CN114591960A - 长反义rna诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法 - Google Patents

长反义rna诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，包括以下步骤：针对细胞内特异表达的内源性RNA设计反向互补的长反义RNA，并在体外进行人工合成；使用长反义RNA处理细胞，以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。本发明针对某些细胞内表达的特异性RNA序列，设计与其连续反向互补的长反义RNA(lasRNA)，使用这些lasRNA对细胞处理后，可以针对特定的细胞诱导干扰素产生，干扰素结合干扰素受体后抑制细胞的生长。因此，本发明可根据细胞内的RNA序列而选择性地诱导干扰素产生和抑制特定类型的细胞生长。

Description

长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法。
背景技术
现有技术中，常用的RNA干扰方法主要有下述几种：1、使用20个碱基左右的双链RNA来达到抑制靶基因的目的，但是其一般不会引起细胞内干扰素的显著变化。并且，针对特定基因的敲减一般只会使相关的靶基因的RNA表达降低，而不会产生细胞的生长抑制；2、小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰的核心，其可通过转录后基因沉默，直接通过酶复合物降解信使RNA(mRNA)分子，从而阻止其翻译，降低其活性。siRNA是一种有价值的研究工具，无论是在细胞培养中还是在活体中，其引入到细胞中的合成的双链RNA(dsRNA)可以选择性地诱导特定基因的表达抑制，但是，siRNA一般不产生干扰素，也不引起细胞的生长抑制；poly(I:C)是比较长的RNA，使用poly(I:C)处理后可以诱导细胞产生干扰素，但这种处理没有序列特异性，无法针对细胞内特定的RNA序列来诱导细胞的生长抑制。
需要指出的是，过去30年，利用单链反义寡核苷酸调控基因表达的研究有很多，其所用的寡核苷酸为修饰后的DNA寡核苷酸，这些寡核苷酸较短，而且其目的主要是调控特定基因的表达和RNA剪切。
针对现有技术中RNA干扰方法存在的问题，本发明提出了一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的新方法，即首先针对细胞内特异表达的RNA设计反向平行的长链反义RNA，并在体外进行人工合成；然后使用长反义RNA处理细胞，以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。表1列出了长反义RNA(LasRNA)与siRNA、poly(I:C)的区别。
表1长反义RNA(lasRNA)与RNAi、poly(I:C)的比较
Figure BDA0003578118430000021
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，该方法可针对特定的细胞诱导干扰素产生，干扰素结合干扰素受体后抑制细胞的生长。
本发明提供一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，包括以下步骤：
S1、针对细胞内特异表达的内源性RNA设计反向互补的长反义RNA，并在体外进行人工合成；
S2、使用长反义RNA处理细胞，以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。
研究发现，与细胞内特异表达的内源性RNA反向互补的单链RNA在被引入到细胞后，与内源性RNA反向互补形成长链双链RNA，能诱导干扰素的产生，并产生细胞的生长抑制。我们将这种与内源性RNA反向平行(互补)的单链RNA称为长反义RNA(Long Anti-SenseRNA，LasRNA)。
作为本技术方案优选地，步骤S1中，所述内源性RNA包括mRNA、lncRNA和感染的病毒RNA。
不同分化状态的细胞或不同的细胞类型具有不同的基因表达谱，也就是所表达RNA种类和水平不同。有的细胞则因为感染了微生物而表达特定的微生物RNA，如感染HPV的宫颈上皮细胞表达HPV E6 RNA，感染HBV的肝脏细胞表达HBx；有的细胞由于处于病理状态(如肿瘤细胞等)而表达特异的RNA；有的细胞则外源性地表达了特定的基因而表达特异的RNA。因此，本发明的方法可根据细胞内的RNA序列而选择性地诱导干扰素的产生，并抑制特定类型细胞的生长。
