DE602004006509T2

DE602004006509T2 - Zu einem für den menschlichen cd40-rezeptor codierenden cdna-bereich homologe oligoribonukleotidsequenz sowie damit zusammenhängende duplex-oligoribonukleotide, vektoren, pharmazeutische zusammensetzungen und verwendungen

Info

Publication number: DE602004006509T2
Application number: DE602004006509T
Authority: DE
Inventors: Josep Maria Aran Perramon; Josep Maria Grinyo Boira; Juan Torras Ambros; Raquel Pluvinet Ortega; Josep Maria Cruzado Garrit; Immaculada Herrero Fresneda
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-04-08
Filing date: 2004-03-15
Publication date: 2008-05-21
Anticipated expiration: 2024-03-16
Also published as: EP1614751B1; DE602004006509D1; WO2004090134A1; ES2216707A1; ES2216707B1; EP1614751A1; ATE362537T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Oligoribonukleotidsequenz homolog zu einer Region von cDNA, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert, sowie Doppelstrang-Oligoribonukleotide gebildet durch das Verbinden der Oligoribonukleotidsequenzen und dazu komplementären Sequenzen. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist außerdem das Bereitstellen von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die Oligoribonukleotidsequenzen und/oder die Doppelstrang-Oligoribonukleotide umfassen, Transfervektoren, welche zu deren Expression in der Lage sind, sowie Verwendungen davon.
Stand der Technik
Strategien zur Hemmung der Genexpression
Auf Molekülebene sind Erkrankungen häufig das Ergebnis der inadäquaten Expression von einem oder verschiedenen Proteinen, welche durch Gene codiert sind. Die bis heute angewandten herkömmlichen pharmakologischen Behandlungen waren in vielen Fällen in der Lage, die Symptomatologie der Erkrankungen zu lindern, jedoch beinhaltet die Mehrheit der Behandlungen Nebenwirkungen, welche sich bei verlängerter Behandlung aufgrund der unspezifischen Wirkungen der angewandten Arzneimittel verschlimmern.
Mit der Entwicklung von Molekularbiologie und Gentechnik wurde kürzlich das Gentherapiekonzept eingeführt, eine spezifische kausale Behandlung für Erkrankungen, welche auf direkter Einwirkung auf die Nukleinsäuren basieren. So wurde in Fällen, in denen bekannt ist, dass eine bestimmte Viren-, Entzündungs- oder Tumorerkrankung durch eine anomale Expression/Synthese eines bestimmten Proteins hervor gerufen wird, eine Reihe therapeutischer Methodiken entwickelt, „Antisense" genannt, welche auf die Abschwächung der Produktion des Proteins gerichtet sind. Zu diesem Zweck werden kleine Fragmente von Nukleinsäuren (Antisense-Oligonukleotide) verwendet, von denen einige eine katalytische Wirkung aufweisen (Ribozyme, DNAzyme, ...), wodurch der Abbau der Boten-RNA (mRNA) potenziert und/oder die Biosynthese des an der Erkrankung beteiligten Proteins blockiert wird, und zwar durch spezifische Bindung an bestimmte Sequenzen der entsprechenden Ziel-mRNA. Nichtsdestotrotz wurden in den bis heute durchgeführten vorklinischen und klinischen Tests die inhibitorische Effizienz und die biologischen Auswirkungen der Moleküle wegen ihres unzureichenden Verhältnisses in der Effizienz/Sicherheitsbilanz bezweifelt.
Erst vor Kurzem wurde eine vielversprechende neue Strategie zum Regulieren oder Blockieren der Genexpression auf RNA-Ebene, „Post-Transkriptionelles Gen-Silencing" (PTGS) genannt, eingeführt. Auch „RNA-Interferenz" (RNAi) genannt, betrifft das Phänomen die spezifische Unterdrückung der Genexpression, welche durch kleine Doppelstrang-RNA-Moleküle (siRNA) mediiert wird. Erst vor Kurzem ergaben experimentelle Ergebnisse einen RNAi-Antriebsmechanismus, der sich von dem durch die Antisense-Moleküle verwendeten unterscheidet. Die siRNA-Moleküle (bevorzugt 21 bis 25 Nukleotide lang) agieren anscheinend als eine Führungssequenz, welche an einen Proteinkomplex bindet, welcher Nukleaseaktivität aufweist. Dieser Komplex ist in der Ziel-mRNA positioniert, welche eine spezifische Sequenz enthält, die komplett komplementär zu dem Antisense-Strang der siRNA ist, und initiiert deren Abbau.
Der Hauptvorteil, den die Verwendung von siRNAs optimiert für RNAi im Vergleich zu den „Antisense"-Methoden bietet, ist ihre extreme Wirksamkeit, was die Verwendung von sehr niedrigen Konzentrationen von siRNA (von 1 bis 100 nM), die in der Lage ist, eine zu 80 bis 100 % spezifische Hemmung der Expression eines bestimmten Gens zu bewirken, ermöglicht. Außerdem scheinen die siRNAs resistenter gegen den Nuklease-mediierten Abbau zu sein als die Antisense-Oligonukleotide. Daher können sich die siRNAs als sehr wirksam als therapeutische Wirkstoffe herausstellen. Von den Einzelstrang-Oligoribonukleotidsequenzen ist auch bekannt, dass sie in der Lage sind, eine leistungsstarke spezifische Hemmung der Expression ihres Zielgens zu bewirken.
