CN104312973B - I型干扰素在诱导atx蛋白表达中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种I型干扰素的新用途。该新用途为I型干扰素在如下任一中的应用:a1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达;a2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品。实验证明,I型干扰素通过I型干扰素受体(IFNAR)激活JAK‑STAT、PI3K‑AKT和NF‑κB等信号通路诱导免疫细胞中ATX的表达,这些通路的抑制剂及相关基因siRNA能抑制I型干扰素诱导的ATX表达;TLR激活可诱导免疫细胞中ATX的表达,而且这种感染相关的ATX诱导表达是由I型干扰素介导的;与炎症反应和自身免疫相关的细胞因子TNF‑α和IFN‑γ能协同促进免疫细胞中ATX的表达,这一过程同样依赖于I型干扰素的产生和I型干扰素下游通路。本发明揭示了I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达的新功能,对I型干扰素的临床应用和ATX‑LPA通路相关疾病的干预治疗具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种I型干扰素的新用途,特别涉及I型干扰素在诱导ATX蛋白表达中的应用。
背景技术
早在1957年,Isaacs和Lindenmann发现了I型干扰素。正是由于它能够“干扰”病毒的复制,由此命名为干扰素(interferon,IFN)。干扰素是一类广泛表达的信号因子,具有很强的抗病毒和生长抑制作用。这些因子是抵御病毒侵染的第一道防线,在对恶性细胞的免疫监视过程中发挥重要作用。干扰素可以分为两种类型:I型干扰素和II型干扰素。I型干扰素包括13种干扰素-α和干扰素-β;II型干扰素即干扰素-γ。I型干扰素与位于细胞膜上的I型干扰素受体(IFNAR)结合,从而激活相应的信号通路,调控相关基因的表达,发挥生物学功能。这些信号通路包括JAK-STAT、p38MAPK、ERK、PI3K-AKT和NF-κB等。
I型干扰素的表达主要受到模式识别受体的控制,这些受体可以识别外源微生物保守的独特的模式分子。可以诱导I型干扰素表达的模式识别受体可以分为两类:Toll-like受体(TLR)和RIG-I-like解旋酶(RLHs)。RLHs广泛表达在各类细胞的细胞质中,可以识别侵染病毒产生的dsRNA。TLRs主要定位于细胞表面或者内体中,可以识别细菌、病毒等微生物的特定组分。当细菌或病毒侵染机体时,被相应的模式识别受体识别,从而诱导I型干扰素的表达。I型干扰素参与许多TLR相关的基因表达调控,并可以直接作用于免疫细胞,在抗感染免疫中发挥重要的作用。
Autotaxin(ATX)是核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(nucleotide pyrophosphatase,NPP)家族中的一员即NPP2,最早从人黑素瘤细胞A2058的条件培养基中分离获得,是一个分泌型糖蛋白。它具有lysoPLD活性,其主要生理功能是催化溶血磷脂胆碱(LPC)水解生成溶血磷脂酸(LPA)。LPA通过细胞表面的受体发挥生物学功能,可以促进细胞的存活、增殖和迁移。人们发现在生理状况下,ATX是在血管发育、神经系统的发育所必须的。在疾病状态下,ATX是恶性肿瘤中表达发生最显著上调的40个基因之一;ATX/LPA可以促进肿瘤细胞的迁移,被认为是肿瘤治疗的重要靶点之一。ATX-LPA通路与多种炎症相关疾病有关。在微生物重复侵染的状态下,急性炎症转变成慢性炎症,ATX-LPA通路促使更多细胞因子的产生,并聚集到组织微环境中,从而加剧病情,抑制ATX的活性则可以使症状减轻。这种现象在多种慢性炎症相关疾病小鼠模型的研究中得到证实,如类风湿关节炎、哮喘、多发性硬化症等免疫相关疾病。但是免疫反应过程中ATX表达调控的机制目前还不清楚。因此,认识ATX在炎症中的表达调控机制显得极为迫切,具有较高临床应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种I型干扰素的新用途。
本发明所提供的I型干扰素的新用途具体为I型干扰素在如下任一中的应用:
(a1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达;
(a2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
(b1)在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达;
(b2)制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明的另一个目的是提供一种具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明所提供的具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品,其活性成分为I型干扰素或能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质。
在本发明中,所述能够促进I型干扰素表达和/或增强I型干扰素作用的物质具体为如下中任一种:
(1)Toll-like受体的配体;
(2)肿瘤坏死因子α和干扰素γ混合物。
在(1)中,所述Toll-like受体的配体具体可为TLR4配体、TLR3配体或TLR9配体;所述TLR4配体具体可为细菌脂多糖(LPS)(如Sigma-Aldrich公司产品,其产品目录号为L2880);所述TLR3配体具体可为poly(I:C)(如Sigma-Aldrich公司产品,其产品目录号为P9582);所述TLR9配体具体可为CpG寡核苷酸(如InvivoGen公司产品,其产品目录号为tlrl-2216)。
