ES2216707B1 - Secuencia oligoribonucleotidica homologa a una region del cdna que codifica para el receptor cd40 humano y oligoribonucleotidos duplex, vectores, composiciones farmaceuticas y usos correspondientes. - Google Patents

Secuencia oligoribonucleotidica homologa a una region del cdna que codifica para el receptor cd40 humano y oligoribonucleotidos duplex, vectores, composiciones farmaceuticas y usos correspondientes.

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Abstract

Secuencia oligoribonucleotídica homóloga a una región del cDNA que codifica para el receptor CD40 humano y oligoribonucleótidos dúplex, vectores, composiciones farmacéuticas y usos correspondientes. La invención hace referencia a las secuencias oligoribonucleotídicas 5''- gcgaauuccuagacaccug-3'' y 5''-caggugucuaggaauucgc-3'' que son homólogas a la región comprendida entre los nucleótidos 241 a 259 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592, así como secuencias y oligonucleótidos dúplex derivados de las mismas. También hace referencia a composiciones farmacéuticas que los comprendan, a vectores de transferencia génica capaz de inducir su expresión, y su uso para la preparación de medicamentos, por ejemplo para la inhibición de la expresión del receptor CD40 humano, para el bloqueo o reducción de la interacción entre CD40 y CD40L humano, etc.

Description

Secuencia oligoribonucleotídica homóloga a una región del cDNA que codifica para el receptor CD40 humano y oligoribonucleótidos duplex, vectores, composiciones farmacéuticas y usos correspondientes.
Campo de la invención
La invención se refiere a una secuencia oligoribonucleotídica homóloga a una región del cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592, así como a oligoribonucleótidos dúplex formados por la unión por homología de dichas secuencias oligoribonucleotídicas. La invención tiene también por objeto composiciones farmacéuticas que comprendan dichas secuencias oligoribonucleótidicas y/o dichos oligoribonucleótidos dúplex, vectores de transferencia capaces de inducirlos, y usos de los mismos.
Estado de la técnica Estrategias de inhibición de la expresión génica
A nivel molecular, las enfermedades son frecuentemente el resultado de la expresión inadecuada de una o varias proteínas, codificadas por los genes. Los tratamientos farmacológicos convencionales que se han aplicado hasta el momento han conseguido en muchos casos paliar la sintomatología de las enfermedades, pero la mayoría de dichos tratamientos comportan efectos secundarios, que se agravan cuando los tratamientos son continuados, debido a las acciones inespecíficas de los fármacos utilizados.
Con el desarrollo de la biología molecular y la ingeniería genética se introdujo recientemente el concepto de terapia génica, un tratamiento causal y específico de las enfermedades basado en acciones directas sobre los ácidos nucleicos. Así, en los casos en los que se conoce que una determinada enfermedad viral, inflamatoria, o tumoral es debida a una expresión/síntesis anómala de una determinada proteína, se han desarrollado una serie de metodologías terapéuticas denominadas "antisentido", destinadas a atenuar la producción de dicha proteína. Para ello se utilizan fragmentos pequeños de ácidos nucleicos (oligonucleótidos antisentido), algunos de ellos con actividad catalítica (ribozimas, DNAzimas, ...) que potencian la degradación del RNA mensajero (mRNA) y/o bloquean la biosíntesis de la proteína implicada en la enfermedad al unirse específicamente a determinadas secuencias del correspondiente mRNA diana. Sin embargo, en los ensayos preclínicos y clínicos realizados hasta el momento, la eficacia inhibidora y los efectos biológicos de dichas moléculas se han visto cuestionados por su deficiente relación en el balance eficacia/seguridad.
