CN101291948B - 寡核糖核苷酸以及其用于治疗脱发、肾衰竭和其它疾病的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双链化合物，优选一种寡核糖核苷酸，其下调人类p53基因的表达。本发明还涉及一种药物组合物，它含有该化合物，或能够表达该寡核糖核苷酸化合物的媒介物，以及药学上可接受的载体。本发明还涉及一种治疗患有脱发或急性肾衰竭或其他疾病患者的方法，包括向患者给药治疗有效剂量的所述药物组合物从而治疗患者。脱发可由化疗或放疗引起，并且所述患者可能患有癌症，尤其是乳腺癌。

Description

寡核糖核苷酸以及其用于治疗脱发、肾衰竭和其它疾病的方法

在本申请中引用了各种专利和科技出版物。为了更完全地描述本发明所属领域的现有技术，各出版物的公开以参考的方式完全引入本申请中。 

发明背景 

siRNA和RNA干涉

RNA干涉(RNAi)是涉及双链(ds)RNA-依赖性基因特异性转录后沉默的现象。最初，研究此现象并操作哺乳动物细胞的实验尝试因为响应于长dsRNA分子而活化的活性、非特异性抗病毒防御机制而受挫；见Gil等.2000，Apoptosis，5：107-114。后来发现21个核苷酸RNA的合成二联体能介导哺乳动物细胞内基因特异性RNAi，而不刺激通用的抗病毒防御机制(见Elbashir等.Nature 2001，411：494-498和Caplen等.Proc Natl Acad Sci2001，98：9742-9747)。因此，小的干涉RNA(siRNA)是小的双链RNA，在理解基因功能的方面已成为有力的工具。 

因此，RNA干涉(RNAi)是指哺乳动物中由小的干涉RNA(siRNA)(Fire等，1998，Nature 391，806)或微RNA(miRNA)(Ambros V.Nature431：7006，350-355(2004)；和Bartel DP.Cell.2004 Jan 23；116(2)：281-97MicroRNAs：genomics，biogenesis，mechanism，and function)介导的序列特异性转录后基因沉默过程。植物中相应的过程通常称为特异性转录后基因沉默或RNA沉默，并通常在真菌中称为压制。siRNA是双链RNA分子，它下调或沉默(防止)其内源(胞内)对应部分基因/mRNA的表达。RNA干涉是基于dsRNA物质进入特定蛋白复合体的能力，然后它靶向于互补的细胞RNA并特异性地降解它。因此，RNA干涉响应是含有siRNA的核酸内切酶复合体的特征，该复合体通常称为RNA-诱导的沉默复合体(RISC)，它介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解可在互补于siRNA双链体反义链的区域中间发生(Elbashir等2001，Genes Dev.，15，188)。详细地说，较长的dsRNA由III 型RNA酶降解为短的(17-29bp)dsRNA片段(也称为小抑制RNA-“siRNA”)(DICER，DROSHA，etc.，Bernstein等.，Nature，2001，v.409，p.363-6；Lee等.，Nature，2003，425，p.415-9)。RISC蛋白复合体识别这些片段和互补的mRNA。整个过程结束于靶mRNA的核酸内切酶裂解(McManus&Sharp，Nature Rev Genet，2002，v.3，p.737-47；Paddison&Hannon，Curr Opin Mol Ther.2003 Jun；5(3)：217-24)。对于这些术语和可能机制的信息，见Bernstein E.，Denli AM.Harmon GJ：2001 The rest issilence.RNA.I；7(11)：1509-21；Nishikura K.：2001 A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst.Cell.I 16；107(4)：415-8和PCT公布WO 01/36646(Glover等)。 

已经广泛报道了对应于已知基因的siRNA的选择和合成，见，例如Chalk AM，Wahlestedt C，Sonnhammer EL.2004 Improved and automatedprediction of effective siRNA Biochem.Biophys.Res.Commun.Jun 18；319(1)：264-74；Sioud M，Leirdal M.，2004，Potential design rules and enzymaticsynthesis of siRNAs，Methods Mol Biol；252：457-69；Levenkova N，Gu Q，RuxJJ.2004，Gene specific siRNA selector Bioinformatics.I 12；20(3)：430-2和Ui-Tei K，Naito Y，Takahashi F，Haraguchi T，Ohki-Hamazaki H，Juni A，UedaR，Saigo K.，Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequencesfor mammalian and chick RNA interference Nucleic Acids Res.2004 I9；32(3)：936-48.Se also Liu Y，Braasch DA，Nulf CJ，Corey DR.Efficient andisoform-selective inhibition of cellular gene expression by peptide nucleicacids，Biochemistry，2004 1 24；43(7)：1921-7。还可参见于PCT公布WO2004/015107(Atugen)和WO 02/44321(Tuschl等)，以及Chiu YL，RanaTM.siRNA function in RNAi：a chemical modification analysis，RNA 2003Sep；9(9)：1034-48和用于生产修饰的/更稳定siRNA的I专利No.5898031和6107094(Crooke)。 

多个研究组描述了能够在细胞内产生siRNA的基于DNA的媒介物的进展。该方法一般涉及转录小的发夹RNA，它在细胞内被有效处理以形成siRNA。Paddison等.PNAS 2002，99：1443-1448；Paddison等.Genes&Dev 2002，16：948-958；Sui等.PNAS 2002，8：5515-5520；和Brummelkamp等.Science 2002，296：550-553。这些报道介绍了产生能够特异性地靶向于 大量内源和外源表达基因的siRNA的方法。 

siRNA近来已经被成功地用于灵长类中的抑制；详情见Tolentino等.，Retina 24(1)February 2004 I 132-138。 

p53基因和多肽

人类p53基因是熟知和高度研究的基因。p53多肽在细胞胁迫响应机制中起重要作用，通过转化各种不同刺激，例如DNA破坏条件，诸如γ-辐射、转录或复制脱调节，和癌基因转化，引起细胞生长停止或凋亡(Gottlieb等，1996，Biochem.Biophys.Acta，1287，p.77)。p53多肽对诱导响应这样的刺激的细胞程序性死亡或“凋亡”是必需的。大多数抗癌治疗还伤害或杀死含有天然p53的正常细胞，导致与健康细胞的伤害或死亡相关的严重副作用。因为这些副作用很大程度上由p53-介导的正常细胞死亡而确定，抗癌治疗急性阶段暂时抑制p53已经作为避免这些严重毒性事件的治疗策略。这描述于美国专利No.6,593,353和Komarov PG等，1999，Achemical inhibitor ofp53 that protects mice from the side effects of cancertherapy.，Science，285(5434)：1651，1653.已证实p53参与了化疗和辐射诱导的脱发(Botcharev等，2000，p53 is essential for Chemotherapy-inducedHair Loss，Cancer Research，60，5002-5006)。 

脱发

近来在理解调节毛囊形成和头发生长的分子和途径中已经有了重大进展。化疗破坏生产毛干的生长球(bulb)中的基体角质化细胞的增殖。这使得毛囊进入营养不良的退化阶段，其中毛干的整体性受损，然后头发断裂并掉落。由于超过90％的头皮囊在任何时间都处于生长阶段，这些头发在化疗后迅速丧失，因此脱发是快速和广泛的(George Cotsarelis and SarahE.Millar，2001，Towards a molecular understanding of hair loss and itstreatment，TRENDS in Molecular Medicine Vol.7 No.7)。很可能导致头发丧失的化疗药物为：顺铂、阿糖胞苷、环磷酰胺、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、异环磷酰胺和长春新碱。辐射诱导的一般脱发在实际上100％的接受全脑辐射(WBR)的患者中观察到，尤其是3000rad或更高的。 

