JP5031585B2 - 5−フルオロ−ウラシル免疫測定法 - Google Patents
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Description
・器官機能
・遺伝子調節
・病状
・年齢
・薬物間相互作用
・薬物接摂取時間
・投薬の方法
・投薬に関するテクニック
この可変性の結果、異なる個人が同じ薬を等しい量で服用して、結果的に劇的に異なる臨床結果をもたらされることもある(非特許文献2参照)。同じ5−FU投薬の有効性は、個々の薬物クリアランスおよび患者の中の最終の血清薬物濃度に基づいて著しく変わる。治療薬管理によって、臨床医に経口薬の投与および静脈注射用薬の投与の両方で患者の個々の変化を洞察することができるだろう。治療薬管理によって、患者への投薬を個別的に取り扱うことができるかもしれない。また、望まない副作用なしで癌を有効に治療する見込みは、はるかに高いだろう(非特許文献3)。
Diasio et. al. J. Clin. Invest.81:pp47−51,1988,Wei et. al. J. Clin. Invest.98:pp610−615,1996 Hon et. al. Clinical Chemistry 44、pp 388−400,1998 Nieto,Current Drug Metabolism2:pp53−66,2001
の化合物を有する免疫原のポリアミンポリマーの共役である免疫原の使用により、5−FUに特異で、ウラシル、シトシンといった他のピリミジン塩基と同様に、テガフールと実質的に反応しない、又は結合しない抗体を生産することが見出された。
の1位置換5−FU化合物を備えた担体の共役、又は
の化合物、又はそれの混合物である。
からなる配位子部分と共役し、
一般式II−Bの化合物の官能結鎖部分は次に示す一般式からなる。
これらの配位子部分は、共役の担体上で1つ以上の活性部位であってもよい。
この記述の全体にわたって、次の定義の意に解釈される。
免疫測定法を構築する際、5−FUの共役は、本発明の抗体上の結合部位に対して試料中の5−FUと競合するために構築される。本発明の免疫測定法では、本発明の抗体を生産するための免疫原は、一般式III−Aの化合物の3位置換5−FU誘導体である。また、試薬は、一般式III−AまたはIII-Bの1位置換5−FU誘導体である。一般式III−A及びIII−Bの化合物では、リンカースペーサは、この分子の−CH2−(Y)p−X´−部分を構成する。リンカーX´及びスペーサ−CH2−(Y)p−は、共役と免疫原の生成において一般的である。免疫測定法のための共役と免疫原を生成するために利用された従来のスペーサ結鎖基のうちのどれでも、一般式III−A及びIII−Bの化合物で利用することができる。そのような従来のリンカーおよびスペーサは米国特許5,501,987および米国特許5.101,015に開示されている。
である。基
のハロゲン化物とが反応することによって、一般式II−Bの化合物を生成するために結合させることができる。
本発明は、さらに前述の免疫原の使用により生成された5−FUに対するモノクロナール抗体を含む新規の抗体に関する。本発明によれば、本発明に従って生成されたこれらの抗体は、5−FUに選択的に反応し、5−FUの免疫測定を邪魔する化合物を含んでいるテガフールあるいは他のピリミジンに反応しないことが分かった。本発明は5−FUに対する新規の抗体およびモノクロナール抗体に関する。発明の抗血清は、本発明の免疫原を備えた宿主動物を免疫することにより好都合に生成することができる。適切な宿主動物は、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびその他同種のものといったげっ歯動物、あるいはヤギ、羊、馬およびその他同種のものといった高等哺乳動物を含んでいる。初回量、出血および追加免疫注射は、動物中の免疫反応を誘発するために認められた試験計画書(protocols)に従って与えることができる。例えば、好ましい実施例では、マウスは、初回量として100μgの免疫原を腹腔内投与(i.p.)で受け、また後に6か月の期間にわたって2回以上、100μgの免疫原の追加免疫注射を受けた。周期的な出血によって、免疫されたマウスの血液試料は、従来の免疫測定を利用する5−FU結合に対する免疫反応を発生させることが観察された。これらの方法は、望ましい活性を有する抗血清を生成している宿主に関して調べるための便利な方法を提供する。
本発明によれば、一般式II−Aのこれらの化合物の免疫原から生じた前述の共役および抗体は、患者試料中の5−FUの測定試薬として利用することができる。この測定は免疫測定法によって行なわれる。一般式II−Bの化合物から形成された試薬共役が、本発明に従って生じた抗体中の結合部位のために試料中の5−FUと競合するどんな免疫測定法も、患者試料中の5−FUの存在を決定するために使用することができる。5−FUを含んでいるという疑いをかけられた試料中の5−FUの測定を行うための方法は、(a)水性媒質試料、(b)本発明に従って生成された5−FUの抗体、(c)一般式II−A及びII−Bの化合物から形成された共役を、混合することを含む。試料中の5−FU量は、試料と抗体との混合物に既知量で加えられた共役の特異抗体への結合の阻害を測定することにより決定することができる。未知の試料による既知量の共役のそのような結合の阻害の結果は、5−FUの既知の標準溶液を使用して同じ測定で得られた結果と比較される。未知の試料中の5−FUの量を測定する際、試料、一般式II−Bの化合物から形成された共役、および抗体は、任意の順に加えられてもよい。