Muy recientemente se ha introducido una nueva y prometedora estrategia de regulación o bloqueo de la expresión génica a nivel de RNA, denominada "silencia miento génico post-transcripcional" (PTGS). También llamada "interferencia de RNA" (RNA interference; RNAi), dicho fenómeno se refiere a la supresión específica de la expresión génica mediada por pequeñas moléculas de RNA de doble cadena (siRNA). Resultados experimentales muy recientes han propuesto un mecanismo de actuación de RNAi diferente al utilizado por las moléculas antisentido. Las moléculas de siRNA (preferentemente de 21-25 nucleótidos de longitud), aparentemente actúan como secuencia guía que se une a un complejo proteico con actividad de nucleasa. Dicho complejo se posiciona en el mRNA diana, que contiene una secuencia específica totalmente complementaria a la cadena antisentido del siRNA, e inicia su degradación.
La principal ventaja que ofrece la utilización de siRNAs optimizados para RNAi, respecto a los métodos "antisentido" es su extremada eficiencia, que permite utilizar concentraciones muy bajas de siRNA (de 1 a 100 nM) capaces de producir un 80-100% de inhibición específica de la expresión de un determinado gen. Además, parece que los siRNAs son más resistentes que los oligonucleótidos antisentido a la degradación mediada por nucleasas. Por tanto, los siRNAs pueden resultar muy efectivos como agentes terapéuticos. Es conocido también que las secuencias oligoribonucleotídicas de cadena sencilla son asimismo capaces de producir una inhibición potente y específica de la expresión de su gen diana.
El receptor CD40 como diana para tratamientos de terapia génica
La proteína CD40, identificada en 1985, es un receptor localizado en la superficie celular que pertenece a la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-R). Dicha biomolécula se caracterizó inicialmente en los linfocitos B. Se demostró posteriormente que juega un papel clave en las respuestas inmunes humorales dependientes de las células T al analizar las consecuencias de su disfunción en pacientes con síndrome hiper-IgM, y en ratones knock-out (deficientes) para CD40. Además su ligando específico, la proteína CD40L (CD154), es un miembro de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF) y se expresa fundamentalmente en células T CD4+ activadas. Así, se observó que las interacciones CD40-CD40L activan diferentes rutas de transducción de señales las cuales inducen la producción de diferentes citoquinas y otros mediadores que, en definitiva, juegan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune.
Recientemente se ha constatado que CD40 se expresa también en monocitos, células dendríticas, células endoteliales, fibroblastos y células epiteliales. En las células no-hematopoyéticas, el receptor CD40 está implicado en la amplificación y regulación de las respuestas inflamatorias. Además, estudios experimentales utilizando ratones knock-out o anticuerpos anti-CD40 han demostrado que el bloqueo . de la interacción CD40-CD40L es beneficiosa en varios modelos patológicos, que incluyen el trasplante, las manifestaciones autoinmunes y las enfermedades infecciosas.
En los documentos citados al final de la presente descripción, que se incorporan en la misma por referencia, se puede obtener más información sobre los estudios y técnicas citados anteriormente.
Sumario de la invención
La invención tiene por objeto una secuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las secuencias oligoribonucleotídicas
5'-gcgaauuccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 1)
y
5'-caggugucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 2)
donde estas secuencias oligoribonucleotídicas son homólogas a la región comprendida entre los nucleótidos 241 a 259 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592.
La invención tiene también por objeto un oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología (también denominada apareamiento complementario) de las secuencias oligoribonucleotídicas según la reivindicación 1, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados:
\hskip0,5cm 5'-gcgaauuccuagacaccuguu-3' (SEQ ID NO 7)
3'-uucgcuuaaggaucuguggac-5'
\hskip0,5cm 5'-gcgaauuccuagacaccugtt-3' (SEQ ID NO 8)
3'-ttcgcuuaaggaucuguggac-5'
En la presente solicitud el término "secuencia oligoribonucleotidica" es un término que se refiere a la composición de un oligoribonucleótido. Los oligoribonucleótidos son elementos o entidades biológicas (segmentos cortos de RNA) necesariamente de cadena sencilla. Asimismo en la presente solicitud el término "oligoribonucleótido dúplex" se refiere a los oligoribonucleótidos de doble cadena, como por ejemplo siRNA, shRNA, etc.
