
另一方面，可以通过将抗体或伊马替尼或其药理活性盐缀合物附着到固体支持物，如微量滴定板或包括固体颗粒在内的任何其他常规固体支持物来进行这些测定法。将抗体或蛋白附着到这样的固体支持物本领域公知。可以使用任何常规方法进行这样的附着。在许多情况下，为了有助于测量，可以将标记，如放射性标记或酶标记置于抗体、缀合物或固体颗粒上，作为辅助来检测结合或未结合到抗体上的从化学式IV的化合物形成的缀合物的量。其他适合的标记包括发色团、荧光团等。
为了方便起见，本发明的测定组分可以以试剂盒、有预定量的伊马替尼或其药理活性盐的测定法中使用的新试剂的包装组合的形式提供。这些试剂包括本发明的抗体，以及从化学式IV的化合物形成的缀合物。
在这些比粗的试剂之外，也可以包括添加剂如辅助试剂，例如，稳定剂、缓冲剂等。各种试剂的相对量可以宽范围变化以为试剂溶液的浓度提供实质性优化的测定灵敏度。试剂可以在溶液中或作为干粉末提供，干粉末经常是冻干的，并包括赋形剂，其在溶解后能提供具有实施检测的适合浓度的试剂溶液。
实施例
在实施例中，如下缩写被用于表示下列意思：
在实施例中，下面的方案1展示了按实施例编号制备并提及的具体化合物。磷酸盐缓冲液组分具有含下列成分的水溶液：
15.4mM磷酸氢二钠(NaHPO4)
4.6mM磷酸二氢钠(NaH2PO4)
pH＝7.2±0.10
实施例中使用的乙醚是二乙醚。这些实施例中给出的份数或百分数是体积份数。
方案1
实施例
实施例1
伊马替尼甲磺酸盐的提取
将14片每片含400mg伊马替尼甲磺酸盐的药片使用研钵和杵碾成细粉末；药片的包衣没有事先去除。碾碎的药片粉末在1500mL10％的MeOH(体积)/CH2Cl2中搅拌4小时。来自碾碎药片的含有伊马替尼甲磺酸盐的混合物通过硅藻土过滤，去除溶剂得到7.14g含伊马替尼甲磺酸盐的黄色固体。将含伊马替尼甲磺酸盐的黄色固体溶于75mL热的乙醇中的20％氯仿(体积)以产生伊马替尼甲磺酸盐溶液，随后加入50mL1∶1的乙醚∶乙醇(体积∶体积)，使伊马替尼甲磺酸盐溶液变浑浊。在冰中冷却引起伊马替尼甲磺酸盐析出，随后继续缓慢加入乙醚。析出的伊马替尼甲磺酸盐与乙醚分层(layer)，覆盖，使其保持过夜。
通过过滤收集析出的伊马替尼甲磺酸盐，并使用50mL冷的乙醚中的10％乙醇(体积)清洗，随后真空干燥以获得6.42g(115％)浅黄色固体伊马替尼甲磺酸盐。在乙醚的帮助下，第二次进行伊马替尼甲磺酸盐从氯仿/乙醇中再结晶以得到4.45g(79％)浅黄色固体伊马替尼甲磺酸盐。从药片中分离的该伊马替尼甲磺酸盐浅黄色固体被用于实施例2中。结构通过NMR和元素分析确认。纯度通过HPLC确认。
实施例2
伊马替尼游离碱的制备
将实施例1制备的伊马替尼甲磺酸盐(1)(1.01g，1.71mmol)加入250mL二氯甲烷中以形成伊马替尼甲磺酸盐悬液。加入50mL10％饱和的NaHCO3水溶液，并与二氯甲烷中的伊马替尼甲磺酸盐悬液充分混合以在有机层中(二氯甲烷)产生伊马替尼游离碱。从NaHCO3水溶液和二氯甲烷形成的乳浊液被过滤除去，产生含伊马替尼游离碱的二氯甲烷有机层和水层。含伊马替尼游离碱的二氯甲烷有机层被从水层中分离出来。有机层在Na2SO4/MgSO4上干燥。为分离伊马替尼游离碱，过滤有机层(二氯甲烷)以除去Na2SO4/MgSO4，随后去除有机层，产生含伊马替尼游离碱的固体。向含伊马替尼游离碱的固体添加甲苯并闪蒸(flashevaporate)3次，随后真空干燥以去除残余的水。获得白色固体伊马替尼游离碱并用于实施例3中。伊马替尼游离碱显示与结构相一致的1H、13CNMR和APCI数据。NMR分配基于DQF-COSY实验。
实施例3
伊马替尼丁酸乙酯的制备
将实施例2中制备的干燥的伊马替尼游离碱在氮气下溶于35mL干DMF中并在冰中冷却。有效搅拌含有伊马替尼的混合物，并一次加入固体氢化钠(矿物油中60％分散体，0.111g，2.78mmol，1.6eq)。通过注射器向含伊马替尼的混合物中缓慢加入3-5mLDMF中的4-溴丁酸乙酯溶液(0.59g，3.0mmol，1.8eq)，使产生伊马替尼丁酸乙酯(2)的反应进行过夜。反应混合物的APCI(+)原位分析显示m/z＝608.3(100％)，494.2(30％)，和722.4(5％)amu，分别对应伊马替尼丁酸乙酯(2)、伊马替尼起始原料、和伊马替尼二丁酸乙酯(2)。
