WO2005116210A2 - Sirna und shrna gegen stat6 zur behandlung allergischer erkrankungen, pathologischer atemwegsveränderungen und von krebs - Google Patents

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Definitions

  • compositions for the treatment of allergic diseases, pathological changes in the respiratory tract and cancer by modulating the gene expression of the Stat ⁇ .
  • the invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of allergic diseases, pathological changes in the respiratory tract and cancer, uses of nucleic acids for the production of pharmaceutical compositions, processes for their production and processes for the treatment of said diseases.
  • Stat ⁇ is the abbreviation for "signal transducer and activator of transcription 6". State is a mandatory transcription factor in the signal transduction of interleukins IL-4 and IL-13. As a result of the binding of IL-4 or IL-13 to cells, Stat ⁇ is phosphorylated by JAK kinases and forms homodimers. The homodimers migrate to the nucleus and induce the transcription of genes. This signaling pathway is formed in both hematopoietic and non-haematopoietic cells.
  • T lymphocytes the interaction with antigen-presenting cells and the IL-4-dependent Stat ⁇ activation leads to differentiation in T helper cells of type 2 (Th2) and to the formation of IL-4, IL-5, IL-9 and IL-13th
  • Th2 T helper cells of type 2
  • Stat ⁇ signaling pathway leads to IL-4-dependent proliferation and to secretion of the Imunglobulins IgE and IgG4.
  • Non-hematopoietic cells that are involved in the immune response at the site of the antigen invasion such as epithelial cells, smooth muscle cells and fibroblasts of the respiratory tract, also have stat-dependent cell functions, such as the expression of chemically sensitive mediators and adhesion molecules, the release of matrix metalloproteases and the production of slime.
  • VCAM1 VCAM1
  • eotaxins IL-5
  • IL-13 IL-5
  • MMP Matrix metalloproteases
  • TIMPS TIMPS
  • Allergic diseases are characterized by a complex inflammatory genesis.
  • the pathological changes are attributed in particular to the interleukins generated by antigen-specific Th2 cells and their effects, which are primarily directed towards the elimination of extracellular pathogens.
  • the adaptation of these immune responses to allergens can lead to allergic reactions both on the skin and in the lungs.
  • Allergic asthma is characterized by ate hypersensitivity, eosinophilia, subepithelial fibrosis and mucus overproduction. In knock-out mice, it was shown that the deficiency of Stat ⁇ leads to the elimination of the expression of the asthmatic phenotype. There is evidence of involvement of stat-dependent mechanisms in the pathogenesis of tumors.
  • IL-4 and IL-13 stimulate the induction of enzymes, particularly the 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase / ⁇ 5- ⁇ 4 isomerase, which catalyze the formation of active steroidal sex hormones in peripheral target tissues.
  • enzymes particularly the 3 ⁇ -hydroxysteroid dehydrogenase / ⁇ 5- ⁇ 4 isomerase, which catalyze the formation of active steroidal sex hormones in peripheral target tissues.
  • the systemic availability of steroid hormones induced by IL-4 and IL-13 can promote the growth of sensitive tumor cells. For example, peripherally formed dihydrotestosterone after androgen ablation through pharmacological or surgical castration is an important source for the growth of prostate cancer.
  • Stat6 deficient mice have increased immunity to primary and metastatic tumors, i.e. they are resistant to relapses of primary fibrosarcomas, reject transplanted mastocytomas and show a reduced mortality after transplantation of spontaneously metastatic breast cancer.
  • the Reed-Sternberg cells which represent the malignant population of this clonal B-cell disease, have both IL-13 receptors and endogenous IL-13 formation in a large number of cases. It has been demonstrated on cell lines of Hodgkin's lymphoma that Stat ⁇ is constitutively active as a result of autocrine growth regulation by IL-13. The autocrine growth regulation can be inhibited by an IL-13 antagonist.
  • RNA interference (RNAi) molecules such as small interfering RNA (siRNA), small hairpin RNA (shRNA), microRNA (miRNA) and long, double-stranded RNA - (dsRNA), and catalytic nucleic acids such as ribozymes and DNAzymes are suitable Inhibit expression of genes by degradation of the target RNA.
  • siRNA small interfering RNA
  • shRNA small hairpin RNA
  • miRNA microRNA
  • dsRNA long, double-stranded RNA -
  • catalytic nucleic acids such as ribozymes and DNAzymes
  • RNAi molecules inhibit the expression of genes in cell lines, plants and animals. "-.
  • Catalytic nucleic acids have both a nucleic acid sequence that realizes the catalytic reaction and a nucleic acid sequence that specifically binds to the target nucleic acid. It is particularly between ribonymes and DNAoxymes made up of ribonucleotides and deoxyribonucleotides. • distinguished. Representatives of the ribozymes with binding-specific RNA cleavage are the hammerhead,.
  • Hepatitis deta virus, hairpin and VS ribozyme or with self-cleaving properties are the Group 1 intron, Group II intron and the ribonuclease P ribozyme;
  • Representatives of the DNAzymes are, for example, the 10-23 and DEC22-18 DNAzy as well as the Zn 2+ -dependent, imidazole-containing DNAzyme (J.Am.Chem. Soc. 122 (2000) 2433), the LANzym (J.Am. Chem. Soc. 124 (2002) 13682) or the metal-independent, imidazo and cationic amine-containing DNAzyme (J.Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9950).
  • These catalytic nucleic acids cleave RNA.
  • the sequence sections of the cleavage are characteristic of the catalytic nucleic acid. The cleavage of the target RNA leads to the inhibition of gene expression.
  • RNAi molecules and catalytic nucleic acids can be produced by commercial RNA or DNA synthesis and using vectors which contain expression cassettes with eukaryotic Ü ⁇ / H 1 promoters (Ambion) or prokaryotic T7 / T3 / SP6 promoters , Their stability in metabolically active systems is increased by the introduction of chemical modifications.