Preferentemente la secuencia oligoribonucleotídica está extendida por cualquiera de sus extremos por como máximo cuatro ribonucleótidos adicionales en total, formando una secuencia oligoribonucleotídica extendida, donde dichos ribonucleótidos adicionales son homólogos a la correspondiente región comprendida entre los nucleótidos 237 a 263 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592. Efectivamente, la adición de dichos ribonucleótidos adicionales no modifica substancialmente la eficacia de la secuencia. La invención comprende también los oligoribonucleótidos dúplex formados por la unión por homología de estas secuencias oligoribonucleotídicas extendidas, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados. Estos nucleótidos terminales uu o tt son obtenidos en función del procedimiento de síntesis empleado: enzimático (uu) o químico (tt).
Asimismo es posible el empleo de secuencias oligoribonucleotídicas que estén formadas por una parte de las secuencias oligoribonucleotídicas anteriores, en las que se ha eliminado entre 1 y seis ribonucleótidos de uno de sus extremos, y se han añadido la misma cantidad de oligoribonucleótidos por el extremo opuesto. Adicionalmente es posible alargar la secuencia resultante con una cantidad de ribonucleótidos comprendida entre 1 y 6. Dicho de otra manera, la invención tiene asimismo por objeto una secuencia oligoribonucleotídica que comprende una subsecuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las subsecuencias oligoribonucleotídicas
5'-uccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 3)
5'-gcgaauuccuaga-3' (SEQ ID NO 4)
5'-ucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 5)
5'-caggugucuagga-3' (SEQ ID NO 6)
y que comprende, adicionalmente un máximo de 12 ribonucleótidos adicionales añadidos por cualquiera de sus extremos o por ambos extremos simultáneamente, formando una secuencia oligoribonucleotídica modificada, de tal manera que la secuencia oligoribonucleotídica modificada es homóloga a la región comprendida entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica par el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592. Es asimismo ventajoso la obtención de un oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas modificadas como las citadas anteriormente, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
Ventajosamente, cualquiera de las secuencias oligoribonucleotídica de acuerdo con la invención comprende, adicionalmente de uno a tres ribonucleótidos terminales por su extremo 3', formando una secuencia nucleotídica alargada, donde dichos ribonucleótidos terminales no son homólogos a la correspondiente región entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592. También es ventajoso la obtención del correspondiente oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas alargadas, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
Preferentemente la secuencia oligoribonucleotídica, la secuencia oligoribonucleotídica extendida, la secuencia oligoribonucleotídica modificada, o la secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta la unión de por lo menos un péptido, un azúcar, un lípido o un polímero. Son asimismo interesantes los oligoribonucleótidos dúplex formados a partir de las mismas.
Ventajosamente la secuencia oligoribonucleotídica, la secuencia oligoribonucleotídica extendida, la secuencia oligoribonucleotídica modificada, o la secuencia oligoribonucleotídica alargada, o el oligoribonucleótido dúplex correspondiente, presenta por lo menos una modificación química en alguno de los elementos que componen su estructura, ya sea en los ribonucleósidos o en los enlaces internucleotídicos.
Preferentemente esta modificación química es una modificación del grupo formado por la adición de un grupo fosfato en el extremo 5' de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de grupos 2'-hidroxil por grupos
2'-O-metil en las ribosas componentes de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de ribonucleósidos por análogos ribonucleosídicos como los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos, y la sustitución de los enlaces fosfato internucleotídicos por otros enlaces como fosforotioato o metilfosfonato. Estas modificaciones pueden ser realizadas fácilmente y no conlleva una alteración sustancial de las propiedades biológicas.
Otra forma preferente de realización de la invención se obtiene cuando en el oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención, las secuencias oligoribonucleotídicas, las secuencias oligoribonucleotídicas extendidas, las secuencias oligoribonucleotídicas modificadas, o las secuencias oligoribonucleotídicas alargadas, están unidas entre sí de manera covalente por uno de sus extremos a través de un lazo o linker de 2 a 25 nucleótidos para formar un shRNA.
La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica que comprende una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención.