例において、次の略語は、下記に指し示すように使用される。
THF テトラヒドロフラン
EA エチルアルコール
DCM ジクロロメタン
DMAP ジメチルアミノピリジン
NHS N−ヒドロキシ−コハク酸イミド
EDC 1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミド塩酸塩
TLC 薄層クロマトグラフィ
ANS 8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸
i.p. 腹腔内の
HRP 西洋わさびペルオキシダーゼ
TMB 3,3´,5,5´―テトラメチルベンチジン
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩
BSA ウシ血清アルブミン
BTG ウシチログロブリン
PBS リン酸塩緩衝生理的食塩水
di 脱イオン水
例において、図式1、図式2、図式3a、図式3b及び図式4は、例の番号に従って生成され言及された特異化合物を下記に示す。図式は以下の通りである。
図式1、1位置換5−FU活性化エステル[4]の生成
DMF(100ml)中にフルオロウラシル(50g)[1]を溶解した溶液に、トリエチルアミン(78g)を30℃下で攪拌しながら加えた。その後、エチル−4−ブロモ酪酸塩(88.5g)を滴下方法で加えた。添加が終わった後、生じた反応混合物を室温で48時間撹拌した。反応混合物をろ過し、溶剤を減圧下で取り除いた。残留物を酢酸エチル中で結晶化し、26g(29%)の化合物[2]を得た。
図式2、1位置換5−FU酸[5]の生成
アセトニトリル(300mL)に化合物[4](3.2g)を溶解した溶液に水(900mL)を加え、1.2当量のp−メチルアミノ安息香酸を加えた。得られる反応混合物を20時間室温で攪拌した。アセトニトリルを除去するために減圧下で混合物を濃縮した。沈澱が生じ、濾過によって収集した。その後、アセトン中で2.8gの加工していない生成物を結晶化した。加工していない生成物をシリカゲルカラム(1〜2滴の酢酸を加えたクロロホルム:メタノールが15:1の溶液で抽出)で精製し、2gの化合物[5]を得た。
図式3a、3位置換5−FU酸誘導体[12]、[14]の生成
80mLのPOCl3と15.6gの5−FU[1]の混合物を、40℃で凝縮器、温度計および滴下漏斗を装備した三つ口フラスコの中で撹拌した。N,N−ジメチルアニリン25mLを滴下方法で加え、得られる混合物を還流するため3時間加熱した。過剰POCl3を減圧下で蒸発させた。混合物を室温まで冷やし、75gの砕いた氷の中へ注いだ。その後、クロロホルム(50mLで3回)で抽出した。化合した抽出物を水で洗浄し、MgSO4で乾燥し、濃縮して約50%の収率で黄色っぽい固形の化合物[7]を得た。
図式3b、3位置換5−FU酸誘導体[6]の生成
ベンゼン20mL、水20mLおよび0.5gのテトラブチルアンモウニウム臭化物の混合物を55℃に加熱した後、溶液A(1規定水酸化ナトリウム水溶液20mL中に2gの[9]を混合したもの)及び溶液B(20mLのベンゼン中に2.05gの4−ブロモ酪酸エチルを混合したもの)を交互に混合物にくわえた。反応混合物のpHはpH8−10に調整した。添加終了後、反応混合物を2時間半還流した。有機相を分離し、5%水酸化ナトリウムと水で洗浄し、MgSO4で乾燥した。有機溶媒は減圧下で除去した。残留物をシリカゲルカラムで精製し(エーテル:酢酸エチルが10:1のもので溶出)、化合物[15]を38%の収率で油状の生成物として得た。
対応する酸[3,5,12,14,6]からNHS活性エステルを生成する一般的な方法
乾燥ジクロロメタン(CH2Cl2)20mL中にNHS(1.39mol)を攪拌して溶解した溶液に、酸(0.695mmol)[3,5,12,14,または6]とEDC(2.085mmol)を加えた。溶液を窒素雰囲気下の室温で18時間攪拌した。3mLの塩酸(0.3N)を加えることによって反応を止め、更に5分間攪拌した。有機相を分離し、(Na2SO4で)乾燥し、濾過し、(真空下で)蒸発させて、白い固形物を得た。
1位置換5−FU KLH免疫原の生成
50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にKLH(31.2mg/mL)を混合したもの5.86mLに、例1で生成した化合物[4](DMSO中12.8mg/mL)を0.692mL滴下法で加え、pHを8.5に調整した。混合物を室温で18時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
3位置換5−FU BTG免疫原の生成
50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にBTG(16.9mg/mL)を混合したもの11.4mLに、DMSOを1.2mL滴下法で加え、pHは7.5であった。ここに、例3aで生成された化合物[13](DMSO中に52.5mg/mL)を0.277mL滴下法で加え、pHは再び7.5であった。混合物を室温で18時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
3位置換5−FU KLH免疫原の生成
50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にKLH(24.9mg/mL)を混合したもの8.3mLに、DMSOを0.922mL滴下法で加え、pHは7.5であった。ここに、例3aで生成された化合物[13](DMSO中に52.6mg/mL)を0.277mL滴下法で加え、pHは再び7.5であった。混合物を室温で18時間撹拌した。その後、この免疫原の共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