  • RNAi molecules and catalytic nucleic acids in particular derivatives stabilized by chemical modification, can be brought into effect directly or using transfection reagents and vectors in cells, tissues, organs or organisms.
  • the invention is based on the technical problem of providing improved agents for the treatment of allergic diseases, pathogenic airway changes and cancer.
  • the invention teaches a pharmaceutical composition containing a
  • Double-stranded siRNA molecules of the following basic composition are particularly suitable:
  • Antisense strand 5 '- (N') 19 _ 23 (X ') 0 _ 5
  • X, X' ribonucleotides, preferably thymidine and deoxy-thymidine
  • N successive ribonucleotides of the mRNA sequence of the Stat ⁇ (GI: 23397677, NCBI) or partial sequence of length 19 to 23 from the Stat ⁇ sequence
  • N ' a ribonucleotide complementary to this sequence section of the stat6 mRNA.
  • homologs to the sequences mentioned with a homology of at least 80%, preferably at least 90% (calculated using the MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE program, in the version valid at the time of registration).
  • all nucleic acids hybridizing with the nucleic acids used according to the invention are included, namely those which are under stringent conditions (5 ° C to 25 ° C below the melting temperature; see additionally JM Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989 ) and EM Southern, J Mol Biol, 98: 503ff (1975)) hybridize.
  • Double-stranded RNA molecules can a) be an integral part of long RNA molecules, such as icroRNA or double-stranded RNA, and can be generated from them by catalytic cleavage, for example by Dicer or target-specific ribozyme or DNAzyme, and b ) be short, double-stranded RNA, such as shRNA, which follow the principle of action of the above siRNA.
  • They can also be catalytic nucleic acids, such as ribozymes and DNAzymes, which bind specifically to the stat ⁇ mRNA, cleave them at the binding sites which are characteristic of ribozymes and DNAzymes and inhibit gene expression.
  • the oligonucleotide is an siRNA or a shRNA, in particular is selected from the group consisting of SEQ ID 1 to 9.
  • the pharmaceutical composition additionally contains physiologically compatible pharmaceutical auxiliaries and / or or contains carriers.
  • the pharmaceutical preparation of a pharmaceutical composition according to the invention can be carried out in a manner customary in the art. For example, Na + , K + , Li + or cyclohexyl monium can be used as counterions for ionic compounds.
  • Suitable solid or liquid pharmaceutical preparation forms are, for example, granules, powders, dragees, tablets, (micro) capsules, suppositories, syrups, juices, suspensions, emulsions, drops or solutions for injection (IV, IP, IM, SC) or nebulization (aerosols ), transdermal systems, as well as preparations with protracted release of active ingredient, in the manufacture of which conventional auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers are used.
  • auxiliaries such as carriers, explosives, binders, coatings, swelling agents, lubricants or lubricants, flavors, sweeteners and solubilizers are used.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be produced by including at least one inhibitor used according to the invention in a defined dose with a pharmaceutically suitable and physiologically compatible carrier and, if appropriate, other suitable active ingredients, additives or auxiliaries defined inhibitor dose mixed and prepared for the desired dosage form.
  • a 'pharmaceutical composition of the invention may further comprise one or more further components of active ingredients contain.
  • Various oligonucleotides which inhibit the expression of Stat ⁇ mRNA are suitable for this purpose, for example. It. it is also possible, for example, to use cytotoxic components, for example in the treatment of cancer. Cytotoxic components are compounds that directly or indirectly induce apoptosis or at least inhibit growth. In addition to radioisotopes (eg 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu), such groups or compounds can be in particular toxins (eg diphtheria-Pseudomonas toxin) or cytostatics, including so-called prodrugs, which are used in tumor therapy.
  • radioisotopes eg 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu
  • such groups or compounds can be in particular toxins (eg diphtheria-Pseudomon
  • alkylating agents for example mechlorethamine, ifosfamide, chlorambucil, cyclophosphamide, melphalan, alkylsulfonates, busulphan, nitrosoureas, carmustine, lomustine, sustin, triazenes, dacarbazine
  • antimetabolites for example folic acid antagonists, fluorimidine analogs, pyrimidine reXuratogens, pyrimethanexilators, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexurate, pyrimethanexilators, pyrimethanexurate, pyriminex, etc.) , Fluorodeoxyuridine, cytarabine, gemcitabine, purine analogs, mercaptopurine), mitotic inhibitors (e.g.
  • vincaalkaloids vincristine, vinblastine, paclitaxal, docetaxel, protaxel
  • epipodophyllotoxins e.g. etoposide, teniposide
  • antibiotics e.g. dactinubin, e.g. dactinubin, e.g. dactinubin, e.g. dactinubin, e.g. dactinubin Anthracyclines, bleomycin, L-asparaginase), platinum complex compounds (e.g. cisplatin), hormones and related compounds (e.g. adrenal gland steroids,
  • an immunostimulating component is usually a protein or an effective component thereof, which stimulates cells of the immune system.
  • cytokines such as M-CSF, GM-CSF, G-CSF, interferons such as IFN-alpha, beta, gamma, interleukins such as IL-1 to -16 (except -8), human LIF, chemokines such as Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 and IL-8.
  • the invention further relates to the use of an oligonucleotide, in particular an siRNA or a shRNA, preferably according to one of the sequences Seq. ID 1 to 9, for the production of a pharmaceutical composition for the treatment of various diseases.
  • the diseases can be, in particular, allergic diseases, such as asthma, atopic dermatitis, rhinitis and pollinosis, diseases of the lungs, such as inflammation, bronchial obstruction, pulmonary vasoconstriction, bronchitis and emphysema, and tumor diseases, such as carcinomas, leukemias, lymphomas, in particular Hodgkin Lymphomas, and melanomas including metastatic forms act.