La invención tiene asimismo por objeto un vector de transferencia génica capaz de inducir la expresión de una secuencia oligoribonucleótidica y/o de un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención.
Preferentemente se usa una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para la inhibición de la expresión del receptor CD40 humano, o para el bloqueo o reducción de la interacción entre CD40 y CD40L humano.
Asimismo es ventajoso usar una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por fenómenos de rechazo en transplantes de órganos o tejidos, procesos inflamatorios agudos, procesos inflamatorios crónicos, procesos con coestimulación de linfocitos, manifestaciones alérgicas, manifestaciones autoinmunes, manifestaciones o enfermedades cardiovasculares (como por ejemplo la arteriosclerosis), procesos infecciosos y manifestaciones reumatológicas.
Otro uso preferente de una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención es para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales, infecciones bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, tiroiditis y artritis.
También es ventajoso el uso de una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes neurodegenerativos.
Breve descripción de los dibujos
Otras ventajas y características de la invención se aprecian a partir de la siguiente descripción, en la que, sin ningún carácter limitativo, se relata un modo preferente de realización de la invención, haciendo mención de los dibujos que se acompañan. Las figuras muestran:
Fig. 1, representación gráfica de la distribución de 4 siRNAs dúplex diseñados para inhibir la expresión de CD40 humano a lo largo de la secuencia del correspondiente cDNA.
Fig. 2, relaciones CD40/ciclofilina obtenidas en la cuantificación relativa de tránscritos CD40.
Fig. 3, análisis mediante Western blot de la expresión de CD40 (a) y \beta- actina (b) en las células ECV-304 tratadas con los diferentes siRNAs dirigidos contra CD40 humano.
Resultados experimentales
Los resultados originales que se presentan a continuación incluyen el diseño, síntesis y caracterización de la eficacia inhibidora de siRNAs para el silenciamiento génico de CD40. Se demuestra la obtención de un siRNA (siRNA2) con actividad inhibidora potente y específica de la expresión/síntesis de CD40 en un modelo celular tumoral que expresa el receptor CD40.
Obtención de siRNAs contra el receptor CD40 humano
Se han diseñado y sintetizado siRNAs dúplex dirigidos contra CD40 humano, más un siRNA dúplex control, cuya secuencia no está dirigida a silenciar la expresión de ningún gen. A continuación se describe la metodología utilizada en el cribado de las diferentes moléculas de siRNA sintetizadas. Como ejemplo, se detalla la completa caracterización de 4 de dichas moléculas. La distribución de 4 de los siRNAs dúplex diseñados para inhibir la expresión de CD40 humano a lo largo de la secuencia del correspondiente cDNA se muestra en la Figura 1.
Para diseñar los siRNAs a partir de la secuencia del cDNA diana se evitan las regiones 5' y 3' no traducidas así como las regiones cercanas al codón de iniciación, ya que poseen lugares de unión a proteínas reguladoras. Dichas proteínas, así como los complejos de iniciación de la traducción proteica pueden interferir con la unión del complejo RISC (RNA-induced silencing complex) con actividad endonucleasa, mediador de la degradación del mRNA diana.
Para cada siRNA se utiliza una pareja de oligonucleótidos de 21 pares de bases, 19 de las cuales son complementarias al gen diana, en este caso al CD40 humano.
Existen fundamentalmente dos maneras de preparar los dúplex de siRNA in vitro, el método químico, en el que las cadenas de RNA de 21-25 nucleótidos se sintetizan mediante un sintetizador convencional de RNA/DNA por separado y posteriormente se anillan por complementariedad formando el dúplex de siRNA. Alternativamente, se utiliza un método enzimático de síntesis de siRNA basado en la transcripción in vitro utilizando la T7 RNA polimerasa. En el presente caso se ha utilizado el segundo método, la transcripción in vitro, al resultar más económico para los experimentos de caracterización a pequeña escala.