作为本技术方案优选地，步骤S1中，所述长反义RNA的长度大于等于30个核苷酸。
作为本技术方案优选地，步骤S1中，所述长反义RNA的长度大于等于120个核苷酸。
研究表明，长度大于等于30个核苷酸(nt)以上的长反义RNA具有诱导干扰素产生的作用，而120nt左右的长反义RNA具有更显著的诱导作用。
作为本技术方案优选地，步骤S2具体包括：使用长反义RNA处理细胞，长反义RNA与内源性RNA在细胞浆内形成长双链RNA，长双链RNA以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。
使用长反义RNA对细胞处理后，在细胞桨(不是细胞核)内形成长的双链RNA(double strand RNA)，这个新形成的双链RNA一条是内源性的，一条是外源性的，可以诱导表达特定内源性RNA序列的细胞产生干扰素,从而抑制细胞的生长。
作为本技术方案优选地，步骤S2中，长反义RNA与内源性RNA的连续反向互补序列的长度大于等于30个核苷酸。
某些细胞内表达的内源性RNA如长非编码RNA(lncRNA)等也与细胞内的mRNA等形成部分互补的双链，但一般这种双链的互补是断断续续的，不是连续的，并且这种互补主要发生在细胞核内，而长双链RNA的受体在细胞质内，细胞核内形成的这种非连续性RNA双链不会诱导干扰素反应。
在本发明中，长反义RNA与内源性RNA是连续反向互补的，并且互补序列的长度大于等于30个核苷酸。
作为本技术方案优选地，步骤S2中，长双链RNA以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长具体包括：长双链RNA以诱导表达特定内源性RNA序列的细胞产生干扰素，干扰素结合干扰素受体后抑制细胞的生长。
作为本技术方案优选地，所述干扰素为细胞中I型干扰素。
作为本技术方案优选地，所述I型干扰素包括干扰素α1、干扰素α2和干扰素β。
人体细胞生产三种I型干扰素，干扰素α1(Interferonα1)，干扰素α2(Interferonα2，INFa2)和干扰素β(Interferonβ，INFb)，这三种干扰素可在各个类型的细胞中被诱导表达。干扰素α1、α2和干扰素β可以通过自分泌效应作用于干扰素受体(IFNAR1和INFAR2)来抑制细胞生长。
在本发明中，除针对特异性的外源性微生物如HPV、HBV等的RNA序列设计长反向RNA(lasRNA)以外，也可以针对特定类型的细胞设计长反义RNA来抑制该类型细胞生长。例如，人体有230多种细胞类型，各个类型的细胞所表达的RNA谱是不同的。另外，在病理情况下，病变细胞如肿瘤细胞高表达特定的RNA。因此，本发明使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法可针对特定细胞进行生长抑制诱导。此外，本方法在诱导特定类型植物细胞产生生长抑制方面也有潜在的应用。
本发明的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，与现有技术相比，具有以下优点：
1、本发明针对某些细胞内表达的特异性RNA序列，设计与其连续反向互补的长反义RNA(lasRNA)，使用这些lasRNA对细胞处理后，可以针对特定的细胞诱导干扰素产生，干扰素结合干扰素受体后抑制细胞的生长。因此，本发明可根据细胞内的RNA序列而选择性地诱导干扰素产生和抑制特定类型的细胞生长；
2、不同分化状态的细胞或不同的细胞类型具有不同的基因表达谱，也就是所表达RNA种类和水平不同。有的细胞则因为感染了微生物而表达特定的微生物RNA，如感染HPV的宫颈上皮细胞表达HPV E6 RNA，感染HBV的肝脏细胞表达HBx；有的细胞由于处于病理状态(如肿瘤细胞等)而表达特异的RNA；有的细胞则外源性地表达了特定的基因而表达特异的RNA。而利用本专利提供的方法，可根据细胞内的RNA序列而选择性地诱导干扰素的产生，并抑制特定类型细胞的生长。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明长反义RNA(lasRNA)诱导细胞生长抑制示意图；
图2为本发明长双链RNA(lasRNA)刺激干扰素产生的分子机制；
图3为本发明干扰素和受体结合后刺激下游信号转导；
图4为本发明不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞干扰素mRNA的影响；