脱发是癌症患者中最怕的化疗副作用之一，尽管化疗后的头发丧失实际上会再生长。从患者的角度，作为化疗的令人痛苦的副作用，头发丧失 (脱发)仅次于恶心。约75％的患者描述化疗诱导的头发丧失等于或比癌症导致的痛苦更有破坏性。 

因此，尽管头发病不致命，它们对社会交往和患者的心理健康的深远影响是不可否认的。对头发丧失的治疗需要产生了数十亿美元的工业。尽管如此，目前多数上市产品无效，证据为FDA仅批准了两种对头发丧失的治疗。已知的治疗或疗法对癌症治疗诱导的脱发无效。 

急性肾衰竭(ARF)

ARF是一种临床综合症，特征为在几天内发生的肾功能的快速衰退。ARF的主要特征是肾小球滤过率(GFR)的急速下降，导致含氮废物(尿素、肌酸酐)的滞留。在整个世界人口中，每年发生每百万人中170-200例的严重ARF。目前，对已建立的ARF还没有特异性治疗。已经发现多种药物来改善毒性和缺血性实验性ARF，由不同动物模型中表现为较低血清肌酸酐水平、减少组织学损伤和肾功能的快速恢复。这些包括抗氧化剂、钙通道阻滞剂、利尿剂、血管活性物质、生长因子、抗炎剂等。然而，已经在临床试验中研究的这些药物显示无优势，并且尚未批准在临床ARF中使用。 

在大多数住院患者中，ARF由急性肾小管坏死(ATN)引起，这由缺血性和/或肾毒性创伤造成。肾灌注不足是由低血容量、心源性和感染性休克，由给药血管收缩药物或肾血管损伤造成的。肾毒素包括外源毒素例如造影剂和氨基糖苷以及内源毒素例如肌红蛋白。然而近来的研究认为肾组织中的细胞凋亡在大多数人类ARF病例中是突出的。凋亡性细胞死亡的主要位点是远端肾单位。在缺血性损伤的开始阶段，肌动蛋白细胞骨架整体性的丧失导致上皮变扁平，失去刷状缘，失去局部细胞接触，以及随后细胞脱离下层基质。已经认为凋亡小管细胞死亡比坏死细胞死亡有更多预测的功能变化(Komarov等.Science.1999Sep 10；285(5434)：1733-7)；还见于(Supavekin等.Kidney Int.2003 May；63(5)：1714-24)。 

总之，目前没有令人满意的治疗方式来预防和/或治疗毒性脱发和急性肾衰竭，也没有令人满意的治疗方式来治疗伴有p53多肽水平升高的许多其它疾病和疾患，因此需要开发为此目的的新型化合物。 

发明的概述 

本发明提供了抑制p53基因的新型双链寡核糖核苷酸。本发明还提供了一种药物组合物，其包括一种或多种此寡核糖核苷酸，以及能够表达寡核糖核苷酸的媒介物。本发明还提供了一种方法以治疗患有一种疾病的患者，其中p53活性的暂时(可逆)抑制是有利的，所述方法包括向患者给药一般作为药物组合物的一种或多种寡核糖核苷酸，以治疗有效的剂量从而治疗患者。本发明还包括治疗其它伴有p53多肽水平升高的疾病。因为长期的p53失活会显著增加癌症风险，优选的是使用本发明分子暂时抑制p53。 

在一个优选实施方案中，当使用p53siRNA暂时抑制p53是有利的，并伴有常规化疗(如此处所述)或放疗时，这里所公开的新型siRNA分子可用于治疗肿瘤。例如，此处公开的新型siRNA分子保护含有p53的正常细胞不受化疗或放疗诱导的细胞凋亡。当p53抑制强化了这些细胞的凋亡性细胞死亡时，此处公开的新型siRNA分子还可用于抑制p53在特定癌细胞中的表达。特别地，放疗和化疗会引起严重的副作用，如对淋巴系统和造血系统以及肠上皮的严重伤害，这限制了这些治疗的有效性，并会导致引起心理痛苦的脱发。这些副作用是由p53介导的细胞凋亡引起的。因此，为了消除或减轻癌症治疗带来的副作用，使用本发明siRNA分子在正常细胞诱导p53活性的暂时抑制是有利的，从而保护正常组织。 

在另一优选实施方案中，此处所公开的新型siRNA分子可用于治疗急性肾衰竭(ARF)，该疾病的特征为肾功能的急速衰退，并伴有肾组织中的凋亡性细胞死亡。 

此处所公开的新型siRNA分子还可用于治疗其它疾患，其中p53被激活，原因为与损伤相关的各种刺激，损伤例如烧伤、体温过高、与受阻的血供应如心肌梗塞、中风、和缺血中相关的缺氧。使用本发明siRNA分子暂时抑制p53可治疗性地有效减少或消除中枢神经系统中p53依赖性神经元死亡，即脑和脊髓损伤，在移植前保存组织和器官，准备骨髓移植的宿主，并减轻或消除癫痫发作期间的神经元损伤。 

p53还在细胞衰老中起作用。尤其是，衰老相关的正常组织形态学和生理学变化可涉及p53活性。已知随着时间聚集在组织中的衰老细胞能维 持较高水平的p53依赖性转录。衰老组织中聚集的衰老细胞的p53依赖性分泌生长抑制物。因此，此处公开的siRNA分子还可用于抑制组织衰老。 

附图说明

图1.此图表示人类p53基因-SEQ ID NO：1的核苷酸序列。 

图2.此图表示人类p53多肽-SEQ ID NO：2的氨基酸序列。 

图3.此图表示证明各种人类p53 siRNA对p53表达作用的WesternBlot结果。 

图4.此图表示证明各种小鼠p53 siRNA对p53表达作用的WesternBlot结果。 

图5.此图表示作为动物急性肾衰竭指征的血清肌酸酐水平，所述动物遭遇两侧肾动脉钳紧并如所指的以p53 siRNA化合物或对照处理。 

图6.此图表示动物肾组织中肾小管坏死的程度，所述动物遭遇两侧肾动脉钳紧并以p53 siRNA化合物处理。 

图7.此图说明在经受缺血-再灌注肾伤害的动物肾的皮质腔中，p53siRNA处理下调凋亡前基因Puma的表达。 

发明的详细描述 

本发明一般涉及下调p53基因表达的化合物，尤其涉及新型小干涉RNA(siRNA)，以及这些新型siRNA用于治疗各种疾病和医学疾患的用途，尤其是脱发或急性肾衰竭或伴有p53多肽水平升高的疾病。本发明的发明人已经发现为了治疗任何所述疾病或疾患，诱导p53的暂时抑制是有利的。抑制p53的方法、分子和组合物将在这里详细地讨论，而且，任何所述分子和/或组合物可有利地用于治疗经受任何所述疾患的患者。 

本发明提供了体内抑制靶p53基因表达的方法和组合物。通常，该方法包括给药寡核糖核苷酸，诸如小干涉RNA(即siRNA)，其在生物条件下(细胞内)靶向于特定p53 mRNA并与之杂交或相互作用，或给药能在细胞内产生siRNA的核酸物质，以足以通过RNA干涉机制下调靶基因表达的量。尤其是，所述方法可用于抑制p53基因的表达以治疗疾病。 

根据本发明，p53基因的siRNA分子或抑制物可用作药物以治疗各种病理，尤其是脱发或急性肾衰竭或其它伴有p53多肽水平升高的疾病。因为长期p53失活会显著增加癌症风险，优选的是使用本发明分子抑制p53是暂时的/可逆的。 

