WO2010032506A1 - アレルギー疾患の治療のための核酸医薬 - Google Patents

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WO2010032506A1
WO2010032506A1 PCT/JP2009/055383 JP2009055383W WO2010032506A1 WO 2010032506 A1 WO2010032506 A1 WO 2010032506A1 JP 2009055383 W JP2009055383 W JP 2009055383W WO 2010032506 A1 WO2010032506 A1 WO 2010032506A1
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stat6
strand
seq
sense strand
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PCT/JP2009/055383
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横関博雄
細矢一輝
佐藤貴浩
根本靖久
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国立大学法人東京医科歯科大学
株式会社ハプロファーマ
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
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    • A61P17/04—Antipruritics
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    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Definitions

  • the present invention relates to a double-stranded RNA (dsRNA) molecule targeting the STAT6 gene and a pharmaceutical composition for treatment or prevention of allergic diseases comprising the dsRNA molecule.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • RNA interference is a phenomenon in which mRNA is cleaved in a sequence-specific manner by double-stranded RNA (dsRNA), resulting in suppression of gene expression, and is a defense system at the nucleic acid level common to organisms.
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA short interfering RNA
  • the immune response consists of cellular immunity by type-1 helper (Th1) cells and humoral immunity by type-2 helper (Th2) cells.
  • Th1 immune response is an autoimmune disease and transplant rejection
  • Th2 immune response is an allergic disease.
  • IL-4 and IL-13 are known as Th2-type cytokines involved in the Th2 immune response.
  • the transcriptional regulator STAT6 (Signal transducers and activators of transcription 6) is an important transcriptional regulator of signal transduction through the IL-2 and IL-13 receptors, which are Th2-type cytokines, and is involved in maintaining a Th2-type immune response. Has been reported.
  • mice lacking STAT6 have been prepared, and it has been reported that IL-4 information is not transmitted to cells, and as a result, no allergic reaction occurs (see Non-Patent Documents 2 and 3). ).
  • Waterhouse, P.A. M.M. et al. Nature, 411: 834-843, 2001. Takeda et al. , Nature, 1996 Apr 18; 380 (6575): 627-30. Shimoda et al. , Nature, 1996 Apr 18; 380 (6575): 630-3.
  • the present invention provides a double-stranded (ds) RNA capable of suppressing the expression of STAT6 involved in allergic diseases through Th2-type cytokines by RNA interference, and a pharmaceutical composition for preventing or treating allergic diseases containing the dsRNA.
  • ds double-stranded
  • the inventors of the present application have found that a sense strand having the same base sequence as the STAT6 gene sequence or a part thereof and an antisense having a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand It was found that a dsRNA molecule consisting of a strand specifically suppresses the expression of the STAT6 gene.
  • the present invention is as follows.
  • a double-stranded RNA (dsRNA) molecule that targets the mRNA of the STAT6 gene is a dsRNA molecule of the following (a) or (b):
  • A) One strand is a sense strand identical to a sequence having 15 to 50 consecutive bases in a base sequence in which thymine is replaced with uracil in the STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the strand is an antisense strand comprising a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand; or (b) a base sequence in which thymine is replaced with uracil in the STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a sense strand consisting of a sequence capable of hybridizing to the STAT6 gene, wherein one or several bases are deleted, substituted or added in the sequence having 15 to 50 consecutive bases
  • the antisense strand comprises a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand.
  • dsRNA molecule according to [1], wherein the dsRNA molecule is the following (c) or (d): (C) a sequence having the 3426th to 3446th bases of the base sequence in which thymine is substituted with uracil in the human STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1 on one side, a sequence having the 3432th to 3453th bases, A nucleotide selected from the group consisting of a sequence having nucleotides 259 to 279 and a sequence having nucleotides 3026 to 3046 in the nucleotide sequence in which thymine is substituted with uracil in the mouse STAT6 gene sequence represented by No.
  • 3432 to 3452 A sequence having the 259th to 279th bases of the base sequence in which thymine is substituted with uracil in the mouse STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 3, and a sequence having the 3026th to 3046th bases
  • a sense strand consisting of a sequence in which one or several bases are deleted, substituted or added in any base sequence selected from the group consisting of the sequence capable of hybridizing to the STAT6 gene, and the other strand
  • An antisense strand comprising a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand.
  • the dsRNA molecule comprises a sense strand represented by SEQ ID NO: 5 and an antisense strand represented by SEQ ID NO: 6, a sense strand represented by SEQ ID NO: 7 and an antisense strand represented by SEQ ID NO: 8, and a sequence
  • the sense strand represented by number 9 and the antisense strand represented by SEQ ID NO: 10 the sense strand represented by SEQ ID NO: 11 and the antisense strand represented by SEQ ID NO: 12, and the sense represented by SEQ ID NO: 13
  • the dsRNA molecule according to [2] comprising any one of the base pairs selected from the group consisting of a strand and an antisense strand represented by SEQ ID NO: 14.
  • [4] The dsRNA molecule according to any one of [1] to [3], wherein the sense strand and the antisense strand are linked via a linker molecule.
  • [5] A vector comprising the template DNA of the dsRNA molecule of [4] and expressing the dsRNA molecule.
  • [6] A pharmaceutical composition for treating or preventing allergic diseases that can suppress the expression of the STAT6 gene, comprising one or more dsRNA molecules according to any one of [1] to [4].
  • [7] A pharmaceutical composition for the treatment or prevention of allergic diseases that can suppress the expression of the STAT6 gene, comprising the vector of [5].
  • a vector comprising the template DNA of the dsRNA molecule of [9] and expressing the dsRNA molecule.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of experimental protocols 1 (A) and 2 (B) of the examples.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structures of siRNA and shRNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing suppression of STAT6 expression by introduction of human STAT6 siRNA.
  • FIG. 4 is a diagram showing eotaxin-3 production by human fibroblasts introduced with human STAT6 siRNA.
  • FIG. 5 is a diagram showing suppression of expression of STAT6 at the mRNA level in human fibroblasts into which human STAT6 shRNA has been introduced.
  • FIG. 6 is a diagram showing suppression of expression of STAT6 at the protein level in human fibroblasts into which human STAT6 shRNA has been introduced.
  • FIG. 1 is a diagram showing an outline of experimental protocols 1 (A) and 2 (B) of the examples.
  • FIG. 2 is a diagram showing the structures of siRNA and shRNA.
  • FIG. 3 is a diagram showing suppression of STAT6 expression by introduction of human STAT6 si
  • FIG. 7 is a diagram showing eotaxin-3 production by human fibroblasts into which human STAT6 shRNA has been introduced.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of confirming suppression of STAT6 expression in normal fibroblasts by introduction of mouse STAT6 siRNA by the Western blot method.
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of confirmation by RT-PCR of suppression of STAT6 expression in normal fibroblasts by introduction of mouse STAT6 siRNA.
  • FIG. 10 is a diagram showing the results of quantifying the eotaxin (CCL11) concentration produced by co-stimulation of IL-4 and TNF-alpha in normal fibroblasts by introducing mouse STAT6 siRNA by ELISA.
  • FIG. 11 is a diagram showing the effect of STAT6 siRNA on contact hypersensitivity reaction.
  • FIG. 11A shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by TNCB
  • FIG. 11B shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by DNFB
  • FIG. 11C shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by Oxazole.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of STAT6 siRNA on contact hypersensitivity reaction by Giemsa staining.
  • FIG. 13 is a diagram showing the effect of STAT6 siRNA on the contact hypersensitivity reaction by the profile of cells invading.
  • FIG. 14 is a diagram showing the effect on contact hypersensitivity reaction by STAT6 siRNA-containing ointment.
  • FIG. 11A shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by TNCB
  • FIG. 11B shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by DNFB
  • FIG. 11C shows the effect on the contact hypersensitivity reaction by Oxazole.
  • FIG. 12 is a diagram showing the effect of STAT6 siRNA
  • FIG. 15 is a diagram showing the effect of STAT6 siRNA on the rhinitis model by the number of sneezing.
  • FIG. 16 shows the effect of STAT6 siRNA on rhinitis model by Giemsa staining.
  • FIG. 17 shows the effect of STAT6 siRNA on the rhinitis model by the number of infiltrating eosinophils.
  • the present invention relates to a double-stranded dsRNA (double-stranded RNA) molecule that targets the mRNA of the transcriptional regulatory factor STAT6 (Signal transducers and activators of transcription 6).
  • One strand of the dsRNA molecule is a sense strand having the same base sequence as the transcription factor STAT6 gene sequence or a part thereof and capable of hybridizing, and the other strand is a base sequence complementary to the base sequence of the sense strand
  • a dsRNA molecule that is an antisense strand containing, wherein the sense strand and the antisense strand bind complementarily.