誘導体12を伴う3位置換5−FU BSA共役(10:1比率)の生成
50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にBSA(50mg/mL)を溶解した溶液1mLに、DMSOを0.111mL滴下法で加えた。例4(52.5mg/mLのDMSO溶液0.045mL)のように生成した化合物[12]の活性化N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを滴下法で加えた。混合物を室温で夜通し攪拌し、3位置換5−FUとBSAの共役を生成した。その後、この共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
誘導体6を伴う3位置換5−FU BSA共役(1:1比率)の生成
50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にBSA(50mg/mL)を溶解した溶液20.0mLに、DMSOを2.222mL滴下法で加えた。pHは7.5であった。ここに、例4で生成した化合物[6](DMSO中に20.0mg/mL)の活性化N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを0.272mL滴下法で加えた。pHは再び7.5であった。混合物を室温で18時間攪拌した。その後、この免疫原共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
誘導体5を伴う1位置換5−FU BSA共役(20:1比率)の生成
氷水槽中の、50mMのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)にBSA(50mg/mL)を溶解した溶液14mLに、DMSOを14mL滴下法で加えた。例4で生成した化合物[5]の活性化N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(57mg/mL DMSO溶液1.65mL)を滴下法で加えた。混合物を室温で夜通し攪拌し、1位置換5−FUとBSAの共役を生成した。その後、この共役を透析によって精製し、以前に記載した生成物(Wu et. al., Bioconj. Chem., 8:pp385-390, 1997, Li et al., Bioconj. Chem., 8:pp896-905, 1997, Salamone et al., J. Forensic Sci. pp821-826, 1998)と一致した特徴をなした。
5−FU抗体の生成
10匹の雌のBALB/cのマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された、例5で生成した5−FU−KLH又は例6aで生成した5−FU−BTGで、一匹につき100μg、腹腔内投与(i.p.)で免疫した。マウスは、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき100μgで最初の注射の4週間後に追加免疫した。追加免疫テストの10日後、各マウスからの出血を、眼窩出血によって得た。これらのテスト出血からの抗血清は、例12a、13及び14で評価された5−FU抗体を含んでいた。モノクロナール抗体に対しては、10匹の雌のBALB/cマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された例6bで生成した3位置換5−FU−KLHを、一匹につき100μg、腹腔内投与(i.p.)で免疫した。マウスは、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき100μgで最初の注射の4週間後に追加免疫した。追加免疫テストの10日後、各マウスからの出血を眼窩出血によって得、これらを例12a及び15のように検査した。融合(第0日)前の4日のスタートを切るモノクロナール抗体を生成するために、マウスに、連続3日間、PBS中の3位置換5−FU KLH免疫原を、400μg(第3日)、200μg(第2日)、200μg(第1日)で、腹腔内投与(i.p.)で注射した。脾臓細胞を選択したマウスから分離し、Curent Protocols in Immunology, 2.5.1-2.5.8, (1992), Wiley&Sons, NY. Coligan,J.E.らの方法による50%ポリエチレングリコール1500を備えた2×107SP2/O細胞と融合した。融合細胞を、10個の、20%Fetal Clone I、2%L−グルタミン(100mM)、2%50X HATが加えられたDMEM/F12の96ウェル形式プレートで培養した。2週間後、ハイブリドーマ上澄みをELISA(例12b)によって抗-5-FUの存在のために測定した。陽性ウェルを拡大し、再び同じ方法によって測定した。陽性クローンが、競合的ELISA(例12a及び15)によって結合する5−FUに対して確認された。ELISAによって陽性クローンは、Coligan、J.E.et al., Current Protocols in Immunology, 2.5.8-2.5.17,(1992),Wiley & Sons, NYで開示されている限界希釈法によって、一、二度サブクローン化された。
5−FU誘導体5―BSA共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