本发明提供了双链寡核糖核苷酸(siRNA)，其下调p53基因的表达。本发明的siRNA是二联体寡核糖核苷酸，其中有义链衍生自p53基因的mRNA序列，反义链互补于有义链。一般，可耐受靶mRNA序列的一些偏差而不损害siRNA活性(见于如Czauderna等2003 Nucleic AcidsResearch 31.(11)，2705-2716)。本发明的siRNA在转录后水平抑制基因表达，同时破坏或不破坏mRNA。不由理论束缚，siRNA可为了特定裂解和降解而靶向于mRNA和/或可抑制靶信息的翻译。 

p53多肽有至少四种变体(见Bourdon等.Genes Dev..2005；19：2122-2137)。图1中所给的序列是gi-8400737的核苷酸序列。对应的多肽序列具有393个氨基酸；见图2。所有变体和任何其它类似的小变体都包括在p53多肽的定义和编码它们的p53基因的定义中。 

如此处所用，术语“p53基因”定义为p53基因的任何同源物，与SEQID NO：1的氨基酸编码区或在高度严格杂交条件下结合于p53基因的核酸序列具有优选90％同源性，更优选95％同源性，甚至更优选98％同源性，这些是本领域中已知的(例如参见Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1988)，updated in 1995 and 1998)。 

如此处所用，术语“p53”或“p53多肽”定义为p53多肽的任何同源物，与SEQ ID NO：2具有优选90％同源性，更优选95％同源性，甚至更优选98％同源性，作为其全长或片段或域，作为突变体或由剪接的变体核酸序列编码的多肽，作为与其他多肽的嵌合体，只要任何上述具有与p53多肽相同或大致相同的生物功能。 

一般地，用于本发明的siRNA包括含有双链结构的核糖核酸，而该双链结构包括第一链和第二链，第一链包括相邻核苷酸的第一伸展，并且所述第一伸展至少部分互补于靶核酸，和第二链包括相邻核苷酸的第二伸展，所述第二伸展与靶核酸至少部分相同，所述第一链和/或第二链包括多个修饰的核苷酸组，所述核苷酸在2’-位点有修饰，从而在所述链内每 组修饰的核苷酸在一侧或两侧被核苷酸侧翼组所侧翼，形成所述侧翼组核苷酸的侧翼核苷酸是未修饰的核苷酸或具有不同于修饰核苷酸的修饰的修饰核苷酸。而且，所述第一链和/或第二链可包括多个修饰核苷酸并可包括所述多个修饰核苷酸组。 

修饰核苷酸组和/或侧翼核苷酸组可包括许多核苷酸，其数量选自1个核苷酸至10个核苷酸。关于此处特指的任何范围，应理解为每个范围公开了在用于界定范围的相应数字之间的任意单独整数，包括所述两个界定范围的数字。因此，在这样的情况下所述的组包括一个核苷酸、二个核苷酸、三个核苷酸、四个核苷酸、五个核苷酸、六个核苷酸、七个核苷酸、八个核苷酸、九个核苷酸和十个核苷酸。 

所述第一链的修饰核苷酸的方式可由相对于第二链的修饰核苷酸的方式的一个或多个核苷酸来替换。 

上述的修饰可选自：氨基、氟、甲氧烷氧基、烷基、氨基、氟、氯、溴、CN、CF、咪唑、羧酸酯(caboxylate)、硫代酯(thioate)、C₁至C₁₀低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基、OCF₃、OCN、O-、S-、或N-烷基；O-、S-、或N-链烯基；SOCH₃；SO₂CH₃；ONO₂；NO₂、N₃；杂环烷基(heterozycloalkyl)；杂环烷芳基(heterozycloalkaryl)；氨基烷氨基；多烷基氨基或取代的甲硅烷基及其它，如描述于欧洲专利EP O 586 520 B1或EP O618 925 B1。 

siRNA的双链结构在一侧或两侧可是平头的。具体地，双链结构在由第一链的5’-末端和第二链的3’末端界定的双链结构侧可是平头的，或双链结构在由第一链的3’-末端和第二链的5’末端界定的双链结构侧可是平头的。 

此外，双链的至少一个可具有在5’-末端至少一个核苷酸的悬突；所述悬突可由至少一个脱氧核糖核酸组成。至少一个链还可任选地在3’-末端具有至少一个核苷酸的悬突。 

siRNA双链结构的长度通常从约17到21个，并更优选地18个或19个碱基。而且所述第一链的长度和/或所述第二链的长度可独立地选自从约15个到约23个碱基、17至21个碱基和18个或19个碱基的范围。 

此外，所述第一链和靶核酸之间的互补可以是完全的，或者第一链和靶核酸之间形成的二联体可包括至少15个核苷酸，其中在形成所述双链结构的所述第一链和靶核酸之间有1个或2个错配。 

在某些情况下，第一链和第二链都各自包括至少一组的修饰核苷酸和至少一侧翼组的核苷酸，每组修饰核苷酸包括至少一个核苷酸，而每个侧翼组核苷酸包括至少一个核苷酸，第一链的每组修饰核苷酸与第二链的侧翼核苷酸组对齐，第一链的最末端5’核苷酸是修饰核苷酸组的核苷酸，第二链的最末段3’核苷酸是侧翼组核苷酸的核苷酸。每组修饰核苷酸可由单个核苷酸组成和/或每侧翼组核苷酸可由单个核苷酸组成。 

此外，可能在第一链上，形成核苷酸侧翼组的核苷酸是未修饰的核苷酸，其被布置在相对于形成修饰核苷酸组的核苷酸的3’方向，在第二链上，形成修饰核苷酸组的核苷酸是修饰的核苷酸，其被布置在相对于形成核苷酸侧翼组的核苷酸的5’方向。 

siRNA的第一链还可包括8至12个，优选9至11个修饰核苷酸组，第二链可包括7至11个，优选8至10个修饰核苷酸组。 

第一链和第二链可由环结构连接，该环可包括非核酸的聚合物，诸如聚乙二醇及其它。可替换地，环结构可包括核酸。 

此外，siRNA第一链的5’-末端可连接到第二链的3’-末端，或第一链的3’-末端可连接到第二链的5’-末端，所述连接可通过核酸连接物，其通常具有10-2000核酸碱基。 

尤其是，本发明提供一种具有结构A的化合物： 

5′(N)_x-Z 3′(反义链) 

3′Z′-(N′)_y 5′(有义链) 

其中每个N和N’是核糖核酸，其糖残基中可为修饰或未修饰的，而且(N)_x和(N′)_y是寡聚物，其中每个连续的N或N’由共价键连接至下一N或N’； 

其中每个x和y是19和40之间的整数； 

其中每个Z和Z’可存在或不存在，但如果存在时为dTdT，并且共价地连接于其所存在的链的3’末端； 

而且，其中(N)_x的序列包括对p53mRNA的反义序列，尤其是存在于表A、B和C中的任何反义链。 

本领域技术人员易于理解的是，本发明化合物由多个核苷酸组成，其 通过共价键连接。每个这样的共价键可以是磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、或两者的组合，沿着各链的核苷酸序列的长度。其它可能的骨架修饰描述于美国专利No.5,587,361；6,242,589；6,277,967；6,326,358；5,399,676；5,489,677；和5,596,086。 

在特定实施方案中，x和y优选为约19至约27的整数，最优选地从约19至约23。在本发明化合物的特定实施方案中，x可等于y(即x＝y)，并且在优选实施方案中，x＝y＝19或x＝y＝21。在特别优选的实施方案中x＝y＝19。 

在本发明化合物一个实施方案中，Z和Z′都不存在；在另一实施方案中，Z或Z′之一存在。 

在本发明化合物一个实施方案中，化合物所有核糖核苷酸在其糖残基上都未修饰。 

在本发明化合物一个优选实施方案中，至少一个核糖核苷酸在其糖残基上修饰，优选地在2’位点修饰。在2’位点的修饰导致存在一个基团，其优选地选自氨基、氟、甲氧基、烷氧基和烷基。在存在时最优选实施方案中，在2’位的基团是甲氧基(2′-O-甲基)。 