反应混合物使用100mL二氯甲烷稀释，在冰中冷却并使用10mL水冷淬。分离含伊马替尼丁酸乙酯的二氯甲烷层和水层。为增加产量，使用3X50mL二氯甲烷和2X25mL的乙酸乙酯萃取水层。含有马替尼丁酸乙酯衍生物的组合有机组分被去除，而留下伊马替尼衍生物混合物。为分离伊马替尼丁酸乙酯，在100g硅胶上使用5-50％的甲醇/二氯甲烷梯度层析混合物。得到伊马替尼丁酸乙酯(2)的量为0.61g(59％)，TLCRf＝0.36(1∶4∶0.05MeOH∶CHCl3∶HOAc)。APCI(+)m/z＝608.3amu。
实施例4
伊马替尼丁酸乙酯的水解
4-{[4-(4-甲基-哌嗪基-1-甲基)-苯甲酰基]-[4-甲基-3-(4-吡啶基-3-嘧啶基-2-氨基)-苯]-氨基}-丁酸乙酯(2)(1.21g，2.0mol，1eq)被溶于60mLTHF中并在冰中冷却。20mL水中的LiOH·H2O(0.28g，6.7mmol，3.4eq)溶液随搅拌滴加入其中。水解反应在0℃温浴3小时，随后使其升温至室温进行过夜以产生游离酸，伊马替尼丁酸。
在冰中冷却含伊马替尼丁酸的反应混合物之后，滴加入0.5MHCl(aq)以达到pH5-6。去除挥发性溶剂以提供白色固体的含伊马替尼丁酸的粗反应产物。为去除杂质，粗反应产物在水中磨碎，过滤收集并真空干燥，随后在乙醚中磨碎以提供黄色固体伊马替尼丁酸衍生物，化合物3，其量为0.99g，为部分盐酸盐。熔点203-207℃(dec)。TLCRf＝0.36(7∶1∶0.1)CHCl3∶MeOH∶NH4OH。APCI(+)m/z＝580.2amu。1HNMR(dmso-d6，80℃)与结构一致。分析C33H37N7O3·1.65H2O·0.1HCl要求C：64.48；H：6.25；N：15.83；Cl：0.63。发现C：64.65；H：6.64；N：15.99；Cl：0.58。HPLC纯度为100％。
实施例5
磺基-NHS活化的伊马替尼酯
通过与EDC和磺基-NHS的反应衍生伊马替尼丁酸(3)以产生磺基-NHS活化的伊马替尼酯，以最终与蛋白缀合(实施例6a、b、7)。向被搅拌的5mL无水DMSO中加入化合物3(94mg，0.16mmol)，随后加入EDC(94mg，0.49mmol)和磺基-NHS(107mg，0.49mmol)。反应混合物在氮气中室温下搅拌18小时以产生磺基-NHS活化的伊马替尼酯。反应混合物被直接用于实施例6a和6b。
实施例6a
伊马替尼免疫原的制备
通过将300mgKLH溶解于19.6mL磷酸盐缓冲液中(50mM，pH7.5)，并随后在冰上搅拌KLH溶液的同时缓慢加入39.2mLDMSO来制备KLH蛋白溶液，搅拌在室温下再持续30分钟，随后加入实施例5中制备的磺基-NHS活化的伊马替尼衍生物(4)(2.532mL，0.08mmol)。KLH和活化的伊马替尼衍生物(4)的反应混合物在琥珀色玻璃瓶中室温下搅拌18小时产生伊马替尼-KLH缀合物(5)。随后通过在室温下对磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)中66％的DMSO透析来纯化伊马替尼-KLH缀合物。随后DMSO的比例逐步减少：60％、50％、40％、20％、10％和0％。最后的透析在4℃对磷酸盐缓冲液进行。通过紫外-可见光谱识别伊马替尼-KLH缀合物(5)。缀合物被稀释至磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)中2mg/mL的终浓度。
实施例6b
伊马替尼免疫原的制备
如实施例6a制备伊马替尼免疫原，除了其中将伊马替尼-KLH缀合物(5)稀释至磷酸盐缓冲液和DMSO(50％体积)中2mg/mL的终浓度。
实施例7
与衍生物4的伊马替尼-BSA缀合物制备