  • allergic diseases such as asthma, atopic dermatitis, rhinitis and pollinosis
  • diseases of the lungs such as inflammation, bronchial obstruction, pulmonary vasoconstriction, bronchitis and emphysema
  • tumor diseases such as carcinomas, leukemias, lymphomas, in particular Hodgkin Lymphomas, and melanomas including metastatic forms act.
  • the invention further relates to an oligonucleotide which inhibits the expression of Stat6 mRNA, in particular siRNA or shRNA, for example of the structure
  • the invention further relates to a method for producing a pharmaceutical composition according to the invention, the oligonucleotide being mixed in a physiologically effective dose with customary auxiliaries and / or carriers and galenically prepared.
  • the invention further relates to a method for inhibiting the expression of Stat ⁇ mRNA, a cell expressing Stat ⁇ being supplied with a physiologically effective amount of an inhibitory nucleic acid specific for Stat ⁇ , in particular an siRNA or a shRNA, preferably a nucleic acid according to the invention, in vitro or in vivo becomes.
  • an inhibitory nucleic acid specific for Stat ⁇ in particular an siRNA or a shRNA, preferably a nucleic acid according to the invention, in vitro or in vivo becomes.
  • the invention relates to a method for the treatment of an allergic disease, a pathological change in the respiratory tract and / or cancer, a pharmaceutical composition according to the invention being presented to a sick person or mammal.
  • the expression of the treatment also includes prophylaxis.
  • Example 1 Selection and preparation of RNAi molecules for inhibiting the expression of Stat ⁇
  • siRNA and shRNA are RNAi molecules for inhibiting the expression of the human stat ⁇ mRNA: ssl: Sense strand 5 '-UGCCUUCUCUGAGAUGGAC (tt) Antisense strand 5' -GÜCCAUCUCAGAGAAGGCA (tt) ss2: Sense strand 5 '-ACGCUGUCÜCCGGAGCUAC (tt) Antisense strand 5' -GUAGCUCCGGAGACAGCGÜUT (tt) UGAGCGAAUGGACAGGÜCU (tt) hs1: 5 '-GACCCCCÜGAAGCUGGÜGGCUCUGCCACCAGCÜUCAGGGGGÜC (tt) hs2: 5' -GÜAAGCAAUATGUCACUAGCCACGCUAGÜGACUTAÜUGCÜÜAC (tt)
  • hs3 5 '-GCCAAAGACCUGUCCAUUCGAGACGAAUGGACAGGÜCUUÜGGC (11)
  • T stands for deoxythymidine. Deoxythymidine serves to stabilize the RNA and is also unnecessary, which is why these groups are given in brackets as optional.
  • the siRNA is produced by standard methods of RNA oligonucleotide synthesis (Dharmacon) and that of the shRNA by in vitro transcription using
  • T7 promoter sequence containing oligonucleotides BioTez
  • T7 RNA polymerase Promega
  • the cell lines HeLa, A549, L929, BaF3 and human skin fibroblasts are combined with siRNA and the cationic transfection reagent (Tfx-20, Tfx-50 or DOTAP) with one
  • the siRNA concentration is 0.1 ⁇ M.
  • the Transfection reagents are used with OptiMEM medium (in vitro) according to the manufacturer's instructions.
  • Example 3 Effect of siRNA on mRNA and protein expression of stat ⁇ in cell cultures
  • the effect of the siRNA on stat ⁇ expression in cell cultures is demonstrated by quantitative mRNA determination using real time PCR and semi-quantitative Stat6 protein determination using Western blot.
  • the RNA is isolated using the RNeasy Kit (Qiagen) using RNase-free DNase 1.
  • the cDNA synthesis takes place with the Supe-Script Reverse Transcriptase (RT) Kit (Invita ⁇ ogen) using an oligo (dT) primer.
  • Real time PCR is carried out with the LightCycler (Röche) and the FastStart DNA Master SYBRGreen 1 Kit (Röche).
  • the stat6 mRNA expression is quantified with reference to the constitutively expressed reference gene pyruvate dehydrogenase.
  • the cellular proteins are obtained 48 hours after transfection of the cells by lysis, separated with polyacrylamide gel electrophoresis in 7% SDS and Stat6 with the Western blot using the M20 antibody (Santa Cruz Biotechnology) on the Trans -Blot nitrocellulose membrane (Bio-Rad) with ECL detection (Amersham) detected.
  • FIG. 1 The inhibition of Stat6 protein expression in the human HeLa cell line by siRNA is shown in Figure 1.
  • 5xl0 4 Heia cells were in a 12-well Microtiter plate with 0.1 ⁇ M siRNA and Tfx-20 with a charge ratio of 1: 1 transfected over 2 hours. After 48 hours, the proteins were extracted and separated on a 7.5% SDS-PAGE.
  • Stat ⁇ was detected by immunoblot with the M20 Stat ⁇ antibody.
  • Lane 1, 2, 3, 4 and 5 control without siRNA, control siRNA, ssl, ss2 and ss3.
  • Figure 1 demonstrates that the siRNA ss3 is even more effective than ssl and ss2.
  • the siRNA ss3 is also active in the human lung epithelial carcinoma cell line A549 and in the murine pro-B cell line BaF3 and lung fibroblast cell line L929.
  • IL-4 stimulates the proliferation of the murine pro-B cell line BaF3 via the Stat ⁇ signaling pathway.
  • BaF3 cells are transfected with 0.3 ⁇ M siRNA and DOTAP over 2 hours and incubated for 24 hours in the presence of 1 nM IL-3. After removal of the IL-3 by washing with the culture medium, the cells are incubated with 1 nM IL-4 for 24 h and the proliferation rate is measured with the XTT test (Röche).