在本发明优选的实施方案中，化合物反义链和有义链内的交替核糖核苷酸被修饰。尤其是用于实施例的siRNA已被如此修饰，在反义链的第一、第三、第五、第七、第九、第十一、第十三、第十五、第十七和第十九核苷酸上存在2′O-Me基团，而同样的修饰即2′O-Me基团存在于有义链的第二、第四、第六、第八、第十、第十二、第十四、第十六和第十八核苷酸。此外，应注意的是，在根据本发明这些特定核酸的情况下，第一伸展与第一链相同，第二伸展与第二链相同，并且这些核酸也是平头的。 

在特别优选的实施方案中，siRNA的序列是表A中的I5。 

根据本发明一个优选实施方案，siRNA的反义链和有义链仅在3’-末端而不是5’-末端磷酸化。根据本发明另一优选实施方案，反义链和有义链在3’-末端和5’-末端都未磷酸化。根据本发明另一优选实施方案，有义链5’位置的第一个核苷酸被特殊地修饰以取消体内任何5’-磷酸化的可能。 

在本发明化合物的另一个实施方案中，反义链5’和3’末端的核苷酸在其糖残基上修饰，有义链5’和3’末端的核苷酸在其糖残基上未修饰。 

本发明还提供了一种媒介物，其能够以未修饰形式在细胞中表达任何上述的寡核糖核苷酸，之后可进行合适的修饰。 

本发明还提供了一种组合物，其包括在载体中的本发明一种或多种化合物，该载体优选为药物可接受的载体。此组合物可包括两种或多种不同siRNA的混合物。 

本发明还提供了一种组合物，其包括本发明上述化合物，其共价或非共价地连接于本发明一种或多种化合物，以足以有效抑制人类p53的量，以及载体。该组合物可在胞内由内源胞内复合体处理以产生本发明的一种或多种寡核糖核苷酸。 

本发明还提供了一种组合物，其包括载体和足以有效下调细胞中人类p53表达的量的本发明一种或多种化合物，所述化合物包括大致互补于(N)_x序列的序列。 

此外本发明提供了一种与对照相比至少50％下调基因p53表达的方法，包括将基因p53mRNA转录子接触本发明一种或多种化合物。 

在一个实施方案中，所述寡核糖核苷酸是下调p53，而p53的下调选自p53功能的下调、p53多肽的下调和p53mRNA表达的下调。 

在一个实施方案中，所述化合物是下调p53多肽，而p53的下调选自p53功能的下调(可由酶检测或与已知天然基因/多肽的相互作用子的结合检测而检查，及其它)、p53蛋白的下调(可由Western blotting、ELISA或免疫沉淀而检查，及其它)和p53mRNA表达的下调(可由Northernblotting、定量RT-PCR、原位杂交或微阵列杂交而检查，及其它)。 

本发明还提供了一种治疗患有伴有p53多肽水平升高疾病的患者的方法，该方法包括给药患者治疗有效剂量的本发明组合物籍此治疗患者。优选地，本发明提供了一种治疗患有一种疾病的患者的方法，其中p53的暂时抑制是有利的。在一个优选的实施方案中，本发明的组合物与常规化疗或放疗一起用于治疗肿瘤，以防止化疗或放疗相关的脱发。在另一优选实施方案中，本发明组合物用于治疗急性肾衰竭。在另一优选实施方案中，本发明组合物用于一些疾患，其中p53被激活，原因为与损伤相关的各种刺激，损伤例如烧伤、体温过高、与受阻的血供应如心肌梗塞、中风、和缺血中相关的缺氧。使用本发明siRNA分子暂时抑制p53可治疗性地有效减少或消除中枢神经系统中p53依赖性神经元死亡，即脑和脊髓损伤， 在移植前保存组织和器官，准备用于骨髓移植的宿主，减轻或消除癫痫发作期间的神经元损伤和抑制组织衰老。 

本发明还提供了治疗有效剂量的一种或多种本发明化合物用于制备组合物的用途，所述组合物用于治疗伴有p53多肽水平升高的疾病，诸如在患有脱发或急性肾衰竭的患者中。 

更具体地，本发明提供了一种寡核糖核苷酸，其中一条链包括连续的核苷酸，其具有从5’到3’的SEQ ID NO：3-25(表A，有义链)或SEQ ID NO：49-119(表B，有义链)或SEQ ID NO：191-253(表C，有义链)或其同源物所列序列，其中每个末端区域中多至2个核苷酸中有一个碱基被改变。 

寡核糖核苷酸的末端区域是指19-mer序列中碱基1-4和/或16-19和21-mer序列中碱基1-4和/或18-21。 

此外，本发明提供了寡核糖核苷酸，其中一条链包括连续的核苷酸，其具有从5’到3’的SEQ ID NO：26-48(表A，反义链)或SEQ ID NO：120-190(表B，反义链)或SEQ ID NO：254-316(表C，反义链)或其同源物所列序列，其中每个末端区域中多至2个核苷酸中有一个碱基被改变。 

本发明优选的寡核糖核苷酸是表D中人类p53寡核糖核苷酸系列号3、5、20和23以及表E中小鼠p53寡核糖核苷酸系列号1 11、12、14、17和18。这些等同于表A中系列号3、5、20和23(人类)以及11、12、14、17和18(小鼠)。本发明最优选的寡核糖核苷酸是人类p53寡核糖核苷酸，其具有表A中系列号23的序列。 

本发明目前最优选的化合物是平头的19-mer寡核糖核苷酸，即x＝y＝19且Z和Z′都不存在。寡核糖核苷酸分子在有义链和反义链的3’末端都磷酸化，或都未磷酸化；或有义链5’位置的第一个核苷酸被特殊地修饰以取消体内任何5’-磷酸化的可能。可替换的核糖核酸在反义链和有义链的2’位置都修饰，其中2’位置的基团是甲氧基(2′-O-甲基)，且其中反义链5’和3’末端的核糖核酸在其糖残基被修饰，有义链5’和3’末端的核糖核酸在其糖残基未被修饰。目前最优选的这种化合物是如此修饰的寡核糖核苷酸，其包括表A系列号23的序列。 

在本发明的一个方面，寡核糖核苷酸包括双链结构，从而这样的双链结构包括 

第一链和第二链，而 

第一链包括连续核苷酸的第一伸展，和第二链包括连续核苷酸的第二伸展，而 

第一伸展与编码p53的核酸序列互补或相同，和第二伸展与编码p53的核酸序列相同或互补。 

在一个实施方案中，第一伸展和/或第二伸展包括从约14至40个核苷酸，优选地约18至30个核苷酸，更优选地从约19至27个核苷酸，最优选地从约19至23个核苷酸，尤其是从约19至21个核苷酸。在这样的实施方案中，寡核糖核苷酸长度可从17-40核苷酸。 

此外，根据本发明的核酸进一步包括表中所列多核苷酸中任一个的至少14个连续核苷酸，并优选地在双链结构任一末端的14个连续核苷酸碱基对，所述双链结构由如上所述的第一伸展和第二伸展组成。 

在一个实施方案中第一伸展包括寡核糖核苷酸的至少14个连续核苷酸的序列，而这样的寡核糖核苷酸选自SEQ.ID.No 3-316，优选地选自具有表A系列号3、5、20或23(人类)或系列号11、12、14、17和18(小鼠)任一序列的寡核糖核苷酸，更优选地选自具有表A系列号3、5、20或23任一序列的寡核糖核苷酸。 

此外，根据本发明其它的核酸包括任一SEQ.ID.No 3至316的至少14个连续核苷酸，更优选地在双链结构任一末端包括14个连续核苷酸碱基对，所述双链结构由如上所述的第一伸展和第二伸展组成。本领域技术人员应理解的是，尽管给出了根据本发明核酸的可能长度，尤其是形成根据本发明核酸的单个伸展的，相对于p53编码序列向各侧的一些移位是可能的，这样的移位可在两个方向为1、2、3、4、5和6个核苷酸，这样产生的双链核酸分子仍在本发明范围内。 