在(2)中,所述肿瘤坏死因子α(如peprotech公司产品,其产品目录号为300-01A)和干扰素γ(如peprotech公司产品,其产品目录号为300-02)混合物中,所述肿瘤坏死因子α和所述干扰素γ的质量配比为1:1。相应的,在所述肿瘤坏死因子α和干扰素γ混合物的工作液中,所述肿瘤坏死因子α和所述干扰素γ的质量浓度配比为1:1,两者的工作浓度均为50ng/ml。
I型干扰素信号通路抑制剂或抑制I型干扰素产生的物质在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围:
(c1)在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达;
(c2)制备具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明的又一个目的是提供一种具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品。
本发明所提供的具有在免疫细胞中抑制ATX蛋白(或ATX基因)表达的功能的产品,其活性成分为I型干扰素信号通路抑制剂或能够抑制I型干扰素产生的物质。
在本发明中,所述I型干扰素信号通路抑制剂具体为如下(a)-(c)中的任一种:所述抑制I型干扰素产生的物质具体为如下(d):
(a)JAK-STAT信号通路抑制剂、PI3K-AKT信号通路抑制剂或NF-κB信号通路抑制剂;
(b)siSTAT1、siSTAT3、siAKT、siJAK1、siTYK2或siIFNAR1;
所述siSTAT1为序列表中序列1所示的双链RNA分子;所述siSTAT3为序列表中序列2所示的双链RNA分子(核酸分子);所述siAKT为序列表中序列3所示的双链RNA分子(核酸分子);所述siJAK1为序列表中序列4所示的双链RNA分子(核酸分子);所述siTYK2为序列表中序列5所示的双链RNA分子(核酸分子);所述siIFNAR1为序列表中序列6所示的双链RNA分子(核酸分子);
(c)IFN-α中和性抗体(如Peprotech公司产品,其产品目录号为500-P32AG)或IFN-β的中和性抗体(如Peprotech公司产品,其产品目录号为500-P32B);
(d)siIRF3或siIRF7;
所述siIRF3为序列表中序列7所示的双链RNA分子(核酸分子);所述siIRF7为序列表中序列8所示的双链RNA分子(核酸分子)。
在本发明的一个实施例中,上述(a)中,所述JAK-STAT信号通路抑制剂具体为Pyridone6(如Calbiochem公司产品,其产品目录号为420099);所述PI3K-AKT信号通路抑制剂具体为LY294002(如Sigma-Aldrich公司产品,其产品目录号为L9908);所述NF-κB信号通路抑制剂具体为BAY-11-7082(如Sigma-Aldrich公司产品,其产品目录号为B5556)。
在本发明中,所述I型干扰素具体可为IFN-α(如Peprotech公司产品,其产品目录号为300-02AA)或IFN-β(如Peprotech公司产品,其产品目录号为300-02BC)。
在本发明中,所述ATX蛋白的氨基酸序列为序列表中序列9所示,所述ATX蛋白的编码基因具体为序列表中序列10。
在本发明中,所述免疫细胞具体可为如下中的任一种:THP-1细胞、外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(monocyte)、非单核细胞(Non-monocyte)或单核细胞来源的树突状细胞(monocyte derived dendritic cell,moDC)。
实验证明,I型干扰素(IFN-α和IFN-β)可以通过JAK-STAT、PI3K-AKT和NF-κB通路诱导免疫细胞中ATX的表达。这些通路的抑制剂以及相关基因siRNA能够抑制I型干扰素诱导的ATX表达。同时,本发明的发明人还发现感染免疫中TLR的激活可以诱导ATX的表达,而且这种感染相关的ATX诱导表达是由I型干扰素介导的。IFN-β的中和性抗体、IFNAR1的siRNA以及IFN-β信号通路的抑制剂均能够抑制TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR9配体CpG寡核苷酸以及TLR3配体poly(I:C)诱导的ATX表达。此外,与炎症反应和自身免疫相关的细胞因子TNF-α和IFN-γ能够协同促进ATX的表达,这一过程同样依赖于I型干扰素的产生和I型干扰素下游通路。这些发现不仅揭示了I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达的新功能,而且阐释了免疫反应过程中ATX表达调控的机制,对I型干扰素的临床应用和ATX-LPA通路相关疾病的干预治疗具有重要意义。
附图说明
图1为I型干扰素诱导免疫细胞中ATX表达。A:THP-1人单核细胞;B:PBMC、monocyte以及Non-monocyte;C:人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、T细胞系Jurkat、以及几种肿瘤细胞系(HEK293、SW480、A549和MCF-7)。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图2为PI3K抑制剂LY、JAK抑制剂P6、NF-κB抑制剂BAY能够抑制I型干扰素诱导的ATX的表达。A:THP-1细胞;B:PBMC;C:单核细胞。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图3为siAKT、siJAK、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3都可以抑制I型干扰素诱导的ATX的表达。A:siAKT;B:siJAK和siTYK2;C:siSTAT1和siSTAT3。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图4为TLR的激活导致ATX的表达上调。A:THP-1细胞;B:moDC细胞。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图5为siIRF3或者siIRF7抑制TLR介导ATX的表达。A:siIRF3/poly(I:C);B:siIRF3/LPS;C:siIRF7/CpG。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图6为LPS、CpG和poly(I:C)诱导I型干扰素的表达。
