JP2013522594A - レナリドマイド及びサリドマイドイムノアッセイ - Google Patents
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Abstract
Description
○年齢
○体重
○臓器機能
○薬剤−薬剤相互作用
○遺伝的調節
○コンプライアンス
[式中、Bは、−C(=O)−CH2−、−C(=O)−NH−CH2−、−C(=O)−O−CH2−又は−CH2−であり、
Yは、有機スペーサー基であり、
pは、0から1までの整数であり、
Xは、前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である]
とのコンジュゲートである免疫原を使用することによって、レナリドマイド並びにレナリドマイドとサリドマイドとの混合物に特異的であって、サリドマイド及びレナリドマイドの双方の薬学的に不活性な代謝産物とは反応も結合もしない抗体が産生されることが見出されている。
[式中、B、Y及びPは、上記の通りであり、X2は、前記担体に結合することができる末端官能基である]
とのコンジュゲートである。
[式中、X’は、−CH2−又は官能リンカー基であり、
Y、p及びBは、上記の通りである]。
本明細書の全体にわたり、以下の定義を理解しておくべきである:
イムノアッセイの構築において、式IVの化合物のコンジュゲートは、試料中でその抗体上の結合部位について式I又は式IIの化合物と競合するように構築される。本発明のイムノアッセイにおいて、試薬は、担体と式IVの化合物とのコンジュゲートである。式IVの化合物において、リンカースペーサーは、この分子の「−B−(Y)p−X’−」部分を構成する。このリンカーX’及びスペーサー「−B−(Y)p−」は、コンジュゲート及び免疫原を調製する際の従来型である。イムノアッセイ用のコンジュゲート及び免疫原を調製するのに利用される従来のスペーサー−リンカー基のうちの任意のものを、式IVの化合物において利用することができる。こうした従来のリンカー及びスペーサーは、米国特許第5,501,987号及び米国特許第5,101,015号に開示されている。
[式中、m及びoは、0から6までの整数であり、nは、1から6までの整数であり、アルキレンがあれば特に好ましいスペーサー基となる]
等の基である。これらの式において、mは0であり、nは好ましくは1から6までの整数、最も好ましくは1又は2であり、oは好ましくは0又は1である。
[式中、R3は、水素であるか、又は結合した酸素原子と共に反応性エステルを形成しており、R4は、酸素又は硫黄である]。
基は、イソシアネート又はイソチオシアネートであってもよい。OR3によって形成される活性エステルとしては、例えばN−ヒドロキシスクシンアミド、1−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びp−ニトロフェニルエステルのような、イミドエステル等が挙げられる。しかし、アミン基と反応可能なあらゆる活性エステルを使用することができる。
である、式IVのハプテンのコンジュゲート又は免疫原を生成する。
ハロCH2−(Y)p−X VII
[式中、Y、p及びXは、上記の通りである]
と反応させることによって生成され得る。
[式中、Y、p及びXは、上記の通りである]
と縮合させることによって生成され得る。
本発明は、新規な抗体、特に、上述の免疫原を利用することによって産生することができる、式Iの化合物及び式IIの化合物並びにそれらの混合物に対するモノクローナル抗体にも関する。本発明に従って作製されるこれらの抗体は、式Iの化合物及び式IIの化合物並びにこれらの混合物と選択的に反応性であることが見出されている。これらの抗体は、式Iの化合物及び式IIの化合物のいずれについてのイムノアッセイとも干渉するはずである、式Iの化合物及び式IIの化合物の薬学的に不活性でない代謝産物とは反応しない。これらの不活性な代謝産物とは反応しない本発明の抗体の能力により、これらの抗体は、式Iの化合物又は式IIの化合物のいずれかについてのイムノアッセイを行う際に特に有用とされる。
本発明によれば、該コンジュゲート及び式IIIの化合物の免疫原から産生される該抗体は、患者の試料中の式I及び式IIの化合物の決定のための試薬として利用することができる。この決定は、イムノアッセイによって行われる。患者の試料中の式I又は式IIの化合物の存在を決定するために、式IIIの化合物から形成される試薬コンジュゲートが、本発明に従って作製された抗体上の結合部位について、試料中の式I又は式IIの化合物と競合するあらゆるイムノアッセイを利用することができる。レナリドマイド又はサリドマイドを含有すると考えられる試料において式I及び式IIの化合物についてのこうしたアッセイを行う方法には、(a)水性媒体試料、(b)本発明に従って作製された、式I及び式IIの化合物に対する抗体、及び(c)式IIIの化合物から形成される該コンジュゲートを組み合わせることが含まれる。試料中の式I又は式IIの化合物は、該試料と抗体との混合物に添加された既知量のコンジュゲートの特異的抗体に対する結合の阻害を測定することによって決定することができる。既知量のコンジュゲートのこうした結合の、未知の試料による阻害の結果を、同様のアッセイにおいて式I又は式IIの化合物の既知の標準溶液を利用することによって得られる結果と比較する。未知の試料中の式I又は式IIの化合物の量を決定する際には、該試料、式IIIの化合物から形成される該コンジュゲート、及び該抗体を、任意の順序で添加することができる。