  • Example 5 Characterization of the siRNA inhibition of stat ⁇ expression on the IL-4 and TNFalpha- stimulated expression of the chemotactic protein eotaxin
  • IL-4 and TNFalpha stimulate the formation of eotaxin by human skin fibroblasts.
  • Skin fibroblasts are transfected with 0.1 ⁇ M siRNA and Tfx-20 over two hours and Incubated for 24 hours.
  • Eotaxin formation is induced by adding 1 nM IL-4 and 1 nM TNF ⁇ and, after 48 h of incubation in the cell culture supernatant, measured by an eotaxin ELISA (Becton Dickison).

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein die Stat6 mRNA Expression inhibierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.

Description

Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemwegsveränderungen und von Krebs durch Modulation der Genexpression des Statδ.
Gebiet der Erfindung.
Die Erfindung betrifft eine pharmaceutische Zusammen- setzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemwegsveränderungen und von Krebs, Verwendungen von Nukleinsäuren zur Herstellung pharmazeutischer Zusammensetzungen, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren zur Behandlung genannter Erkrankungen.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
Statβ ist die Abkürzjung für "signal transducer and activa- tor of transcription 6". State ist ein obligatorischer Transkriptionsfaktor in der Signaltransduktion der Inter- leukine IL-4 und IL-13. Im Ergebnis der Bindung von IL-4 oder IL-13 an Zellen wird Statβ durch JAK-Kinasen phospho- ryliert und bildet Homodimere. Die Homodimeren wandern zum Kern und induzieren die Transkription von Genen. Dieser Signalweg ist sowohl in haematopoetischen als auch in nichthä atopoetischen Zellen ausgebildet. In T-Lymphozyten führt die Interaktion mit antigenpräsentierenden Zellen und die IL-4-abhängige Statβ-Aktivierung zur Differen- zierung in T-Helferzellen vom Typ 2 (Th2) und zur Bildung von IL-4, IL-5, IL-9 und IL-13. In B-Lymphozyten kommt es über die Aktivierung des Statβ-Signalweges zur IL-4-abhängigen Proliferation und zur Sekretion der Imunglobuline IgE und IgG4. Nichthämatopoetische Zellen, die am Ort der Antigeninvasion an der Immunantwort beteiligt sind, wie z.B. Epithelzellen, glatte Muskelzellen und Fibroblasten der Atemwege, verfügen ebenfalls über Statβ-abhängige Zellfunktionen, wie die Expression von che otaktisehen Mediatoren und Adhäsionsmolekülen, die Freisetzung von Matrixmetalloproteasen und die Produktion von Schleim. In der Lunge wird die Bildung des VCAM1, der Eotaxine und des IL-5 durch IL-4/IL-13 stimuliert. Diese Proteine sind für die Rekrutierung, die Aktivität und das Überleben der eosinophilen Granulozyten und damit für die Entzündungsprozesse von Bedeutung. Matrixmetalloproteasen (MMP) und ihre Inhibitoren (TIMPS) sind an den Auf- und Abbauprozessen des Bindegewebes sowie an der Regulation inflammatorischer Prozesse beteiligt. Untersuchungen an Mäusen und humanen Zellkulturen legen. nahe, dass insbesondere IL-13 die Schleimproduktion in Lungenepithelzellen stimuliert.
Allergische Erkrankungen sind durch eine komplexe entzündliche Genese gekennzeichnet. Die pathologischen Veränderungen werden insbesondere auf die durch Antigen-- spezifische Th2-Zellen generierten Interleukine und ihre- primär auf die Elimination extrazellulärer Pathogene gerichteten Wirkungen zurückgeführt. Die Adaptation dieser Immunreaktionen auf Allergene kann sowohl auf der Haut als auch in der Lunge zu allergischen Reaktionen führen. Allergisches Asthma ist durch Ate wegshyperreagibilität, Eosinophilie, subepitheliale Fibröse und Schleimüberpro- duktion gekennzeichnet. An knock-out Mäusen wurde gezeigt, dass die Defizienz von Statβ zur Elimination der Ausprägung des asthmatischen Phänotyps führt. Es gibt Hinweise auf eine Beteiligung Statβ-abhängiger Mechanismen an der Pathogenese von Tumoren. Steroidhormon- sensitive normale humane Epithelzellen der Mamma und der Prostata sowie Tumorzelllinien der Brust, des Kolons und der Cervix exprimieren Statβ. In diesen Zellen stimulieren IL-4 und IL-13 die Induktion von Enzymen, insbesondere die 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase/Δ5-Δ4-Isomerase, die die Bildung aktiver steroidaler Sexualhormonen in peripheren Zielgeweben katalysieren. Die durch IL-4 und IL-13 induz- ierte systemische Verfügbarkeit von Steroidhormonen kann das Wachstum sensitiver Tumorzellen fördern. So stellt z.B. peripher gebildetes Dihydrotestosteron nach Andro- genablation durch pharmakologische oder chirurgische Kastration eine wichtige Quelle für das Wachstum des Prostatakarzinoms dar.
Stat6-defiziente Mäuse verfügen über eine erhöhte Immunität gegen primäre und metastatische Tumoren, d.h. sie sind resistent gegen Rezidive primärer Fibrosarkome, re- jizieren transplantierte Mastozytome und zeigen eine erniedrigte Mortalität nach der Transplantation spontan metastasierender Mammakarzinome.