图7为IFN-α和IFN-β特异性中和性抗体对TLR介导的THP-1细胞中ATX表达的影响。A:poly(I:C);B:LPS;C:CpG。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图8为IFN-α和IFN-β特异性中和性抗体对TLR介导的moDC细胞中ATX表达的影响。A:poly(I:C);B:LPS。图中,*表示在P<0.05水平上差异显著,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图9为siIFNAR1抑制TLR介导ATX的表达。
图10为肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)协同促进ATX表达。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
图11为TNF-α和IFN-γ上调ATX的表达依赖于I型干扰素。A:TNF-α对THP-1细胞中IFN-β的表达具有促进作用;B:当IFN-β特异的中和性抗体存在时,TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达的作用被显著抑制;C:通过转入siIFNAR1敲低细胞中IFNAR1的表达,阻断I型干扰素的信号通路,能够抑制TNF-α和IFN-γ上调ATX表达的作用。图中,**表示在P<0.01水平上差异显著。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
THP-1人单核细胞:购自ATCC公司,目录号:TIB-202。用含有10%(体积分数)的胎牛血清(Hyclone)的RPMI-1640(Gibco)培养基培养,培养基中加入2mM L-谷氨酰胺(Gibco),100μg/ml链霉素(Gibco)和100U/ml青霉素(Gibco)。
人脐静脉内皮细胞(HUVEC):购自sciencell公司,目录号:8000。T细胞系Jurkat:购自ATCC公司,目录号:TIB-152。肿瘤细胞系HEK293、SW480、A549和MCF-7,均购自ATCC公司,目录号分别为:CRL-1573、CCL-228、CCL-185和HTB-22。
Trizol:Invitrogen公司;M-MLV:Promega公司;RNAse抑制剂:Promega公司;BCA蛋白定量试剂盒:Thermo公司;iQ SYBR:Green supermix Bio-Rad公司;转染试剂lipofectamine2000:Invitrogen公司;BSA:Amresco公司;LPS:Sigma-Aldrich公司(产品目录号为L2880);CpG:InvivoGen公司(产品目录号为tlrl-2216);poly(I:C):Sigma-Aldrich公司(产品目录号为P9582);JAKs抑制剂Pyridone6(P6):Calbiochem公司(产品目录号为420099);PI3K抑制剂LY294002:Sigma-Aldrich公司(产品目录号为L9908);NF-κB抑制剂BAY-11-7082:Sigma-Aldrich公司(产品目录号为B5556);干扰素-β(IFN-β)中和性抗体:Peprotech公司(产品目录号为500-P32B);干扰素-α(IFN-α)中和性抗体:Peprotech公司(产品目录号为500-P32AG);ECL发光显色试剂盒:Millipore公司;Human IFN-α:Peprotech公司(产品目录号为300-02AA);Human IFN-β:Peprotech公司(产品目录号为300-02BC);Human IL4:Peprotech公司200-04;Human GM-CSF:Peprotech公司300-03;TNF-α:peprotech公司(产品目录号为300-01A);IFN-γ:peprotech公司(产品目录号为300-02)。
实施例1、I型干扰素可以诱导免疫细胞中ATX的表达
一、I型干扰素在THP-1人单核细胞中对ATX表达的诱导作用
用I型干扰素IFN-α和IFN-β分别处理THP-1人单核细胞,通过实时定量反转录PCR(qRT-PCR)和western blot分别检测ATX mRNA和蛋白的表达水平。具体如下:
1、用I型干扰素IFN-α和IFN-β分别处理THP-1人单核细胞
分别将IFN-α(或IFN-β)加入培养有THP-1人单核细胞的细胞培养基中,使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。处理时间设置三个时间梯度:0h、2h和4h。
2、实时定量反转录PCR(qRT-PCR)检测
A.RNA提取
(1)收集细胞样品,用PBS溶液洗涤2遍,然后离心去上清。
(2)在沉淀中加入1ml的Trizol溶液,吹打混匀,室温静置5分钟。
(3)加入氯仿(每1ml trizol加0.2ml的氯仿),盖紧离心管,用手剧烈摇荡15秒。
(4)室温静置5分钟,12000g4℃离心15分钟。
(5)将上层水相转移到新的离心管中,加入0.5ml异丙醇,混匀后放置10分钟。
(6)12000g,4℃离心10分钟,弃上清。
(7)加入1ml的75%(体积分数)乙醇洗涤一次,7500g4℃离心5分钟,弃上清,沉淀烘干10分钟。
(8)加入20μl DEPC水溶解沉淀,放置于60℃水浴锅溶解10分钟。
(9)通过分光光度计测量RNA浓度,将制备好的样品冻于-80℃冰箱储存。
B.qRT-PCR
(1)反转录获得cDNA