Der CD40-Rezeptor als Ziel für Gentherapiebehandlungen
Das Protein CD40, welches 1985 identifiziert wurde, ist ein auf der Zelloberfläche befindlicher Rezeptor, der zur Familie der Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (TNF-R) gehört. Das Biomolekül wurde anfänglich in den B-Zellen charakterisiert. Anschließend wurde beim Analysieren der Konsequenzen seiner Dysfunktion bei Patienten mit dem Hyper-IgM-Syndrom und bei Knock-out-Mäusen (defizient) für CD40 nachgewiesen, dass es eine Schlüsselrolle bei den T-Zellen abhängigen humoralen Immunreaktionen spielt. Des Weiteren ist sein spezifischer Ligand, das Protein CD40L (CD154), ein Mitglied der Familie der Tumornekrosefaktor (TNF)-Zytokine und wird grundsätzlich in CD4+-aktvierten T-Zellen exprimiert. So wurde beobachtet, dass die CD40-CD40L-Wechselwirkungen unterschiedliche Signalwandlungswege aktivieren und so die Herstellung unterschiedlicher Zytokine und anderer Mediatoren herbeiführen, welche kurzgefasst eine fundamentale Rolle bei der Regulierung der Immunreaktion spielen.
Kürzlich wurde festgestellt, dass CD40 auch in Monozyten, dendritischen Zellen, Endothelzellen, Fibroblasten und Epithelzellen exprimiert wird. In nicht-blutbildenden Zellen ist der CD40-Rezeptor an der Amplifikation und Regulierung der Entzündungsreaktionen beteiligt. Außerdem haben experimentelle Studien unter Verwendung von Knockout-Mäusen oder Anti-CD40-Antikörpern gezeigt, dass die Blockade der CD40-CD40L-Wechselwirkung vorteilhaft für verschiedene pathologische Modelle ist, einschließlich Transplantate, Autoimmunmanifestationen und Infektionskrankheiten.
Weitere Informationen zu den oben genannten Studien und Verfahren sind aus den am Ende dieser Beschreibung aufgelisteten Dokumenten erhältlich.
Kurzdarstellung der Erfindung
Eine Aufgabe der Erfindung ist eine Oligoribonukleotidsequenz der Gruppe gebildet durch die Oligoribonukleotidsequenzen
5'-gcgaauuccuagacaccug-3' (SEQ. ID. NR. 1)
und
5'-caggugucuaggaauucgc-3' (SEQ. ID. NR. 2)
wobei diese Oligoribonukleotidsequenzen homolog zu der Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 241 bis 259 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid bereitzustellen, welches durch das Verbinden der Oligoribonukleotidsequenzen nach Anspruch 1 durch Homologie (auch komplementäre Paarung genannt) gebildet wird, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
5'-gcgaauuccuagacaccuguu-3' (SEQ. ID. NR. 7)
3'-uucgcuuaaggaucuguggac-5'
5'-gcgaauuccuagacaccugtt-3' (SEQ. ID. NR. 8)
3'-ttcgcuuaaggaucuguggac-5'
In der vorliegenden Anmeldung ist der Begriff „Oligoribonukleotidsequenz" ein Begriff im Hinblick auf die Zusammensetzung eines Oligoribonukleotids. Die Oligoribonukleotide sind biologische Elemente oder Einheiten (kurze RNA-Segmente), welche notwendigerweise einsträngig sind. Ebenso betrifft in dieser Anmeldung der Begriff „Doppelstrang-Oligoribonukleotid" die Doppelstrang-Oligoribonukleotide wie zum Beispiel siRNA, shRNA usw.
Bevorzugt ist die Oligoribonukleotidsequenz an einem der Enden davon um insgesamt höchstens vier zusätzliche Ribonukleotide erweitert, wodurch eine erweiterte Oligoribonukleotidsequenz gebildet wird, wobei die zusätzlichen Ribonukleotide homolog zu der entsprechenden Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 237 bis 263 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert, d.h.:
5'-gaaagcgaauuccuagacaccuggaac-3' (SEQ. ID. NR. 13)
Tatsächlich modifiziert das Hinzufügen dieser zusätzlichen Ribonukleotide die Wirksamkeit der Sequenz nicht wesentlich. Die Erfindung umfasst auch die Doppelstrang-Oligoribonukleotide gebildet durch das Verbinden dieser erweiterten Oligoribonukleotidsequenzen durch Homologie, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist. Diese Abschlussnukleotide uu oder tt werden in Abhängigkeit vom eingesetzten Syntheseverfahren erhalten: enzymatisch (uu) oder chemisch (tt).
Es ist außerdem möglich, Oligoribonukleotidsequenzen zu verwenden, welche einerseits durch die zuvor genannten Oligoribonukleotidsequenzen gebildet sind, von denen 1 bis 6 Ribonukleotide von einem der Enden entfernt wurden, und die gleiche Anzahl Oligoribonukleotide wurde an dem anderen Ende hinzugefügt. Es ist außerdem möglich, die entstehende Sequenz mit einer Reihe von Oligoribonukleotiden im Bereich von 1 bis 6 zu verlängern. Anders ausgedrückt, ist es auch eine Aufgabe der Erfindung, eine Oligoribonukleotidsequenz bereitzustellen, welche eine Oligoribonukleotidsubsequenz aus der Gruppe gebildet durch die Oligoribonukleotidsubsequenzen
5'-uccuagacaccug-3' (SEQ. ID. NR. 3)
5'-gcgaauuccuaga-3' (SEQ. ID. NR. 4)
5'-ucuaggaauucgc-3' (SEQ. ID. NR. 5)
5'-caggugucuagga-3' (SEQ. ID. NR. 6)
umfasst, und welche außerdem ein Maximum von 12 zusätzlichen Ribonukleotiden hinzugefügt an einem der Enden davon oder an beiden Enden gleichzeitig umfasst, wodurch eine modifizierte Oligoribonukleotidsequenz gebildet wird, so dass die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz homolog zu der Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 230 bis 270 in der cDNA ist, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert. Es ist außerdem von Vorteil, ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden von zwei modifizierten Oligoribonukleotidsequenzen wie den zuvor genannten durch Homologie bereitzustellen, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
Vorteilhafterweise umfasst jede der Oligoribonukleotidsequenzen gemäß der Erfindung zusätzlich ein bis drei Abschlussribonukleotide am 3'-Ende davon, wodurch eine verlängerte Nukleotidsequenz gebildet wird, wobei die Abschlussribonukleotide nicht homolog zu der entsprechenden Region zwischen den Nukleotiden 230 bis 270 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert. Es ist auch von Vorteil, das entsprechende Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden von zwei verlängerten Oligoribonukleotidsequenzen durch Homologie bereitzustellen, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
Bevorzugt besitzt die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz die Verbindung von mindestens einem Peptid, einem Zucker, einem Lipid oder einem Polymer. Außerdem von Interesse sind die aus diesen gebildeten Doppelstrang-Oligoribonukleotide.