HATU O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート
DIPEA N−N’−ジイソプロピルエチルアミン
DMF ジメチルホルムアミド
TFA トリフルオロ酢酸
CH2Cl2 ジクロロメタン
DMSO ジメチルスルホキシド
NHS N−ヒドロキシスクシンイミド
s−NHS スルホ−N−ヒドロキシスクシンイミド
EDC 1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エチルカルボジイミドヒドロクロリド
KLH キーホールリンペットヘモシアニン
BSA ウシ血清アルブミン
PBS リン酸緩衝生理食塩水
NaCl 塩化ナトリウム
HRP ホースラディッシュペルオキシダーゼ
ANS 8−アニリノ−1−ナフタレンスルホン酸
TMB 3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン
TRIS トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンヒドロクロリド
diH2O 脱イオン水
リン酸緩衝液の組成には、
15.4mM 二塩基性リン酸ナトリウム(Na2HPO4)
4.6mM 一塩基性リン酸ナトリウム(NaH2PO4)
pH=7.2±0.10
を含有する水溶液がある。
レナリドマイド誘導体のカルバモイルペンタント(pentantoic)酸誘導体[3]の調製(スキーム1)
レナリドマイド[1](1.0g、3.86mmol)及びグルタル酸無水物[2](0.48g、4.25mmol)の無水トルエン中の混合物を窒素下で3.5時間加熱還流した。別のグルタル酸無水物[2](0.18g、1.53mmol)を添加し、この混合物をさらに2時間加熱して[3]を生成させた。この混合物を0℃まで冷却し、[3]を沈澱させた。この沈澱した固体を濾過し、CH2Cl2で洗浄して1.55gの粗化合物[3]を得た。この粗化合物をエタノール(20mL)/H2O(1mL)から再結晶化させて、純粋な[3](1.30g、90%)を白色固体として得た。
レナリドマイド誘導体のカルバモイル−ブチリルアミノ−安息香酸メチル誘導体[7]の調製(スキーム2)
例1において生成した化合物[3](800mg、2.14mmol)を窒素下で無水DMF(20mL)中に溶解して、これに、ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)(1.27mL、7.27mmol)及びアミン[10](700mg、2.35mmol)を添加し、その後、HATU(1.88g、4.93mmol)を添加した。この反応混合物を25℃で24時間撹拌して、[6]を生成させた。フラスコの内容物を酢酸エチルで希釈した。その有機相(酢酸エチル)を、1Mの塩酸、飽和炭酸水素ナトリウム及び水で洗浄した。次いで、この酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、これを濾過して取り除いた。酢酸エチル溶媒の除去によって粗生成物[6]が得られ、これを100%のEtOAc及び1〜2%のMeOH/EtOAcを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純生成物[6](680mg、57%)を白色固体として得た。
NHS/s−NHSで活性化された薬剤誘導体を、対応する酸[3]及び[7]から調製する一般的な方法
レナリドマイド酸誘導体[3]をEDC及びNHSで活性化して、タンパク質に対する最終的な結合(例4及び5a)のための、NHSで活性化されたレナリドマイドのエステル[4]を作製した。レナリドマイド酸誘導体[7]をEDC及びs−NHSで活性化して、最終的にタンパク質に結合させるための(例5b)、s−NHSで活性化されたレナリドマイドのエステル[8]を作製した。
NHSで活性化されたレナリドマイドカルバモイルペンタン酸誘導体[4]の調製
レナリドマイド誘導体[3]、例1、スキーム1、(67.62mg)を、7mLのDMSO中に溶解し、これに、NHS(59.60mg)及びEDC(93.00mg)を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で20時間撹拌して、NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体のエステル[4]を作製した。この反応混合物を、例4及び5aにおいて直接使用した。
s−NHSで活性化されたエステルレナリドマイドカルバモイル−ブチリルアミノ−メチル−安息香酸誘導体[8]の調製
レナリドマイド誘導体[7]、例2、スキーム2(16.3mg)を、1.6mLのDMSO中に溶解し、これに、s−NHS(25.3mg)及びEDC(18.1mg)を添加した。この反応混合物を、窒素雰囲気下、周囲温度で20時間撹拌して、s−NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体のエステル[8]を作製した。この反応混合物を、例5bにおいて直接使用した。
活性化ハプテン[4]を有するKLH免疫原の調製