图5为本发明不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞干扰素分泌的作用；
图6为本发明不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞生长的影响；
图7为本发明CK8长反义RNA(lasRNA)和CD235a长反义RNA(lasRNA)对HeLa细胞和K562干扰素分泌的作用；
图8为本发明CK8长反义RNA(lasRNA)和CD235a长反义RNA(lasRNA)对HeLa细胞和K562的生长抑制作用。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、长反义RNA(lasRNA)诱导细胞生长抑制的原理
由图1可知，将制备的长反义RNA(lasRNA)导入细胞内，如果细胞内表达有互补的内源性RNA，长反义RNA(lasRNA)与细胞内RNA形成长双链RNA(long double strand RNA，ldsRNA)，长双链RNA将诱导干扰素的生成并抑制细胞生长。
2、长反义RNA通过其细胞质内的受体产生诱导干扰素效应
细胞质内双链RNA(dsRNA)的识别受体(或称感受器)有RIG-I、MDA5和TLR3，其中RIG-I和MDA5为细胞质内的双链RNA(dsRNA)结合蛋白质和感受器，TLR3是位于细胞质内的小泡等的双链RNA(dsRNA)受体和感受器。这些双链RNA(dsRNA)受体在结合双链RNA(dsRNA)后，启动信号转导，使干扰素的表达增高(图2)。
RIG-I和MDA5属于维甲酸诱导基因I(RIG-I)样受体(RLRs)家族成员，是细胞浆内双链RNA感受器，在双链RNA诱导的干扰素产生中起关键作用。RIG-I识别短双链RNA(dsRNA)和5′-三磷酸RNA，MDA5识别特别长的双链RNA(dsRNA)。RIG-I和MDA5招募另一种衔接蛋白IPS-1，IPS-1通过TBK1/IKK/i复合体磷酸化IRF-3和IRF-7，磷酸化IRF-3和IRF-7激活I型IFN基因的表达。
TLR3定位于细胞质小泡，如内质体和内质网(ER)，识别微生物核苷酸。TLR3识别双链RNA(dsRNA)。TLR3的晶体结构分析表明，含有LRR结构域的TLR3的外结构域在一定长度以上的双链RNA(dsRNA)存在下发生二聚。TLRs的外结构域呈马蹄形，双链RNA(dsRNA)与TLR3外域的N端和C端部分结合，配体与TLR外结构域的结合稳定了二聚体的形成，从而导致TIR结构域的二聚化和信号转导的启动。作为对双链RNA(dsRNA)刺激的响应，TLR3招募了另一个适配器蛋白TRIF，TRIF通过其N端部分的TRAF结合基序与TRAF3和TRAF6结合，TRIF含有一个C端受体相互作用蛋白(RIP)同型相互作用基序(RHIM)，并通过RHIM与RIP1和RIP3相互作用。TRADD也参与了TRIF依赖的信号通路。TRIF和IPS-1结构类似，共享信号分子，也就是说表达IFN诱导基因的下游信号分子在TLR3和RLR信号通路之间共享，TRIF和IPS-1通过激活TBK1/IKK/i复合体而使IRF-3和IRF-7发生磷酸化，磷酸化后的IRF-3和IRF-7激活I型IFN基因的表达(图2)。
由图2可知，长双链RNA通过结合双链RNA受体RIG-I、MDA5和TLR3，启动信号转导，使干扰素的表达增高。
3、干扰素α1、α2和干扰素β可以通过自分泌效应作用于干扰素受体(IFNAR1和INFAR2)来抑制细胞生长
干扰素α1、α2和干扰素β与受体结合可引发Jak激酶和Stat转录因子的磷酸化，导致Stat激活、核移位和ISRE报告结构的转录(图3)。干扰素α处理的细胞与对照组细胞平行进入S期，但进入G2/M期的时间延迟，延长干扰素α治疗剂量依赖性地抑制细胞生长。对干扰素α处理的非同步培养细胞的细胞周期分析显示，S期细胞群增加。干扰素结合受体后产生的生长抑制作用可能是通过TP53通路来实现的，其中GADD45a和Dusp5可能在抑制细胞生长中起非常重要作用(图3)。
由图3可知，干扰素α1、α2和干扰素β通过自分泌效应作用于干扰素受体(IFNAR1和INFAR2)来抑制细胞生长。这些生长抑制作用可能是通过TP53通路来实现的，其中GSDD45和Dusp5等基因的表达可能在抑制细胞生长中起非常重要作用。
实施例2
本实施例选用上皮细胞特异表达角蛋白8(CK8)RNA，采用针对CK8mRNA的长反义RNA(lasRNA)，以验证长双链RNA在上皮来源细胞如HeLa细胞内诱导干扰素产生和细胞生长抑制的效果。表2列出了本实施例所用部分细胞系的标记物基因。