Vorteilhafterweise weisen die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz oder das entsprechende Doppelstrang-Oligoribonukleotid mindestens eine chemische Modifikation in einem oder einem anderen der Elemente auf, welche die Struktur davon bilden, entweder in den Ribonukleosiden oder in den Internukleotidbindungen. Diese chemische Modifikation ist bevorzugt eine Modifikation aus der Gruppe gebildet durch die Addition einer Phosphatgruppe am 5'-Ende der Oligoribonukleotidsequenz, den Austausch der 2'-Hydroxylgruppen in den Komponentenribosen der Oligoribonukleotidsequenz durch 2'-O-Methylgruppen, die Substitution von Ribonukleosidanaloga wie die N3'→P5'-Phosphoramidate für Ribonukleoside und den Austausch der Internukleotidphosphatbindungen durch andere Bindungen wie Phosphorthioat oder Methylphosphonat. Diese Modifikationen können leicht durchgeführt werden und beinhalten keine wesentliche Veränderung der biologischen Eigenschaften.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung erhält man, wenn im Doppelstrang-Oligoribonukleotid der Erfindung die Oligoribonukleotidsequenzen, die erweiterten Oligoribonukleotidsequenzen, die modifizierten Oligoribonukleotidsequenzen oder die verlängerten Oligoribonukleotidsequenzen an einem der Enden davon durch eine Schleife oder einen Linker von 2 bis 25 Nukleotiden kovalent miteinander verbunden sind, um eine shRNA zu bilden.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, welche eine Oligoribonukleotidsequenz und/oder ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid gemäß der Erfindung umfasst.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist das Bereitstellen eines Gentransfervektors, welcher in der Lage ist, die Expression einer Oligoribonukleotidsequenz und/oder eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids gemäß der Erfindung einzuleiten.
Vorteilhafterweise wird eine Oligoribonukleotidsequenz und/oder ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid gemäß der Erfindung für das Herstellen eines Medikamentes verwendet, wobei das Medikament bevorzugt dem Hemmen der Expression des humanen CD40-Rezeptors oder dem Blockieren oder Reduzieren der humanen CD40-CD40L-Wechselwirkung dient.
Es ist genauso von Vorteil, eine Oligoribonukleotidsequenz und/oder ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid gemäß der Erfindung für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch Abstoßungsphänomene bei Organ- oder Gewebetransplantaten, akute Entzündungsprozesse, chronische Entzündungsprozesse, Prozesse mit Kostimulation von Lymphozyten, Allergiemanifestationen, Autoimmunmanifestationen oder kardiovaskuläre Manifestationen (wie zum Beispiel bevorzugt Arterioskle rose), Infektionsprozesse, rheumatologische Manifestationen und Krebs zu verwenden.
Eine weitere bevorzugte Verwendung einer Oligoribonukleotidsequenz und/oder eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids gemäß der Erfindung ist für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch allergische Dermatitis, Psoriasis, Arteriosklerose, Multiple Sklerose, Lungenfibrose, Vireninfektionen, Bakterieninfektionen, Asthma, Diabetes Typ I, Lyme-Krankheit, Crohn-Krankheit, ulzeröse Kolitis, Lupus, Thyreoiditis, Arthritis, Lymphome und Leukämie.
Es ist auch von Vorteil, eine Oligoribonukleotidsequenz und/oder ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid gemäß der Erfindung für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Störungen zu verwenden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung werden in der folgenden Beschreibung offenbart, welche, ohne jeglichen einschränkenden Charakter, eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft, unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen, wobei:
1 eine graphische Darstellung der Verteilung von vier Doppelstrang-siRNAs ist, welche dafür ausgelegt sind, die Expression des humanen CD40 entlang der Sequenz der entsprechenden cDNA zu hemmen.
2 CD40/Cyclophyllin-Verhältnisse zeigt, welche man bei der relativen Quantifizierung von CD40-Transkripten erhält.
3 eine Western-Blot-Analyse der Expression von CD40 (a) und β-Actin (b) in den ECV-304-Zellen behandelt mit den unterschiedlichen siRNAs, welche gegen humanes CD40 gerichtet sind, zeigt.
4 die Expression von ICAM-1 in unbehandelten HUVEC durch Flusszytometrie, unstimuliert (helles Histogramm) und stimuliert mit CD154 (dunkles Histogramm) zeigt.
5 die Expression von VCAM-1 in unbehandelten HUVEC durch Flusszytometrie, unstimuliert (helles Histogramm) und stimuliert mit CD154 (dunkles Histogramm) zeigt.