5−FU濃度を測定するELISA法を、タンパク質結合及びプレートにつき96ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp C8又はF8 Immunomodules)で行った。pH9.6の0.05M重炭酸ナトリウム中に10μg/mLで5−FU―BSA共役(例8のように生成)を混合したもの300μLを加え、室温で3時間保温することによって、各ウェルを5−FU―BSA共役でコーティングした。ウェルをpH9.6の0.05M重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後5%スクロース400μL、0.2%カゼインナトリウム溶液で室温で30分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを37℃で夜通し乾燥した。
5−FU誘導体12―BSA共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
5−FU濃度を測定するELISA法を、タンパク質結合及びプレートにつき96ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp C8又はF8 Immunomodules)で行った。各ウェルを、pH9.6の0.05M重炭酸ナトリウム中に10μg/mLで5−FU―BSA共役(例7aのように生成)を混合したもの300μLを加え、室温で3時間保温することによって、5−FU―BSA共役でコーティングした。ウェルをpH9.6の0.05M重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後5%スクロース400μL、0.2%カゼインナトリウム溶液で室温で30分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを37℃で夜通し乾燥した。
5−FU誘導体6―BSA共役を伴うマイクロタイタープレート感作手順
5−FU濃度を測定するELISA法を、タンパク質結合及びプレートにつき96ウェルを含むのに最適化されたポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp C8又はF8 Immunomodules)で行った。各ウェルを、pH9.6の0.05M重炭酸ナトリウム中に10μg/mLで5−FU―BSA共役(例7bのように生成)を混合したもの300μLを加え、室温で3時間保温することによって、5−FU―BSA共役でコーティングした。ウェルをpH9.6の0.05M重炭酸ナトリウムで洗浄し、その後5%スクロース375μL、0.2%カゼインナトリウム溶液で室温で30分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを37℃で夜通し乾燥した。
抗体選別手順−滴定量
5−FU抗体(例9で生成)を選別するためのELISA法を、例7a、7b及び8で記載されるような5−FU―BSAで感作されたマイクロタイタープレートで行なった。抗体選別検査を、5−FU抗体を含む抗血清を、0.1%BSA及び0.01%チメロサールを含むリン酸緩衝生理食塩水で1:100、1:1000、1:10,000及び1:100,000に希釈することによって行った。感作された5−FU―BSAウェル(例11a,11b及び10で生成)のそれぞれのウェルに、希釈抗体100μLを加え、振動させながら室温で10分間培養した。この培養中、抗体はウェル内で5−FU共役に結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを、3回、0.02Mのトリス、0.9%塩化ナトリウム、0.5%Tween−80及び0.001%チメロサール、pH7.8で、洗浄した。ウェル内で5−FU―BSA共役に結合する5−FU抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサールを伴うPBSに1/2000で希釈されたヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役(ジャクソン イムノリサーチ)100μLを各ウェルに加えた。振動させながら室温で10分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役がウェル内で5−FU抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役を除去するためにプレートを再び3回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後TMB(TMB Liquid Substrate, Sigma又はBioFx、HRP用培養基)100μLを加え、室温で振動させながら10分培養する間に適度な色をつけた。着色のための培養に続いて、停止液(1.5%フッ化ナトリウムの脱イオン水)50μLを着色を停止するために各ウェルに加え、10秒間の振動後、650nmの吸光度を測定した(モレキュラーデバイスプレートリーダ)。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、1.5の吸光度となる希釈(滴定量)として表わされる。滴定量は、測定された抗体の抗体希釈(x軸)対650nmでの吸光度(y軸)をログで図示し、1.5の吸光度での滴定量を推定することによって測定される。滴定量は、例13、14及び15に記載された間接競合マイクロタイタープレート測定で使用された抗体の濃度(希釈)を決定した。