传输：已经开发了专门针对于增强并改善siRNA向哺乳动物细胞的传输的传输系统，见于例如Shen等(FEBS letters 539：111-114(2003))，Xia等.，Nature Biotechnology 20：1006-1010(2002)，Reich等.，MolecularVision 9：210-216(2003)，Sorensen等.(J. Mol.Biol.327：761-766(2003)，Lewis等.，Nature Genetics 32：107-108(2002)和Simeoni等，Nucleic AcidsResearch 31，11：2717-2724(2003)。近来siRNA已经成功用于灵长类中的抑制；详情请见Tolentino等.，Retina 24(1)February 2004 I 132-138。siRNA的呼吸制剂描述于Davis等人的美国专利申请No.2004/0063654。胆固醇- 轭合的siRNA(及其它类固醇和脂质轭合的siRNA)可用于传输，见Soutschek等Nature432：173-177(2004)Therapeutic silencing of anendogenous gene by systemic administration of modified siRNAs；和Lorenz等.Bioorg.Med.Chemistry.Lett.14：4975-4977(2004)Steroid and lipidconjugates of siRNAs to enhance cellular uptake and gene silencing in livercells。 

本发明的siRNA或药物组合物根据良好医疗实践给药和确定剂量，并考虑个别患者的临床情况，所治疗疾病，给药位置和方法，给药方案，患者年龄，性别，体重和对医疗执业者已知的其它因素。 

“治疗有效剂量”是根据如本领域已知的这些考虑而确定。该剂量必须有效达到改善，包括但不限于改善的存活率或更快的恢复，或改善或消除症状和由本领域技术人员选作合适测量的其它指征。本发明化合物可由任何常规给药途径给药。应注意的是，该化合物可作为化合物或作为药学上可接收的盐给药，而且可单独给药或作为有效成分结合药物可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和媒介物给药。化合物可口服、皮下或非胃肠包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内以及鼻内，和鞘膜内和灌注技术给药。化合物的植入也是有用的。可制备液态形式用于注射，该术语包括皮下、经皮、静脉内、肌内、鞘膜内和其它非胃肠给药途径。液态组合物包括含水溶液，带有或不带有有机共溶剂、水性或油性悬浮液，带有食用油的乳剂，以及类似的药物赋形物。此外，在一些情况下，用于本发明新型治疗的组合物可配制为用于鼻内和类似给药的气溶胶。所治疗的患者是温血动物，尤其是哺乳动物包括人类。药物可接受的载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和赋形物以及植入载体通常是指惰性、非毒性、不与本发明活性成分反应的固态或液态填充物、稀释物或包被物质，包括脂质体和微球。用于本发明的传输系统的例子包括美国专利No.5,225,182；5,169,383；5,167,616；4,959,217；4,925,678；4,487,603；4,486,194；4,447,233；4,447,224；4,439,196；和4,475,196。许多其它这样的植入物、传输系统和组件对本领域技术人员而言是熟知的。在本发明的一个特定实施方案中，尤其优选局部和经皮制剂。 

一般地，用于人类的化合物活性剂量在每天1ng/kg至约20-100mg/kg体重的范围，优选每天约0.01mg至约2-10mg/kg体重，以每天一个剂量 或每天给药2次或3次或更多次，持续1-4周或更长的给药方案。 

应注意的是，根据本发明siRNA化合物在肾近曲小管中向靶细胞的传输尤其有效地治疗急性肾衰竭。不受限于理论，这可能是因为正常siRNA分子是经过肾近曲小管的细胞从身体分泌。因此，裸siRNA分子是天然集中在急性肾衰竭治疗所靶向的细胞中。 

这里所用的术语“治疗”是指给药治疗物质，以有效地改善疾病相关的症状，以减轻疾病的严重度或治愈疾病，或以防止疾病发生。 

在特定实施方案中，给药包括静脉内给药。在另一特定实施方案中，给药包括局部或部位给药。 

本发明另一方面是一种治疗患有脱发或急性肾衰竭或伴有p53多肽水平升高的疾患的方法，包括向患者给药有效量的本发明药物组合物以治疗患者。 

在治疗脱发的优选实施方案中，给药包括局部或部位给药。在另一优选实施方案中，给药包括经皮给药。在特定实施方案中，药物组合物施用于患者头皮。在治疗ARF的优选实施方案中，给药包括静脉内、动脉内或腹膜内给药。 

本发明的另一方面是对经受可导致脱发治疗的患者预防脱发的方法，包括向患者给药治疗有效量的本发明药物组合物以治疗患者。 

本发明另一方面提供了一种药物组合物，其包括任何上述寡核糖核苷酸(SEQ ID NO：3-316)或媒介物和药学上可接受载体。本发明另一方面是治疗有效量的任何上述寡核糖核苷酸(SEQ ID NO：3-316)或媒介物用于制备促进患者恢复的药剂的用途，该患者患有脱发或急性肾衰竭或伴有p53水平升高的疾患。 

在优选实施方案中，该药剂包括局部药剂。在特定实施方案中，该药剂施用于患者头皮。在另一优选实施方案中，该药剂包括经皮给药。 

在本发明上述所有方面，脱发可由化疗或放疗诱导，并称为“毒性脱发”。详细地说，毒性脱发可由辐射如γ辐射或化疗剂引起，化疗剂如依托泊苷、5-FU(5-氟尿嘧啶)、顺铂、多柔比星、长春花碱、长春新碱、长春碱、长春瑞滨、紫杉醇、环磷酰胺、异磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥、丝裂霉素、达卡巴嗪、碳铂、塞替派、柔红霉素、伊达比星、米托蒽醌、博来霉素、埃斯波霉素A1(esperamicin A1)、更生霉素、普卡霉素、 卡莫司汀、洛莫司汀、牛磺莫司汀、链佐星、美法仑、更生霉素、丙卡巴肼、地塞米松、泼尼松、2-氯脱氧腺苷、阿糖胞苷、多西紫杉醇、氟达拉滨、吉西他滨、赫赛汀、羟基脲、伊立替康、甲氨喋呤、奥沙利铂、rituxin、司莫司汀、表柔比星、依托泊苷、tomudex(雷替曲塞)和托泊替康，或这些化疗剂之一的化学类似物。非常可能导致脱发的化疗剂为：顺铂、阿糖胞苷、环磷酰胺、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、异磷酰胺和长春新碱。 

本发明的化合物优选地用于治疗急性肾衰竭，尤其是在术后患者由于缺血的急性肾衰竭，和由于如给药顺铂化疗的急性肾衰竭或败血病相关的急性肾衰竭。本发明化合物优选用途是对经受大的心脏手术或血管手术的高风险患者预防急性肾衰竭。有高风险发展急性肾衰竭的患者可使用各种打分方法识别，如Cleveland Clinic algorithm或美国Academic Hospitals(QMMI)和Veterans′Administration(CICSS)开发的方法。本发明化合物其它优选用途是预防肾移植患者的缺血性急性肾衰竭，或预防接受化疗的患者的毒性急性肾衰竭。其它用途是创伤愈合、急性肝衰竭、顺铂诱导的耳聋(可能局部地)、造血干细胞的体外扩增、在移植前通过把供体器官/组织浸泡于siRNA溶液(可能通过电穿孔)而保存以及在移植后促进移植组织存活。其它适应症可以是中风、帕金森病、阿尔茨海默病、多柔比星引起的心毒性、心肌梗塞/心衰竭并在移植后改善移植组织存活(由全身给药)。不束缚于理论，所有这些疾病都伴有p53多肽水平的升高。 