In Hodgkin Lymphomen verfügen die Reed-Sternberg-Zellen, welche die maligne Population dieser klonalen B-Zell- Erkrankung darstellen, in einer großen Anzahl von Fällen sowohl über IL-13-Rezeptoren als auch über eine endogene IL-13-Bildung. An Zelllinien des Hodgkin Lymphoms wurde nachgewiesen, dass Statβ im Ergebnis einer autokrinen Wachstumsregulation durch IL-13 konstitutiv aktiv ist. Die autokrine Wachstumsregulation kann durch einen IL-13-Antagonisten inhibiert werden. RNA-Interferenz (RNAi) -Moleküle, wie small interfering RNA (siRNA) , small hairpin RNA (shRNA) , microRNA (miRNA) und lange, doppelsträngige RNA - (dsRNA) , und katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, sind geeignet die Expression von Genen durch Degradation der Target-RNA zu inhibieren. Die zelluläre, unter der Wirkungen des Enzyms Dicer erfolgende Spaltung von dsRNA und miRNA führt zur Bildung von siRNA, d.h. kurzer, ca. 21 Nukleotide langer, doppelsträngiger RNA mit 3 ' -termin'alen Einzel- strangüberhängen. Exogen applizierte synthetische oder unter Verwendung von Vektoren generierte siRNA oder shRNA (eine kurze, doppelsträngige RNA mit einer Hairpin- Struktur) verfügen über Wirkungen, die der durch zelluläre Mechanismen gebildeten siRNA entspricht. RNAi-Moleküle inhibieren die Expression von Genen in Zelllinien, Pflanzen und Tieren. " -.
Katalytische Nukleinsäuren verfügen sowohl über eine Nukleinsäure-Sequenz, die die katalytische Reaktion real- isiert, als auch über eine Nukleinsäure-Sequenz, die spezifisch an die Target-Nukleinsäure bindet. Es wird insbesondere zwischen aus Ribonukleotiden und aus Desoxyribo- nukleotiden aufgebauten Ribozymen bzw. DNAzymen . • unterschieden. Vertreter der Ribozyme mit Bindungs- spezifischer RNA-Spaltung sind das Hammerhead, . Hepatitis deta Virus, Hairpin und VS Ribozym bzw. mit selbstspaltenden Eigenschaften sind die Group 1 Intron, Group II Intron und das Ribonuklease P Ribozym; Vertreter der DNAzyme sind z.B. das- 10-23- und das DEC22-18 DNAzy sowie das Zn2+-abhängige, imidazolenthaltende DNAzym (J.Am. Chem. Soc. 122 (2000) 2433), das LANzym (J.Am. Chem. Soc. 124 (2002) 13682) oder das Metall-unabhängige, imidazo- und kationisches Amin-enthaltende DNAzym (J.Am. Chem. Soc. 124 (2002) 9950) . Diese katalytischen Nukleinsäuren spalten RNA. Die Sequenzabschnitte der Spaltung sind charakteristisch für die katalytische Nukleinsäure. Die Spaltung der Target-RNA führt zur Hemmung der Genexpression.
RNAi-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren können durch kommerzielle RNA- oder DNA-Synthese sowie unter Verwendung von Vektoren, die u.a. Expressionskassetten mit eukaryon- tischen Üβ/H 1 -Promotoren (Ambion) oder prokaryontischen T7/T3/SP6-Promotoren enthalten, hergestellt werden. Ihre Stabilität in Stoffwechsel-aktiven Systemen wird durch die Einführung chemischer Modifikationen erhöht. Die Modifikationen erfolgen u.a. als Substitution der Phosphat-Reste durch Phosphorothioate, der 2 ' -OH-Gruppe der Zucker- Ribonukleotide durch 2'-0-Methyl, 2'-0-Allyl oder -NH2 sowie durch Einführung von Desoxyribonukleotiden, z.B. von 3 ' -terminalen Desoxy-Thymidinen in den Einzelstrangüberhängen der siRNA oder in den Bindungsarmen der Ribozyme, oder von 3', -3 ' -invertierten Desoxyribonukleo- tiden. RNAi-Moleküle und katalytische Nukleinsäuren, insbesondere durch chemische Modifikation stabilisierte Derivate, können direkt oder unter Verwendung von Trans- fektionsreagentien sowie von Vektoren in Zellen, Geweben, Organen oder Organismen zur Wirkung gebracht werden.
Zu den vorstehenden Zusammenhängen wird ergänzend auf die folgenden Literaturstellen verwiesen. Takeda, K. et al., (1997) J.Mol . Med. 75, 317-326 Kuper an, D. A. et al., (2002) Nat . Med. 8, 885-889 Walter, D. M. et al., (2001) J lmmunoi . 161 , 4668-4675 Taube, C. et al., (2002) J lmmunoi . 169, 6482-6489 Zhu, Z. et al., (2002) J lmmunoi . 168, 2953-2962 Elias, J. A. et al . , (2003) J Clin. lnvest 111, 291-297 Wills-Karp, M. et al . , (2003) Curr. Opin. Pulm.Med. 9, 21-27 Kelly, E. A. et al.,(2003) Curr .Opin. Pulm. ed. 9,28-33 Riffo-Vasquez, Y. et al.,(2002) Pharmacol. Ther . 94,. 5 185-211 Foster, P. S. et al . , (2002) Pharmacol. Ther. 94, 253-264 Lee, J. H. et al . , (2001) Am. JRespirCellMol. Biol. 25, 474-485 Moore, P. E. et al., (2002) Äm.J Physiol Lung Cell0 Mol. Physiol 282, L847-L853 Oshima, Y. et al., (2001) Cel/ lmmunoi. 211, 37-42 Skinnider, B. F. et al . , (2002) Leuk. Lymphoma 43, 1203-1210- Gingras, S. et al., (2001) J Steroid Biochem.Mol.Biol. 76, 213-225 Takeda, K. et al., (1996) Nature 380, 627-630 Shimoda, K. et al., (1996) Nature 380, 630-633 Kuper an, .D. et al., (1998) J.Exp.Med. 187, 939-948 Terabe, M. et al . , (2000) Nat. lmmunoi. 1, 515-520 Kacha, A. K. et al., (2000) J lmmunoi. 165, 6024-6028 Ostrand-Rosenberg, S. et al., (2000) J.Immunolr 165, 6015-6019 Ostrand-Rosenberg, S. et al., (2002) J lmmunoi. 169, 5796-5804 Zamore, P. D. et al . , (2000) Cell 101, 25-33 Elbashir, S. M. et al., (2001) Nature 411, 494-498 • Elbashir, S. M. et al . , (2001) EMBO J 20, 6877-6888 Elbashir, S. M. et al.,' (2002) Methods 26, 199-213 Sohail, M. et al., (2003) Nucleic Äcids Res. 31, E38 Kawasaki, H. et al., (2003) Nucleic Äcids Res. 31, 981-987 Shuey, D. J. et al., (2002) Drug Discov. Today 7 , 1040-46 Sorensen, D. R. et al . , (2003) J Mol.Biol. 327, 761-766
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Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zu Grunde, verbesserte Mittel zur Behandlung von allergischer Erkrankungen, pathogener Atemwegsveränderungen und von Krebs zur Verfügung zu stellen.