抗体選別手順―モノクロナール選別
5−FUモノクロナール抗体(例9で生成)を選別するELISA法を、例7bで記載した5−FU―BSAで感作されたマイクロタイタープレートで行った。5−FU―BSA感作ウェル(例11bで生成)の各ウェルに、0.1%BSA及び0.01%チメロサールを含む50μLリン酸緩衝生理食塩水と、そして次にモノクロナール培養上澄み50μLを加え、10分間室温で振動させながら培養した。この培養の間、抗体はウェル内で5−FU―共役に結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを3回、0.02Mトリス、0.9%塩化ナトリウム、0.5%Tween−80及び0.001%チメロサール、pH7.8で、洗浄した。ウェル内で5−FU―BSA共役に結合する5−FU抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサールを伴うPBS中に予め決められた比活性に希釈(約1/2000)されたヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役(ジャクソン イムノリサーチ)100μLを各ウェルに加えた。振動させながら室温で10分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役がウェル内で5−FU抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―HRP酵素共役を除去するためにプレートを再び3回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後TMB(TMB Liquid Substrate, Sigma又はBioFx、HRP用培養基)100μLを加え、室温で振動させながら10分培養する間に着色した。着色のための培養に続いて、停止液(1.5%フッ化ナトリウムの脱イオン水)50μLを着色を停止するために、各ウェルに加え、10秒間の振動後、650nmの吸光度を測定した(モレキュラーデバイスプレートリーダ)。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例した。2倍のバックグラウンドよりも大きい吸光度を有する試料を陽性とした。
5−FU誘導体4共役の抗体におけるIC50及び交差反応を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
5−FU濃度を測定するためのELISA法を、例7aに記載する5−FU―BSAで感作したマイクロタイタープレートで行った。5−FU、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールは、0.01〜10,000ng/mLの濃度範囲の間でPBS中に10倍希釈された。測定は、例12aで測定された滴定量に希釈された50μLの抗体(例5の免疫原を用いて例9で生産)で測定するために、50μLの分析物を培養することによって行った。10分間の培養(振動を伴うローテーター(R.T.))の間、ウェル内及び溶液中の分析物に5−FU共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、0.02Mトリス、0.9%塩化ナトリウム、0.5%Tween−80及び0.001%チメロサール、pH7.8で、3回洗浄した。ウェル内の5−FU―BSA共役に結合した5−FU抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサールを伴うPBS中に1/2000に希釈されたヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役(ジャクソン イムノリサーチ)100μLを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で10分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役がウェル内の5−FU抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び3回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、TMB(TMB Liquid Substrate, Sigma又はBioFx、HRP用培養基)を100μL加え、室温で振動させながら10分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液(1.5%フッ化ナトリウムの脱イオン水)50μLを、着色を停止するために加え、10秒間の振動後、650nmでの吸光度を測定した(モレキュラーデバイスプレートリーダ)。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の5−FU量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。
与えられた分析物に対するIC50値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の50%を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、5−FUに対するIC50とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するIC50との比率で、パーセント表示で計算した。例5の免疫原で例9のように生成した抗体で測定するとき、ウラシル、チミンおよびシトシンに対する5−FUに関連するパーセント表示で表わした交差反応性は7%以下で、テガフールに対しては200%であった。結果を表1に示す。