表2.本实施例涉及的部分细胞系情况
Figure BDA0003578118430000091
1、不同长度反义RNA的制备
首先合成了带有T7启动子的、对应反义RNA序列的双链DNA模板(见表4)，用T7RNA聚合酶进行转录，制备相关的RNA，反义RNA序列见表3。
本发明中CK8 lasRNA的序列如SEQ ID No.1所示，CD235a lasRNA的序列如SEQ IDNo.2所示。
1.1制备
在试管中，于室温一次加入下列试剂：5x转录缓冲液100μl、DTT(100mM)100μl、RNase inhibitor500单位、rNTP capping mix(see Section II)100μl、Ribo m 7G CapAnalog，5mM 25μl、DNA模板(10μg)10μl、T7 RNA聚合酶200单位、加ddH2O至500μl，室温培养3h。
1.2 RNA纯化
(1)、在180μl反应产物中添加20μl 3M醋酸钠，pH 5.2，彻底混合；
(2)、加等量苯酚/氯仿混合物，然后用氯仿萃取两次，收集水相并转移到新的管中；
(3)、通过加入2体积的乙醇沉淀RNA，-20℃孵育至少30分钟，离心收集沉淀；
(4)、移除上清液，用500μl冷却的70％乙醇冲洗沉淀；
(5)、将沉淀干燥后加入乙酸缓冲液进行冷冻保存。
表3本实施例反义RNA序列
Figure BDA0003578118430000101
Figure BDA0003578118430000111
表4本实施例反义RNA制备所用DNA模板和T启动子序列
Figure BDA0003578118430000112
2、不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞干扰素mRNA的影响
CK8是上皮细胞的特征性标记物，上皮细胞胞质中的骨架蛋白除微丝(肌动蛋白)、微管蛋白外，主要是细胞角蛋白(cytokeratins，CK)。CK8存在于某些正常腺上皮及其肿瘤，包括许多导管上皮和腺上皮，如结肠、胃、小肠、气管的上皮和尿路上皮。
宫颈癌细胞HeLa表达CK8，但红系白血病细胞K562则不表达CK8。本实施例采用不同长度的CK8反义RNA对HeLa细胞进行了处理，观察细胞内干扰素a1、a2、b的mRNA水平的变化。
使用不同长度(20nt、30nt、60nt、120nt)的CK8反义RNA和对照反义RNA(相同长度的CD235a反义RNA)对HeLa细胞进行了处理后，使用QRT-PCR法对干扰素α1、α2、β的mRNA水平进行测定。具体测定方法如下：
(1)、将HeLa细胞用含5％FBS的DMEM培养基进行培养。培养条件为：100mm培养皿，10mL培养基，5％CO2，37℃进行培养；培养HeLa细胞生长达50％融合度后，加入不同长度(20nt，30nt，60nt，120nt)的CK8和对照反义RNA对HeLa细胞进行了处理。反义RNA和对照RNA的终浓度是0-50nM，用脂质体L2000进行了细胞转导；
(2)、加入反义RNA和对照RNA24小时后，将贴壁的细胞用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加1mLPBS在冰上用细胞刮刮细胞，4℃，3000rpm离心10分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并对细胞进行计数；
(3)、每组细胞中加入1mL Trizol Reagent裂解细胞，冰上裂解5min。将各组Trizol裂解液中的细胞吸至无RNA酶的1.5mL EP管中，剧烈震荡后，室温放置3min；
(4)、每管加入200μL氯仿，反复颠倒剧烈震荡几次，室温放置5min，4℃，12000rpm，离心15min。
(5)、取出另一新的1.5mL EP管，小心将上层水相转移至其中(约500μL)，每管加入等体积的异丙醇(约500μL)，轻轻来回颠倒几次混匀后室温放置10min，4℃，12000rpm，离心10min；
(6)、小心弃去上清，加入提前预冷的75％乙醇(用无RNA酶水配制)至少1mL，轻轻弹管壁使沉淀悬浮，4℃，7500rpm，离心5min；
(7)、小心弃去上清，敞开管盖于室温干燥5-10min，以20-30μL无RNA酶水溶解RNA，55℃金属水浴上加热5min以促进RNA溶解。
(8)、取1μL总RNA用Nano
Figure BDA0003578118430000131