  • the sense strand and the antisense strand do not necessarily have to be completely complementary, and one or more, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably There may be 1 to 3, 2 or 1 mismatches.
  • the target sequence in the STAT6 gene may be a coding region or a non-coding region.
  • dsRNA molecules include siRNA molecules and shRNA molecules.
  • the dsRNA molecule can also form a miRNA molecule.
  • the number of bases of the target sequence of the STAT6 gene of the dsRNA molecule of the present invention is not particularly limited, but is 15 to 50 bases, 15 to 45, 15 to 40, 15 to 35, or 15 to 30 bases, preferably 20 to 35 bases, More preferred is 21 to 35, 21 to 25, or 21 to 23 bases, and particularly preferred is 21 bases.
  • the sense strand having the same nucleotide sequence as the STAT6 gene sequence or a part thereof and capable of hybridizing is the human STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the mouse STAT6 represented by SEQ ID NO: 3. It means an RNA sequence having a base sequence in which thymine in the gene sequence is replaced with uracil.
  • the sense strand constituting the dsRNA molecule of the present invention is preferably the same as the gene sequence of STAT6, but may be a substantially identical sequence. That is, as long as the sense strand of the dsRNA molecule and the actual target STAT6 mRNA sequence hybridize, one or more, that is, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3, 2 One or one base may be deleted, substituted or added to cause a mismatch.
  • Hybridization conditions in this case are in vivo conditions when the dsRNA of the present invention is administered in vivo and used as a medicament, and moderate when using the dsRNA of the present invention as a reagent in vitro. Stringent conditions or highly stringent conditions.
  • the sense strand sequence and the target sequence of the dsRNA of the present invention are the BLAST [J. Mol. Biol. , 215, 403-410 (1990)], FASTA [Methods. Enzymol. , 183, 63-98 (1990)] and the like, a numerical value calculated by using a default (initial setting) parameter of a homology search program known to those skilled in the art is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably Has sequence identity of 96, 97, 98 or 99% or more.
  • the dsRNA molecule of the present invention is provided as a shRNA (short hairpin RNA) molecule in which the sense strand and the antisense strand defined above are connected via a linker molecule and a loop structure is formed at the linker portion to be folded. Can be done.
  • shRNA molecules can be processed by Dicer to produce siRNA molecules.
  • the linker molecule contained in the shRNA molecule may be a polynucleotide linker or a non-polynucleotide linker as long as it can link the sense strand and the antisense strand to form a stem loop structure, and is not particularly limited. Polynucleotide linkers known to those skilled in the art are preferred.
  • the hairpin loop sequence is not limited, and examples thereof include a sequence starting with UU consisting of 5 to 12 bases, such as UUCAAGGA.
  • Other loop sequences include Lee NS. et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 500-505, Paddison PJ. et al. (2002) Genes and Dev. 16, 948-958, Sui G. et al. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 5515-5520, Paul CP. et al. (2002) Nat. Biotech. 20, 505-508, Kawasaki H. et al. et al. (2003) Nucleic Acids Res.
  • a loop having the sequence described in 31,700-707 or the like can be employed.
  • shRNA molecules can also be synthesized in vitro or in vivo based on known methods as described above. When synthesizing, a single RNA strand containing a sense strand and an antisense strand as reverse sequences is synthesized, and then a single strand of RNA is formed by self-complementary binding to obtain a shRNA molecule. Can do.
  • the sense strand or antisense strand constituting the dsRNA molecule may optionally have an overhang at the 3 ′ end, and the type and number of bases of the overhang are not limited. For example, 1 to 5
  • a sequence consisting of 1 to 3, more preferably 1 or 2 bases is exemplified, and examples thereof include TTT, UU and TT.
  • an overhang refers to a base that is added to the end of one strand of a dsRNA molecule and does not have a base that can complementarily bind to the corresponding position of the other strand.
  • the overhang may be a base that essentially constitutes the DNA of the target STAT6 gene.
  • the dsRNA of the present invention comprises 21 consecutive bases in the base sequence in which the sense strand is substituted with uracil in the STAT6 gene sequence, and the antisense strand excludes 2 bases on the 3 ′ end side of the sense strand. It has a sequence complementary to the base sequence, and has a structure having an overhang consisting of 2 bases on the 3 ′ end side of the sense strand and the antisense strand.
  • the sense strand or the antisense strand constituting the dsRNA molecule is 1 to 3 bases as necessary within a range that does not affect the siRNA activity in order to facilitate various experimental operations such as gene sequencing.
  • the sense strand or the antisense strand may be phosphorylated at the 5 ′ end as necessary, and for the shRNA molecule, triphosphate (ppp) may be bound to the 5 ′ end. As described above, triphosphate (ppp) may be bound to the overhang consisting of G at the 5 ′ end of the sense strand.
  • the sense strand has a sequence having the 3426th to 3446th bases of the base sequence in which thymine is substituted with uracil in the human STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1, and has a 3432 to 3452th base.
  • nucleotide sequence is the same as that of the human STAT6 gene sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a sequence having positions 3426 to 3446 of the nucleotide sequence in which thymine is substituted with uracil, or positions 3432 to 3451 It is preferable that it is the same as the sequence having the base.
  • the dsRNA molecule of the present invention comprises a sense strand represented by SEQ ID NO: 5 and an antisense strand represented by SEQ ID NO: 6, a sense strand represented by SEQ ID NO: 7 and an antisense strand represented by SEQ ID NO: 8,
  • the sense strand represented by number 9 and the antisense strand represented by SEQ ID NO: 10 the sense strand represented by SEQ ID NO: 11 and the antisense strand represented by SEQ ID NO: 12, and the sense represented by SEQ ID NO: 13
  • the dsRNA of the present invention can be synthesized in vitro by chemical synthesis or a transcription system using a promoter and RNA polymerase.
  • RNA single strands having sequences complementary to each other as reverse sequences and having self-complementarity may be synthesized and combined at the self-complementary part. Annealing of the synthesized sense strand and antisense strand can be performed by a general method known to those skilled in the art.
  • dsRNA annealing buffer Dissolve the synthesized sense strand and antisense strand in dsRNA annealing buffer, mix the same amount (equal number of moles), heat the temperature until the double strands dissociate, and then gradually cool and incubate. Can be done by. Annealing conditions may be performed, for example, by allowing to stand at 90 ° C. for 1 minute and then at 37 ° C. for 1 hour. Then, dsRNA molecules can be obtained by performing phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation.
  • synthesis using a promoter and RNA polymerase may be performed by synthesizing a template DNA having a structure in which a sense strand and an antisense strand are linked by a loop downstream of one promoter, and then transcribe the RNA using RNA polymerase.
  • a sequence consisting of G may be added to the end of the promoter.
  • the DNA sequence appropriately includes a control sequence such as a terminator. Promoters and / or other regulatory sequences are operably linked to the vector.
  • Linked in a functional manner means that in the cell into which the vector has been introduced, the dsRNA molecule is expressed and the target STAT6 mRNA is degraded under the control of a promoter and / or other regulatory sequences. Thus, it means that a promoter and / or other control sequences are linked and incorporated into the vector.
  • a promoter and / or other control sequences are linked and incorporated into the vector.
  • a TTTTTTT sequence may be used.
  • the promoter a constitutive promoter, a tissue-specific promoter, a time-specific promoter, or the like can be used.
  • a T3 promoter, a T7 promoter, or the like is used.
  • PolIII promoters such as U6 promoter and H1 promoter are used. It is done.
  • a plasmid vector, a viral vector, etc. can be used as a vector.
  • a plasmid vector a pBAsi vector, a pSUPER vector or the like may be used, and as a virus vector, an adenovirus vector, a lentivirus vector, a retrovirus vector or the like can be used.
  • the present invention also includes a vector that expresses the dsRNA molecule.
  • the dsRNA molecule of the present invention can cleave STAT6 mRNA in a sequence-specific manner, thereby causing RNA interference (RNAi) that suppresses the expression of the STAT6 gene and knocking down the STAT6 gene.
  • RNAi RNA interference
  • dsRNA molecule of the present invention is provided with a length of 30 bases or more, it is processed by the action of an RNase III-like enzyme called Dicer and has 21 to 27 bases having a 2 base overhang at the 3 ′ end. It can generate siRNA (small interfering RNA) molecules.
  • This siRNA molecule is incorporated into a protein complex called RISC (RNA-induced silencing complex), recognizes and degrades STAT6 mRNA by homology with the siRNA molecule, and suppresses the expression of the STAT6 gene.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the dsRNA molecules of the present invention can be used for the treatment and prevention of allergic diseases.