5−FU誘導体13共役抗体におけるIC50及び交差反応性を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
5−FU濃度測定のためのELISA法を、例8で記載される5−FU―BSAで感作したマイクロタイタープレートで行った。5−FU、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールを、0.01〜10,000ng/mLの濃度範囲の間でPBS中に10倍希釈した。測定は、例12aで測定された滴定量に希釈された50μLの抗体(例9で生成)で測定するために、50μLの分析物を培養することによって行った。10分間の培養(振動を伴うローテーター(R.T.))の間、ウェル内及び溶液中の分析物に5−FU共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、0.02Mトリス、0.9%塩化ナトリウム、0.5%Tween−80及び0.001%チメロサール、pH7.8で、3回洗浄した。ウェル内の5−FU―BSA共役に結合した5−FU抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサールを伴うPBS中に1/2000で希釈されたヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役(ジャクソン イムノリサーチ)100μLを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で10分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役がウェル内の5−FU抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び3回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、TMB(TMB Liquid Substrate, Sigma又はBioFx、HRP用培養基)を100μL加え、室温で振動させながら10分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液(1.5%フッ化ナトリウムの脱イオン水)50μLを、着色を停止するために加え、10秒間の振動後、650nmでの吸光度を測定した(モレキュラーデバイスプレートリーダ)。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の5−FU量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。与えられた分析物に対するIC50値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の50%を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、5−FUに対するIC50とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するIC50との比率で、パーセント表示で計算した。例6aの免疫原を用いて例9のように生成した抗体で測定するとき、ウラシルに対する5−FUに関連するパーセントで表わした交差反応性は8%未満で、シトシンに対しては0.03%未満、テガフールに対しては1%未満、チミンに対しては約12%であった。結果を表1に示す。
5−FU誘導体13共役抗体におけるIC50及び交差反応性を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
5−FU濃度測定のためのELISA法を、例7bで記載される5−FU―BSAで感作したマイクロタイタープレートで行った。5−FU、ウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールを、試料によって0.1〜1,000,000ng/mLの濃度範囲の間でPBS中に10倍希釈した。測定は、例12aで測定された滴定量に希釈された50μLの抗体(例9で生成)で測定するために、50μLの分析物を培養することによって行った。10分間の培養(振動を伴うローテーター(R.T.))の間、ウェル内及び溶液中の分析物に5−FU共役に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、0.02Mトリス、0.9%塩化ナトリウム、0.5%Tween−80及び0.001%チメロサール、pH7.8で、3回洗浄した。ウェル内の5−FU―BSA共役に結合した5−FU抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、0.1%BSA、0.05%ANS、0.01%チメロサールを伴うPBS中に、予め決められた比活性(約1/2000)に希釈されたヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役(ジャクソン イムノリサーチ)100μLを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で10分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−HRP酵素共役がウェル内の5−FU抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び3回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、TMB(TMB Liquid Substrate, Sigma又はBioFx、HRP用培養基)を100μL加え、室温で振動させながら10分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液(1.5%フッ化ナトリウムの脱イオン水)を50μL、着色を停止するために加え、10秒間の振動後、650nmにおける吸光度を測定した(モレキュラーデバイスプレートリーダ)。