Grundzüge der Erfindung und Ausführungsformen.
Zur Lösung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine die
Statδ mRNA Expression inhibierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.
Es sind eine Vielzahl von Oligonukleotiden geeignet. Besonders geeignet sind doppelsträngige siRNA-Moleküle folgender grundsätzlicher Zusammensetzung:
Sensestrang 5 ' - (N) 19_23 (X) 0_5 Antisensestrang 5 ' - (N ' ) 19_23 (X ' ) 0_5 wobei X, X' = Ribonukleotide, bevorzugt Thymidin und Desoxy-Thymidin, N = aufeinanderfolgende Ribonukleotide der mRNA-Sequenz des Statβ (GI: 23397677, NCBI) bezie- hungeweise Teilsequenz der Länge 19 bis 23 aus der Statβ Sequenz, und N' = ein zu diesem Sequenzabschnitt der stat6-mRNA komplementäres Ribonukleotid. Es sind auch Homologe zu den genannten Sequenzen mit einer Homologie von zumindest 80%, vorzugsweise zumindest 90% einsetzbar (berechnet mit dem Programm MEGALIGN, DNASTAR LASERGENE, in der zum Anmeldezeitpunkt gültigen Fassung) . Weiterhin sind alle mit erfindungsgemäß eingesetzten Nukleinsäuren hybridisierende Nukleinsäuren umfasst, nämlich solche, die unter stringenten Bedingungen (5°C bis 25 °C -unterhalb der AufSchmelztemperatur; siehe ergänzend J.M. Sambrook et al., A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und E.M. Southern, J Mol Biol, 98:503ff (1975)) hybridisieren. Doppelsträngige RNA-Moleküle, wie vorstehend angegeben, können a) integraler Bestandteil langer RNA-Moleküle, wie icroRNA oder doppelsträngiger RNA, sein und aus diesen durch katalytische Spaltung, z.B. durch Dicer oder Target-spezifisches Ribozym bzw. DNAzym, generiert werden, und b) kurze, doppelsträngige RNA, wie shRNA, sein, die dem Wirkungsprinzip der vorstehenden siRNA folgen. Es kann sich auch um katalytische Nukleinsäuren, wie Ribozyme und DNAzyme, handeln, die spezifisch an die statβ mRNA binden, diese an den für Ribozyme und DNAzyme charakteristischen Bindungsstellen spalten und die Genexpression inhibieren. Bevorzugt ist es, wenn das Oligonukleotid eine siRNA oder eine shRNA ist, insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID 1 bis 9. In aller Regel wird es sich empfehlen, wenn die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich physiologisch verträgliche galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe enthält. Die galenische Herrichtjμng einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung kann in fachüblicher Weise erfol- gen. Als Gegenionen für ionische Verbindungen kommen beispielsweise Na+, K+, Li+ oder Cyclohexyla monium infrage. Geeigente feste oder flüssige galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro-) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder Lösungen zur Injektion (i.V., i.p., i.m., s.c.) oder Vernebelung (Aerosole), transdermale Systeme, sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit- oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler, Verwendung finden. Als Hilfsstoffe sei Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Lac- tose, Mannit und andere Zucker, Talcum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Zellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuss- oder Sesamöl, Polyethylenglycole und Lösungsmittel, wie etwa steriles Wasser und ein- oder mehrwertige Alkohole, beispielsweise Glycerin, genannt. Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist dadurch herstellbar, dass mindestens ein erfindungsgemäß verwendeter Inhibitor in definierter Dosis mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und ggf. weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz- oder Hilfsstoffen mit definierter Inhibitordosis gemischt und zu der gewünschten Darreichungsform hergerichtet ist.