ND-1000分光光度计检测其浓度及纯度(OD 260/280应为1.9-2.1)，分装后于-80℃保存备用或直接进行一下操作；
(9)、逆转录合成cDNA，根据Thermo SCIENTIFIC公司逆转录试剂盒提供的说明书进行操作，所有操作均需在冰上进行，具体步骤如下：
取无RNA酶的200μl PCR管中加入以下成分：模板RNA适量(RNA量在0.5-2μg)Oligo-(dT)18Primer 1μL、Random Primer 1μL，加水(nuclease-free)至12μL，65℃加热变性5min后迅速放于冰上冷却；
另取一个无RNA酶的200μl PCR管中依次加入一下成分：5×RT Buffer 4μL、RiboLock RNase Inhibitor 1μL、10mM dNTP Mix 2μL、RevertAid ReverseTranscriptase 1μL，将该混合物加入第一个管中，充分混匀，25℃孵育5min，42℃加热60min，70℃变性5min使反转录酶失活，4℃保存；
(10)、用实时定量PCR对干扰素mRNA进行定量测定，如下为干扰素α1、干扰素α2和干扰素β的定量PCR引物：
干扰素α1定量PCR引物：
Forward：AATTCTGCACCGAACTCTACC(Sense)
Reverse：AGGCACAAGGGCTGTATTT(AntiSense)；
干扰素α2定量PCR引物：
Forward:GGATGAGACCCTCCTAGACAAA(Sense)
Reverse：CAGGCACAAGGGCTGTATTT(AntiSense)；
干扰素β定量PCR引物:
Forward:GAACCTCCTGGCTAATGTCTATC(Sense)
Reverse:TCCTTGGCCTTCAGGTAATG(AntiSense)；
图4(A)为干扰素α1(INFa1)mRNA；(B)为干扰素α2(INFa2)mRNA；(C)为干扰素β(INFb)的mRNA。**P<0.01，n＝6，t检验(CK8反义RNA组与相同长度的对照反义RNA组进行了对比)。
结果表明，反义RNA对干扰素的诱导作用具有剂量依赖性，并且30nt长度以上的CK8反义RNA对干扰素的产生有明显作用。
3、不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞干扰素分泌的影响
使用不同长度(20nt、30nt、60nt和120nt)的CK8反义RNA和对照反义RNA(相同长度的CD235a反义RNA)对HeLa细胞进行了处理后，用ELISA法对干扰素α1、α2和β的分泌水平进行了测定，具体方法如下：
(1)、将HeLa细胞用含5％FBS的DMEM培养基进行培养。将K562白血病细胞用含10％FBS的RPMI培养基进行培养。培养条件：100mm培养皿，10mL培养基，5％CO2，37℃进行培养；
(2)、培养HeLa细胞生长达50％融合度后，或者将K562细胞培养到100万细胞/mL后，加入不同长度(20nt，30nt，60nt和120nt)的CK8和CD235a反义RNA。反义RNA和对照RNA的终浓度是0-50nM；
(3)、加入反义RNA24小时后，将细胞及其培养液于3000rpm下离心5min，收集培养液，用ELISA法进行干扰素蛋白质的浓度测定。
图5(A)为干扰素α1(INFa1)蛋白质水平的变化；(B)为干扰素α2(INFa2)蛋白质水平的变化；(C)为干扰素β(INFb)蛋白质水平的变化；(D)为不同浓度120nt长度的CK8反义RNA对干扰素α1分泌的影响。**P<0.01，,n＝6，t检验(CK8反义RNA组与相同长度的对照反义RNA组进行对比)。
结果表明，CK8长反义RNA在HeLa细胞中显著地诱导干扰素α1、α2和β分泌。
4、不同长度CK8反义RNA对HeLa细胞生长的影响
使用不同长度(20nt，30nt，60nt，120nt)的CK8反义RNA和对照反义RNA(相同长度的CD235a反义RNA；CD235a在HeLa细胞中不表达)对HeLa细胞进行处理后72h，对细胞数进行了测定。**P<0.01，n＝6，用t检验进行了对比(CK8反义RNA组与相同长度的对照反义RNA组进行对比)。具体方法如下：
(1)、将HeLa细胞用含5％FBS的DMEM培养基进行培养。培养条件：100mm培养皿，10mL培养基，5％CO2，37℃进行培养；
(2)、培养HeLa细胞生长达50％融合度后，加入不同长度(20nt、30nt、60nt和120nt)的CK8和对照反义RNA对HeLa细胞进行了处理。反义RNA和对照RNA的终浓度是50nM；