Dentro de la secuencia de cDNA de CD40 humano se buscan secuencias del tipo aa(n19), y una vez escogidas, en posición 3' de cada uno de los oligonucleótidos escogidos se añade una secuencia de 8 pares de bases complementaria a la secuencia del promotor T7 (5'-cctgtctc-3'). Dichos oligonucleótidos y sus homólogos complementarios se unen por separado al cebador del promotor T7, que en presencia de DNA polimerasa (Klenow) genera un DNA de doble cadena en cada caso. Posteriormente, se emplean estos fragmentos cortos de DNA como substratos para una reacción de transcripción in vitro. Finalmente, los productos de dichas reacciones de transcripción se hibridan entre ellos generando RNAs de doble cadena, también llamados siRNA dúplex. Las secuencias de 4 de los siRNA dúplex sintetizados, dirigidos contra CD40 humano, más las del siRNA control son las siguientes:
hCD40 siRNA1
\hskip0,5cm 5'-uuucaccgcaaggaaggcauu-3' (SEQ ID NO 9)
3'-uuaaaguggcguuccuuccgu-5'
hCD40 siRNA2
\hskip0,5cm 5'-caggugucuaggaauucgcuu-3' (SEQ ID NO 7)
3'-uuguccacagauccuuaagcg-5'
hCD40 siRNA3
\hskip0,5cm 5'-agcuuguccaagggugacauu-3' (SEQ ID NO 10)
3'-uuucgaacagguucccacugu-5'
hCD40 siRNA4
\hskip0,5cm 5'-aggaagaucgucgggaaaauu-3' (SEQ ID NO 11)
3'-uuuccuucuagcagcccuuuu-5'
siRNA control
\hskip0,5cm 5'-uggucacgagucuuguaguuu-3' (SEQ ID NO 12)
3'-uuaccagugcucagaacauca-5'
Eficacia de los siRNAs dúplex en el silenciamiento de la expresió.i Je CD40 humano a nivel de mRNA
Las células ECV-304, una línea celular humana con características endoteliales, se transfectan (incuban) por separado con los diferentes siRNA dúplex dirigidos contra el mRNA para CD40 humano, incluido el siRNA dúplex control, a una concentración de 100 nM en cada caso. Su penetración en el interior de las células se facilita mediante la utilización de un lípido catiónico como vehículo de transferencia. A las 48 horas se analizan mediante RT-PCR a tiempo real, los niveles de expresión del tránscrito de CD40 en todas las muestras transfectadas. Dichos valores se normalizan respecto a la expresión de un gen constitutivo de referencia (el gen de la ciclofilina se toma aquí como referencia). Así, se calcula la relación de expresión de CD40/ciclofilina.
En dicho análisis semicuantitativo, la expresión del gen diana (CD40) de cada una de las muestras tratadas con siRNAs se expresa como un valor relativo a la muestra tratada con el siRNA control. El resultado de la cuantificación viene dado en unidades relativas de expresión.
La Tabla 1 siguiente muestra las relaciones CD40/ciclofilina obtenidas en la cuantificación relativa de tránscritos CD40.
TABLA 1
Ratlo CD40/ciclofilina
(merla \pm desviación estándar)
ECV-304
100nM
hCD40-siRNA1 3,41 \pm 1,09
hCD40-siRNA2 0,71 \pm 0,61*
hCD40-siRNA3 3,38 \pm 0,69
hCD40-siRNA4 4,55 \pm 2,09
siRNA Control 2,82 \pm 1,07
Así, según los resultados obtenidos, el dúplex siRNA2 objeto de la presente invención causa una inhibición significativa (p<0.05, test "t" de student) de la expresión de CD40 de unas 4 veces respecto al valor obtenido en las células tratadas con el dúplex siRNA control. En la figura 2 se muestran estos resultados de una forma gráfica.