  • allergic diseases include nasal atrophy, allergic bronchitis, allergic conjunctivitis, inflammatory diseases, rash, urticaria, atopic dermatitis, allergic rhinitis (hay fever), allergic conjunctivitis, allergic gastrointestinal tract Inflammation, bronchial asthma, childhood asthma, food allergies, drug allergies, inflammatory diseases, etc. are included.
  • the present invention includes a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of allergic diseases comprising the above-mentioned dsRNA molecule targeting the STAT6 gene.
  • the composition may comprise one or more of the dsRNA molecules or vectors of the invention in combination.
  • the sense strand represented by SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 1 type, 2 types, or 3 types of dsRNA molecule
  • the dsRNA when the subject is a cell or tissue, the dsRNA can be introduced by culturing simultaneously with the cell or tissue.
  • a method using calcium ions an electroporation method, a spheroplast method, a lithium acetate method, a calcium phosphate method, a lipofection method, a microinjection method, and the like can be given.
  • the subject when an animal individual, it can be administered by oral route, nasal route, and intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal injection, or parenteral route.
  • it can be administered in a liquid state or an aerosol state mixed with a known penetrant.
  • a cationic polymer that is a positively charged polymer may be mixed and administered.
  • the cationic polymer include polyethylene imine (PEI, linear or branched type), polyamine, and commercially available gene introduction reagents.
  • Examples of commercially available gene introduction reagents include Lipofectamine (registered trademark), Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX, and the like. Furthermore, when administering to a specific site
  • Suitable carriers include, but are not limited to, physiological saline, phosphate buffered saline, phosphate buffered saline glucose solution, and buffered saline.
  • the amount of dsRNA to be introduced can be appropriately determined according to the type, severity, age, weight, etc. of the disease to be prevented or treated, but at least one copy of dsRNA per cell in the diseased part. An amount such that is introduced is preferred.
  • the molecular weight of dsRNA is 1 nM to 100 ⁇ M, preferably 10 nM to 50 ⁇ M, more preferably 100 nM to 20 ⁇ M.
  • RNA interference to suppress (silence) the expression of the STAT6 gene by RNA interference is when the dsRNA of the present invention is not introduced when the expression of the STAT6 gene is determined using the gene mRNA or protein expression level as an index.
  • the dsRNA of the present invention is not introduced when the expression of the STAT6 gene is determined using the gene mRNA or protein expression level as an index.
  • 100% is suppressed but also the case where 75% or more, 50% or more, or 20% or more is suppressed is included.
  • mRNA it can be measured by Northern hybridization, RT-PCR, in situ hybridization, etc.
  • the dsRNA of the present invention having an overhang consisting of one or several G at the 5 ′ end of the sense strand does not cause an interferon reaction in the cell or individual even when introduced into the cell or individual.
  • Not inducing interferon means not inducing the expression of interferon ⁇ or ⁇ , and includes not only the synthesis of interferon but also the activation of pathways involving interferon. This includes not only the case where the expression of interferon is suppressed by 100%, but also the case where it is suppressed by 75% or more, 50% or more, 20% or 10% or more.
  • the presence or absence of an interferon reaction can be determined by measuring the production of interferon itself or interferon mRNA. For this measurement, Northern hybridization, RT-PCR, in situ hybridization, Western blotting, ELISA, measurement using a protein chip to which an antibody is bound, and protein activity measurement may be performed as described above.
  • the dsRNA of the present invention is characterized in that even when introduced into a cell or individual, the dsRNA does not induce cell damage to the cell or individual cell.
  • PLR dsRNA-dependent protein kinase
  • the cell damage means that the cell does not exhibit a normal function or is damaged to such an extent that proliferation is suppressed, and includes cell death such as apoptosis and necrosis.
  • not inducing cell damage means not only inducing cell damage but also in comparing cell damage as compared with the case where double-stranded RNA not added with a sequence consisting of G at the 5 ′ end of the sense strand is introduced. Including the case where the number of cells that cause the oxidization is 75% or less, 50% or less, 20% or less, or 10% or less.
  • Whether or not cytotoxicity has been induced can be determined by observing the cells and examining whether or not a cytopathic effect (CPE) has appeared, and by measuring the metabolic activity of the cells or by dye exclusion assays such as trypan blue. Judgment can be made.
  • CPE cytopathic effect
  • the dsRNA of the present invention does not induce both interferon induction and cytotoxicity, or does not induce either interferon induction or cytotoxicity.
  • “without inducing interferon and / or cell damage” includes not only the case where the induction is completely inhibited but also the case where the induction is reduced.
  • the present invention further comprises a method of administering the dsRNA of the present invention to an organism and suppressing the expression of the STAT6 gene in the organism without inducing the expression of interferon, the dsRNA of the present invention being administered to an animal, It includes a method for preventing and treating allergic diseases involving genes without inducing interferon expression.
  • the present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
  • mice were purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd. All mice were sterilized in an aseptic environment facility and bred with food and water according to the guidelines of animal experiments at Tokyo Medical and Dental University. 7-12 week-old mice were used in the experiment, and at least 4 mice per group were used.
  • Preparation of human STAT6 siRNA (small interfering RNA) and shRNA (small hairpin RNA) and determination of their effects Small RNA STAT6 siRNA and STAT6 shRNA used in the experiment were prepared by joint research with Haplopharma Co., Ltd. BLAST Search (http: // www) is based on the theory of inducing more powerful RNAi than existing ones (Ui-Tei K, et al., Nucleic.
  • mice STAT6 siRNA Since experiments in vivo were scheduled to use mice, mouse STAT6 siRNA had to be examined in vitro as in humans. Thus, three types of mouse STAT6 siRNA sequence candidates were designed based on the same theory as in humans. For determining the effect of RNA interference, normal fibroblasts collected from the skin of the back of newborn mice were used. Cell culture and stimulation Intracellular introduction of STAT6 siRNA is Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen). Intracellular introduction was performed by two types of protocols. The respective protocols are shown in FIGS. 1A and B. Experimental protocol 1 Normal fibroblasts are seeded in 6-well plates.
  • the culture was carried out by adding 10% fatal calf serum (FCS; Sigma) and 1% antibiotics / antimytics (Gibco-BR) to Dullbeco's modified Eagle's medium (DMEM; Sigma) as a culture solution. 37 ° C, 5% CO 2 It carried out on condition of this.
  • SiRNA or shRNA is introduced in a 60-70% subconfluent state, and after the introduction, the cells are further cultured for 48 hours to recover the cells.
  • Experimental protocol 2 siRNA or shRNA is introduced in the same manner as protocol 1. After the introduction, the culture medium was changed to DMEM supplemented with 2% FCS and 1% antibiotics / anticotics (Serum starvation).
  • rhIL-4 rmIL-410 ng / mL and TNF ⁇ 40 ng / mL in mice
  • shRNA is introduced into a cell before being decomposed into Dicer, it works more specifically than siRNA that separately expresses double strands, and can reduce the interferon response due to introduction.
  • the structure of shRNA and siRNA is shown in FIG.
  • RNA extraction and reverse transcription Extraction of RNA from normal fibroblasts was performed using ISOGEN (Nippon Gene).
  • Reverse transcription was performed using hexanenucleotide mix (A260; 6.25 U / ml) (Roche), dNTPs (0.125 mM) (Takara Bio), human planta RNase inhibitor (80U) (Takara Bio), reverse Utter; It was performed using a reaction buffer containing murine leukemia virus (Takara Bio) and 800 ng of RNA. The total amount was 40 ⁇ L, and the reaction was performed at 37 ° C. for 60 minutes. Quantitative Polymerase chain reaction (PCR) Quantitative PCR reaction was performed according to the protocol using Stratagene's Brilliant SYBR Green QPCR Master Mix. Mx3000P Real-Time PCR system (Stratagene) was used for the measurement.
  • PCR Quantitative Polymerase chain reaction
  • STAT6 siRNA-containing ointment The STAT6 siRNA-containing ointment was prepared to be 2% based on hydrophilic petrolatum. This ointment was applied to Day 3 at 10 nmol / ear on the auricle.
  • Creating a rhinitis model mouse Sensitized by intraperitoneal administration of 0.1 mg of ovalbumin (albumin from chicken egg white, Grade V) (OVA) (Sigma) to Days 0, 7, 14, 21. From Day 21 to 27, 0.2 mg / day of OVA was inhaled daily into the nasal cavity for induction. As an indicator of rhinitis symptoms, the number of sneezes per 5 minutes was counted immediately after Day 27 was induced. Histopathological examination In the contact hypersensitivity reaction model, the auricular tissue was collected and fixed with 10% formalin to create a paraffin block. This was sliced and subjected to histopathological examination by May-Grunwald-Giemsa staining.