6 die Expression von E-Selectin in unbehandelten HUVEC durch Flusszytometrie, unstimuliert (helles Histogramm) und stimuliert mit CD154 (dunkles Histogramm) zeigt.
7 die Expression von ICAM-1 in HUVEC stimuliert mit CD154 und transfiziert mit siRNA-2 (helles Histogramm) oder mit msiRNA-2 (dunkles Histogramm) zeigt.
8 die Expression von VCAM-1 in HUVEC stimuliert mit CD154 und transfiziert mit siRNA-2 (helles Histogramm) oder mit msiRNA-2 (dunkles Histogramm) zeigt.
9 die Expression von E-Selectin in HUVEC stimuliert mit CD154 und transfiziert mit siRNA-2 (helles Histogramm) oder mit msiRNA-2 (dunkles Histogramm) zeigt.
10 die prozentuale Expression von ICAM-1 in stimulierten HUVEC transfiziert mit siRNA-2 oder mit msiRNA-2 im Vergleich zu den nicht transfizierten zeigt.
11 die prozentuale Expression von VCAM-1 in stimulierten HUVEC transfiziert mit siRNA-2 oder mit msiRNA-2 im Vergleich zu den nicht transfizierten zeigt.
12 die prozentuale Expression von E-Selectin in stimulierten HUVEC transfiziert mit siRNA-2 oder mit msiRNA-2 im Vergleich zu den nicht transfizierten zeigt.
13 bis 18 Phasenkontrast-Mikroskopbilder verschiedener einzelner Schichten von HUVEC, unbehandelten HUVEC (13); unbehandelten HUVEC stimuliert mit CD154 (14); unbehandelten HUVEC inkubiert mit HL-60-Zellen (15); unbehandelten HUVEC stimuliert mit CD154 und inkubiert mit HL-60-Zellen (16); HUVEC behandelt mit msiRNA-2, stimuliert mit CD154 und inkubiert mit HL-60-Zellen (17); HUVEC behandelt mit siRNA-2, stimuliert mit CD154 und inkubiert mit HL-60-Zellen (18) sind.
19 das Fluoreszenzverhältnis von angehafteten HL-60-Zellen und HUVEC-Zellen transfiziert mit siRNA-2 oder msiRNA-2 zeigt.
Experimentelle Ergebnisse
Zu den im Folgenden angegebenen ursprünglichen Ergebnissen zählen die Auslegung, die Synthese und die Charakterisierung der inhibitorischen Wirksamkeit von siRNAs für das Gen-Silencing von CD40. Es wird die Herstellung einer siRNA (siRNA-2) gezeigt, welche eine potente inhibitorische Wirkung spezifisch für die Expression/Synthese von CD40 in einem Tumorzellenmodell, welches den CD40-Rezeptor exprimiert, aufweist.
Herstellung von siRNAs gegen den humanen CD40-Rezeptor
Doppelstrang siRNAs, welche gegen humanes CD40 gerichtet sind, sowie eine Kontroll-Doppelstrang-siRNA, deren Sequenz nicht auf das Stilllegen der Expression eines Gens gerichtet ist, wurden ausgelegt und synthetisiert. Die beim Screening der unterschiedlichen synthetisierten siRNA-Moleküle verwendeten Verfahren sind im Folgenden beschrie ben. Als ein Beispiel ist die komplette Charakterisierung von vier der Moleküle detailliert beschrieben. Die Verteilung von vier der Doppelstrang-siRNAs ausgelegt für das Hemmen der Expression des humanen CD40 entlang der Sequenz der entsprechenden cDNA ist in 1 gezeigt.
Zum Auslegen der siRNAs aus der Sequenz der Ziel-cDNA werden die nicht translatierten 5'- und 3'-Regionen und die Regionen nahe dem Startkodon vermieden, da sie Bindungsstellen zu Regulierungsproteinen aufweisen. Diese Proteine sowie die Initiierungskomplexe der Proteintranslation können die Bindung des RISC-Komplexes (RNA-induzierter Silencing-Komplex) stören, welcher Endonukleaseaktivität aufweist, dem Mediator beim Abbau der Ziel-mRNA.
Für jede siRNA wird ein Paar Oligonukleotide verwendet, welche 21 Basenpaare aufweisen, von denen 19 komplementär zum Zielgen, in diesem Fall humanes CD40, sind.
Prinzipiell gibt es zwei Möglichkeiten der Herstellung der siRNA-Doppelstränge in vitro, das chemische Verfahren, bei welchem mit Hilfe eines herkömmlichen RNA/DNA-Synthesizers die RNA-Stränge aus 21 bis 25 Nukleotiden separat synthetisiert und anschließend durch Komplementarität zu einem Ring geformt werden, um einen siRNA-Doppelstrang zu bilden. Alternativ wird ein Enzymverfahren der siRNA-Synthese basierend auf der Transkription in vitro mit Hilfe von T7-RNA-Polymerase verwendet. In diesem Fall wurde das zweite Verfahren, in vitro Transkription, verwendet, da es für Charakterisierungsexperimente im kleinen Format wirtschaftlicher ist.