Eficacia de los siRNA dúplex en la inhibición de la síntesis del receptor CD40 humano
En este caso, las células ECV-304 se transfectan también con los siRNAs (100 nM) dirigidos contra CD40 humano (y paralelamente con el correspondiente siRNA control). Seguidamente se estimulan con las citoquinas proinflamatorias TNF-\alpha y IF-\gamma, que inducen la sobreexpresión de CD40. A las 24 horas del tratamiento, las células se lisan y en el extracto proteico se analizan los niveles de expresión de CD40 (50 kDa) mediante Western blot, con un anticuerpo específico contra CD40 humano. Los valores obtenidos se normalizan respecto a la expresión de \beta-actina (42 kDa) en dichas células.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3. Se confirma que solamente en células tratadas con el dúplex siRNA2, y no en células tratadas con cualquiera de los demás siRNA analizados, se induce un silenciamiento importante de la expresión de CD40. En el caso del siRNA2 objeto de la presente invención los niveles de proteína CD40 muestran una reducción de más del 80% respecto a las muestras no tratadas, o tratadas con el dúplex siRNA control.
Indicaciones
La interacción entre CD40 y CD40L juega un papel muy importante en diferentes aspectos de la respuesta inmune humoral y celular. Dicha interacción es esencial en la activación de los linfocitos T, para potenciar la capacidad de presentación de antígeno en las células presentadoras de antígeno (APC), en la activación de los linfocitos B (induciendo su proliferación y en el control del cambio de isotipo de las IgG), y en la activación de células epiteliales y endoteliales, involucradas en procesos inflamatorios.
Por lo tanto, un uso de acuerdo con la invención es el uso para la preparación de medicamentos con un inhibidor anti-CD40 humano de acuerdo con la invención, como el siRNA2, para el bloqueo o reducción de la interacción entre CD40 y CD40L que en cualquier grado o intensidad sea base de patología humana o este presente en ella, en cualquier disciplina médica, y con la finalidad de producir efectos beneficiosos o terapéuticos.
Por tanto, el empleo de siRNAs anti-CD40 estará indicado especialmente en el campo del trasplante de órganos para inhibir o evitar en su totalidad los fenómenos de rechazo agudo y para la inducción de tolerancia a largo plazo con la administración concomitante de otros inmunosupresores o de forma única y aislada.
Además, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L mediante siRNAs puede ser adecuado en aplicaciones terapéuticas en cualquier enfermedad que curse con procesos inflamatorios, como las manifestaciones alérgicas, autoinmunes, cardiovasculares, infecciosas y reumatológicas (dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales y bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, tiroiditis, artritis), e incluso para desórdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer.
Diferentes estudios preclinicos que han empleado anticuerpos bloqueantes anti-CD40L, o ratones knock-out tanto para CD40 como para CD40L apoyan estas afirmaciones.
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<110> ARAN, JOSEP Mª
\hskip1cm
GRINYO, JOSEP Mª 
\hskip1cm
TORRAS, JOAN 
\hskip1cm
PLUVINET, RAQUEL 
\hskip1cm
HERRERO, IMMACULADA 
\hskip1cm
CRUZADO, JOSEP Mª 
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<120> Secuencia oligoribonucleotídica homóloga a una región del cDNA que codifica para el receptor CD40 humano y oligoribonucleótidos dúplex, vectores, composiciones farmacéuticas y usos correspondientes.
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<130> ARAN-GRINYO-TORRAS-Anti-CD40
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<160> 13
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(19)
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<223> siRNA homólogo a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (241) ... (259)
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskip
cgaauuccu agacaccug 
\hfill
19 
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<210> 2
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<211> 19
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(19)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (259)...(241)
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskip
caggugucua ggaauucgc 
\hfill
19 
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<210> 3
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<211> 13
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<212> RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(13)
\newpage
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<223> siRNA homólogo a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (247) ... (259)
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<400> 3
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uccuagacac cug 
\hfill
13 
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<211> 13
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(13)
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<223> siRNA homólogo a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (241) ... (253)
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<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskip
gcgaauuccu aga 
\hfill
13 
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<210> 5
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<211> 13
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<222> (1)..(13)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; Gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (253) ... (241).
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
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\hskip-.1em\dddseqskip
ucuaggaauu cgc 
\hfill
13 
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<210> 6
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<211> 13
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(13)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (259) ... (247).