取2μg RNA,加入2μl d(T)引物,70℃10分钟,立即放在冰上冷却。按照以下体系进行混合:加入M-MLV5×缓冲液5μl,dNTPs10mM1μl,RNasinRibonuclease inhibitor0.5μl,M-MLV逆转录酶1μl,补入DEPC水至终体积25μl,将混合溶液放于42℃水浴中反应1小时,72℃灭活10分钟,冻存于-20℃冰箱储存。
(2)荧光定量PCR检测
根据IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)的操作手册,利用Bio-Rad的iCycleiQreal-time PCR仪器对目的基因ATX进行检测,结果通过Bio-Rad iQ5分析软件进行检测。以GAPDH基因作为内参。
扩增ATX基因的引物对如下:
ATX-F:5’-GACTATGACTATGATGGCTTAC-3’;
ATX-R:5’-GATGATGCTGTAGTAGTGAGT-3’。
扩增GAPDH基因的引物对如下:
GAPDH-F:5’-TTAGCACCCCTGTCCAAGG-3’;
GAPDH-R:5’-CCTACTCCTTGGAGGCCATG-3’。
反应体系:2×RealqPCR MasterMix(Modified DNA polymerase、SYBR Green I、Optimized PCR buffer、5mM MgCI2、dNTP mix including dUTP)25μl;上游引物F1μl,下游引物R1μl;cDNA模板2μl。
定量PCR仪扩增反应条件设置:50℃2min;95℃10min;95℃15s--60℃60s(40个循环);溶解曲线生成的反应程序为:95℃15s,60℃15s,95℃15s。
数据处理:用IQ5软件获得数据,用EXCEL软件对数据进行处理分析。通过T-Test检验进行统计学差异分析。
3、western blot检测
A.蛋白提取
(1)收集细胞,1500rpm离心5分钟,弃除上清,用预冷的PBS清洗细胞沉淀两次;
(2)吸干残余的PBS,加入适量的细胞裂解液RIPA,吹打混匀,冰浴裂解30分钟;
(3)12000rpm4℃离心20分钟,取上清转移到新的离心管中;
B.BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度
(1)将溶液A和溶液B根据体积比50:1配置成BCA工作液,充分混匀;
(2)将蛋白标准品等比稀释至不同的浓度梯度
(3)在200μl BCA工作液中加入20μl测量样品,充分混匀,37℃反应30分钟;
(4)用分光光度计选用BCA测量模式进行测量,绘制标准曲线。
C.Western蛋白印迹
1)电泳
配置SDS-PAGE蛋白胶,取40μg样品蛋白加入上样缓冲液中,沸水浴5分钟,12000rpm离心2分钟,冷却后离心取上清上样。先用80V恒压电泳,等溴酚蓝进入分离胶后换成120V电压进行电泳。
2)全湿法转膜
将PVDF膜用甲醇活化15秒,然后放入蒸馏水中浸泡5分钟,再放入转膜缓冲液中浸泡15分钟。按照Bio-Rad湿转仪方法进行转膜,100V60分钟。
3)孵育抗体及显色
(1)取出PVDF膜,用TBST洗涤一次,放入封闭液(5%(5g/100ml)BSA)中室温孵育1小时;
(2)用TBST洗涤3次,每次5分钟,放入一抗(anti-human ATX,采用序列9所示的ATX蛋白作为免疫原免疫兔子获得的多克隆抗体)稀释液中室温孵育1小时;
(3)用TBST洗涤3次,每次5分钟,放入二抗(羊抗兔IgG抗体,购自自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5306)稀释液中室温孵育30分钟;
(4)取出膜,用TBST洗涤3次,ECL发光显色。
4、结果
结果显示,IFN-α和IFN-β均可以诱导THP-1人单核细胞中ATX的表达(图1中A)。
二、I型干扰素在人外周血免疫细胞中对ATX表达的诱导作用
从人外周血中分离获得外周血单个核细胞(PBMC),然后从PBMC中分离单核细胞(monocyte)和非单核细胞(Non-monocyte)。分别用IFN-α和IFN-β处理上述三种细胞,通过qRT-PCR检测ATX mRNA的表达。具体如下:
1、三种细胞的分离
采新鲜抗凝健康人外周血,肝素抗凝后,用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)。
将单个核细胞(PBMC)培养于37℃5%CO2培养箱中,贴壁3小时后,把上清移出到另一塑料培养瓶中,以37℃预温的RPMI1640培养基轻洗去除非贴壁的细胞并倒入培养瓶中,贴壁细胞即为单核细胞(monocyte),非贴壁细胞即为非单核细胞(Non-monocyte)。
2、用IFN-α和IFN-β分别处理上述三种细胞
待处理细胞:步骤1分离得到的外周血单个核细胞(PBMC)、单核细胞(monocyte)和非单核细胞(Non-monocyte)。
将IFN-α(或IFN-β)加入培养有待处理细胞的细胞培养基中,使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时,IFN-β的处理时间为4小时。实验同时设置了未经I型干扰素处理的阴性对照。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参见步骤一2进行。
4、结果
结果显示,IFN-α和IFN-β均可以诱导PBMC、monocyte以及Non-monocyte中ATX的表达(图1中B)。
三、I型干扰素在其他细胞中对ATX表达的诱导作用
本发明的发明人还用I型干扰素处理了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)、T细胞系Jurka,以及几种肿瘤细胞系(HEK293、SW480、A549和MCF-7),通过qRT-PCR检测ATX mRNA的表达。具体的处理方法参见步骤二2进行。qRT-PCR检测ATX mRNA的表达参见步骤二3进行。
结果显示,I型干扰素并不能够诱导这些细胞中ATX的表达(图1中C)。
上述结果表明,I型干扰素可以诱导免疫细胞中ATX的表达,而这种作用具有较强的细胞特异性。