300mgのKLHを15mLのリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中に溶解することによってKLHのタンパク質溶液を調製し、その後、1.5mLのDMSO及び例3aにおいて調製した、NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体[4]を3.50mL添加した。KLHと、活性化されたレナリドマイド誘導体[4]とのこの反応混合物を、室温で20時間撹拌させてレナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]を作製した。次いで、このレナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]を、リン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中の10%DMSOに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]を、室温でリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対して透析した。最後の透析は、4℃でリン酸緩衝液に対して行った。このレナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]を、紫外−可視分光法(UV/VIS)によって特徴付けした。このコンジュゲートを希釈して、リン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中2mg/mLの最終濃度にした。
活性化ハプテン[4]を有するBSAコンジュゲートの調製
1gのBSAをリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中に溶解して50mg/mLの最終濃度にすることによってBSAのタンパク質溶液を調製した。このBSAのタンパク質溶液に、氷上で撹拌しながらゆっくりとDMSO(3.3mL)を添加し、その後、例3aにおいて調製した、NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体[4]を0.60mL添加した。BSAのタンパク質溶液に添加する、NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体[4]の量は、レナリドマイド[4]の誘導体とBSAとの間で1:1のモル比で算出した。BSAと、活性化されたレナリドマイド誘導体[4]とのこの混合物を、室温で18時間撹拌させて、活性化されたレナリドマイドエステル[4]とBSAとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中の10%DMSOに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−BSAコンジュゲート[5]を、室温でリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対して透析した。最後の透析は、4℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したレナリドマイド−BSAコンジュゲート[5]を、UV/VIS分光法によって特徴付けした。
活性化されたハプテン[8]を有するBSAコンジュゲートの調製
0.5gのBSAをリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中に溶解して50mg/mLの最終濃度にすることによってBSAのタンパク質溶液を調製した。このBSAのタンパク質溶液に、例3bにおいて調製した、s−NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体[8]を、氷上で撹拌しながらゆっくりと添加した。BSAのタンパク質溶液に添加する、s−NHSで活性化されたレナリドマイド誘導体[8]の量は、レナリドマイドの誘導体[8]とBSAとの間で1:1のモル比で算出した。BSAと、活性化されたレナリドマイド誘導体[8]とのこの混合物を、室温で18時間撹拌させて、活性化されたレナリドマイドエステル[8]とBSAとのコンジュゲートを作製した。次いで、このコンジュゲートを、リン酸緩衝液(50mM、pH7.5)中の10%DMSOに対する透析によって室温で精製した。その後、レナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]を、室温でリン酸緩衝液(50mM、pH7.5)に対して透析した。最後の透析は、4℃でリン酸緩衝液に対して行った。精製したレナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]を、UV/VIS分光法によって特徴付けした。
レナリドマイド[3]に対するポリクローナル抗体の調製
10匹の雌のBALB/cマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳化させた、例4において調製したような、100μg/マウスのレナリドマイド−KLH免疫原[5]で腹腔内に免疫化した。これらのマウスに、初回注射の4週間後に、不完全フロイントアジュバント中に乳化させた100μg/マウスの同一の免疫原で追加免疫を1回行った。追加免疫の20日後に、ポリクローナル抗体を含有する、各マウスからの試験採血を眼窩出血によって得た。レナリドマイド抗体を含有する、これらの試験採血からの抗血清を、例8及び9において評価した。
レナリドマイド[3]に対するモノクローナル抗体の調製