(3)、培养24-72h后，将贴壁的细胞用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加1mL PBS在冰上用细胞刮刮细胞，4℃，3000rpm离心10分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并用MTT法对细胞数进行测量。
结果表明，30nt、60nt、120nt长度的CK8反义RNA对HeLa细胞生长有显著抑制作用(图6)。
5、CK8反义RNA、CD235反义RNA对HeLa细胞和K562干扰素分泌的作用
宫颈癌细胞HeLa表达CK8，但红系白血病细胞K562则不表达CK8；CD235a在红系白血病细胞K562中表达，在HeLa细胞中不表达。CD235a Glycophorin A(血型糖蛋白A)，是一种主要表达在人红细胞及其前体中的唾液糖蛋白，分子量为10kDa。它在红系前体和红细胞表面表达。它携带MNS血型的抗原决定簇，被认为是血凝和溶血的抑制剂。CD235a反义RNA的序列见表3。
(1)、将HeLa和K562细胞用含5％FBS的DMEM培养基进行培养。培养条件：100mm培养皿，10mL培养基，5％CO2,37℃进行培养；
(2)、培养细胞生长达50％融合度后，加入120nt的CK8反义RNA或CD235反义RNA，反义RNA和对照RNA的终浓度是50nM；
(3)、加入反义RNA24小时后，取细胞培养液用ELISA法对干扰素进行浓度测定。
图7(A)为CK8长反义RNA和CD235a长反义RNA对HeLa细胞干扰素分泌的影响；(B)为CK8长反义RNA和CD235a长反义RNA对K562细胞干扰素分泌的影响。IFNa1，干扰素α1；IFNa2，干扰素α2；IFNb，干扰素β。*P<0.05，**P<0.01，n＝6，用t检验进行了对比。
结果表明，CK8长反义RNA显著性地增加了HeLa细胞干扰素分泌，但是对K562细胞无显著刺激作用；CD235长反义RNA显著性地增加了K562细胞干扰素分泌，但是对HeLa细胞无显著刺激作用。
6、CD235a lasRNA和CK8 lasRNA对HeLa细胞和K562细胞生长的影响
(1)、将HeLa细胞用含5％FBS的DMEM培养基进行培养。将K562白血病细胞用含10％FBS的RPMI培养基进行培养。培养条件：100mm培养皿，10mL培养基，5％CO2，37℃进行培养；
(2)、培养HeLa细胞生长达50％融合度后，或者将K562细胞培养到100万细胞/mL后，加入CK8和CD235a长反义RNA(120nt)。反义RNA和对照RNA的终浓度是50nM；
(3)、培养24h、48h、72h后，将贴壁的细胞用冰预冷的PBS洗细胞两次，再加1mL PBS在冰上用细胞刮刮细胞，4℃，3000rpm离心10分钟，收集细胞。用PBS缓冲液悬浮细胞，并对细胞进行计数；
(4)、加入反义RNA 24h、48h、72h后，取K562培养液对细胞进行计数。
图8(A)为CK8长反义RNA(lasRNA)和CD235a长反义RNA(lasRNA)对HeLa细胞的生长抑制作用。(B)为CK8长反义RNA(lasRNA)和CD235a长反义RNA(lasRNA)对K562的生长抑制作用。分别用120nt长度(50nM)的CK8长反义RNA和CD235a长反义RNA对HeLa细胞和K562进行了处理24h、48h、72h后对细胞数进行了测定。*P<0.05，**P<0.01，n＝6，用t检验进行了对比。
结果表明，CD235a长反义RNA抑制K562细胞生长，在HeLa细胞中没有作用；CK8的长反义RNA抑制HeLa细胞生长，在K562中没有作用。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 北京基因安科技有限公司
<120> 长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法
<130> 2022
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1793
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 1
uuggcagagc uagcugaggu uuuauuuugg accaaaaaaa aaaagcaauu gaauuguuuu 60
guagcuggag gcaugggcaa gggggguccc cagguaguaa acuccccagg ugggcugagg 120