Innerhalb der humanen CD40-cDNA-Sequenz werden Sequenzen des Typs AA (N₁₉) gesucht, und nach der Auswahl wird am 3'-Ende von jedem der ausgewählten Oligonukleotide eine Sequenz von 8 Basenpaaren komplementär zu der Sequenz des T7-Promotors (5'-cctgtctc-3') hinzugefügt. Diese Oligonukleo tide und ihre komplementären Homologe werden separat an den Primer des T7-Promotors gebunden, welcher in Gegenwart von DNA-Polymerase (Klenow) in jedem Fall eine Doppelstrang-DNA erzeugt. Anschließend werden diese kurzen DNA-Fragmente als Substrate für eine in vitro Transkriptionsreaktion verwendet. Abschließend werden die Produkte der Transkriptionsreaktionen gegenseitig hybridisiert, wodurch Doppelstrang-RNAs erzeugt werden, welche auch als Doppelstrang-siRNAs bekannt sind. Die Sequenzen von vier synthetisierten Doppelstrang-siRNAs, welche gegen humanes CD40 gerichtet sind, sowie die der Kontroll-siRNA sind Folgende:

hCD40 siRNA-1 5'-uuucaccgcaaggaaggcauu-3' (SEQ. ID. NR. 9) 3'-uuaaaguggcguuccuuccgu-5'
hCD40 siRNA-2 5'-caggugucuaggaauucgcuu-3' (SEQ. ID. NR. 7) 3'-uuguccacagauccuuaagcg-5'
hCD40 siRNA-3 5'-agcuuguccaagggugacauu-3' (SEQ. ID. NR. 10) 3'-uuucgaacagguucccacugu-5'
hCD40 siRNA-4 5'-aggaagaucgucgggaaaauu-3' (SEQ. ID. NR. 11) 3'-uuuccuucuagcagcccuuuu-5'
Kontroll-siRNA 5'-uggucacgagucuuguaguuu-3' (SEQ. ID. NR. 12) 3'-uuaccagugcucagaacauca-5'

Wirksamkeit der Doppelstrang-siRNAs beim Stilllegen der Expression von humanem CD40 auf mRNA-Niveau
ECV-304-Zellen, eine humane Zelllinie, welche Endothelmerkmale aufweist, wurden separat mit den unterschiedlichen Doppelstrang-siRNAs transfiziert (inkubiert), welche gegen die mRNA für humanes CD40 gerichtet sind, einschließlich der Kontroll-Doppelstrang-siRNA, mit einer Konzentration von 100 nM in jedem Fall. Die Penetration davon in die Zellen wurde durch die Verwendung eines kationischen Lipids als Transfervehikel vereinfacht. Nach 48 Stunden wurden die Expressionslevels des CD40-Transkripts in allen transfizierten Proben durch Echtzeit-RT-PCR analysiert. Diese Werte wurden im Vergleich zur Expression eines Referenzgens (das Cyclophyllin-Gen wurde hier als Referenz genommen) normalisiert. So wurde das CD40/Cyclophyllin-Expressionsverhältnis berechnet.
Bei dieser semiquantitativen Analyse wurde die Expression des Zielgens (CD40) von jeder der mit siRNAs behandelten Proben als ein Wert im Vergleich zu der mit der KontrollsiRNA behandelten Probe ausgedrückt. Das Quantifizierungsergebnis ist in relativen Einheiten der Expression angegeben.

Tabelle 1 unten zeigt die CD40/Cyclophyllin-Verhältnisse erhalten bei der relativen Quantifizierung der CD40-Transkripte. Tabelle 1

CD40/Cyclophyllin-Verhältnis (Durchschnitt ± Standardabweichung)
	ECV-304
	100 nM
hCD40-siRNA-1	3,41 ± 1,09
hCD40-siRNA-2	0,71 ± 0,61*
hCD40-siRNA-3	3,38 ± 0,69
hCD40-siRNA-4	4,55 ± 2,09
Kontroll-siRNA	2,82 ± 1,07

Somit verursacht, gemäß der erhaltenen Ergebnisse, die Doppelstrang-siRNA-2 der vorliegenden Erfindung eine signi fikante Hemmung (p < 0,05; Student „T-Test") von etwa vier Mal der Expression des CD40 über dem Wert, welcher bei den mit der Kontroll-siRNA behandelten Zellen erhalten wurde. 2 zeigt diese Ergebnisse graphisch.
Wirksamkeit der Doppelstrang-siRNAs bei der Hemmung der Synthese des humanen CD40-Rezeptors.
In diesem Fall wurden die ECV-304-Zellen auch mit den siRNAs (100 nM) transfiziert, die gegen humanes CD40 gerichtet sind (und parallel dazu mit der entsprechenden Kontroll-siRNA). Sie wurden dann mit den entzündungsfördernden Zytokinen TNF-α und IF-γ stimuliert, welche die Überexpression von CD40 induzieren. 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Zellen lysiert und die Expressionslevels des CD40 (50 kDa) wurden in dem Proteinextrakt durch Western-Blot mit einem spezifischen Antikörper gegen humanes CD40 analysiert. Die erhaltenen Werte wurden im Vergleich zu der Expression von β-Actin (42 kDa) in den Zellen normalisiert.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 3 angegeben. Es wird bestätigt, dass nur in den Zellen behandelt mit der Doppelstrang-siRNA-2, und nicht in den Zellen behandelt mit einer der anderen analysierten siRNAs eine hohe Stilllegung der induzierten Expression von CD40 stattfand. In dem Fall der siRNA-2 der vorliegenden Erfindung zeigen die CD40-Proteinlevels eine Verringerung von über 80 % im Vergleich zu den unbehandelten Proben, oder denen, die mit der Kontroll-Doppelstrang-siRNA behandelt wurden.
Hemmung der Expression zellulärer Adhäsionsmoleküle (CAM) in CD-154-aktivierten Endothelzellen durch RNA-Interferenz (RNAi). RNAi-mediierte Hemmung der Leukozytenadhäsion in CD-154-aktivierten Endothelzellen.