例4において調製したレナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]で免疫化した例6aからのマウスを、モノクローナル抗体の産生に使用した。モノクローナル抗体の場合は、融合の3日前から始めて、例4において調製した、PBS中の400μg(融合の3日前)、200μg(融合の2日前)、及び200μg(融合の1日前)のレナリドマイド−KLHコンジュゲート[5]を該マウスに腹腔内注射した。脾細胞を、選択したマウスから単離して、Coligan,J.E.et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,2.5.1−2.5.8,(1992),Wiley & Sons,NYの方法に従って、50%のポリエチレングリコール1500を用いて2×107のSP2/0細胞で融合させた。この融合細胞を、10枚の96ウェルプレート上の、20%のFetalClone I、2%のL−グルタミン(100mM)及び2%の50XHATを補ったDMEM/F12中に播種した。2週間から3週間後に、このハイブリドーマ上清を、(例8bにおけるような)ELISAによって抗レナリドマイド抗体の存在について試験した。陽性のELISA結果が得られたウェルからの細胞を、24ウェルプレートに展開した。これらのモノクローナル抗体を、例9に記載のような間接的競合マイクロタイタープレートアッセイによって、レナリドマイド及びサリドマイドの結合について試験した。ELISAによって陽性のクローンを、Coligan,J.E.et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,2.5.8−2.5.17,1992,Wiley & Sons,NY中に開示されている方法に従って、限界希釈によって少なくとも1回サブクローン化した。
レナリドマイド−BSAコンジュゲート[5]でのマイクロタイタープレート感作方法
レナリドマイド濃度を測定するためのELISA法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり96個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)中で行った。各ウェルを、0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6中に10μg/mLのレナリドマイド−BSAコンジュゲート[5]を300μL添加して、室温で3時間インキュベートすることによって、(例5aにおけるように調製した)レナリドマイド−BSAコンジュゲート[5]でコーティングした。これらのウェルを0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6で洗浄し、次いで、375μLの5%ショ糖、0.2%カゼインナトリウム溶液で室温で30分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを37℃で一晩乾燥させた。
レナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]でのマイクロタイタープレート感作方法
レナリドマイド濃度を測定するためのELISA法を、タンパク質結合用に最適化されており、プレートあたり96個のウェルを含む、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules)中で行った。各ウェルを、0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6中に10μg/mLのレナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]を300μL添加して、室温で3時間インキュベートすることによって、(例5bにおけるように調製した)レナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]でコーティングした。これらのウェルを0.05Mの炭酸ナトリウム、pH9.6で洗浄し、次いで、375μLの5%ショ糖、0.2%カゼインナトリウム溶液で室温で30分間ブロッキングした。後からコーティングした溶液を除去した後に、このプレートを37℃で一晩乾燥させた。
抗体スクリーニング法−力価(タイター)
この方法は、例9におけるような置換について試験する抗体の希釈率を見出すためのものである。(例6において作製した)レナリドマイド抗体をスクリーニングするためのELISA法を、例7a及び7bにおいて調製したレナリドマイド−BSAコンジュゲートで感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。抗体スクリーニングアッセイは、ポリクローナルレナリドマイド抗体を含有する、(例6aにおけるような)試験採血からのネズミ科動物の血清を、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有するリン酸緩衝生理食塩水中で1:2,000、1:6,000、1:18,000及び1:54,000(容積/容積)に希釈することによって行った。(例7a及び7bにおいて調製した)レナリドマイド−BSAで感作したウェルの各ウェルに、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有する50μLのリン酸緩衝生理食塩水及び50μLの希釈した抗体を添加し、振盪しながら室温で10分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中に受動的に吸収されたレナリドマイド−BSAコンジュゲート(例7a及び7b)に結合する。