实施例2、阻断JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB通路可以抑制I型干扰素诱导ATX的表达
一、三个信号通路抑制剂P6、LY和BAY的作用
I型干扰素通过与细胞表面的I型干扰素受体(IFNAR)相结合,进而激活JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB等通路。本发明的发明人通过qRT-PCR检测了相关通路的抑制剂对IFN-α和IFN-β诱导ATX的表达影响。具体操作如下:
待处理细胞:THP-1人单核细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和单核细胞(monocyte)。
供试信号通路抑制剂:JAK-STAT信号通路的抑制剂Pyridone6(P6)、PI3K-AKT信号通路的抑制剂LY294002(LY)以及NF-κB信号通路的抑制剂BAY-11-7082(BAY)。
向培养有待处理细胞的细胞培养基中加入供试信号通路抑制剂,使供试信号通路抑制剂的终浓度均为10μM;半小时后,再向其中加入IFN-α(或IFN-β),使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时,IFN-β的处理时间为4小时。
通过qRT-PCR检测ATX mRNA表达水平(参见实施例1步骤二3进行)。
结果表明,JAK-STAT信号通路的抑制剂Pyridone6(P6)、PI3K-AKT信号通路的抑制剂LY294002(LY)以及NF-κB信号通路的抑制剂BAY-11-7082(BAY)都能显著抑制I型干扰素诱导的ATX表达(图2)。
二、siAKT、siJAK1、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3的作用
本发明的发明人还通过RNAi技术敲低相关信号通路中重要组分,进一步验证这些通路在IFN-α和IFN-β诱导ATX表达中的作用。具体如下:
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siSTAT1:5’-GCUUCUUGGUCCUAACGCC-3’(序列1);
siSTAT3:5’-CCACUUUGGUGUUUCAUAA-3’(序列2);
siAKT:5’-GCUGGAGAACCUCAUGCUG-3’(序列3);
siJAK1:5’-GACAUGAUAUUGAGAACGA-3’(序列4);
siTYK2:5’-GCAUCCACAUUGCACAUAA-3’(序列5);
阴性对照(NC):5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染及IFN-α或IFN-β的处理
A.siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。
(1)根据吉玛公司说明书,将合成的siRNA加入150μl无RNase水溶解至浓度(20μM),分装冻存于-80℃。
(2)根据Lipofectamine2000说明书进行siRNA转染,具体步骤如下:转染前用2ml新鲜培养基重悬1.5-2×105个细胞,加入到35mm培养皿中;用250μl Opti-MEM培养基稀释siRNA至终浓度为25nM或50nM;同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μlLipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将siRNA和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到细胞培养基中,混匀。
B.IFN-α或IFN-β的处理
转染48小时后,向其中加入IFN-α(或IFN-β),使IFN-α的终浓度为50ng/ml(使IFN-β的终浓度为10ng/ml)。IFN-α的处理时间为2小时,IFN-β的处理时间为4小时。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参,检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司,目录号:sc-47778),二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)。
检测AKT蛋白的一抗为anti-human AKT(购自Cell Signaling Technology公司,目录号:9272);检测JAK1蛋白的一抗为anti-human JAK1(购自Santa Cruz Biotechnology公司,目录号:sc-7228);检测TYK2蛋白的一抗为anti-human TYK2(购自Santa CruzBiotechnology公司,目录号:sc-169);检测STAT1蛋白的一抗为anti-human STAT1(购自Cell Signaling Technology公司,目录号:9172s);检测STAT3蛋白的一抗为anti-humanSTAT3(购自Santa Cruz Biotechnology公司,目录号:sc-482X);检测各蛋白所用的二抗根据一抗进行选择,为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗体(购自自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5306)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
结果显示,siAKT、siJAK1、siTYK2、siSTAT1和siSTAT3都能够抑制IFN-α和IFN-β诱导的ATX表达(图3)。
上述结果表明,阻断JAK-STAT、PI3K-AKT、NF-κB通路可以抑制I型干扰素诱导ATX的表达。
实施例3、TLR的激活可以导致ATX的表达上调