  • the base sequence is as follows. 3424 (STAT6 siRNA 3) 3430 (STAT6 siRNA 4) 2.
  • FIG. 5 shows the results measured by ELISA.
  • the expression of STAT6 at the protein level examined using the Western blot method is also suppressed by the introduction of shRNA.
  • ShRNA based on the existing sequence also shows the same suppression of STAT6 expression (lane 3 in Fig. 6), but the newly created sequence is more potent suppression when compared with ⁇ -actin. It is thought that it has an effect (FIG. 6). 4).
  • FIG. 7 shows the results measured by ELISA. 5). Effect of mouse STAT6 siRNA introduction on STAT6 expression in normal fibroblasts The candidate sequences for mouse STAT6 siRNA are shown below.
  • FIG. 8 shows the results of confirming suppression of STAT6 protein expression by the Western blot method. As shown in FIG. 8, all of STAT6 siRNA 1, 2, and 3 were found to have an effect of suppressing STAT6 protein expression.
  • FIG. 9 shows the results of confirming suppression of STAT6 mRNA expression by RT-PCR.
  • FIG. 10 shows the concentration of eotaxin (CCL11) produced by costimulation of IL-4 (10 ng / mL) and TNF-alpha (40 ng / mL). The result of having quantified by ELISA method is shown.
  • the newly developed mouse STAT6 siRNA also showed an inhibitory effect on the expression of STAT6 mRNA and the production of eotaxin (CCL11).
  • FIG. 15 shows the results of Giemsa staining
  • FIG. 17 shows the number of eosinophil infiltration.
  • dsRNA molecule according to the present invention, it is possible to specifically suppress the expression of the STAT6 gene, thereby inhibiting the production of Th2-type cytokines and chemokines, thereby preventing and treating allergic diseases. It can. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

Th2型サイトカインを介してアレルギー疾患に関与するSTAT6の発現をRNA干渉により抑制し得る二本鎖(ds)RNA及び該dsRNAを含むアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物の提供。　STAT6遺伝子のmRNAを標的とする二本鎖RNA（dsRNA）分子であって、以下の(a)又は(b)のdsRNA分子：(a)　一方の鎖が配列番号１又は３で表されるSTAT6遺伝子配列中の１５～５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は(b)　一方の鎖が配列番号１又は３で表されるSTAT6遺伝子配列中の１５～５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、STAT6遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。

Description

アレルギー疾患の治療のための核酸医薬
　本発明は、ＳＴＡＴ６遺伝子を標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子及び該ｄｓＲＮＡ分子を含むアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
　ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって、その配列特異的にｍＲＮＡが切断され、その結果遺伝子の発現が抑制される現象であり、生物共通の核酸レベルの防御システムであることが報告されている（非特許文献１を参照）。ＲＮＡｉにおいては、ｄｓＲＮＡがダイサー（Ｄｉｃｅｒ）の作用によりプロセッシングされｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）が形成され、ｓｉＲＮＡがガイドＲＮＡとしてターゲット配列を認識し、ターゲットｍＲＮＡを切断することにより、遺伝子の発現が抑制される。
　ＲＮＡｉ法は、遺伝子の発現制御による遺伝子機能解析、遺伝子の発現制御機構の解明、ＲＮＡｉによる遺伝子治療等の利用を目的に種々の検討が行われている。
　免疫応答はｔｙｐｅ−１　ｈｅｌｐｅｒ（Ｔｈ１）細胞による細胞性免疫とｔｙｐｅ−２　ｈｅｌｐｅｒ（Ｔｈ２）細胞による体液性免疫からなり、Ｔｈ１免疫応答は自己免疫疾患や移植拒絶反応、Ｔｈ２免疫応答はアレルギー疾患に関与することが知られている。また、Ｔｈ２免疫応答に関与するＴｈ２型サイトカインとしてＩＬ−４及びＩＬ−１３が知られている。
　転写調節因子ＳＴＡＴ６（Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　６）は、Ｔｈ２型サイトカインであるＩＬ−４及びＩＬ−１３受容体を介するシグナル伝達の重要な転写調節因子であり、Ｔｈ２型免疫応答の維持に関与していることが報告されている。ＳＴＡＴ６の作用に関してはＳＴＡＴ６の欠損マウスが作製され、該マウスではＩＬ−４の情報が細胞に伝達されず、その結果アレルギー反応が起こらないことが報告されている（非特許文献２及び３を参照）。
Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１：８３４−８４３，２００１ Ｔａｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６　Ａｐｒ　１８；３８０（６５７５）：６２７−３０ Ｓｈｉｍｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９６　Ａｐｒ　１８；３８０（６５７５）：６３０−３
　本発明は、Ｔｈ２型サイトカインを介してアレルギー疾患に関与するＳＴＡＴ６の発現をＲＮＡ干渉により抑制し得る二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ及び該ｄｓＲＮＡを含むアレルギー疾患の予防又は治療用医薬組成物の提供を目的とする。
　本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、ＳＴＡＴ６遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有するセンス鎖と該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を有するアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ分子が、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を特異的に抑制することを見出した。さらに、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現の抑制により、Ｔｈ２型サイトカイン又はケモカインの産生が抑制され、アレルギー疾患の予防及び治療に効果を奏することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］　ＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡを標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、以下の（ａ）又は（ｂ）のｄｓＲＮＡ分子：
（ａ）　一方の鎖が配列番号１で表されるＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５~５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
（ｂ）　一方の鎖が配列番号１で表されるＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５~５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、ＳＴＡＴ６遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
［２］　ｄｓＲＮＡ分子が、以下の（ｃ）又は（ｄ）である、［１］のｄｓＲＮＡ分子：
（ｃ）　一方の鎖が配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の２５９~２７９番目の塩基を有する配列、及び３０２６番目~３０４６番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
（ｄ）　一方の鎖が配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の２５９~２７９番目の塩基を有する配列、及び３０２６番目~３０４６番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、ＳＴＡＴ６遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
［３］　ｄｓＲＮＡ分子が、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、［２］のｄｓＲＮＡ分子。
［４］　センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、［１］~［３］のいずれかのｄｓＲＮＡ分子。
［５］　［４］のｄｓＲＮＡ分子のテンプレートＤＮＡを含み該ｄｓＲＮＡ分子を発現するベクター。
［６］　［１］~［４］のいずれかのｄｓＲＮＡ分子を１つ又は複数含む、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［７］　［５］のベクターを含む、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［８］　センス鎖の５’末端に１個又は複数のＧ（グアニン）からなるオーバーハング塩基を有する、［１］~［３］のいずれかのｄｓＲＮＡ分子。
［９］　センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、［８］のｄｓＲＮＡ分子。
［１０］　［９］のｄｓＲＮＡ分子のテンプレートＤＮＡを含み該ｄｓＲＮＡ分子を発現するベクター。
［１１］　［８］又は［９］のｄｓＲＮＡ分子を１つ又は複数含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［１２］　［１０］のベクターを含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［１３］　鼻腔投与するための、［６］、［７］、［１１］又は［１２］のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
［１４］　皮膚に塗布するための軟膏である、［６］、［７］、［１１］又は［１２］のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−２３７００７号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　図１は、実施例の実験プロトコール１（Ａ）及び２（Ｂ）の概要を示す図である。
　図２は、ｓｉＲＮＡとｓｈＲＮＡの構造を示す図である。
　図３は、ヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入によるＳＴＡＴ６の発現抑制を示す図である。
　図４は、ヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞によるｅｏｔａｘｉｎ−３産生を示す図である。