gcuagggcug agccucaggu gggucuccug uucccagugc uacccugcau agcggccucc 180
uucccaggcu cuggggcagc gcaggagggg uaggcuggga ggggcugccg cagcuguuca 240
cuugggcagg acgucagagg acucagacac cagcuuccca ucacgugucu cgaucuucuu 300
cacaaccacg gcccuggagg agcuggugcg gcugaaggag cuggagcccg cgccagagcc 360
aaagcuggag cccaggcugu agcugaggcc ggggcuugug aggcccccau aggccgagcu 420
cagaccaccu gcauagccgc ugguggucuu cguaugaaua cucauguucu gcaucccaga 480
cuccagccgg cucuccucgc ccuccagcag cuuccuguag guggcgaucu cgauguccag 540
ggccagcuug acguucauca gcuccuggua cucacgcagc ugccgcgcca uguccugcuu 600
ggcccgcugc agggcggccu ccagcucgga caacuuggcg uuggcauccu uaauggccag 660
cucuccacgc ugcucggcau cugcaauggc ggccuccagg gaagcccucu ggccuuugag 720
gcccucaauc ucagccugga gccggcugau guuccgguuc aucucagaga ucucagucuu 780
ugugcgccgc aggucauccc cgugcuuccc agccaggcuc ugcagcuccu cauacuugau 840
cugguacaug cucucagccu cagcccggcu gcgguuggca auauccucgu acugugccuu 900
gaccucagca augaugcugu ccauguccag ggagcggcug uuguccaugg acagcaccac 960
agaugugucc gagaucuggg acugcagcuc ccggaucucc ucuucauaua gcugccugag 1020
gaaguugauc ucgucgguca gcccuuccag gcgagacucc agcucuaccu uguucaugua 1080
agcuucaucc acauccuucu ugaugaggac aaauucguuc uccaucucug uacgcuuauu 1140
gaucucaucc ucauacuugu ucuugaaguc cuccaccagc cccugcaugu ugccaagcuc 1200
cgccuccagc uucagcuucu ccuggcccag agucuccagc ugccgccuaa gguuguugau 1260
guagcucucg aacauguugu ccauguugcu ucgagccguc uucugcugcu gcaggaggcu 1320
ccacuugguc uccagcaucu uguucugcug cuccaggaac cguaccuugu cuaugaagga 1380
ggcaaacuug uuguugaggg ucuugaucug cuccuucucc ugggugcgca cggccuggau 1440
guuggggucc accuccagga caagggggcu cagcaggcuc ugguugaccg uaacugcggu 1500
gaugccuccc augccgcugg ccccaccaua gccgccgccc aggccaccgc gaaaguugcu 1560
gcugcccacu cgggagaagc ucgaggagcu gaugcgggaa ccgggcccac ucguguagga 1620
gcggcugcug aaggcccggg ggccagaggu ggacaccuug uaggacuucu gggucacccu 1680
gauggacaug guagaggcag gaguggaggc aggcgggccg aaccaggcgg agaucccuuc 1740