本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，包括： 

获得本发明的一种或多种双链化合物；和 

将所述化合物与药物上可接受载体混合。 

本发明还提供了一种制备药物组合物的方法，包括将本发明一种或多种化合物与药物上可接受载体混合。 

在优选实施方案中，用于制备药物组合物的化合物以药物有效剂量与载体混合。在特定实施方案，本发明化合物与类固醇或脂质或另一种合适的分子如胆固醇轭合。 

可引入核苷酸的修饰或类似物以改进核苷酸的治疗特性。改善的特性包括改善的核酶抗性和/或对渗透细胞膜能力的增加。 

因此，本发明还包括本发明寡核糖核苷酸的所有类似物、或修饰物， 只要其基本上不影响多核苷酸或寡核糖核苷酸的功能。在优选实施方案中，这种修饰涉及核苷酸的碱基部分，涉及核苷酸的糖基和/或涉及核苷酸的磷酸酯部分。 

在本发明实施方案中，核苷酸可选自天然存在的或合成修饰的碱基。天然存在的碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。修饰的寡核苷酸包括肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、6-甲基-、2-丙基-和其它烷基-腺嘌呤、5-卤代尿嘧啶、5-卤代胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶和6-氮杂胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤、8-巯基腺嘌呤、8-巯基烷基腺嘌呤、8-羟基腺嘌呤和其它8-取代的腺嘌呤、8-卤代鸟嘌呤、8-氨基鸟嘌呤、8-巯基鸟嘌呤、8-巯基烷基鸟嘌呤8-羟基鸟嘌呤和其它取代的鸟嘌呤、其它氮杂和去氮杂(deaza)腺嘌呤、其它氮杂和去氮杂鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-三氟胞嘧啶。 

此外，可制备核苷酸的类似物，其中核苷酸的结构被根本地改变，更适于作为治疗剂或实验试剂。核苷酸类似物的一个例子是肽核酸(PNA)，其中DNA(或RNA)中的脱氧核糖(或核糖)磷酸酯骨架以类似于肽中的多酰胺骨架代替。PNA类似物已经显示为抗酶的降解并在体内和体外寿命延长。而且，PNA已经显示为比DNA分子更强地结合互补DNA序列。这个结果归因于PNA链与DNA链之间缺少电荷排斥。可对寡核苷酸进行其它修饰，包括聚合物骨架、环骨架或非环的骨架。 

在一个实施方案中，所述修饰是对磷酸酯部分的修饰，修饰的磷酸酯部分选自硫代磷酸酯。 

本发明化合物可由本领域熟知的任何用于合成核糖核酸(或脱氧核糖核酸)寡核苷酸的方法合成。这样的合成如描述于Beaucage S.L.and IyerR.P.，Tetrahedron 1992；48：2223-2311，Beaucage S.L.and Iyer R.P.，Tetrahedron 1993；49：6123-6194和Caruthers M.H.et.al.，Methods Enzymol.1987；154：287-313；硫代酯的合成描述于Eckstein F.，Annu.Rev.Biochem.1985；54：367-402，RNA分子的合成描述于Sproat B.，in Humana Press 2005edited by Herdewijn P.；Kap.2：17-31，相应的下游工艺描述于Pingoud A.et.al.，in IRL Press 1989edited by Oliver R.W.A.；Kap.7：183-208和Sproat B.，in Humana Press 2005edited by Herdewijn P.；Kap.2：17-31(同上)。 

其它合成步骤是本领域已知的，如描述于Usman等.，1987，J.Am. Chem.Soc，109，7845；Scaringe等.，1990，Nucleic Acids Res.，18，5433；Wincott等.，1995，Nucleic Acids Res.23，2677-2684；和Wincott等.，1997，Methods Mol.Bio.，74，59，和这些步骤可用于普通的核酸保护和偶联基团，诸如在5’-末端二甲氧基三苯甲基，在3’-末端亚磷酰胺。修饰的(如2′-O-甲基化)核苷酸和未修饰的核苷酸如期望的合并。 

本发明的寡核糖核苷酸可单独合成并在合成后结合在一起，例如由连接反应(ligation)(Moore等.，1992，Science 256，9923；Draper等.，国际PCT公布No.WO93/23569；Shabarova等.，1991，Nucleic Acids Research 19，4247；Bellon等.，1997，Nucleosides&Nucleotides，16，951；Bellon等.，1997，Bioconjugate Cham.8，204)，或在合成后杂交和/或脱保护。 

应注意的是，可使用市场销售的机器(如从Applied Biosystems及其它可得的)；寡核糖核苷酸可根据此处所公开的序列制备。化学合成片段的重叠对可使用本领域已知方法连接(如见美国专利No.6,121,426)。单独合成各链，然后在管中互相退火。然后，以HPLC从未退火的单链寡核苷酸(如因为其中一个过量)分离双链siRNA。关于本发明的siRNA或siRNA片段，可合成两种或多种这样的序列并结合以用于本发明。 

本发明的化合物还可由串联合成方法合成，如描述于美国专利申请公开No.US2004/0019001(McSwiggen)，其中两条siRNA链作为单个连续的寡核苷酸片段或链合成，其由可裂解的连接物分开，连接物随后裂解以提供单独的siRNA片段或链，它们杂交并允许siRNA二联体的纯化。连接物可为多核苷酸连接物或非核苷酸连接物。 

本发明还提供了一种药物组合物，其包括两种或多种用于治疗任何此处所述疾病或疾患的siRNA分子，所述两种分子可以产生等效或有利活性的量物理性混合在药物组合物中，或可共价或非共价结合，或由核酸连接物连接，连接物长度从2-100，优选2-50或2-30核苷酸。在一个实施方案中，siRNA包括此处所述的双链核酸结构，其中两个siRNA序列选自表A-C，优选选自表A，ID No：3、5、20和23(人类序列)和11、12、14、17和18(小鼠序列)。 

在另一实施方案中，siRNA分子包括双链核酸结构，其中第一siRNA序列选自表A-C，优选选自表A，ID No：3、5、20和23(人类p53序列)和11、12、14、17和18(小鼠p53序列)，和第二siRNA序列靶向于凋亡 前基因，从而提供有利活性。包括两或多个siRNA序列的串联双链结构在胞内加工以形成两或多种不同siRNA。这样的第二siRNA分子优选为靶向于凋亡前基因的siRNA分子。 

siRNA分子共价或非共价地结合或由连接物连接以形成串联siRNA分子。这样的串联siRNA分子包括两个siRNA序列，通常长约38-150核苷酸，更优选38或40-60核苷酸或如果超过两个siRNA序列包括在串联分子中则相应更长。长的串联分子包括两或多个编码siRNA的长序列，由胞内处理产生，如长dsRNA，也包括作为编码两或多个shRNA的串联分子。这样的串联分子也认为是本发明的一部分。 

靶向p53的siRNA分子可为药物组合物中的活性成分，或可为含有两种或多种siRNA(或编码或内源产生两或多种siRNA的分子，使它成为分子与一种或多种编码两种或多种siRNA的串联分子的混合物)的药物组合物的一种活性成分，所述药物组合物还包括一种或多种另外的、靶向一种或多种另外基因的siRNA分子。同时p53和所述另外基因的抑制将对治疗此处所述疾病具有加和或协同效应。 

在特定实施例，用于治疗此处所述疾病的药物组合物可包括以下化合物的联合：1)p53siRNA和Fas siRNA；2)p53siRNA和Bax siRNA；3)p53siRNA和Noxa siRNA；4)p53siRNA和Puma siRNA；5)p53siRNA和RTP801siRNA；6)p53siRNA和PIDD siRNA；7)p53siRNA，Fas siRNA和RTP801siRNA，Bax siRNA，Noxa siRNA或Puma siRNA或PIDD siRNA的任一个，以形成三聚体或聚合物(即，编码三个siRNA的串联分子)。其它可联合p53siRNA的优选凋亡前基因为TNFα、细胞凋亡蛋白酶2、细胞凋亡蛋白酶3、细胞凋亡蛋白酶9、E2F1和PARP-I。根据本发明，优选的联合是p53siRNA和RTP801siRNA(见PCT专利申请PCT/EP2005/008891)。 