　図５は、ヒトＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６のｍＲＮＡレベルでの発現抑制を示す図である。
　図６は、ヒトＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６のタンパク質レベルでの発現抑制を示す図である。
　図７は、ヒトＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞によるｅｏｔａｘｉｎ−３産生を示す図である。
　図８は、マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入による、正常線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６発現の抑制をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法により確認した結果を示す図である。
　図９は、マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入による、正常線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６発現の抑制をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を示す図である。
　図１０は、マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入による、正常線維芽細胞において、ＩＬ−４とＴＮＦ−ａｌｐｈａの共刺激により産生されるｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量した結果を示す図である。
　図１１は、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡによる接触過敏反応への効果を示す図である。図１１Ａは、ＴＮＣＢによる接触過敏反応への効果を、図１１ＢはＤＮＦＢによる接触過敏反応への効果を、図１１ＣはＯｘａｚｏｌｏｎｅによる接触過敏反応への効果を示す図である。
　図１２は、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡによる接触過敏反応への効果をギムザ染色により示す図である。
　図１３は、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡによる接触過敏反応への効果を浸潤している細胞のプロフィールにより示す図である。
　図１４は、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ含有軟膏による接触過敏反応への効果を示す図である。
　図１５は、鼻炎モデルに対するＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの効果をくしゃみの回数により示す図である。
　図１６は、鼻炎モデルに対するＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの効果をギムザ染色により示す図である。
　図１７は、鼻炎モデルに対するＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの効果を浸潤している好酸球の数により示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明は転写調節因子ＳＴＡＴ６（Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　６）のｍＲＮＡを標的とする二本鎖からなるｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＲＮＡ）分子に関する。該ｄｓＲＮＡ分子の一方の鎖は転写因子ＳＴＡＴ６遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有しハイブリダイズし得るセンス鎖であり、他方の鎖は該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖であるｄｓＲＮＡ分子であり、該センス鎖とアンチセンス鎖は相補的に結合する。この際、センス鎖とアンチセンス鎖は完全に相補的である必要は必ずしもなく、相補的に結合する限り、１又は複数、すなわち、１~１０個、好ましくは１~５個、さらに好ましくは、１~３個、２個若しくは１個のミスマッチがあってもよい。ＳＴＡＴ６遺伝子中の標的配列は、コーディング領域であっても、非コーディング領域であってもよい。
　本発明においてｄｓＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ分子及びｓｈＲＮＡ分子を含む。また、本発明においてｄｓＲＮＡ分子はｍｉＲＮＡ分子を形成し得る。
　本発明のｄｓＲＮＡ分子のＳＴＡＴ６遺伝子の標的配列の塩基数は、特に限定されないが、１５~５０塩基、１５~４５、１５~４０、１５~３５若しくは１５~３０塩基、好ましくは２０~３５塩基、さらに好ましくは２１~３５、２１~２５若しくは２１~２３塩基、特に好ましくは２１塩基である。
　本発明において、ＳＴＡＴ６の遺伝子配列又はその一部に同一な塩基配列を有しハイブリダイズし得るセンス鎖とは、配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列又は配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列を有するＲＮＡ配列を意味する。本発明のｄｓＲＮＡ分子を構成するセンス鎖は、ＳＴＡＴ６の遺伝子配列と同一であることが望ましいが、実質的に同一な配列であってもよい。すなわち、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖と実際に標的となるＳＴＡＴ６のｍＲＮＡ配列がハイブリダイズする限り１又は複数、すなわち、１~１０個、好ましくは１~５個、さらに好ましくは、１~３個、２個若しくは１個の塩基が欠失、置換又は付加してミスマッチが生じていてもよい。この場合のハイブリダイズする条件は、本発明のｄｓＲＮＡを生体内に投与して医薬として用いる場合は、生体内の条件であり、本発明のｄｓＲＮＡを試薬としてｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いる場合は、中度のストリンジェントな条件あるいは高度なストリンジェントな条件であり、このような条件として、例えば、４００ｍＭ　ＮａＣｌ、４０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ　ｐＨ６．４、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０℃から７０℃で１２~１６時間でのハイブリゼーション条件が挙げられる。
　また、本発明のｄｓＲＮＡのセンス鎖配列と標的配列は、ＢＬＡＳＴ［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０）］、ＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３−９８（１９９０）］等の当業者に公知の相同性検索プログラムをデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出される数値で９０％以上、好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６、９７、９８若しくは９９％以上の配列同一性を有する。
　また、本発明のｄｓＲＮＡ分子は、上に定義されたセンス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結され、そのリンカー部でループ構造を形成し折りたたまれたｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）分子として提供され得る。ｓｈＲＮＡ分子はダイサーによってプロセッシングされ、ｓｉＲＮＡ分子を生じ得る。ｓｈＲＮＡ分子に含まれるリンカー分子は、センス鎖とアンチセンス鎖を連結しステムループ構造を形成し得る限り、ポリヌクレオチドリンカーであっても、非ポリヌクレオチドリンカーであってもよく、特に限定しないが、当業者に公知であるポリヌクレオチドリンカーが好ましい。ヘアピンループ配列は限定されないが、５~１２塩基からなるＵＵで始まる配列、例えばＵＵＣＡＡＧＡＧＡが挙げられる。そのほかのループ配列としては、Ｌｅｅ　ＮＳ．ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５００−５０５、Ｐａｄｄｉｓｏｎ　ＰＪ．ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖ．１６，９４８−９５８、Ｓｕｉ　Ｇ．ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９９，５５１５−５５２０、Ｐａｕｌ　ＣＰ．ｅｔ　ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０，５０５−５０８、Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｈ．ｅｔ　ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．３１，７００−７０７等に記載の配列からなるループを採用することができる。ｓｈＲＮＡ分子も、上記したように公知の方法に基づいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏにて合成することが可能である。合成に際しては、センス鎖とアンチセンス鎖を逆方向配列として含む１本のＲＮＡ鎖を合成し、その後この１本のＲＮＡ鎖を自己相補的結合によって二本鎖構造を形成させｓｈＲＮＡ分子を得ることができる。
　ｄｓＲＮＡ分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は必要に応じて、３’末端にオーバーハングを有していてもよく、該オーバーハングの塩基の種類、数は限定されず、例えば、１~５、好ましくは１~３、さらに好ましくは１若しくは２塩基からなる配列が挙げられ、例えば、ＴＴＴ、ＵＵやＴＴが挙げられる。本発明において、オーバーハングとは、ｄｓＲＮＡ分子の一方の鎖の末端に付加された塩基であって、もう一方の鎖の対応する位置に相補的に結合し得る塩基が存在しない塩基をいう。オーバーハングは標的とするＳＴＡＴ６遺伝子のＤＮＡを本来的に構成する塩基であってもよい。例えば、本発明のｄｓＲＮＡは、センス鎖がＳＴＡＴ６遺伝子配列中のチミンがウラシルに置換された塩基配列中の連続する２１塩基からなり、アンチセンス鎖はセンス鎖の３’末端側の２塩基を除く塩基配列に相補的な配列を有し、センス鎖とアンチセンス鎖の３’末端側に、２塩基からなるオーバーハングを有する構造を有する。
　また、センス鎖の５’端に１~３、好ましくは３、２若しくは１のＧ（グアニン）からなる配列からなるオーバーハングを有していてもよい。このようにセンス鎖の５’末端に１個又は複数のＧからなるオーバーハングを設けることにより、ｓｈＲＮＡを導入した細胞においてインターフェロンの発現が誘導されることがない（Ｇｏｎｄａｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．３，ｅ１８，Ｅｐｕｂ　２００８　Ｊａｎ　２１）。
　さらに、ｄｓＲＮＡ分子を構成するセンス鎖又はアンチセンス鎖は、遺伝子の配列決定など種々の実験操作を円滑に行うために、ｓｉＲＮＡ活性に対して影響を与えない範囲で必要に応じて１~３塩基、さらに好ましくは１若しくは２塩基の置換、付加、欠失をさらに含んでも良い。
　また、センス鎖又はアンチセンス鎖は必要に応じて、５’末端がリン酸化されていてもよく、ｓｈＲＮＡ分子については５’末端に三リン酸（ｐｐｐ）が結合していてもよい。上記のようにセンス鎖の５’末端のＧからなるオーバーハングに三リン酸（ｐｐｐ）が結合していてもよい。
　本発明において、好ましくはセンス鎖が、配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の２５９~２７９番目の塩基を有する配列、及び３０２６番目~３０４６番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一であることが好ましく、特に配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、又は３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列と同一であることが好ましい。
　本願発明のｄｓＲＮＡ分子は、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなり、特に配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖又は配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ分子が好ましい。