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskip
caggugucua gga 
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13 
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<211> 21
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(21)
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<223> siRNA homólogo a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (241) ... (259)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
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gcgaauuccu agacaccugu u 
\hfill
21 
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<210> 8
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<211> 21
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<212> DNA/RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(21)
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<223> siRNA homólogo a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (241) ... (259)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
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gcgaauuccu agacaccugt t 
\hfill
21 
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<210> 9
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<211> 21
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(21)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (240) ... (222)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
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uuucaccgca aggaaggcau u 
\hfill
21 
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<210> 10
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<211> 21
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (546) ... (528)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
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agcuugucca agggugacau u 
\hfill
21 
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<210> 11
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<211> 21
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1).. (21)
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<223> siRNA complementario a una región de las moléculas de activación de CDS del linfocito B; gen CD40; gen CDw40; receptor del factor de crecimiento nervioso; (776) ... (758)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
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\hskip-.1em\dddseqskip
aggaagaucg ucgggaaaau u 
\hfill
21 
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<210> 12
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<211> 21
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<212> RNA
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<213> Homo sapiens 
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<220>
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<221> misc_RNA
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<222> (1)..(21)
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<223>
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<400> 12
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\hskip-.1em\dddseqskip
uggucacgag ucuuguaguu u 
\hfill
21

Claims (27)

1. Secuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las secuencias oligoribonucleotídicas
5'-gcgaauuccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 1) y 5'-caggugucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 2)
donde dichas secuencias oligoribonucleotídicas son homólogas a la región comprendida entre los nucleótidos 241 a 259 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592.
2. Secuencia oligoribonucleotídica según la reivindicación 1, caracterizada porque está extendida por cualquiera de sus extremos por como máximo cuatro ribonucleótidos adicionales en total, formando una secuencia oligoribonucleotidica extendida, donde dichos ribonucleótidos adicionales son homólogos a la correspondiente región comprendida entre los nucleótidos 237 a 263 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592.
3. Secuencia oligoribonucleotidica que comprende una subsecuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las subsecuencias oligoribonucleotídicas
5'-uccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 3) 5'-gcgaauuccuaga-3' (SEQ ID NO 4) 5'-ucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 5) 5'-caggugucuagga-3' (SEQ ID NO 6)
y que comprende, adicionalmente un máximo de 12 ribonucleótidos adicionales añadidos por cualquiera de sus extremos o por ambos extremos simultáneamente, formando una secuencia oligoribonucleotídica modificada, de tal manera que dicha secuencia oligoribonucleotídica modificada es homóloga a la región comprendida entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica par el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592.
4. Secuencia oligoribonucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque comprende, adicionalmente de uno a tres ribonucleótidos terminales por su extremo 3', formando una secuencia nucleotídica alargada, donde dichos ribonucleótidos terminales no son homólogos a la correspondiente región entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number
X60592.
5. Secuencia oligoribonucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha secuencia oligoribonucleotídica, dicha secuencia oligoribonucleotídica extendida, dicha secuencia oligoribonucleotídica modificada, o dicha secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta la unión de por lo menos un péptido, un azúcar, un lípido o un polímero.
6. Secuencia oligoribonucleotídica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque dicha secuencia oligoribonucleotídica, dicha secuencia oligoribonucleotídica extendida, dicha secuencia oligoribonucleotídica modificada, o dicha secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta por lo menos una modificación química en alguno de los elementos que componen su estructura, ya sea en los ribonucleósidos o en los enlaces internucleo-
tídicos.
7. Secuencia oligoribonucleotídica según la reivindicación 6, caracterizada porque dicha modificación química es una modificación del grupo formado por la adición de un grupo fosfato en el extremo 5' de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de grupos 2'-hidroxil por grupos 2'-O-metil en las ribosas componentes de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de ribonucleósidos por análogos ribonucleosídicos como los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos, y la sustitución de los enlaces fosfato internucleotídicos por otros enlaces como fosforotioato o metil-
fosfonato.