Ein wichtiger Schritt im Immunentzündungsprozess, die Aktivierung der Endothelzellen durch die CD40-CD154-Wechselwirkung, induziert die Expression der zellulären Adhäsionsmoleküle CAM, was das Austreten von Entzündungszellen aus dem Lumen des Blutgefäßes verursacht. Es wurde daher untersucht, ob die siRNA-2 den CD40-CD154-Aktivierungsweg in HUVEC (humane, venöse Nabelschnurendothelzellen) stören kann. Die Wirkung von siRNA-2 gegen eine Kontrolle, msiRNA-2, bei welcher es sich um eine siRNA-Sequenz gleich der von siRNA-2 handelt, jedoch mit einer Subsequenz von 5 Basenpaaren verändert an einer Zwischenstelle, wurde verglichen. Der Vergleich erfolgte durch Flusszytometrieanalyse sowohl der zellulären Adhäsionsmoleküle CAM und der Anhaftung von Leukozyten in CD40-aktivierten Endothelzellen. Wenn HUVEC zusammen mit Jurkat D1.1 CD154+-Zellen kultiviert wurden, erhöhten HUVEC die Expression von ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin. Im Gegensatz dazu zeigten HUVEC behandelt mit siRNA-2 eine starke Verringerung bei der Expression der obengenannten CAM, wenn sie über CD154 aktiviert wurden. Die Behandlung der HUVEC mit der Kontroll-msiRNA-2 verursachte nur eine leichte Verringerung der Expression von CAM nach Aktivierung durch CD154. Ferner zeigte die direkte Bewertung der Anhaftung von Leukozyten in CD154-aktivierten HUVEC mittels HL-60-Zellen, welche die Liganden für die drei Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin exprimieren, dass die Vorbehandlung mit siRNA-2 die Anhaftung von Leukozyten um 87 % verringerte (19), was mit msiRNA-2 nicht erreicht wird. Daher ist die potente Hemmungswirkung der siRNA-2 gegenüber dem CD40-CD154-Pfad vergleichbar mit dem, was beobachtet wurde, wenn ein Antikörper eingesetzt wurde, welcher das CD154 blockiert. Außerdem hat die Anti-CD40-siRNA-2 keine Auswirkung auf die Anhaftung von Leukozyten induziert durch die Aktivierung von HUVEC durch TNF-α, was ihre Unfähigkeit demonstriert, CD-120 (eine weitere Komponente des TNF-α-Rezeptors) und damit seine Spezifität zu stören.
In einer Reihe von Assays wurden HUVEC Zellen, sowohl nicht transfiziert als auch transfiziert mit siRNA-2 oder msiRNA-
In einer Reihe von Assays wurden HUVEC-Zellen, sowohl nicht transfiziert als auch transfiziert mit siRNA-2 oder msiRNA-2, vor der Analyse durch Koinkubation mit Jurkat D1.1 (CD154+) Zellen mit einem T.EC-Verhältnis von 5:1 für 6 Stunden (E-Selectin) oder 16 Stunden (ICAM-1 und VCAM-1) aktiviert. Etwa 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Kokulturen mit PBS gewaschen, um die Jurkat D1.1-Zellen angehaftet an der HUVEC-Einzelschicht zu entfernen. Die Expression von E-Selectin, ICAM-1 und VCAM-1 in den Endothelzellen wurde durch Flusszytometrie analysiert. In 4, 5 und 6 stellen die hellen Histogramme die Basalexpression von CAM für unbehandelte HUVEC dar, und die dunklen Histogramme stellen die Expression von CAM in unbehandelten HUVEC stimuliert mit D1.1 (CD154+) dar. In 7, 8 und 9 stellen die hellen Histogramme die Expression von CAM in HUVEC transfiziert mit siRNA-2, stimuliert mit D1.1 (CD154+) dar, und die dunkeln Histogramme stellen die Expression von CAM in HUVEC transfiziert mit msiRNA-2, stimuliert mit D1.1 (CD154+) dar.
10, 11 und 12 zeigen Säulendiagramme, welche die prozentuale Expression von CAM wie Folgt berechnet angeben: (((Expression von CAM für Zellen behandelt mit siRNA-2 und induziert mit D1.1 (CD154+)) – (Expression von basalem CAM))/((Expression von CAM für unbehandelte Zellen induziert mit D1.1 (CD154+)) – (Expression von basalem CAM))] × 100.
Ähnliche Berechnungen wurden für msiRNA-2 angestellt.
Die CAM-Expressionsdaten sind die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) der entsprechenden Histogramme für drei unabhängige Experimente.
In einer weiteren Reihe von Assays wurden HUVEC Zellen, nicht transfiziert oder transfiziert mit siRNA-2 oder msiRNA-2, vor dem Assay durch Kokultivierung mit Jurkat D1.1 (CD154+) Zellen mit einem T.EC-Verhältnis von 5:1 für 16 Stunden aktiviert. 48 Stunden nach der Transfektion wurden die Kokulturen mit reichlich PBS gewaschen, um die Jurkat D1.1-Zellen angehaftet an der HUVEC-Einzelschicht zu entfernen, welche anschließend mit Calcein-AM-beladenen HL-60-Zellen für 30 Minuten bei 37 °C koinkubiert wurde. Der Überstand wurde durch Absaugen entfernt und zwei vorsichtige Waschungen erfolgten mit PBS zum Entfernen der nichtangehafteten Zellen. 13 bis 18 zeigen Phasenkontrast-Mikroskopbilder mit einer 40fachen Vergrößerung wie Folgt:

13, Einzelschicht unbehandelter HUVEC.
14, Einzelschicht unbehandelter HUVEC, koinkubiert mit HL-60-Zellen.