　本発明のｄｓＲＮＡは、化学合成や、プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いた転写系によりｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成することができる。化学合成による合成は、互いに相補的な配列を逆方向配列として有し自己相補性を有するＲＮＡ１本鎖を合成し、自己相補性部分で結合させればよい。合成されたセンス鎖及びアンチセンス鎖のアニーリングは、当業者に公知である一般的な方法によって行うことができる。合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖をそれぞれｄｓＲＮＡ用アニーリングバッファーに溶解し、等量（等モル数）を混合し、二本鎖が解離するまで温度を加熱し、その後徐々に冷却してインキュベートすることによって行うことができる。アニーリング条件は、例えば、９０℃にて１分間、続いて３７℃にて１時間静置することによって行えばよい。その後、フェノール／クロロホルム抽出・エタノール沈殿を行うことによって、ｄｓＲＮＡ分子を得ることができる。また、プロモーター及びＲＮＡポリメラーゼを用いた合成は、１つのプロモーターの下流にセンス鎖とアンチセンス鎖をループで連結した構造を有するテンプレートＤＮＡを合成しＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを転写すればよい。センス鎖の５’末端にＧからなるオーバーハング配列を付加するためには、プロモーターの末端にＧからなる配列を付加すればよい。この際、ＤＮＡ配列には、適宜ターミネーター等の制御配列を含ませる。プロモーター及び／又はその他の制御配列はベクターに機能し得るかたちで連結する。「機能し得るかたちで連結する」とは、当該ベクターが導入された細胞において、プロモーター及び／又はその他の制御配列の制御の下、上記ｄｓＲＮＡ分子が発現され標的となるＳＴＡＴ６のｍＲＮＡが分解されるように、プロモーター及び／又はその他の制御配列を連結してベクターに組み込むことを意味する。ターミネーター配列としては、例えば、ＴＴＴＴＴＴ配列を用いればよい。プロモーターとしては、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、時期特異的プロモーター等を用いることができ、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで製造する場合、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター等が用いられる。ベクターに本発明の２本鎖ＲＮＡのテンプレートＤＮＡを導入し、該ベクターを生体内に投与して生体内で２本鎖ＲＮＡを合成する場合、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなどのＰｏｌＩＩＩ系プロモーター等が用いられる。ベクターを用いる場合、ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を用いることができる。プラスミドベクターとしては、ｐＢＡｓｉベクター、ｐＳＵＰＥＲベクター等を用いればよく、ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター等を用いることができる。なお、本発明のｄｓＲＮＡの合成にＴ７プロモーター等を用いた場合、Ｇからなる配列の存在によりＴ７プロモーターが活性化され、ｄｓＲＮＡの製造効率が高まるという利点もある。
　本発明は、上記ｄｓＲＮＡ分子を発現するベクターをも包含する。
　本発明のｄｓＲＮＡ分子は、配列特異的にＳＴＡＴ６のｍＲＮＡを切断し、その結果ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を引き起こし、ＳＴＡＴ６遺伝子をノックダウンすることができる。ＳＴＡＴ６遺伝子がノックダウンされる結果、Ｔｈ２サイトカイン、ケモカインの産生が抑制され、例えば、皮膚等の炎症部位において単核球、好酸球、好中球、肥満細胞、リンパ球等の浸潤が抑制され、炎症を抑制する。
　本発明のｄｓＲＮＡ分子は、３０塩基以上の長さで提供される場合、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様酵素の作用によってプロセッシングされ、３’末端に２塩基のオーバーハングを有する２１~２７塩基のｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）分子を生じ得る。このｓｉＲＮＡ分子が、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ　ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれるタンパク質複合体に取り込まれ、ＳＴＡＴ６　ｍＲＮＡをｓｉＲＮＡ分子との相同性により認識し分解し、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現抑制を行う。
　本発明のｄｓＲＮＡ分子はアレルギー疾患の治療及び予防に用いることができる。ここで、アレルギー疾患には、鼻閉症、アレルギー性気管支炎、アレルギー性結膜炎、炎症性疾患、皮疹、じん麻疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎（花粉症）、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、小児喘息、食物アレルギー、薬物アレルギー、炎症性疾患、等が含まれる。
　本発明は、ＳＴＡＴ６遺伝子を標的とする上記のｄｓＲＮＡ分子を含むアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物を包含する。該組成物は、本発明のｄｓＲＮＡ分子又はベクターの１種又は複数種を組み合わせて含んでもよい。例えば、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなるｄｓＲＮＡ分子の１種、２種又は３種を含んでいてもよい。
　本発明のｄｓＲＮＡの導入方法としては、被験体が細胞や組織の場合、細胞や組織と同時に培養することにより導入することができる。その他、カルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等が挙げられる。被験体が動物個体の場合、経口ルート、鼻孔ルート、並びに静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内の注射又は非経腸的ルートで投与することができる。喘息や鼻炎等の治療のためには、公知の浸透剤と混合した液体状態又はエアロゾル状態で投与することができる。また、皮膚炎等の治療のためには、軟膏の形態で皮膚の患部に塗布により局所投与され得る。該軟膏は、キャリアとして、脂肪、脂肪油、ラノリン、ワセリン、パラフィン、蝋、硬膏剤、樹脂、プラスチック、グルコール類、高級アルコール、グリセリン、水若しくは乳化剤、懸濁化剤を含む。この際、正電荷を有するポリマーであるカチオニックポリマーと混合して投与してもよい。カチオニックポリマーとしては、ポリエチエレンイミン（ＰＥＩ、直鎖型若しくは分岐型）、ポリアミンや市販の遺伝子導入試薬が挙げられる。市販の遺伝子導入試薬として、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　ＲＮＡｉＭＡＸなどを挙げることができる。
　さらに、特定の部位に投与する場合、ドラッグデリバリーシステムを用いて特定部位にデリバリーしてもよい。ドラッグデリバリーシステムは種々の公知の方法があり、投与しようとする部位に応じて適当な方法を採用することができる。ドラッグデリバリーシステムとしては、例えば、キャリアとしてリポソーム、エマルジョン、ポリ乳酸等を利用した公知の方法等が挙げられる。投与は、医薬的に許容され得る希釈剤又はキャリアと混合して行うことが望ましい。適切なキャリアには、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコース液、及び緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。導入するｄｓＲＮＡの量は、予防、治療しようとする疾患の種類、重篤度、被検体の年齢、体重等により適宜決定することができるが、疾患部の細胞１個当たり少なくとも、１コピーのｄｓＲＮＡが導入されるような量が好ましい。例えば１投与単位あたり、ｄｓＲＮＡ分子量で１ｎＭ~１００μＭ、好ましくは１０ｎＭ~５０μＭ、より好ましくは１００ｎＭ~２０μＭである。
　本発明において、ＲＮＡ干渉によりＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）するとは、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、本発明のｄｓＲＮＡを導入しない場合に対して、１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上あるいは２０％以上抑制される場合も含まれる。発現抑制の程度は、ＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の産生量をｄｓＲＮＡ導入前後で比較すればよい。ｍＲＮＡの場合は、ノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ等により測定することができ、タンパク質の場合は、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定等により測定することができる。また、センス鎖の５’端に１個又は数個のＧからなるオーバーハングを有する本発明のｄｓＲＮＡは、細胞や個体に導入しても該細胞、個体でインターフェロン反応を引き起こさない。インターフェロンを誘導しないとは、インターフェロンα又はβの発現を誘導しないことをいい、インターフェロンの合成のみならず、インターフェロンが関与するパスウェイを活性化しないことを含む。インターフェロンの発現が１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上、２０％又は１０％以上抑制される場合も含まれる。インターフェロン反応の有無は、インターフェロン自体又はインターフェロンのｍＲＮＡの産生を測定することにより決定することができる。この測定には、上記のようにノーザンハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ、ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、抗体を結合させたプロテインチップを用いた測定、タンパク質の活性測定を行えばよい。
　さらに、本発明のｄｓＲＮＡは、細胞や個体に導入しても該細胞や、個体の細胞に細胞障害を誘導しないことを特徴とする。一般的に二本鎖ＲＮＡを投与した場合、ｄｓＲＮＡ依存的プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）の活性化により、細胞障害を誘導し得るが、本発明のｄｓＲＮＡはＰＫＲを活性化することがなく細胞障害を誘導することもない。ここで、細胞障害とは、細胞が正常の機能を発揮しないか、あるいは増殖が抑制される程度障害を受けていることをいい、アポトーシス、ネクローシス等の細胞死を含む。本発明において、細胞障害を誘導しないとは、細胞障害を全く誘導しない場合のみならず、センス鎖の５’末端にＧからなる配列を付加しない２本鎖ＲＮＡを導入した場合に比べ、細胞障害を起こす細胞の数が７５％以下、５０％以下、２０％以下、又は１０％以下である場合を含む。細胞障害が誘導されたか否かは、細胞を観察し細胞変性効果（ＣＰＥ）が出現したかどうかを調べることによりわかり、また、細胞の代謝活性を測定したり、トリパンブルー等の色素排除アッセイにより判断することができる。本発明のｄｓＲＮＡは、インターフェロン誘導及び細胞障害の両方を誘導しないか、又はインターフェロン誘導又は細胞障害のいずれかを誘導しない。上記のように本発明において、「インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導せずに」とは、誘導が完全に阻害される場合だけではなく、誘導が減じられる場合も含む。また、インターフェロン及び／又は細胞障害の誘導の阻害も試験系や被験体によって、程度が異なってくることがあるが、少なくとも一つの系又は被験体においてインターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しなければ、本発明のインターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しないｄｓＲＮＡに含まれる。
　本発明は、さらに本発明のｄｓＲＮＡを生物体に投与して、該生物体においてＳＴＡＴ６遺伝子の発現をインターフェロンの発現を誘導せずに抑制する方法、本発明のｄｓＲＮＡを動物に投与して、ＳＴＡＴ６遺伝子が関与するアレルギー疾患を、インターフェロンの発現を誘導せずに予防、治療する方法を包含する。
　本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
方法
動物
　ＢＡＬＢ／ｃマウスは三協ラボサービス株式会社より購入した。全てのマウスは無菌環境施設で、東京医科歯科大学の動物実験ガイドラインに基づき、餌と水を与え飼育した。実験には７−１２週齢のマウスを用い、１グループは少なくとも４匹以上とした。
ヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ　ｈａｉｒｐｉｎ　ＲＮＡ）の作成並びにそれらの効果判定