Eine erfindungsgemäße' pharmazeutische Zusammensetzung kann des weiteren auch eine oder mehrere weitere Wirkstoffkom- ponenten enthalten. Hierfür kommen beispielsweise verschiedene die Expression von Statβ mRNA inhibierende Oligonukleotide in Frage. Es. ist aber auch möglich, beispielsweise zytotoxische Komponenten einzusetzen, beispielsweise bei der Therapie von Krebs. Zytotoxische Komponenten sind Verbindungen, welche direkt oder indirekt Apoptose einleiten oder zumindest wachstumshemmend wirken. Solche Gruppen bzw. Verbindungen können neben Radioisotopen (z.B. 188Re, 213Bi, 99mTc, 90Y, 131J, 177Lu) insbe- sondere Toxine (z.B. Diphterie-Pseudomonas-Toxin) oder Zytostatika einschließlich sogenannter Prodrugs sein, welche in der Tumortherapie eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind: Alkylantien (z.B. Mechlorethamin, Ifosfamid, Chlorambucil, Cyclophosphamid, Melphalan, Alkylsulfonate, Busulphan, Nitrosoharnstoffe, Carmustin, Lomustin, Se- ustin, Triazene, Dacarbazin) , Antimetaboliten (z.B. Folsäure-Antagonisten, Methotrexat, Pyrimidin-Analoga, Fluoruracil, Fluordesoxyuridin, Cytarabin, Gemcitabin, Purin-Analoga, Mercaptopurin) , Mitosehemmer (z.B. Vincaal- kaloide, Vincristin, Vinblastin, Paclitaxal, Docetaxel, Protaxel) , Epipodophyllotoxine (z.B. Etoposid, Teniposid) , Antibiotika (z.B. Dactino ycin, Daunorubicin, Idarubicin, Anthracycline, Bleomycin, L-Asparaginase) , Platinkomplexverbindungen (z.. B. Cisplatin) , Hormone und verwandte Ver- bindungen (z.B. Nebennierensindensteroide,
Aminogluthetimid, Gestagene, Östrogene, Androgene, An- tiöstrogene, Tamoxifen, Steriodanaloga, Flutamid) . Es ist auch möglich, immunmodulierend (stimulierend oder abschwächend) wirkende Wirksubstanzen einzusetzen. Beispielsweise eine immunstimulierende Komponente ist meist ein Protein oder ein wirksamer Bestandteil hiervon, welches Zellen des Immunsystems stimuliert. Beispiele hierfür sind: Zytokine, wie M-CSF, GM-CSF, G-CSF, Inter- ferone, wie IFN-alpha, beta, gamma, Interleukine wie IL-1 bis -16 (außer -8), human LIF, Chemokine wie Rantes, MCAF, MIP-1-alpha, -beta, NAP-1 und IL-8. Die Erfindung betrifft des weiteren die Verwendung eines Oligonukleotides, insbesondere einer siRNA oder einer shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung verschiedener Erkrankungen. Bei den Erkrankungen kann es sich insbesondere um allergische Erkrankungen, wie Asthma, atopische Dermatitis, Rhinitis und Pollinose, Erkrankungen der Lunge, wie Entzündungen, Bron- choobstruktion, pulmonale Vasokonstriktion, Bronchitis und Emphysem sowie Tumorerkrankungen, wie Karzinome, Leukämien, Lymphome, insbesondere Hodgkin Lymphome, und Melanome einschließlich metastasierter Formen handeln.
Die Erfindung betrifft des weiteren ein die Expression von Stat6 mRNA inhibierendes Oligonukleotid, insbesondere siRNA oder shRNA, beispielsweise des Aufbaus
Sensestrang 5 ' - (N) 19_23 (X) 0_5 Antisensestrang 5 ' - ( ' ) 19_23 (X ' ) 0_5,
vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9 und dessen Verwendung. Die Erfindung betrifft des Weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei das Oligonukleotid in einer physiologisch wirksamen Dosis mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Inhibierung der Expression von Statβ mRNA, wobei einer Statβ exprimierenden Zelle in vitro oder in vivo eine physiolo- gisch wirksame Menge einer für Statβ spezifischen inhibitorischen Nukleinsäure, insbesondere eine siRNA oder eine shRNA, vorzugsweise eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, zugeführt wird. Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, einer pathologischen Atemwegsveränderung und/oder von Krebs, wobei einem erkrankten Menschen oder Säugetier eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung dargereicht wird, Der Ausdruck der Behandlung umfasst dabei auch die Prophylaxe .
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von nicht- limitierenden Beispielen näher erläutert.
Beispiel 1: Auswahl und Herstellung von RNAi-Molekülen zur Inhibition der Expression von Statβ
Folgende siRNA und shRNA sind RNAi-Moleküle zur Inhibierung der Expression der humanen statβ-mRNA: ssl: Sensestrang 5 ' -UGCCUUCUCUGAGAUGGAC (tt ) Antisensestrang 5 ' -GÜCCAUCUCAGAGAAGGCA (tt) ss2: Sensestrang 5 ' -ACGCUGUCÜCCGGAGCUAC (tt) Antisensestrang 5 ' -GUAGCUCCGGAGACAGCGü (tt) ss3: Sensestrang 5 ' -AGACCÜGUCCAUUCGCÜCA(tt) Antisensestrang 5 ' -UGAGCGAAUGGACAGGÜCU (tt) hs1 : 5 ' -GACCCCCÜGAAGCUGGÜGGCUCUGCCACCAGCÜUCAGGGGGÜC (tt) hs2 : 5 ' -GÜAAGCAAUATGUCACUAGCCACGCUAGÜGACUTAÜUGCÜÜAC (tt)
hs3 : 5 ' -GCCAAAGACCUGUCCAUUCGAGACGAAUGGACAGGÜCUUÜGGC (11)
Die vorstehenden Sequenzen sind in dieser Reihenfolge die Seq.-ID 1 bis 9. "t" steht hierbei für Desoxythymidin. Desoxythymidin dient der Stabilisierung der RNA und ist aber auch entbehrlich, weshalb diese Gruppen in Klammern als fakultativ angegeben sind. Die Herstellung der siRNA erfolgt durch Standardmethoden der RNA-Oligonukleotid- Synthese (Dharmacon) und die der shRNA durch in vitro Transkription unter Verwendung von
T7-Promotor-Sequenz-enthaltenden Oligonukleotiden (BioTez) und T7-RNA-Polymerase (Promega) .