cugcaggucc uggcuccagc ucaccccauu cauuccgcaa acauuugcug aau 1793
<210> 2
<211> 573
<212> RNA
<213> Artificial
<400> 2
auuuuucacu ugacugaagu cuuaugucuu cuuuguguuc uuuccacauu ugguuuggug 60
aacagauucu cauugaucac uugucucugg auuuucuauu ucaacagaac uuaaaggcac 120
gucuguguca ggugagggga gagguuuuac aucagauggg cuuuucuuua ucagucggcg 180
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gaguguuauc ucugguucag agaaaugaug ggcaaguugu acccuuucuc cgguuuccuc 300
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ugcauaugug ucccguuugu gcguaucauu ugucugugau gagauguaac ucuuugugac 420
ugaagaagag ggugaagugu gcauugccac accaguggua cuugaugcug auaugcucac 480
aauugcugac aauaguaaua caaagauuau uuuuccauac auccugagau caugagcugg 540
uuccugaagu uagugcaaaa aaacuaccaa aga 573

Claims (9)

1.一种使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、针对细胞内特异表达的内源性RNA设计反向互补的长反义RNA，并在体外进行人工合成；
S2、使用长反义RNA处理细胞，以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。
2.根据权利要求1所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S1中，所述内源性RNA包括mRNA、lncRNA和感染的病毒RNA。
3.根据权利要求1所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S1中，所述长反义RNA的长度大于等于30个核苷酸。
4.根据权利要求3所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S1中，所述长反义RNA的长度大于等于120个核苷酸。
5.根据权利要求1所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S2具体包括：使用长反义RNA处理细胞，长反义RNA与内源性RNA在细胞浆内形成长双链RNA，长双链RNA以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长。
6.根据权利要求5所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S2中，长反义RNA与内源性RNA的连续反向互补序列的长度大于等于30个核苷酸。
7.根据权利要求5所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，步骤S2中，长双链RNA以诱导干扰素的产生、抑制细胞的生长具体包括：长双链RNA以诱导表达特定内源性RNA序列的细胞产生干扰素，干扰素结合干扰素受体后抑制细胞的生长。
8.根据权利要求7所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法，其特征在于，所述干扰素为细胞中I型干扰素。
9.根据权利要求8所述的使用长反义RNA诱导细胞干扰素生成、抑制细胞生长的方法统，其特征在于，所述I型干扰素包括干扰素α1、干扰素α2和干扰素β。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104312973A (zh) * 2014-10-09 2015-01-28 北京师范大学 I型干扰素在诱导atx蛋白表达中的应用

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