　実験に使用するｓｍａｌｌ　ＲＮＡであるＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ及びＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡはハプロファーマ社（株）との共同研究により作製した。既存のものよりも強力なＲＮＡｉを誘導する理論（Ｕｉ−Ｔｅｉ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（２００４）．３２：９３６−９４８）を基盤として、ＢＬＡＳＴ　Ｓｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｍｌ．ｎｉｈ，ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｓｈｔｍｌ；ｏｆｆ　ｔａｒｇｅｔ効果の回避）の利用並びにｍＲＮＡの高次構造を予測（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／~ｚｕｋｅｒｍ／）をすることにより、まず、ｓｉＲＮＡの候補配列を決定した。
　候補配列は６つであり、各々の効果は、ヒトの皮膚組織生検から採取したヒト正常皮膚線維芽細胞に導入して評価した。効率のよいＲＮＡ干渉を示す配列のｓｉＲＮＡを選定した後、その配列をもとにして、導入時の非特異的反応（インターフェロン応答）がほとんどみられないという特長をもつｓｈＲＮＡを作成し、同様にＲＮＡｉの効果検討を行った。
マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの候補選定
　Ｉｎ　ｖｉｖｏにおける実験はマウスを用いる予定であったため、マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡについてもヒトと同様にｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける検討を行う必要があった。そこでマウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの配列候補をヒトの場合と同じ理論をもとに３種類設計した。ＲＮＡ干渉の効果判定に関しては新生児マウス背部の皮膚より採取した正常線維芽細胞を用いた。
細胞の培養と刺激
　ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの細胞内導入はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて行った。
　細胞内導入は２種類のプロトコールで行った。それぞれのプロトコールを図１Ａ及びＢに示す。
実験プロトコール１
　６ｗｅｌｌプレートに正常線維芽細胞を播種する。培養は培養液としてＤｕｌｌｂｅｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ社）に１０％　ｆｅｔａｌ　ｃａｌｆ　ｓｅｒｕｍ（ＦＣＳ；Ｓｉｇｍａ社）と１％　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を添加したものを用い、３７℃、５％　ＣＯ２の条件下で行った。６０~７０％　ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔの状態でｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを導入し、導入後、さらに４８時間培養を継続し細胞を回収する。
実験プロトコール２
　ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡの導入はプロトコール１と同様に行う。導入後、培養液をＤＭＥＭに２％ＦＣＳと１％　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃｓを添加したものに変更した（Ｓｅｒｕｍ　ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）。２４時間後にｒｈＩＬ−４（マウスではｒｍＩＬ−４１０ｎｇ／ｍＬとＴＮＦα　４０ｎｇ／ｍＬ）（全てＲ＆Ｄ社）で細胞を刺激し、その２４時間後に細胞上清を回収する。
　ｓｈＲＮＡは、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）に分解される前段階で細胞内に導入されるため、二本鎖を別々に発現するｓｉＲＮＡより特異的に働き、また、導入によるインターフェロン応答を軽減できる。ｓｈＲＮＡとｓｉＲＮＡの構造を図２に示す。
ハプテンによる急性接触過敏反応の誘導
　Ｄａｙ０に５％２，４，６−ｔｒｉｎｉｔｒｏｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＴＮＣＢ）（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝４：１）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）、０．５％　２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（ＤＮＦＢ）（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝４：１）（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ社）、又は５％４−ｅｔｈｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｅ−２−ｐｈｅｎｙｌ−２−ｏｘａｚｏｌｉｎ−５−ｏｎｅ（Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝４：１）（Ｓｉｇｍａ社）を剃毛腹部にそれぞれ５０μＬ塗布して感作した。（ＤＮＦＢのみＤａｙｓ０、１の連日塗布。）その後、Ｄａｙ５で耳介に１％　ＴＮＣＢ（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝１：４）、０．２％ＤＮＦＢ（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝４：１）、又は１％Ｏｘａｚｏｌｏｎｅ（ｉｎ　ａｃｅｔｏｎｅ：ｏｌｉｖｅ　ｏｉｌ＝４：１）をそれぞれ耳介に２０μＬ塗布して惹起。接触過敏反応の指標として耳介腫脹を、ｄｉａｌ　ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ　ｇａｕｇｅ（Ｐｅａｃｏｃｋ社）を用いて測定した。
Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法
　細胞からのタンパク抽出はＣｅｌｌ　ｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社）を用いた。電気泳動後、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　ｐｈａｒｍａｃｉａ　ｂｉｏｔｅｃｈ社）に転写。電気泳動は８０Ｖ　３０ｍｉｎ、その後１３０Ｖ　６０ｍｉｎの条件で行った。１次抗体として、抗ヒトβ−アクチン抗体又は抗ｍｏｕｓｅ　β−アクチン抗体と、抗ヒトＳＴＡＴ６抗体又は抗ｍｏｕｓｅ　ＳＴＡＴ６抗体（共にＳａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）を用いて反応後、２次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗ラビットｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ抗体（ＤＡＫＯ）と反応。発色にはＥＣＬ　ｐｌｕｓ　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。
ＲＮＡの抽出と逆転写
　正常線維芽細胞からのＲＮＡの抽出はＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン社）を用いて行った。逆転写はｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｍｉｘｔｕｒｅ（Ａ２６０；６．２５Ｕ／ｍｌ）（Ｒｏｃｈｅ社）、ｄＮＴＰｓ（０．１２５ｍＭ）（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社）、ｈｕｍａｎ　ｐｌａｃｅｎｔａ　ＲＮａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（８０Ｕ）（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社）、ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（４００Ｕ；Ｍｏｌｏｎｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｌｅｕｋｅｍｉａ　ｖｉｒｕｓ）（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ社）を含んだ反応緩衝液と８００ｎｇのＲＮＡを用いて行った。全量を４０μＬとし、３７℃　６０ｍｉｎで反応を行った。
定量的Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）
　定量的ＰＣＲ反応は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＢｒｉｌｌｉａｎｔ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　ＱＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘを用いて、プロトコルに従って行った。測定にはＭｘ３０００Ｐ　Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いた。
ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡのマウスへの投与
　Ｄａｙ３にＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ（ｉｎ　ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ：ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２０００＝５０：１）を耳介皮下に３０μＬ投与（１ｎｍｏｌ／ｅａｒ）した。
ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ含有軟膏
　ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ含有軟膏は、親水ワセリンを基剤として２％となるよう調製した。この軟膏を、Ｄａｙ３に耳介に１０ｎｍｏｌ／ｅａｒとなるように塗布した。
鼻炎モデルマウスの作成
　Ｄａｙｓ０，７，１４，２１にｏｖａｌｂｕｍｉｎ（ａｌｂｕｍｉｎ　ｆｒｏｍ　ｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｇｇ　ｗｈｉｔｅ，Ｇｒａｄｅ　Ｖ）（ＯＶＡ）（Ｓｉｇｍａ社）０．１ｍｇ、ａｌｕｍ　１ｍｇを腹腔内投与して感作。Ｄａｙｓ２１から２７にかけて０．２ｍｇ／日のＯＶＡを連日鼻腔内に吸入させて惹起した。鼻炎の症状の指標として、Ｄａｙ２７の最終惹起直後に５分間あたりのくしゃみの回数をカウントした。
病理組織学的検討
　接触過敏反応モデルでは、耳介組織を回収し、１０％ホルマリンで固定してパラフィンブロックを作成。これを薄切し、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色にて病理組織学的検討を行った。鼻炎モデルでは、最終惹起１２ｈｒ後の鼻粘膜組織切片をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ染色にて病理組織学的検討を行った。細胞数は、４００倍の視野下で単核細胞、好中球、好酸球、肥満細胞の浸潤細胞数を少なくとも５視野数えて数値化した。
統計学的解析
　統計学的有意差は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ−ｔｅｓｔを用いて検討した。
結果
１．　ヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入によるＳＴＡＴ６の発現抑制
　作成したヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの６つの候補配列について、効率よくＳＴＡＴ６発現を抑制できる配列の検討をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法を用いて行った。図３に結果を示す。図３中、２~７レーンは今回新規に作成した６種類のＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡであり、既存の配列（Ｒｉｐｐｍａｎｎ　ＪＦ　ｅｔ　ａｌ．，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．（２００５）．５７９：１７３−１７８）は８レーンである。新規作成したもののうち４、５レーンについては既存のものに比して明らかに強力なＳＴＡＴ６発現の抑制効果を示している。
　そこで以下の実験にはこの２配列のＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡを用いることにした（以後、３４２４＝ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　３、３４３０＝ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　４とする）。塩基配列は以下のごとくである。