通过将1000mgBSA溶解于磷酸盐缓冲液中(50mM，pH7.5)至终浓度50mg/mL的终浓度来制备BSA蛋白溶液。在冰上搅拌的同时将40mLDMSO缓慢加入BSA蛋白溶液中。在室温下继续搅拌30分钟，随后加入实施例5中制备的磺基-NHS活化的伊马替尼衍生物(4)(0.437mL，0.014mmol)。加入BSA蛋白溶液的磺基-NHS活化的伊马替尼衍生物(4)的量计算为在伊马替尼衍生物(4)和BSA之间有1∶1的摩尔比率。BSA和活化的伊马替尼衍生物的混合物在琥珀色玻璃瓶中室温下搅拌18小时产生活化的伊马替尼酯(4)和BSA的缀合物。随后通过在室温下对磷酸盐缓冲液(50mM，pH7.5)中66％的DMSO透析来纯化该缀合物。随后DMSO的比例逐步减少：60％、50％、40％、20％、10％和0％。最后的透析在4℃对磷酸盐缓冲液进行。纯化的伊马替尼-BSA缀合物通过UV/VIS光谱识别。
实施例8a
伊马替尼多克隆抗体的制备
两组每组10只雌性BALB小鼠腹腔内注射免疫。一组使用100μg/小鼠的实施例6a中制备的伊马替尼-KLH免疫原(10只小鼠)，而另一组使用100μg/小鼠的实施例6b中制备的在完全弗氏佐剂中乳化的伊马替尼-KLH免疫原(10只小鼠)。在初始注射后四周使用100μg/小鼠的乳化于不完全弗氏佐剂中的相同免疫原加强小鼠一次。加强后20天，通过眼窝取血从每只小鼠获得含多克隆抗体的测试血样。得自这些测试血样的抗血清所含的伊马替尼抗体在实施例9、10a和11中进行评价。
实施例8b
伊马替尼单克隆抗体的制备
使用实施例6b制备的伊马替尼-KLH免疫的实施例8a的小鼠被用于生产单克隆抗体。对单克隆抗体，融合前3天开始，小鼠被腹腔注射400μg(融合前3天)、200μg(融合前2天)、和200μg(融合前1天)实施例6b中制备的PBS/DMSO中的伊马替尼-KLH。从选择的小鼠中分离脾细胞，并按照Coligan，J.E.etal.，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，2.5.1-2.5.8，(1992)，Wiley&Sons，NY的方法使用50％的聚乙二醇1500将其与2X107SP2/0细胞融合。融合的细胞被置于10块96孔板上，在补充了20％FetalCloneI，2％L-谷氨酰胺(100mM)和2％50XHAT的DMEM/F12中。二到三星期后，通过ELISA检测杂交瘤细胞上清中抗伊马替尼抗体的存在(按实施例10b)。给出阳性ELISA结果的孔中的细胞(实施例10b)被扩展到24孔板。ELISA阳性的克隆按照Coligan，J.E.etal.，eds.，CurrentProtocolsinImmunology，2.5.8-2.5.17，(1992)，Wiley&Sons，NY中公开的的方法，通过有限稀释法被亚克隆两次。含得自所选亚克隆的单克隆抗体的杂交瘤细胞培养物上清通过竞争性ELISA(实施例11)来确认伊马替尼结合性。通过如实施例11中描述的间接竞争性微量滴定板检测法来测试这些单克隆抗体的伊马替尼结合性和与主要伊马替尼代谢物，N-去甲基伊马替尼的交叉反应性。
实施例9
使用伊马替尼-BSA缀合物微量滴定板致敏程序
在对蛋白结合优化并且每板含有96个孔的聚苯乙烯微量滴定板(NunCMaxiSorpF8Immunomodules)上进行测定伊马替尼浓度的ELISA方法。通过加入300μL10μg/mL的0.05MpH9.6碳酸钠中的伊马替尼-BSA缀合物来以伊马替尼-BSA缀合物(按实施例7制备)包被每个孔，并在室温温育3小时。孔使用0.05MpH9.6碳酸钠清洗并使用375μL5％的蔗糖，0.2％酪蛋白酸钠溶液在室温下封闭30分钟。在去除包被后溶液之后，板在37℃干燥过夜。
实施例10a
抗体筛选程序-滴定