此外，p53siRNA或任何包括或编码p53siRNA的核酸分子可连接(共价或非共价)于针对表达于靶细胞上的细胞表面可内化分子的抗体，以达到增强的靶向从而治疗此处所述疾病。例如，抗-Fas抗体(优选中和抗体)可与p53siRNA分子联合。 

本发明化合物可直接传输或经由病毒或非病毒媒介物传输。直接传输时，序列通常被赋予核酸酶抗性。可替换地，所述序列可并入表达框或构 建体，从而序列如下讨论地表达于细胞。一般构建体含有合适的调节序列或启动子以允许序列表达于靶细胞。任选用于传输本发明化合物的媒介物是市场可得的，可为了传输本发明化合物而由本领域已知方法修饰。 

还考虑一种长的包括一个或多个主干和环结构的寡核苷酸(通常长25-500核苷酸)，其中主干区包括本发明的寡核苷酸序列，可以载体传输，优选以药学上可接受载体，并在胞内由内源细胞复合体(如上所述的DROSHA和DICER)加工以产生一个或多个较小的双链寡核苷酸(siRNA)即本发明的寡核苷酸。该寡核苷酸可称为串联shRNA构建体。考虑这种长寡核苷酸是包括一个或多个主干和环结构的单链寡核苷酸，其中每个主干区包括p53基因的有义和相应反义siRNA序列。尤其是，考虑这种寡核苷酸包括如任一表A、B或C所列的有义和反义siRNA序列。如此处所用，术语“多肽’’是指除了多肽以外的寡肽、肽和全蛋白。 

p53失活化合物的筛选： 

本发明的一些化合物和组合物可用于筛选检测，以鉴定和分离调节p53活性的化合物，尤其是调节脱发或急性肾衰竭或伴有p53多肽水平升高的疾患的化合物。待筛选的化合物包括诸如小化学分子和反义寡核苷酸等物质。 

本发明化合物对p53多肽活性的抑制活性或本发明化合物对p53的结合可用于确定另外化合物与p53多肽的相互作用，如，是否另外化合物与本发明寡核苷酸竞争对p53的抑制，或者该另外化合物救助所述抑制。可由各种方式检测抑制或活化，如，及其它，检测p53多肽活性产物，或在放射性或荧光竞争检测中代替从p53多肽的结合化合物。 

以下参考实施例详细说明本发明，但不是教导仅限于此。 

此处对任何文件的引用不意味一种认可，即该文件是有关现有技术，或认为对本申请任何权利要求的专利性(相关)的材料。对任何文件的内容或日期的任何引证是基于申请人在提交时可得的信息，不构成对这种引证正确性的确认。 

实施例 

分子生物学一般方法 

本领域中已知的标准分子生物学技术，未特殊描述的，为以下Sambrook等.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York(1989)，和Ausubel等.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)和Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley&Sons，NewYork(1988)，和Watson等.，Recombinant DNA，Scientific American Books，New York和Birren等(eds)Genome Analysis：A Laboratory Manual Series，Vols.1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York(1998)中以及美国专利4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所述的方法，并引入这里作为参考。聚合酶链式反应(PCR)以PCR实验方案一般进行：AGuide To Methods And Applications，Academic Press，San Diego，CA(1990)。原位(细胞中)PCR结合流式细胞术可用于检测含有特定DNA和mRNA序列的细胞(Testoni等.，1996，Blood 87：3822)。进行RT-PCR的方法是本领域中已知的。 

实施例1：产生活性siRNA化合物的序列 

使用专用的算法和基因p53的已知序列(SEQ ID NO：1)，产生许多可能的siRNA的序列。表A展示了23种siRNA，它们目前已被选择、化学合成和测试活性(见实施例2)。所有siRNA是19-mer。 

表A 

注意上述表A中，siRNA 1-23的有义链分别具有SEQ ID NO：3-25，siRNA 1-23的反义链分别具有SEQ ID NO：26-48。siRNA化合物No 1(SEQID NO：3和26)从文献获知(Dira和cBernards，Reversal of senescence inmouse fibroblasts through lentiviral suppression of p53，J.Biol.Chem.(2003)278：11731)，siRNA No 2(SEQ ID NO：4和27)也从文献获知(Brummelkamp等.Science 2002，296：550-553)。然而，这些化合物用于此处所述治疗方法的用途以前未公开，因此是新颖的。 

下面的表B展示了71种另外的19-mer siRNA，它们已由专用算法产生。 

表B 

注意上述表B中，siRNA 1-71的有义链分别具有SEQ ID NO：49-119，siRNA 1-71的反义链分别具有SEQ ID NO：120-190。 

以下表C展示了63种另外的21-mer siRNA，它们已由专用算法产生。 

表C 

注意上述表C中，siRNA 1-63的有义链分别具有SEQ ID NO：191-253，siRNA 1-63的反义链分别具有SEQ ID NO：254-316。 

实施例2：测试siRNA化合物的抗-p53活性 

实验方案 

I.制备siRNA(双链寡核苷酸) 

冻干的寡核苷酸溶解于不含RNA酶的蒸馏水中以得到最终浓度为100uM。溶解的寡核苷酸在室温保持15min然后迅速冻于液氮。 

寡核苷酸储存于-80℃并在使用前以PBS稀释。 

II.siRNA在人类细胞中以Lipofectamine2000试剂转染： 

将2x10⁵p53-wt HCT116或SW480细胞每孔植入6孔板。24h后，以Lipofectamine2000试剂(获得自Invitrogen)将细胞用p53寡核苷酸转染。 

进行以下步骤： 

1.转染前，细胞培养基用1500ul无抗生素的新鲜培养基代替。 

2.在无菌塑料管中，将Lipofectamine2000试剂(根据每孔5ul计算量)加入250ul无血清培养基，并在室温培育5min。 

3.在另一个管中，人类抗-p53寡核苷酸(量可变以适合每孔的期望终浓度)加入到250ul无血清培养基。 

4.Lipofectamine2000复合体与p53寡核苷酸溶液混合并在室温培育20min。 

5.所得混合物逐滴加入细胞，并在37℃培养细胞。 

6.SW480细胞：转染48hr后收集细胞，使用RIPA缓冲液萃取蛋白。 

7.HCT116细胞： 

转染40h后，将5Fu(Sigma)加入细胞以产生25ug/ml的终浓度。转染48h后(5Fu处理8h后)，收集细胞，使用RIPA缓冲液萃取蛋白。 

8.使用单克隆抗体(Do-I clone，Santa Cruz)以Western Blot分析确定p53的表达。为了归一化，检查点的微管蛋白表达。 

III.小鼠p53基因和小鼠p53寡核苷酸以Lipofectamine2000试剂共转染入PC3细胞： 

将2x10⁵p53--null PC3细胞每孔植入6孔板。24h后，以Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)将小鼠p53基因和GFP基因以及p53 寡核苷酸转染细胞。进行以下步骤： 

1.转染前，细胞培养基用1500ul无抗生素的新鲜培养基代替。 

2.在无菌塑料管中，Lipofectamine2000试剂(每孔5ul)加入250ul无血清培养基，并在室温培育5min。 

3.在另一个管中，将4ug DNA(p53基因：GFP基因，10∶1)和人类p53寡核苷酸加入到250ul无血清培养基。 

4.Lipofectamine2000复合体与p53寡核苷酸溶液混合并在室温培育20min。 

5.所得混合物逐滴加入细胞，在37℃培养细胞。 

6.转染48hr后收集细胞，使用RIPA缓冲液萃取蛋白。 

7.使用单克隆抗体(Clone240，Chemicon)以Western Blot分析确定p53的表达。为了归一化，检查点的GFP表达。 

结果： 

A.人类p53寡核苷酸： 

表D： 

注意：表D中的数字对应于表A中所用的数字，其中siRNA 1-23的有义链分别具有SEQ ID NO：3-25，siRNA 1-23的反义链分别具有SEQ ID NO：26-48。 