プレートのウェルを、0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール、pH7.8で3回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中でレナリドマイド−BSAコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質(本例ではTMB)と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBS中で特定の活性(約1/3000)まで希釈して、これを各ウェルに100μL添加した。振盪しながら室温で10分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び3回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、HRPの基質であるTMB(TMB Substrate、BioFx)を100μL添加して、振盪しながら室温で10分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して発色を停止させ、20秒間振盪した後に、650nmにおいて吸光度を決定した(Molecular Devices Plate Reader)。1ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、希釈率(力価)として表され、1.5の吸光度という結果になった。力価は、測定された抗体の抗体希釈率(x軸)対吸光度650nm(y軸)をグラフ化して、1.5の吸光度における力価を補間することによって決定した。1.5の吸光度が得られたこの力価により、例9に記載の間接的競合マイクロタイタープレートアッセイにおいて使用する抗体の濃度(希釈率)を決定した。
抗体スクリーニング法−モノクローナルスクリーニング
(例8bにおいて作製した)レナリドマイドモノクローナル抗体をスクリーニングするためのELISA法を、例7bに記載のレナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]で感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。(例7bにおいて調製した)レナリドマイド−BSAで感作したウェルの各ウェルに、0.1%のBSA及び0.01%のチメロサールを含有する50μLのリン酸緩衝生理食塩水及び次いで50μLのモノクローナル培養液上清を添加し、振盪しながら室温で10分間インキュベートした。このインキュベート中に、抗体が、ウェル中でレナリドマイド−BSAコンジュゲートに結合する。プレートのウェルを、0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール、pH7.8で3回洗浄し、結合していない抗体をすべて除去した。ウェル中のレナリドマイド−BSAコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質(本例ではTMB)と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBS中で1/3000に希釈して、これを各ウェルに100μL添加した。振盪しながら室温で10分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び3回洗浄して、結合していないヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、HRPの基質であるTMB(TMB Substrate、BioFx)を100μL添加して、振盪しながら室温で10分間インキュベートしている間に発色させた。発色のためのインキュベート後に、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して発色を停止させ、10秒間振盪した後に、650nmにおいて吸光度を決定した(Molecular Devices Plate Reader)。1ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例した。バックグラウンドの3倍より大きい吸光度を有する試料が陽性であるとされた。例8bに記載のように、0.4を超える吸光度を有する試料を24ウェルプレートに展開した。
間接的競合マイクロタイタープレートイムノアッセイ法
レナリドマイドに対する抗体のIC50の決定
IC50値を決定するためのELISA法を、例7bに記載のレナリドマイド−BSAコンジュゲート[9]で感作したマイクロタイタープレートを用いて行った。検体、すなわちレナリドマイド及びサリドマイドをDMSO中に溶解し、1から100,000ng/mLの濃度範囲にわたって、diH2O中に希釈した。それぞれのアッセイは、50μLの検体溶液を、例4(レナリドマイド)の免疫原で例6aにおいて産生されたポリクローナル抗体から選択される抗体のうちの1種の50μL及び例8b(レナリドマイド及びサリドマイド)において産生されたモノクローナル抗体から選択されるうちの1種の50μLと共にインキュベートすることによって行った。これらのアッセイはすべて、ウェルのそれぞれにおいて、抗体の濃度を、例8aにおいて決定された力価に希釈することによって行った。(振盪しながら室温で)10分間のインキュベート中に、(例7bにおいて作製した)ウェル中のレナリドマイド−BSAコンジュゲートと、溶液中の検体とに対する抗体結合の競合が生じる。