该程序是为了找出如实施例11置换的要测试的抗体稀释度。使用实施例9中制备的以伊马替尼-BSA致敏的微量滴定板进行筛选单克隆抗体(实施例8a和8b中生产)的ELISA方法。通过将来自测试血样的含伊马替尼多克隆抗体小鼠血清在含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲液中稀释至1∶2000、1∶6000、1∶20000和1∶50000(体积/体积)来进行抗体筛选测定。为评价单克隆抗体，将实施例8b的杂交瘤细胞上清，按实施例10b的程序发现其抗体的存在为阳性，在含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲液中稀释至1∶2、1∶4、1∶16等(体积/体积)。向每个伊马替尼-BSA致敏的孔(实施例9中制备)中加入50μL含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲液，以及50μL稀释的单克隆抗体并在室温下摇动温育10分钟。在该温育期间抗体与孔中被动吸收的伊马替尼缀合物(实施例9)结合。使用0.02MTRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8的溶液清洗板的孔3次以去除任何没有结合的抗体。为检测与孔中伊马替尼-BSA缀合物结合的伊马替尼抗体的量，加入100μL在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中被稀释至预定比活性(约1/3000)的羊抗鼠抗体-HR酶缀合物(JacksonImmunoresearch)，当与底物温育时，在本实施例中是TMB，其能够与小鼠免疫球蛋白特异性结合并产生有色产物。在室温下摇动温育10分钟之后，在这期间羊抗鼠抗体-HR酶缀合物与孔中伊马替尼抗体结合，板再被清洗三次以去除未结合的羊抗鼠抗体-HR酶缀合物。为了在孔中显示出可测量的颜色，清洗后加入100μLTMB(TMB底物，BioFx)，HRP的底物，以在室温下10分钟摇动温育中显示颜色。温育显色后，向每个孔中加入50μL终止溶液(1.5％去离子水中的氟化钠)以终止显色，摇动20秒后再测定650nm的吸光度(MolecularDevicesPlateReader)。一个孔中抗体的量与测得的吸光度成正比，并被表示为得到1.5的吸光度的稀释度(滴度)。通过将测量抗体的抗体稀释度(x轴)对650nm吸光度(y轴)作图并在1.5的吸光度插入滴度来确定滴度。产生1.5吸光度的滴度确定用于实施例11描述的间接竞争性微量滴定板检测的抗体浓度(稀释度)。
实施例10b
抗体筛选程序-单克隆筛选
使用实施例9中描述的伊马替尼-BSA致敏的微量滴定板进行筛选单克隆抗体(实施例8b中生产)的ELISA方法。向每个伊马替尼-BSA致敏的孔(实施例9中制备)中加入50μL含0.1％BSA和0.01％硫柳汞的磷酸盐缓冲液，随后加入50μL单克隆抗体上清液并在室温下摇动温育10分钟。在该温育期间抗体与孔中的伊马替尼缀合物结合。使用0.02MTRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8的溶液清洗板的孔3次以去除任何没有结合的抗体。为检测与孔中伊马替尼-BSA缀合物结合的伊马替尼抗体的量，加入100μL在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中被稀释至约1/3000的羊抗鼠抗体-HR酶缀合物(JacksonImmunoresearch)，当与底物温育时，在本实施例中是TMB，其能够与小鼠免疫球蛋白特异性结合并产生有色产物。在室温下摇动温育10分钟之后，在这期间羊抗鼠抗体-HRP酶缀合物与孔中伊马替尼抗体结合，板再被清洗三次以去除未结合的羊抗鼠抗体-HRP酶缀合物。为了在孔中显示出可测量的颜色，清洗后加入100μLTMB(TMB底物，BioFx)，HR的底物，以在室温下10分钟摇动温育中显示颜色。温育显色后，向每个孔中加入50μL终止溶液(1.5％去离子水中的氟化钠)以终止显色，摇动10秒后在测定650nm的吸光度(MolecularDevicesPlateReader)。一个孔中抗体的量与测得的吸光度成正比。吸光度是背景三倍或更多倍的样品被指定为阳性。如实施例8b描述的，50份有最高吸光度的样品被扩展至24孔板。