３４２４（ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
３４３０（ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
２．　ヒトＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞によるｅｏｔａｘｉｎ−３産生
　ＩＬ−４刺激により、ＳＴＡＴ６経路に依存してヒト線維芽細胞から産生されるｅｏｔａｘｉｎ−３の産生は、実験１により選定されたＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　３あるいはＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　４の導入によって有意に抑制された。図４にＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。また、無刺激状態での線維芽細胞からのｅｏｔａｘｉｎ−３産生には影響を与えなかった（ｄａｔａ　ｎｏｔ　ｓｈｏｗｎ）。
３．　ヒトＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６の発現抑制
　上記実験１、２で効果がみられたｓｉＲＮＡ２つの配列をもとにしてｓｈＲＮＡを作製した（それぞれＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡ３、ＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡ４）。そして、これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏでのＳＴＡＴ６発現への効果を検討した。まず、Ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ法にて確認したＳＴＡＴ６のｍＲＮＡレベルの発現は、ｓｉＲＮＡの結果と同様、新規配列の２つにおいてより強力な抑制効果が得られた）。図５にＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法を用いて検討したタンパクレベルにおけるＳＴＡＴ６の発現も、ｓｈＲＮＡの導入によって抑制されている。既存の配列をもとにしたｓｈＲＮＡも同等のＳＴＡＴ６の発現抑制をみているが（図６の第３レーン）、β−アクチンとの比較をみると今回新たに作成した配列のほうがより強力な抑制効果をもつと考えられる（図６）。
４．　ヒトＳＴＡＴ６　ｓｈＲＮＡを導入したヒト線維芽細胞によるｅｏｔａｘｉｎ−３産生
　ｓｈＲＮＡ導入にても、ｓｉＲＮＡ導入時と同様、新規作成したものが既存のものより強いｅｏｔａｘｉｎ−３産生抑制効果がみられた。図７にＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。
５．　マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ導入による、正常線維芽細胞におけるＳＴＡＴ６発現への効果
　マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの候補配列を以下に示す。図８にＳＴＡＴ６タンパク発現の抑制をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ法にて確認した結果を示す。図８に示すように、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　１，２，３の全てにＳＴＡＴ６タンパク発現を抑制する効果が見られた。その中でも最も効率よくＳＴＡＴ６タンパク発現を抑制したＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　３を以後ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡとして用いた。図９にＳＴＡＴ６　ｍＲＮＡ発現の抑制をＲＴ−ＰＣＲにより確認した結果を、図１０にＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍＬ）とＴＮＦ−ａｌｐｈａ（４０ｎｇ／ｍＬ）の共刺激により産生されるｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）濃度をＥＬＩＳＡ法にて定量した結果を示す。図９及び１０に示すように、ＳＴＡＴ６　ｍＲＮＡの発現、ｅｏｔａｘｉｎ（ＣＣＬ１１）の産生に関しても、新たに開発したマウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡは抑制効果を示した。
マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　１
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ　２
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
マウスＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ３
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
６．　ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡによる接触過敏反応への効果
　ＴＮＣＢ、ＤＮＦＢ、Ｏｘａｚｏｌｏｎｅによる接触過敏反応は、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの耳介への皮下投与により有意に抑制された（図１１）。また、ＴＮＣＢに対する接触過敏反応においてギムザ染色により病理組織学的検討を行ったところ、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡを投与した群において、コントロール群と比較して、顕著な浮腫の軽減と細胞浸潤の減少がみられた（図１２）。浸潤している細胞のプロフィール検討では、単核細胞、好酸球、好中球、脱顆粒している肥満細胞において細胞数の減少がみられた（図１３）。
７．　ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ含有軟膏による接触過敏反応への効果
　ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ含有軟膏を作成し、耳介に塗布したところ、コントロール群と比較して耳介腫脹に有意な抑制が得られた（図１４）。この結果から、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡは軟膏としての使用が可能と考えられた。
８．　鼻炎モデルに対するＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの効果
　ＯＶＡ感作マウスの鼻腔にＤａｙｓ２１から２７にかけて連日ＯＶＡを吸入させて鼻炎反応を誘発。そして、Ｄａｙｓ２２，２３，２４にＰＢＳに溶解したＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡ（３ｎｍｏｌ／ｄａｙ）を鼻腔内に投与して、その治療効果を検討した。その結果、ＳＴＡＴ６　ｓｉＲＮＡの投与により、くしゃみの回数が有意に減少した（図１５）。炎症反応の抑制は、好酸球浸潤の顕著な減少など、病理組織学的にも確認された。図１６にギムザ染色の結果を、図１７に好酸球浸潤数を示す。
　本発明によるｄｓＲＮＡ分子を用いて、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を特異的に抑制することができ、それによってＴｈ２型サイトカイン及びケモカインの産生を阻害することができ、その結果アレルギー疾患を予防及び治療することができる。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号５から１４　合成
［配列表］
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Claims (14)

  1. 　ＳＴＡＴ６遺伝子のｍＲＮＡを標的とする二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子であって、以下の（ａ）又は（ｂ）のｄｓＲＮＡ分子：
    （ａ）　一方の鎖が配列番号１又は３で表されるＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の１５~５０個の連続した塩基を有する配列に同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
    （ｂ）　一方の鎖が配列番号１又は３で表されるＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列中の少なくとも１５~５０個の連続した塩基を有する配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、ＳＴＡＴ６遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
  2. 　ｄｓＲＮＡ分子が、以下の（ｃ）又は（ｄ）である、請求項１記載のｄｓＲＮＡ分子：
    （ｃ）　一方の鎖が配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の２５９~２７９番目の塩基を有する配列、及び３０２６番目~３０４６番目の塩基を有する配列からなる群から選択される塩基配列と同一なセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である；又は
    （ｄ）　一方の鎖が配列番号１で表されるヒトＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の３４２６~３４４６番目の塩基を有する配列、３４３２~３４５２番目の塩基を有する配列、配列番号３で表されるマウスＳＴＡＴ６遺伝子配列においてチミンがウラシルに置換された塩基配列の２５９~２７９番目の塩基を有する配列、及び３０２６番目~３０４６番目の塩基を有する配列からなる群から選択されるいずれかの塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換若しくは付加した配列であって、ＳＴＡＴ６遺伝子にハイブリダイズし得る配列からなるセンス鎖であり、他方の鎖が該センス鎖の塩基配列に相補的な塩基配列を含むアンチセンス鎖である。
  3. 　ｄｓＲＮＡ分子が、配列番号５で表されるセンス鎖と配列番号６で表されるアンチセンス鎖、配列番号７で表されるセンス鎖と配列番号８で表されるアンチセンス鎖、配列番号９で表されるセンス鎖と配列番号１０で表されるアンチセンス鎖、配列番号１１で表されるセンス鎖と配列番号１２で表されるアンチセンス鎖、及び配列番号１３で表されるセンス鎖と配列番号１４で表されるアンチセンス鎖からなる群より選択されるいずれかの塩基対からなる、請求項２記載のｄｓＲＮＡ分子。
  4. 　センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項１~３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  5. 　請求項４に記載のｄｓＲＮＡ分子のテンプレートＤＮＡを含み該ｄｓＲＮＡ分子を発現するベクター。
  6. 　請求項１~４のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ分子を１つ又は複数含む、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  7. 　請求項５記載のベクターを含む、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  8. 　センス鎖の５’末端に１個又は複数のＧ（グアニン）からなるオーバーハング塩基を有する、請求項１~３のいずれか１項に記載のｄｓＲＮＡ分子。
  9. 　センス鎖とアンチセンス鎖がリンカー分子を介して連結されている、請求項８記載のｄｓＲＮＡ分子。
  10. 　請求項９に記載のｄｓＲＮＡ分子のテンプレートＤＮＡを含み該ｄｓＲＮＡ分子を発現するベクター。
  11. 　請求項８又は９に記載のｄｓＲＮＡ分子を１つ又は複数含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  12. 　請求項１０に記載のベクターを含む、インターフェロン及び／又は細胞障害を誘導しない、ＳＴＡＴ６遺伝子の発現を抑制し得るアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  13. 　鼻腔投与するための、請求項６、７、１１又は１２に記載のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
  14. 　皮膚に塗布するための軟膏である、請求項６、７、１１又は１２に記載のアレルギー疾患の治療又は予防のための医薬組成物。
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