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中の5−FU量に逆比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。与えられた分析物に対するIC50値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の50%を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、5−FUに対するIC50とウラシル、チミン、シトシンおよびテガフールに対するIC50との比率で、パーセント表示で計算した。例6bの免疫原を用いて例9のように生成したモノクロナール抗体で測定するとき、ウラシルに対する5−FUに関連するパーセント表示の交差反応性は8%未満で、シトシンに対しては0.01%未満、テガフールに対しては約1%、チミンに対しては4%未満であった。結果を表2に示す。
Claims (23)
- a)試料と、
b)5−フルオロ−ウラシルに選択的に反応する抗体であって、前記抗体の前記5−フルオロ−ウラシルへの結合反応について交差反応を生じるウラシル、シトシン及びテガフールに対して12%以下の交差反応率を有する抗体と、
c)一般式
の化合物と担体の共役、又は、
一般式
の化合物と担体の共役、又は、
前記一般式II−Aの化合物と担体の共役と、前記一般式II−Bの化合物と担体の共役の混合体、
の混合物を用意することを含む試料中の5−フルオロ−ウラシルを検出するための免疫測定法であって、
試料中の5−フルオロ−ウラシル及び前記抗体に結合する前記共役を生じさせ、その後、試料中の5−フルオロ−ウラシルの存在を測定可能とすることによって前記抗体に結合又は未結合の前記混合物中の前記共役量を測定することを特徴とする免疫測定法。 - 請求項1記載の免疫測定法であって、一般式II−Aの化合物及び/又は一般式II−Bの化合物中のpは0であることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項1記載の免疫測定方法であって、一般式II−Aの化合物及び/又は一般式II−Bの化合物中のpは1であることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項7記載の免疫測定法であって、一般式II−Aの化合物及び/又は一般式II−Bの化合物中の前記形成されるエステルは低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルであることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項1〜8いずれか一項に記載の免疫測定法であって、前記試料はヒトの試料であることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項1〜10いずれか一項に記載の免疫測定法であって、前記抗体は固形支持体に付着していることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項11記載の免疫測定法であって、前記固形支持体はマイクロタイタープレートであることを特徴とする免疫測定法。
- 請求項11記載の免疫測定法であって、前記固形支持体は微小粒子であることを特徴とする免疫測定法。
- 選択的に5−フルオローウラシルに結合する抗体であって、前記抗体の前記5−フルオロ−ウラシルへの結合反応について交差反応を生じるウラシル、シトシン及びテガフールに対して12%以下の交差反応率を有することを特徴とする抗体。
- 請求項14記載の抗体であって、前記抗体はモノクロナール抗体であることを特徴とする抗体。
- 請求項14又は請求項15記載の抗体であって、前記抗体はマウス、ウサギ又はラット由来のものであることを特徴とする抗体。
- 分離した容器に試薬を含み、患者試料中の5−フルオローウラシルの存在を検出するキットであって、
試薬の1つは、一般式
の化合物と担体の共役、又は、
一般式
の化合物と担体の共役、又は、
前記一般式II−Aの化合物と担体の共役と、前記一般式II−Bの化合物と担体の共役の混合体であり、
第2の容器は、5−フルオロ−ウラシルに選択的に反応する抗体であって、前記抗体の前記5−フルオロ−ウラシルへの結合反応について交差反応を生じるウラシル、シトシン及びテガフールに対して12%以下の交差反応率を有する抗体を含むことを特徴とするキット。 - 請求項20記載のキットであって、前記共役は第1の容器に予め決められた量存在することを特徴とするキット。
- 請求項20又は請求項21記載のキットであって、前記キットは前記試料中の5−フルオロ−ウラシルの量を測定するのに用いられることを特徴とするキット。
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