实施例11
确定伊马替尼抗体IC50和交叉反应性的间接竞争性微量滴定板免疫检测程序
使用实施例9中描述的伊马替尼-BSA致敏的微量滴定板进行确定IC50值和交叉反应性的ELISA方法。分析物-伊马替尼和N-去甲基伊马替尼在去离子水中被稀释至10到1000000ng/mL的浓度范围。通过将50μL伊马替尼溶液与50μL选自实施例6a的免疫原在实施例8a中生产的多克隆抗体，使用实施例6b的免疫原在实施例8a中生产的多克隆抗体以及实施例8b中产生的单克隆抗体的抗体之一温育，来进行每个测定。通过将每个孔中的抗体浓度稀释至实施例10a中确定的滴度来进行所有测定。在10分钟温育期间(室温，摇动)，存在孔中的伊马替尼-BSA缀合物(实施例9中产生)和溶液中的分析物的抗体结合竞争。该温育之后使用0.02MTRIS，0.9％NaCl，0.5％Tween-80和0.001％硫柳汞，pH7.8清洗板的孔3次以去除任何没有结合的材料。为检测与孔中伊马替尼-BSA缀合物结合(实施例9中产生)的伊马替尼抗体的量，加入100μL在含0.1％BSA、0.05％ANS、0.01％硫柳汞的PBS中被稀释至预定比活性(约1/3000)的羊抗鼠抗体-HR酶缀合物(JacksonImmunoresearch)，当与底物温育时，在本实施例中是TMB，其能够与小鼠免疫球蛋白特异性结合并产生有色产物。在室温下摇动温育10分钟之后，在这期间羊抗鼠抗体-HR酶缀合物与孔中伊马替尼抗体结合，板再被清洗三次以去除未结合的第二缀合物。为了在孔中显示出可测量的颜色，清洗后加入100μLTMB(TMB底物，BioFx)，HR的底物，以在室温下10分钟摇动温育中显示颜色。温育显色后，向每个孔中加入50μL终止溶液(1.5％去离子水中的氟化钠)以终止显色，摇动20秒后在测定650nm的吸光度(MolecularDevicesPlateReader)。一个孔中抗体的量与测得的吸光度成正比，而与样品中伊马替尼的量成反比。通过构建孔中的吸光度对孔中的被分析物浓度作图的剂量-反应曲线来确定伊马替尼和N-去甲基伊马替尼的IC50。含有被分析物的孔中颜色的吸光度与没有被分析物的比较，并产生标准曲线。给出的被分析物的IC50值被定义为具有50％不含被分析物孔的吸光度所需要的被分析物浓度。交叉反应性被计算为伊马替尼甲磺酸盐IC50与去甲基伊马替尼IC50的比率并以百分数表示。当以这种抗体池测定时，N-去甲基伊马替尼相对于伊马替尼的交叉反应性百分数小于或等于7％。伊马替尼多克隆抗体的结果示于下面表I。当使用选择的单克隆抗体测定时，N-去甲基伊马替尼相对于伊马替尼的交叉反应性百分数小于4％。伊马替尼单克隆抗体的结果示于表II。
表I
使用伊马替尼多克隆抗体的竞争性免疫检测的交叉反应性
(实施例8a)
表II
使用伊马替尼单克隆抗体的竞争性免疫检测的交叉反应性
(实施例8b)
从表I和表II看出，依照本发明生产的抗体基本与伊马替尼甲磺酸盐反应，而与代谢物，N-去甲基伊马替尼基本不反应。

Claims (27)

1.用于检测样品中伊马替尼及其药理活性盐的免疫测定法，包括提供如下的混合物：样品、与伊马替尼及其药理活性盐选择性结合并且相对于与伊马替尼及其药理活性盐而言与N-去甲基伊马替尼具有小于15％的交叉反应性的抗体、以及缀合物，使样品中的伊马替尼及其药理活性盐和所述缀合物与所述抗体结合，之后测量所述混合物中与所述抗体结合或未结合的所述缀合物的量，由此能够确定样品中的伊马替尼或其药理活性盐的存在，其中所述缀合物是含聚合物的载体与如下化学式的化合物或其药理活性盐的缀合物，其中所述聚合物具有反应性硫醇基或氨基：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团；而且，
P为从0到1的整数；而且
所述抗体由包含免疫原性载体的免疫原所产生，所述免疫原性载体含有聚合物，其中所述聚合物具有与化学式IV的化合物或其药理活性盐相连的反应性硫醇基或氨基。
2.权利要求1的免疫测定法，其中所述样品是人类样品。