一、THP-1细胞中TLR配体对ATX表达的影响
Toll-like receptor(TLR)作为一类模式识别受体,是机体识别异物侵染的重要感受器。本发明的发明人检测了TLR配体对ATX表达的影响。具体操作如下:
1、TLR配体处理THP-1细胞
供试TLR配体有TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)和TLR9配体CpG寡核苷酸。
(1)LPS处理
将LPS加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,使其终浓度为0.1μg/ml。处理16小时。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
(2)poly(I:C)和CpG寡核苷酸处理
A.poly(I:C)处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml;同时用250μlOpti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,混匀。
B.CpG寡核苷酸处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释CpG至终浓度为1μM;同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,混匀。
poly(I:C)和CpG寡核苷酸的处理时间均为6小时。
实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)和TLR9配体CpG寡核苷酸都可以诱导THP-1细胞中ATX的表达(图4中A)。
二、单核细胞来源的树突状细胞中TLR配体对ATX表达的影响
1、单核细胞来源的树突状细胞的获得
从人外周血中分离到单核细胞(具体分离方法参见前文),调整细胞浓度为1×106个/L,接种于6孔培养板,0.002L/孔,加入rhGM-CSF(50μg/L)、rhIL-4(50μg/L),然后置37℃、5%CO2培养箱内培养,第3天采取半量换液并补加细胞因子,继续培养至第6天,获得成熟的树突状细胞,即为单核细胞来源的树突状细胞(monocyte derived dendritic cell,moDC)。该moDCs中只表达TLR3和TLR4,不表达TLR9。
2、TLR配体处理moDC细胞
供试TLR配体有TLR4配体细菌脂多糖(LPS)和TLR3配体poly(I:C)。
(1)LPS处理
将LPS加入到培养有moDC细胞的细胞培养基中,使其终浓度为0.1μg/ml。处理16小时。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
(2)poly(I:C)处理
用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml;同时用250μlOpti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到细胞培养基中,混匀,处理时间为6h。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,当用LPS和poly(I:C)分别处理moDCs时,均可以显著上调moDCs细胞中ATX的表达(图4中B)。
上述结果表明,TLR3、TLR4和TLR9等TLR的激活可以诱导免疫细胞中ATX的表达。
实施例4、TLR激活导致ATX表达上调依赖I型干扰素自分泌途径
TLR的激活可以诱导I型干扰素的表达,其中TLR3和TLR4是通过IRF3介导的I型干扰素的表达,而TLR9是通过IRF7介导I型干扰素的表达。
一、siIRF3和siIRF7对TLR激活诱导ATX的表达影响
本发明的发明人通过转入siIRF3或siIRF7,分别敲低IRF3和IRF7的表达,研究其对TLR激活诱导ATX的表达影响。具体操作如下:
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siIRF3:5’-ccacuuugguguuucauaa-3’(序列7);
siIRF7:5’-gccucuaugacgacaucga-3’(序列8);
阴性对照(NC):5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染,转染48小时后,再参照实施例3步骤一1用TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)或TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参,检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司,目录号:sc-47778),二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)。
检测IRF3蛋白的一抗为anti-human IRF3(购自Cell Signaling Technology公司,目录号:11904P);检测IRF7蛋白的一抗为anti-human IRF7(购自Cell SignalingTechnology公司,目录号:13014S);检测各蛋白所用的二抗根据一抗进行选择,为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)或羊抗兔IgG抗体(购自自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5306)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
5、结果
结果显示,siIRF3可以抑制TLR4配体LPS和TLR3配体poly(I:C)处理THP-1细胞时ATX的表达上调(图5中A和B);siIRF7可以抑制TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞时ATX的表达上调(图5中C)。