\newpage
8. Oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de las secuencias oligoribonucleotídicas según la reivindicación 1, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados :
\hskip0,5cm 5'-gcgaauuccuagacaccuguu-3' (SEQ ID NO 7) 3'-uucgcuuaaggaucuguggac-5' \hskip0,5cm 5'-gcgaauuccuagacaccugtt-3' (SEQ ID NO 8) 3'-ttcgcuuaaggaucuguggac-5'
9. Oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de las secuencias oligoribonucleotídicas extendidas según la reivindicación 2, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
10. Oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas modificadas según la reivindicación 3, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
11. Oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas alargadas según la reivindicación 4, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
12. Oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, caracterizado porque dicha secuencia oligoribonucleotídica, dicha secuencia oligoribonucleotídica extendida, dicha secuencia oligoribonucleotídica modificada, o dicha secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta la unión de por lo menos un péptido, un azúcar, un lípido o un polímero.
13. Oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, caracterizado porque dicha secuencia oligoribonucleotídica, dicha secuencia oligoribonucleotídica extendida, dicha secuencia oligoribonucleotídica modificada, o dicha secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta por lo menos una modificación química en alguno de los elementos que componen su estructura, ya sea en los ribonucleósidos o en los enlaces internucleotídicos.
14. Oligoribonucleótido dúplex según la reivindicación 13, caracterizado porque dicha modificación química es una modificación del grupo formado por la adición de un grupo fosfato en el extremo 5' de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de grupos 2'-hidroxil por grupos 2'-O-metil en las ribosas componentes de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de ribonucleósidos por análogos ribonucleosídicos como los N3'\rightarrowP5' fosforamidatos, y la sustitución de los enlaces fosfato internucleotídicos por otros enlaces como fosforotioato o metilfosfonato.
15. Oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, caracterizado porque dichas secuencias oligoribonucleotídicas, dichas secuencias oligoribonucleotídicas extendidas, dichas secuencias oligoribonucleotídicas modificadas, o dichas secuencias oligoribonucleotídicas alargadas, están unidas entre sí de manera covalente por uno de sus extremos a través de un lazo o linker de 2 a 25 nucleótidos para formar un shRNA.
16. Composición farmacéutica que comprende una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
17. Composición farmacéutica que comprende un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
18. Vector de transferencia génica capaz de inducir la expresión de una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
19. Vector de transferencia génica capaz de inducir la expresión de un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
20. Uso de una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento.
21. Uso de un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la preparación de un medicamento.
22. Uso de una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por fenómenos de rechazo en transplantes de órganos o tejidos, procesos inflamatorios agudos, procesos inflamatorios crónicos, procesos con coestimulación de linfocitos, manifestaciones alérgicas, manifestaciones autoinmunes, manifestaciones cardiovasculares, procesos infecciosos y manifestaciones reumatológicas.
23. Uso de un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por fenómenos de rechazo en transplantes de órganos o tejidos, procesos inflamatorios agudos, procesos inflamatorios crónicos, procesos con coestimulación de linfocitos, manifestaciones alérgicas, manifestaciones autoinmunes, manifestaciones cardiovasculares, procesos infecciosos y manifestaciones reumatológicas.
24. Uso de una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales, infecciones bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, tiroiditis y artritis.
25. Uso de un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales, infecciones bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, tiroiditis y artritis.
26. Uso de una secuencia oligoribonucleótidica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes neurodegenerativos.
27. Uso de un oligoribonucleótido dúplex según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes neurodegenerativos.
ES200300822A 2003-04-08 2003-04-08 Secuencia oligoribonucleotidica homologa a una region del cdna que codifica para el receptor cd40 humano y oligoribonucleotidos duplex, vectores, composiciones farmaceuticas y usos correspondientes. Expired - Fee Related ES2216707B1 (es)

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ES200300822A ES2216707B1 (es) 2003-04-08 2003-04-08 Secuencia oligoribonucleotidica homologa a una region del cdna que codifica para el receptor cd40 humano y oligoribonucleotidos duplex, vectores, composiciones farmaceuticas y usos correspondientes.
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