3.权利要求2的免疫测定法，其中抗体或缀合物附着至固体支持物。
4.权利要求3的免疫测定法，其中所述固体支持物是微量滴定板。
5.权利要求2的免疫测定法，其中所述固体支持物是纳米颗粒。
6.一种抗体，其与伊马替尼及其药理活性盐选择性结合，并且相对于伊马替尼及其药理活性盐而言与N-去甲基伊马替尼具有小于15％的交叉反应性，所述抗体源自免疫原性载体的免疫原，所述免疫原性载体含有聚合物，其中所述聚合物具有与如下化学式的化合物或其药理活性盐相缀合的反应性硫醇基或氨基：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数。
7.权利要求6的抗体，其中所述抗体源自小鼠、兔或大鼠。
8.权利要求6的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
9.权利要求8的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
10.如下化学式的化合物或其药理活性盐：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数。
11.权利要求10的化合物，其中Y是含有1到10个碳原子的亚烃基，
其中n和o为从0到6的整数，而m为从1到6的整数。
12.权利要求11的化合物，其中p为1。
13.权利要求12的化合物，其中X为
其中R3为氢或连同其附着的氧原子形成反应性酯，且R4为氧或硫。
14.权利要求13的化合物，其中X为而R3形成反应性酯。
15.包含载体的缀合物，所述载体含有聚合物，其中所述聚合物具有与如下化学式的化合物或其药理活性盐相缀合的反应性硫醇基或氨基：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数。
16.权利要求15的缀合物，其中Y是含有1到10个碳原子的亚烃基，
其中n和o为从0到6的整数，且m为从1到6的整数。
17.权利要求16的缀合物，其中p为1。
18.权利要求17的缀合物，其中X为
其中R3为氢或连同其附着的氧原子形成反应性酯，且R4为氧或硫。
19.包含免疫原性载体的免疫原，所述免疫原性载体含有聚合物，其中所述聚合物具有与如下化学式的化合物或其药理活性盐相缀合的反应性硫醇基或氨基：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数。
20.权利要求19的免疫原，其中Y是含有1到10个碳原子的亚烃基，
其中n和o为从0到6的整数，而m为从1到6的整数。
21.权利要求20的免疫原，其中p为1。
22.权利要求21的免疫原，其中X为
其中R3为氢或连同其附着的氧原子形成反应性酯，且R4为氧或硫。
23.权利要求21的免疫原，其中X为且R3形成反应性酯。
24.权利要求23的免疫原，其中免疫原性聚合物含有一个或多个通过连接的氨基，其中R4为氧或硫。
25.用于确定患者样品中伊马替尼或其药理活性盐的存在的试剂盒，包含单独容器中的试剂，试剂中的一种为含聚合物的载体与如下化学式的化合物或其药理活性盐的缀合物，其中所述聚合物具有反应性硫醇基或氨基：
其中Y为有机间隔基；
X是能够通过所述氨基或硫醇基与所述载体结合的末端官能团，而且；
P为从0到1的整数；
以及单独容器中的第二试剂，其是与伊马替尼及其药理活性盐选择性结合、并且相对于伊马替尼及其药理活性盐而言与N-去甲基伊马替尼具有小于15％交叉反应性的抗体，所述抗体由免疫原性载体产生，所述免疫原性载体含有聚合物，其中所述聚合物具有与化学式IV的化合物及其药理活性盐相连的反应性硫醇基或氨基。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述缀合物在所述第一容器中以预定的量存在。
27.权利要求26的试剂盒，其中所述试剂盒用于确定所述样品中伊马替尼及其药理活性盐的量。
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