二、TLR配体诱导I型干扰素的表达
1、TLR配体处理THP-1细胞
参照实施例3步骤一1进行。LPS的处理时间为2h,poly(I:C)和CpG寡核苷酸的处理时间均为6h。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测IFN-α和IFN-βmRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
其中扩增IFN-α基因的引物对如下:
IFN-α-F:5’-GATGGCCGTGCTGGTGCTCA-3’;
IFN-α-R:5’-TGATTTCTGCTCTGACAACCTCCC-3’。
其中扩增IFN-β基因的引物对如下:
IFN-β-F:5’-AAACTCATGAGCAGTCTGCA-3’;
IFN-β-R:5’-AGGAGATCTTCAGTTTCGGAGG-3’。
结果显示:TLR4只可以介导IFN-β的表达,而不能介导IFN-α的表达;而TLR3和TLR9既可以介导IFN-α的表达也可以介导IFN-β的表达(图6)。
三、IFN-α和IFN-β的中和性抗体对TLR介导的THP-1细胞中ATX表达的影响
1、IFN-α或IFN-β的中和性抗体处理细胞
(1)LPS/IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体,使其终浓度为1μg/ml,30min后,再向其中加入LPS,使其终浓度为0.1μg/ml,LPS处理16小时。实验同时设置未经处理的细胞以及经IgG处理的细胞作为对照。
(2)poly(I:C)或CpG寡核苷酸/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
A.poly(I:C)/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体),使其终浓度为1μg/ml,30min后,用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml;同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,混匀。poly(I:C)/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6h。
B.CpG寡核苷酸/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体),使其终浓度为1μg/ml,30min后,用250μl Opti-MEM培养基稀释CpG寡核苷酸至终浓度为1μM;同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将CpG寡核苷酸和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,混匀。CpG寡核苷酸/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6h。
实验同时设置未经处理的细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,通过加入IFN-α或IFN-β的中和性抗体阻断相应I型干扰素的作用,发现IFN-β的中和性抗体在THP-1细胞中能够抑制TLR3、4、9活化导致的ATX表达上调,而IFN-α的中和性抗体则没有显著的效果(图7)。
四、IFN-α和IFN-β中和性抗体对TLR介导的moDC细胞中ATX表达的影响
1、IFN-α或IFN-β的中和性抗体处理细胞
(1)LPS/IFN-β中和性抗体处理
向培养有moDC细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体,使其终浓度为1μg/ml,30min后,再向其中加入LPS,使其终浓度为0.1μg/ml,LPS处理16小时。实验同时设置未经处理的细胞以及经IgG处理的细胞作为对照。
(2)poly(I:C)/IFN-α或IFN-β中和性抗体处理
向培养有moDC细胞的细胞培养基中加入IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体),使其终浓度为1μg/ml,30min后,用250μl Opti-MEM培养基稀释poly(I:C)至终浓度为10μg/ml;同时用250μl Opti-MEM培养基稀释5μl Lipofectamine2000,轻轻混合,室温放置5分钟;将poly(I:C)和Lipofectamine2000轻轻混合,室温放置20分钟,然后加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,混匀。poly(I:C)/IFN-α中和性抗体(或IFN-β中和性抗体)处理时间为6小时。实验同时设置未经处理的moDC细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,通过加入IFN-α或IFN-β的中和性抗体阻断相应I型干扰素的作用,发现在moDC细胞中IFN-β中和性抗体和IFN-α中和性抗体均能够抑制TLR3配体poly(I:C)诱导ATX的表达,其中IFN-β中和性抗体的抑制作用更为显著(图8中A);IFN-β中和性抗体能够抑制moDC细胞中TLR4配体LPS诱导ATX的表达(图8中B)。
五、siIFNAR1抑制TLR介导ATX的表达
I型干扰素通过结合位于细胞表面的I型干扰素受体(IFNAR)来发挥作用。IFNAR由两个亚基组成,即IFNAR1和IFNAR2。本发明的发明人通过RNAi敲低细胞中IFNAR1的表达,研究其对TLR激活诱导ATX的表达影响。具体操作如下:
1、siRNA的合成
siRNA(双链)由上海吉马公司按照表格中序列进行合成。
siIFNAR1:5’-CUGGGAUGGAUAAUUGGAU-3’(序列6)