如表D所示，在两个系统SW480和HCT116，根据上述实验方案II测试了四种人类寡核苷酸。作为测试结果基础的代表性的结果(Western Blot)示于图3。 

B.小鼠p53寡核苷酸 

表E： 

注意：表E中的数字(如同表D一样)对应于表A中所用的数字，其中siRNA 1-23的有义链分别具有SEQ ID NO：3-25，siRNA 1-23的反义链分别具有SEQ ID NO：26-48。作为测试结果基础的代表性的Western Blot结果示于图4。 

实施例3：脱发的模型系统 

可在以下系统完成测试活性siRNA： 

a.小鼠的脱发模型 

b.体外培养的人类毛囊 

c.人类毛囊嫁接于裸小鼠 

注意：测试活性siRNA的系统描述于Botcharev等，2000，p53 is essentialfor Chemotherapy-induced Hair Loss，Cancer Research，60，5002-5006。 

实施例4：急性肾衰竭(ARF)的模型系统 

可在败血病-诱导的ARF或缺血-再灌注诱导的ARF完成测试活性siRNA： 

1.败血病-诱导的ARF 

两种预测性败血病-诱导的ARF动物模型描述于Miyaji T，Hu X，YuenPS，Muramatsu Y，Iyer S，Hewitt SM，Star RA，2003，Ethyl pyruvate decreasessepsis-induced acute renal failure and multiple organ damage in aged mice，Kidney Int.Nov；64(5)：1620-31。这两种模型是小鼠优选衰老小鼠的脂多糖给药和盲肠结扎穿剌伤。 

2.缺血-再灌注诱导的ARF 

这个预测性模型描述于Kelly KJ，Plotkin Z，Vulgamott SL，Dagher PC，2003 January，.P53 mediates the apoptotic response to GTP depletion afterrenal ischemia-reperfusion：protective role of a p53 inhibitor，J Am SocNephrol.；14(1)：128-38。 

缺血-再灌注损伤在大鼠双侧肾动脉钳紧45分钟后诱导，并随后释放止血钳以再灌注24小时。在钳紧之前2小时和之后30分钟将250μg的p53siRNA(QM5序列，表A)注射到颈动脉。钳紧之后4小时和8小时将另外250μg的siRNA经颈动脉注射。抗GFP的siRNA作为阴性对照。用于此处描述实验中的siRNA在有义链和反义链的3’端具有磷酸化基团。在动物模型中发现3’-非磷酸化siRNA与相应的3’磷酸化siRNA具有相似的生物活性。通过在手术前和手术后24小时后测量血清肌酸酐水平而监控ARF发展。在手术末期，大鼠通过内在股管灌注热PBS和4％多聚甲醛。移除左肾并贮存在4％多聚甲醛用于随后的组织学分析。急性肾衰竭经常界定为血清肌酸酐水平从基线的迅速增加。血清肌酸酐至少0.5 mg/dL或44.2μmol/L的增加认为是急性肾衰竭的指征。手术后时间0点和ARF手术24小时测量血清肌酸酐。 

为了研究p53siRNA在大鼠肾中的分布，糖残基中具有交替O-甲基修饰的Cy3-标记的19-mer平头siRNA分子(2mg/kg)静脉内给药3-5分钟，然后使用两光子共聚焦显微镜体内成像。共聚焦显微镜分析表示，肾中siRNA的大部分集中在近端肾小管的胞内体部分。胞内体和细胞质siRNA荧光在传输2小时后相对稳定，在24小时消失。 

如图5所示，45-分钟肾双侧动脉钳紧处理(PBS处理)后血清肌酸酐水平有10倍增加。4次注射p53siRNA(QM5序列，表A)(钳紧之前2hrs和钳紧之后30min，4h和8h)显著降低血清中肌酸酐水平50％(P＜0.001)。这些结果表示，p53siRNA可保护肾组织不受缺血-再灌注损伤并减轻ARF的严重度。 

进一步通过分析肾组织中肾小管坏死而确定p53siRNA处理对肾缺血-再灌注损伤的作用。肾小管坏死可打分为：无损伤(损伤分数0)，单细胞、片块状分离的坏死(损伤分数1)，组织小于25％的肾小管坏死(损伤分数2)，组织25至50％的肾小管坏死(损伤分数3)，组织超过50％的肾小管坏死(损伤分数4)。图6表明动物中以损伤分数(Y-轴)表示的肾小管损伤不经受肾缺血-再灌注损伤(组1)，或在肾缺血-再灌注损伤动物中由PBS处理(组2)，两次注射p53siRNA(组3)，三次注射p53siRNA(组4)，或四次注射p53siRNA(组5)。如图6所示，与PBS对照组相比，四次注射p53siRNA引起肾小管损伤的显著降低。图7表明，四次注射p53siRNA处理在经缺血-再灌注损伤动物的肾皮质部分下调前凋亡基因Puma的表达。这表明p53siRNA处理能够抑制缺血-再灌注损伤后肾的凋亡进程。 

Claims (20)

1.一种具有下述结构的siRNA化合物：

反义链SEQ ID NO：48：5′ugaagggugaaauauucuc-Z 3′；

有义链SEQ ID NO：25：3′Z′-acuucccacuuuauaagag 5′；

其中每个a、c、u和g是核糖核苷酸，而且每个连续的核糖核苷酸由共价键连接至核糖核苷酸；以及

其中每个Z和Z’可存在或不存在，但如果存在时为dTdT，并且共价地连接于其所存在的链的3’末端；以及

其中在反义链和有义链中的交替核糖核苷酸的糖残基被修饰以致存在2’-O-Me基团，且被修饰的糖残基存在于反义链的5’和3’末端而未修饰的糖残基存在于有义链的5’和3’末端。

2.如权利要求1所述的化合物，其中所述共价键是磷酸二酯键。

3.如权利要求1或2所述的化合物，其中Z和Z′都不存在。

4.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述反义链和有义链在5’和3’末端是非磷酸化的。

5.如权利要求3所述的化合物，其中所述反义链和有义链在5’和3’末端是非磷酸化的。

6.如权利要求1或2所述的化合物，其中所述反义链和有义链在3’末端是磷酸化的。

7.如权利要求3所述的化合物，其中所述反义链和有义链在3’末端是磷酸化的。

8.一种药物组合物，其包括有效下调人类p53基因表达的量的权利要求1至7中任一项所述的化合物和载体。

9.权利要求1至7中任一项所述的化合物在制备用于治疗患有疾病的患者的药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其中所述疾病是脱发。

11.如权利要求9所述的应用，其中所述患者在较大手术后处于发展急性肾衰竭的高风险。

12.如权利要求9所述的应用，其制备为用于移植后移植组织存活的药物。

13.如权利要求9所述的应用，其中所述疾病是脑损伤和脊髓损伤。

14.如权利要求13所述的应用，其中所述脑损伤是癫痫发作。

15.如权利要求9所述的应用，其中所述疾病是顺铂诱导的耳聋。

16.如权利要求15所述的应用，其中所述药物制备为用于局部给药。

17.如权利要求9所述的应用，其中所述药物制备为用于局部给药。

18.权利要求1至7中任一项所述的化合物在制备用于预防经受大手术的患者急性肾衰竭的药物中的应用。

19.如权利要求11或18所述的应用，其中所述手术是心脏手术。

20.如权利要求9或18所述的应用，其中所述药物制备为用于全身给药。

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