Beispiel 2: Transfektion von siRNA in Zelliinien
Die Zelllinien HeLa, A549, L929, BaF3 sowie humane Hautfi- broblasten werden mit siRNA und dem kationischen Transfek- tionsreagenz (Tfx-20, Tfx-50 bzw. DOTAP) mit einem
Ladungsverhältnis von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Die siRNA-Konzentration beträgt 0,1 μM. Die Transfektionsreagenzien werden mit OptiMEM-Medium (Invi- trogen) nach den Vorschriften der Hersteller eingesetzt,
Beispiel 3: Wirkung der siRNA auf die mRNA- und Proteinexpression des statβ in Zellkulturen
Der Nachweis der Wirkung der siRNA auf die statβ-Expression in Zellkulturen erfolgt durch quantita- tive mRNA-Bestimmung mit der real time PCR und semiquantitativer Stat6-Protein-Bestimmung mit dem Western blot. Acht Stunden nach Beginn der Transfektion wird die RNA mit dem RNeasy Kit (Qiagen) unter Einsatz von RNase-freier DNase 1 isoliert. Die cDNA-Synthese erfolgt mit dem Supe - Script Reverse Transkriptase (RT) Kit (Invitaςogen) unter Verwendung eines Oligo (dT) -Primers . Die real time PCR wird mit dem LightCycler (Röche) und dem FastStart DNA Master SYBRGreen 1 Kit (Röche) durchgeführt. Die stat6 mRNA- Expression wird unter Bezugnahme auf das konstitutiv ex- primierte Referenzgen Pyruvat-Dehydrogenase quantifiziert.
Zur Charakterisierung der Stat6-Proteinexpression werden die zellulären Proteine 48 Stunden nach Transfektion der Zellen durch Lyse gewonnen, mit der Polyacrylamid- Gelelektrophorese in 7 % SDS aufgetrennt und Stat6 mit dem Western blot unter Verwendung des M20-Antikörpers (Santa Cruz Biotechnology) auf der Trans-Blot Nitrocellulose- Membran (Bio-Rad) mit ECL-Detektion (Amersham) nachgewiesen.
Die Inhibition der Proteinexpression des Stat6 in der humanen HeLa-Zelllinie durch siRNA ist in Figure 1 dargestellt. 5xl0 4 Heia-Zellen wurden in einer 12-well Mikrotiterplatte mit 0,1 μM siRNA und Tfx-20 mit einem Ladungsratio von 1:1 über 2 Stunden transfiziert. Nach 48 h wurden die Proteine extrahiert und mit einer 7,5 % SDS- PAGE aufgetrennt. Das Statβ wurde durch Immunoblot mit dem M20-Statβ-Antikörper nachgewiesen. Lane 1, 2, 3, 4 und 5: Kontrolle ohne siRNA, Kontroll-siRNA, ssl, ss2 und ss3. Figur 1 demonstriert, dass die siRNA ss3 noch wirksamer als ssl und ss2 ist. Die siRNA ss3 ist auch in der humanen Lungenepithel-Karzinomzelllinie A549 und in der murinen pro-B-Zelllinie BaF3 und Lungenfibroblasten-Zelllinie L929 wirksam.
Beispiel 4 : Charakterisierung der siRNA-Hemmung der . Statβ-Expression auf die IL-4 abhängige Prbliferation
IL-4 stimuliert die Proliferation der murinen pro-B- Zelllinie BaF3 über den Statβ-Signalweg. BaF3-Zellen wer- den mit 0,3 μM siRNA und DOTAP über 2 Stunden transfiziert und 24 h in Gegenwart von 1 nM IL-3 inkubiert. Nach Entfernung des IL-3 durch Waschung mit dem Kulturmedium werden die Zellen mit 1 nM IL-4 über 24 h inkubiert und mit dem XTT-Test (Röche) die Proliferationsrate gemessen.
Beispiel 5 : Charakterisierung der siRNA-Hemmung der statβ-Expression auf die IL-4 und TNFalpha- stimulierte Expression des chemotaktisehen Proteins Eotaxin
IL-4 und TNFalpha stimulieren die Bildung von Eotaxin durch humane Hautfibroblasten. Hautfibroblasten werden mit 0,1 μM siRNA und Tfx-20 über zwei Stunden transfiziert und 24 Stunden inkubiert. Die Eotaxin-Bildung wird durch Zugabe von 1 nM IL-4 und 1 nM TNFα induziert und nach 48 h Inkubation im Zellkulturüberstand durch einen Eotaxin- ELISA (Becton Dickison) gemessen.

Claims

Patentansprüche :
1. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein die Statβ mRNA Expression modulierendes Oligonukleotid in physiologisch wirksamer Dosis.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das Oligonukleotid eine siRNA oder eine shRNA ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Oligonukleotid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Seq.-ID 1 bis 9. ■>
4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zusätzlich enthaltend physiologisch verträgliche galenische Hilfs- und/oder Trägerstoffe.
5. Verwendung eines Oligonukleotides, insbesondere einer siRNA oder einer shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung allergischer Erkrankungen, pathologischer Atemwegsveränderungen und von Krebs .
6. Die Expression von Statβ mRNA inhibierendes isoliertes Oligonukleotid, insbesondere siRNA oder shRNA, vorzugsweise gemäß einer der Sequenzen Seq.-ID 1 bis 9.
7. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei ein Oligonukleotid nach Anspruch β in einer physiologisch wirksamen Dosis mit üblichen Hilfs- und/oder Trägerstoffen gemischt und galenisch hergerichtet wird.
8. Verfahren zur Modulierung, insbesondere Inhibierung, der Expression von Statβ mRNA, wobei einer Statβ ex- primierenden Zelle, insbesondere einer Vertebraten- zelle, vorzugsweise einer humanen Zelle, in vitro oder in vivo eine physiologisch wirksame Menge einer Statβ modulierenden, insbesondere inhibierenden, Nukleinsäure, insbesondere eine siRNA oder eine shRNA, vorzugsweise eine Nukleinsäure gemäß einer der Sequenzen 1 bis 9, zugeführt wird.
9. Verfahren zur Behandlung einer allergischen Erkrankung, einer pathologischen Atemwegsveränderung und/oder von Krebs, wobei einem erkrankten Menschen oder Säugetier eine pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 dargereicht wird.
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