阴性对照(NC):5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染,转染48小时后,再参照实施例3步骤一1用TLR4配体细菌脂多糖(LPS)、TLR3配体poly(I:C)或TLR9配体CpG寡核苷酸处理THP-1细胞。
参照实施例2步骤二2进行。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
以β-actin作为内参,检测该内参的一抗为anti-humanβ-actin(购自Santa CruzBiotechnology公司,目录号:sc-47778),二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)。
检测IFNAR1蛋白的一抗为anti-human IFNAR1(购自Santa Cruz Biotechnology公司,目录号:sc-7391);二抗为羊抗小鼠IgG抗体(购自北京中杉金桥生物技术有限公司,目录号:ZDR-5307)。
具体操作参照实施例1步骤一3进行。
5、结果
结果显示,siIFNAR1能够抑制LPS、poly(I:C)和CpG寡核苷酸处理时THP-1细胞中ATX的表达上调(图9)。
上述结果表明,TLR配体诱导ATX表达上调依赖I型干扰素的产生,阻断I型干扰素产生的途径或者阻断I型干扰素发挥功能的信号通路都能够抑制TLR激活导致的ATX表达上调。
实施例5、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)能够协同上调ATX的表达
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和干扰素-γ(IFN-γ)两种细胞因子,参与多种生命活动,与自身免疫疾病密切相关。有多篇文章报道,ATX与自身免疫疾病相关。因此,本发明的发明人分别用TNF-α和IFN-γ单独或者组合处理THP-1细胞,检测对ATX表达影响。具体操作如下:
1、TNF-α和/或IFN-γ处理THP-1细胞
将TNF-α和/或IFN-γ分别单独或者组合加入到THP-1细胞的培养基中,使TNF-α的终浓度为50ng/ml,IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。处理时间为16h。实验同时设置未经处理的细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,TNF-α和IFN-γ单独处理对ATX表达的上调作用较小。而TNF-α和IFN-γ共同处理是则能使ATX的表达显著地升高(图10)。
上述结果说明,TNF-α和IFN-γ能够协同诱导ATX的表达。
实施例6、TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达依赖于I型干扰素的作用
有报道表明,TNF-α能够促进I型干扰素的表达(主要是IFN-β),而I型干扰素和II型干扰素(IFN-γ)具有协同作用。
一、TNF-α对I型干扰素的诱导作用
1、TNF-α处理THP-1细胞
将TNF-α加入到培养有THP-1细胞的细胞培养基中,使其终浓度为50ng/ml。处理时间为2h。实验同时设置未经处理的THP-1细胞作为对照。
2、qRT-PCR检测IFN-α和IFN-βmRNA的表达
参照实施例4步骤二2进行。
结果显示,TNF-α对THP-1细胞中IFN-β的表达具有促进作用(图11中A)。
二、IFN-β中和性抗体抑制TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达
1、TNF-α和IFN-γ/IFN-β中和性抗体处理细胞
向培养有THP-1细胞的细胞培养基中加入IFN-β中和性抗体,使其终浓度为1μg/ml,30min后,将TNF-α和IFN-γ组合加入其中,使TNF-α的终浓度为50ng/ml,IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。TNF-α和IFN-γ的处理时间为16h。实验同时设置未经IFN-β中和性抗体处理的对照组,以及采用IgG替代IFN-β中和性抗体处理的对照组。
2、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例1步骤一2进行。
结果显示,当IFN-β特异的中和性抗体存在时,TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达的作用被显著抑制(图11中B)。
三、siIFNAR1抑制TNF-α和IFN-γ协同上调ATX表达
1、siRNA的合成
同实施例4步骤五1。
2、siRNA转染
待转染细胞为THP-1细胞。参照实施例2步骤二2进行转染,转染48小时后,再将TNF-α和IFN-γ组合加入到其中,使TNF-α的终浓度为50ng/ml,IFN-γ的终浓度也为50ng/ml。TNF-α和IFN-γ的处理时间为16h。实验同时设置未转染的对照组。
3、qRT-PCR检测ATX mRNA的表达
参照实施例2步骤二3进行。
4、Western blot检测
参照实施例4步骤五4进行。
5、结果
结果显示,通过转入siIFNAR1敲低细胞中IFNAR1的表达,阻断I型干扰素的信号通路,能够抑制TNF-α和IFN-γ上调ATX表达的作用(图11中C)。
上述结果表明,阻断I型干扰素的通路能够抑制TNF-α和IFN-γ诱导的ATX表达。
Claims (3)
1.I型干扰素在制备具有在免疫细胞中诱导ATX蛋白表达的功能的产品的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述I型干扰素为IFN-α或IFN-β。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述ATX蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示。
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