15, unbehandelte HUVEC, aktiviert mit Jurkat D1.1 (CD154+).
16, unbehandelte HUVEC, aktiviert mit Jurkat D1.1 (CD154+), koinkubiert mit HL-60-Zellen.
17, HUVEC behandelt mit msiRNA-2, aktiviert mit Jurkat D1.1 (CD154+), koinkubiert mit HD-60-Zellen.
18, HUVEC behandelt mit siRNA-2, aktiviert mit Jurkat D1.1 (CD154+), koinkubiert mit HL-60-Zellen.

Nach der mikroskopischen Untersuchung wurden die übrigen angehafteten Zellen gesammelt und das Verhältnis von Fluoreszenz-markierten angehafteten HD-60-Zellen zu nicht markierten Endothelzellen wurde bestimmt. Das Verhältnis wurde durch Flusszytometrie nach Zählung von 10.000 Ereignissen pro Probe bestimmt. 100 % Anhaftung wurde dem Durchschnittsverhältnis erhalten aus HUVEC behandelt mit msiRNA-2 (19) zugeordnet.
Indikationen
Die CD40-CD40L-Wechselwirkung spielt eine sehr wichtige Rolle bei unterschiedlichen Aspekten der humoralen und zellulären Immunreaktion. Die Wechselwirkung ist essentiell bei der Aktivierung der T-Zellen, zur Erhöhung der Kapazität der Präsentation von Antigen in den Antigen-präsentierenden Zellen (APC), bei der Aktivierung von B-Zellen (einschließlich ihrer Proliferation und bei der Steuerung der Änderung des Isotops der IgGs) und bei der Aktivierung von Epithel- und Endothelzellen, welche an Entzündungsprozessen beteiligt sind.
Daher ist eine Verwendung gemäß der Erfindung die Verwendung für das Herstellen von Medikamenten, welche einen anti-human CD40-Inhibitor gemäß der Erfindung wie die siRNA-2 aufweisen, für die Blockierung oder Verringerung der CD40-CD40L-Wechselwirkung, welche die Grundlage der humanen Pathologie darstellt oder in einem beliebigen Maße darin vorliegt, in einer medizinischen Disziplin und mit dem Zweck der Erzeugung vorteilhafter oder therapeutischer Wirkungen.
Daher ist die Verwendung von Anti-CD40-siRNAs besonders auf dem Gebiet von Organtransplantaten angezeigt, zum Hemmen oder kompletten Vermeiden der akuten Abstoßungsphänomene und für das Herbeiführen von Langzeittoleranz mit der begleitenden Verabreichung von anderen Immunsuppressoren oder allein und isoliert.
Des Weiteren kann die Blockierung der CD40-CD40L-Wechselwirkung durch siRNAs angemessen sein bei therapeutischen Anwendungen bei einer Erkrankung, welche mit Entzündungsprozessen voranschreitet, wie Allergie-, Autoimmun-, kardiovaskulären, Infektions- und rheumatologischen Manifestationen (allergische Dermatitis, Psoriasis, Arteriosklerose, Multiple Sklerose, Lungenfibrose, Viren- und Bakterieninfektionen, Asthma, Diabetes Typ I, Lyme-Krankheit, Crohn-Krankheit, Thyreoiditis, Arthritis) und selbst bei neurodegenerativen Störungen wie der Alzheimer-Krankheit. Unterschiedliche vorklinische Studien, bei welchen Anti-CD40L- Blockierungsantikörper eingesetzt wurden, oder Knock-out-Mäuse, sowohl für CD40 als auch für CD40L, unterstützen diese Aussagen.
Allgemeine Referenzen

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SEQUENZLISTE

Claims

Oligoribonukleotidsequenz aus der Gruppe gebildet durch die Oligoribonukleotidsequenzen 5'-gcgaauuccuagacaccug-3' (SEQ. ID. NR. 1) und 5'-caggugucuaggaauucgc-3' (SEQ. ID. NR. 2) wobei diese Oligoribonukleotidsequenzen homolog zu der Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 241 bis 259 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert.
Oligoribonukleotidsequenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie an einem der Enden davon durch insgesamt höchstens vier zusätzliche Ribonukleotide erweitert ist, wodurch eine erweiterte Oligoribonukleotidsequenz gebildet wird, wobei die zusätzlichen Ribonukleotide homolog zu der entsprechenden Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 237 bis 263 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert.
Oligoribonukleotidsequenz, welche eine Oligoribonukleotidsubsequenz aus der Gruppe gebildet durch die Oligoribonukleotidsubsequenzen 5'-uccuagacaccug-3' (SEQ. ID. NR. 3) 5'-gcgaauuccuaga-3' (SEQ. ID. NR. 4) 5'-ucuaggaauucgc-3' (SEQ. ID. NR. 5) 5'-caggugucuagga-3' (SEQ. ID. NR. 6) umfasst, und welche außerdem ein Maximum von 12 zusätzlichen Ribonukleotiden hinzugefügt an einem der Enden davon oder an beiden Enden gleichzeitig umfasst, wodurch eine modifizierte Oligoribonukleotidsequenz gebildet wird, so dass die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz homolog zu der Region eingeschlossen zwischen den Nukleotiden 230 bis 270 in der cDNA ist, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert.
Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich ein bis drei Abschlussribonukleotide am 3'-Ende davon umfasst, wodurch eine verlängerte Nukleotidsequenz gebildet wird, wobei die Abschlussribonukleotide nicht homolog zu der entsprechenden Region zwischen den Nukleotiden 230 bis 270 in der cDNA sind, welche den humanen CD40-Rezeptor, wie laut GeneBank-Zugangsnummer X60592, codiert.
Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz die Verbindung von mindestens einem Peptid, einem Zucker, einem Lipid oder einem Polymer aufweist.
Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz eine chemische Modifikation in einem oder einem anderen der Elemente aufweist, welche die Struktur davon bilden, entweder in den Ribonukleosiden oder in den Internukleo tidbindungen, wobei die chemische Modifikation eine Modifikation aus der Gruppe gebildet durch die Addition einer Phosphatgruppe am 5'-Ende der Oligoribonukleotidsequenz, den Austausch der 2'-Hydroxylgruppen in den Komponentenribosen der Oligoribonukleotidsequenz durch 2'-O-Methylgruppen, die Substitution von Ribonukleosidanaloga wie die N3'→P5'-Phosphoramidate für Ribonukleoside und den Austausch der Internukleotidphosphatbindungen durch andere Bindungen wie Phosphorthioat oder Methylphosphonat ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden der Oligoribonukleotidsequenzen nach Anspruch 1 durch Homologie, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt: 5'-gcgaauuccuagacaccuguu-3' (SEQ. ID. NR. 7) 3'-uucgcuuaaggaucuguggac-5' 5'-gcgaauuccuagacaccugtt-3' (SEQ. ID. NR. 8) 3'-ttcgcuuaaggaucuguggac-5' erweitert ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden der erweiterten Oligoribonukleotidsequenzen nach Anspruch 2 durch Homologie, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden von zwei modifizierten Oligoribonukleotidsequenzen nach Anspruch 3 durch Homologie, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid gebildet durch das Verbinden von zwei verlängerten Oligoribonukleotidsequenzen nach Anspruch 4 durch Homologie, wobei der entstehende Doppelstrang an den 3'-Enden davon durch zwei ungepaarte Abschlussnukleotide uu oder tt erweitert ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz die Verbindung von mindestens einem Peptid, einem Zucker, einem Lipid oder einem Polymer aufweist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligoribonukleotidsequenz, die erweiterte Oligoribonukleotidsequenz, die modifizierte Oligoribonukleotidsequenz oder die verlängerte Oligoribonukleotidsequenz mindestens eine chemische Modifikation in einem oder einem anderen der Elemente aufweist, welche die Struktur davon bilden, entweder in den Ribonukleosiden oder in den Internukleotidbindungen, wobei die chemische Modifikation eine Modifikation aus der Gruppe gebildet durch die Addition einer Phosphatgruppe am 5'-Ende der Oligoribonukleotidsequenz, den Austausch der 2'-Hydroxylgruppen in den Komponentenribosen der Oligoribonukleotidsequenz durch 2'-O-Methylgruppen, die Substitution von Ribonukleosidanaloga wie die N3'→P5'-Phosphoramidate für Ribonukleoside und den Austausch der Internukleotidphosphatbindungen durch andere Bindungen wie Phosphorthioat oder Methylphosphonat ist.
Doppelstrang-Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligoribonukleotidsequenzen, die erweiterten Oligoribonukleotidsequenzen, die modifizierten Oligoribonukleotidsequenzen oder die verlängerten Oligoribonukleotidsequenzen an einem der Enden davon durch eine Schleife oder einen Linker von 2 bis 25 Nukleotiden zum Bilden einer shRNA kovalent miteinander verbunden sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche eine Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 13 umfasst.
Gentransfervektor, welcher eine Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 exprimiert.
Gentransfervektor, welcher ein Doppelstrang-Oligoribonukleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 13 exprimiert.
Verwendung einer Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für das Herstellen eines Medikamentes.
Verwendung eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 7 bis 13 für das Herstellen eines Medikamentes.
Verwendung einer Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch Abstoßungsphänomene bei Organ- oder Gewebetransplantaten, akute Entzündungsprozesse, chroni sche Entzündungsprozesse, Prozesse mit Kostimulation von Lymphozyten, Allergiemanifestationen, Autoimmunmanifestationen oder kardiovaskuläre Manifestationen, Infektionsprozesse, rheumatologische Manifestationen und Krebs.
Verwendung eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 7 bis 13 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch Abstoßungsphänomene bei Orga- oder Gewebetransplantaten, akute Entzündungsprozesse, chronische Entzündungsprozesse, Prozesse mit Kostimulation von Lymphozyten, Allergiemanifestationen, Autoimmunmanifestationen oder kardiovaskuläre Manifestationen, Infektionsprozesse, rheumatologische Manifestationen und Krebs.
Verwendung einer Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch allergische Dermatitis, Psoriasis, Arteriosklerose, Multiple Sklerose, Lungenfibrose, Vireninfektionen, Bakterieninfektionen, Asthma, Diabetes Typ I, Lyme-Krankheit, Crohn-Krankheit, ulzeröse Kolitis, Lupus, Thyreoiditis, Arthritis, Leukämien und Lymphome.
Verwendung eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 7 bis 13 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung einer Erkrankung aus der Gruppe gebildet durch allergische Dermatitis, Psoriasis, Arteriosklerose, Multiple Sklerose, Lungenfibrose, Vireninfektionen, Bakterieninfektionen, Asthma, Diabetes Typ I, Lyme-Krankheit, Crohn-Krankheit, ulzeröse Kolitis, Lupus, Thyreoiditis, Arthritis, Leukämien und Lymphome.
Verwendung einer Oligoribonukleotidsequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Störungen.
Verwendung eines Doppelstrang-Oligoribonukleotids nach einem der Ansprüche 7 bis 13 für das Herstellen eines Medikamentes zur Behandlung neurodegenerativer Störungen.