このインキュベート後に、プレートのウェルを、0.02MのTRIS、0.9%のNaCl、0.5%のTween−80及び0.001%のチメロサール、pH7.8で3回洗浄し、結合しなかった物質をすべて除去した。(例7bにおいて作製した)ウェル中のレナリドマイド−BSAコンジュゲートに結合したレナリドマイド抗体の量を検出するために、ネズミ科動物の免疫グロブリンと特異的に結合することができ、基質(本例ではTMB)と共に培養したときに着色生成物を生成することができる、ヤギの抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲート(Jackson Immunoresearch)を、0.1%のBSA、0.05%のANS、0.01%のチメロサールを含むPBS中で予め決定された特定の活性(約1/3000)まで希釈して、これを各ウェルに100μL添加した。振盪しながら室温で10分間インキュベートし、この間にヤギ抗マウス抗体−HRP酵素コンジュゲートがウェル中でレナリドマイド抗体に結合し、その後、これらのプレートを再び3回洗浄して、結合していない二次コンジュゲートを除去した。ウェル中で測定可能な発色をさせるために、洗浄後に、HRPの基質であるTMB(TMB Substrate、BioFx)を100μL添加して、振盪しながら室温で10分間のインキュベートにおいて発色させた。発色のためのインキュベート後に、50μLの停止液(diH2O中1.5%のフッ化ナトリウム)を各ウェルに添加して発色を停止させ、20秒間振盪した後に、650nmにおいて吸光度を決定した(Molecular Devices Plate Reader)。1ウェル中の抗体の量は、測定された吸光度に比例し、試料中のレナリドマイド又はサリドマイドの量に反比例した。レナリドマイド及びサリドマイドのIC50値は、ウェル中の吸光度をウェル中の検体濃度に対してプロットした、用量反応曲線を構築することによって決定した。検体を含有するウェルにおける色の吸光度を、検体を含まないものと比較して、標準曲線を作成した。所与の検体のIC50値は、検体を含有しないウェルの吸光度の50%を有するのに必要な検体の濃度として定義された。下記の表Iに、レナリドマイドに対するポリクローナル抗体についての結果がある。下記の表IIに、レナリドマイドに対するモノクローナル抗体についての結果がある。
Claims (80)
- 試料中のサリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも10%の、サリドマイドとの反応性を有する抗体と、次式を有するリガンド:
[式中、Bは、−C(=O)−CH2−、−C(=O)−NH−CH2−、−C(=O)−O−CH2−又は−CH2−であり、
Yは、有機スペーサー基であり、
pは、0から1までの整数であり、
Xは、担体に結合することができる末端官能基である]
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のサリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートを測定し、それによって前記試料中のサリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。 - 前記試料がヒト試料である、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記ヒト試料が、サリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のサリドマイドの量を測定する、請求項2に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて最少10%の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項3に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が固体支持体に結合されている、請求項5に記載のイムノアッセイ。
- 前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項6に記載のイムノアッセイ。
- 前記固体支持体がナノ粒子である、請求項6に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒツジ又はラットに由来する、請求項9に記載のイムノアッセイ。
- 試料中のレナリドマイドを検出するためのイムノアッセイであって、前記試料と、レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体と、次式を有するリガンド:
[式中、Bは、−C(=O)−CH2−、−C(=O)−NH−CH2−、−C(=O)−O−CH2−又は−CH2−であり、
Yは、有機スペーサー基であり、
pは、0から1までの整数であり、
Xは、担体に結合することができる末端官能基である]
との担体のコンジュゲートとを含有する混合物を用意するステップと、前記試料中のレナリドマイド及び前記コンジュゲートを前記抗体と結合させるステップと、その後、前記抗体に結合している又は結合していない前記混合物中の前記コンジュゲートの量を測定し、それによって前記試料中のレナリドマイドの存在が検出可能となるステップとを含む上記イムノアッセイ。 - 前記試料がヒト試料である、請求項11に記載のイムノアッセイ。
- 前記ヒト試料が、レナリドマイドで治療した患者から採取された試料であり、前記イムノアッセイが、前記抗体に結合している又は結合していないコンジュゲートの量を測定することによって前記試料中のレナリドマイドの量を測定する、請求項12に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて約100%の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項13に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が固体支持体に結合されている、請求項15に記載のイムノアッセイ。
- 前記固体支持体がマイクロタイタープレートである、請求項16に記載のイムノアッセイ。
- 前記固体支持体がナノ粒子である、請求項16に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項12に記載のイムノアッセイ。
- 前記抗体が、マウス、ウサギ、ヒツジ又はラットに由来する、請求項19に記載のイムノアッセイ。
- レナリドマイド及びレナリドマイドとサリドマイドとの混合物からなる群から選択される薬学的に活性な化学療法薬と選択的に反応性である抗体。
- 前記抗体が、薬学的に活性な前記化学療法薬の薬学的に活性でない代謝産物と12%を超えない交差反応性を有し、前記交差反応性が、薬学的に活性な前記化学療法薬に対する前記抗体の結合に相対したものである、請求項21に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項22に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項24に記載の抗体。
- 前記抗体が、マウス、ヒツジ、ウサギ又はラットに由来する、請求項25に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて少なくとも10%の、サリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項22に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて48%の、サリドマイドとの反応性を有する、請求項27に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項27に記載の抗体。
- 前記抗体がレナリドマイドと選択的に反応性である、請求項22に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて少なくとも20%の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項31に記載の抗体。
- 前記抗体が、前記化学療法薬(複数)とのその反応性に基づいて約100%の、レナリドマイドとの選択的反応性を有する、請求項32に記載の抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項32に記載の抗体。
- pが0である、請求項36に記載の化合物。
- 形成されているエステルが、低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルである、請求項41に記載の化合物。
- pが1である、請求項36に記載の化合物。
- Bが−C(=O)−CH2−である、請求項43に記載の化合物。
- Yが、1個から6個までの炭素原子を含む低級アルキレンである、請求項46に記載の化合物。
- OR3がヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する、請求項48に記載の化合物。
- OR3がスルホ−N−ヒドロキシスクシンイミドエステルを形成する、請求項51に記載の化合物。
- 前記担体がポリアミンポリマーを含む免疫原性担体であり、Xは前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である、請求項53に記載のコンジュゲート。
- pが0である、請求項53に記載のコンジュゲート。
- pが1である、請求項53に記載のコンジュゲート。
- 前記担体が、ポリアミンポリマーを含む免疫原性担体であり、Xが、前記ポリアミンポリマーに結合することができる末端官能基である、請求項57に記載のコンジュゲート。
- Yが、1個から6個までの炭素原子を含むアルキレンである、請求項60に記載のコンジュゲート。
- 患者の試料中のサリドマイドの存在を決定するためのキットであって、別々の容器中にパッケージングされた別々の試薬を含み、前記試薬のうちの一方が、次式のリガンド:
[式中、Bは、−C(=O)−CH2−、−C(=O)−NH−CH2−、−C(=O)−O−CH2−又は−CH2−であり、
Yは、有機スペーサー基であり、
pは、0から1までの整数であり、
Xは、担体に結合することができる末端官能基である]
との担体のコンジュゲートであり、他方の試薬が、薬学的に活性な化学療法薬であるレナリドマイド及びサリドマイドの混合物と選択的に反応性であり且つ薬学的に活性な化学療法薬の前記混合物とのその反応性に基づいて少なくとも10%の、サリドマイドとの選択的反応性を有する抗体であるキット。 - pが1である、請求項65に記載のキット。
- Yが低級アルキレンである、請求項66に記載のキット。
- pが1である、請求項72に記載のキット。
- Yが低級アルキレンである、請求項73に記載のキット。
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