SECUENCIA OLIGORIBONUCLEOTÍDICA HOMOLOGA A UNA REGIÓN DEL cDNA QUE CODIFICA PARA EL RECEPTOR CD40 HUMANO Y
OLIGORIBONUCLEÓTIDOS DÚPLEX, VECTORES, COMPOSICIONES
FARMACÉUTICAS Y USOS CORRESPONDIENTES
DESCRIPCIÓN
Campo de la invención
La invención se refiere a una secuencia <oligoribonucleotídica homologa a una región del cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592, así como a oligoribonucleótidos dúplex formados por la unión de dichas secuencias oligoribonucleotídicas y sus complementárias. La invención tiene también por objeto composiciones farmacéuticas que comprendan dichas secuencias oligoribonucleótidicas y/o dichos oligoribonucleótidos dúplex, vectores de transferencia capaces de expresarlos, y usos de los mismos.
Estado de la técnica
Estrategias de inhibición de la expresión génica
A nivel molecular, las enfermedades son frecuentemente el resultado de la expresión inadecuada de una o varias proteínas, codificadas por los genes. Los trata- mientos farmacológicos convencionales que se han aplicado hasta el momento han conseguido en muchos casos paliar la sintomatología de las enfermedades, pero la mayoría de dichos tratamientos comportan efectos secundarios, que se agravan cuando los tratamientos son continuados, debido a las acciones inespecíficas de los fármacos utilizados.
Con el desarrollo de la biología molecular y la ingeniería genética se introdujo recientemente el concepto de terapia génica, un tratamiento causal y específico de las enfermedades basado en acciones directas sobre los ácidos nucleicos. Así, en
los casos en los que se conoce que una determinada enfermedad viral, inflamatoria, o tumoral es debida a una expresión/síntesis anómala de una determinada proteína, se han desarrollado una serie de metodologías terapéuticas denominadas "antisentido", destinadas a atenuar la producción de dicha proleína. Para ello se utilizan fragmentos pequeños de ácidos nucleicos (oligonucleótidos antisentido), algunos de ellos con actividad catalítica (ribozimas, DNA∑imas, ...) que potencian la degradación del RNA mensajero (mRNA) y/o bloquean la biosíntesis de la proteína implicada en la enfermedad al unirse específicamente a determinadas secuencias del correspondiente mRNA diana. Sin embargo, en los ensayos preclínicos y clíni- eos realizados hasta el momento, la eficacia inhibidora y los efectos biológicos de dichas moléculas se han visto cuestionados por su deficiente relación en el balance eficacia/seguridad.
Muy recientemente se ha introducido una nueva y prometedora estrategia de regu- lación o bloqueo de la expresión génica a nivel de RNA, denominada "silencia- miento génico post-transcripcional" (PTGS). También llamada "interferencia de RNA" (RNA interference; RNAi), dicho fenómeno se refiere a la supresión específica de la expresión génica mediada por pequeñas moléculas de RNA de doble cadena (siRNA). Resultados experimentales muy recientes han propuesto un meca- nismo de actuación de RNAi diferente al utilizado por las moléculas antisentido. Las moléculas de siRNA (preferentemente de 21-25 nucleótidos de longitud), ^aparentemente actúan como secuencia guía que se une a un complejo proteico con actividad de nucleasa. Dicho complejo se posiciona en el mRNA diana, que contiene una secuencia específica totalmente complementaria a la cadena antisentido del siRNA, e inicia su degradación.
La principal ventaja que ofrece la utilización de siRNAs optimizados para RNAi, respecto a los métodos "antisentido" es su extremada eficiencia, que permite utilizar concentraciones muy bajas de siRNA (de 1 a 100 nM) capaces de producir un 80-100% de inhibición específica de la expresión de un determinado gen. Además, parece que los siRNAs son más resistentes que los oligonucleótidos antisentido a la degradación mediada por nucleasas. Por tanto, los siRNAs pueden resultar muy efectivos como agentes terapéuticos. Es conocido también que las secuencias oli-
goribonucleotídicas de cadena sencilla son asimismo capaces de producir una inhibición potente y específica de la expresión de su gen diana.
El receptor CD40 como diana para tratamientos de terapia génica
La proteína CD40, identificada en 1985, es un receptor localizado en la superficie celular que pertenece a la familia de los receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-R). Dicha biomolécula se caracterizó inicialmente en los linfocitos B. Se demostró posteriormente que juega un papel clave en las respuestas inmunes humórales dependientes de las células T al analizar las consecuencias de su disfunción en pacientes con síndrome hiper-lgM, y en ratones knock-out (deficientes) para CD40. Además su ligando específico, la proteína CD40L (CD154), es un miembro de la familia de citoquinas del factor de necrosis tumoral (TNF) y se expresa fundamentalmente en células T CD4+ activadas. Así, se observó que las interacciones CD40-CD40L activan diferentes rutas de transducción de señales las cuales inducen la producción de diferentes citoquinas y otros mediadores que, en definitiva, juegan un papel fundamental en la regulación de la respuesta inmune.
Recientemente se ha constatado que CD40 se expresa también en monocitos, cé- lulas dendríticas, células endoteliales, fibroblastos y células epiteliales. En las células no-hematopoyéticas, el receptor CD40 está implicado en la amplificación y regulación de las respuestas inflamatorias. Además, estudios experimentales utilizando ratones knock-out o anticuerpos anti-CD40 han demostrado que el bloqueo de la interacción CD40-CD40L es beneficiosa en varios modelos patológicos, que incluyen el trasplante, las manifestaciones autoinmunes y las enfermedades infecciosas.
En los documentos citados al final de la presente descripción, que se incorporan en la misma por referencia, se puede obtener más información sobre los estudios y técnicas citados anteriormente.
Sumario de la invención
La invención tiene por objeto una secuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las secuencias oligoribonucleotídicas
5'-gcgaauuccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 1)
5'-caggugucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 2)
donde estas secuencias oligoribonucleotídicas son homologas a la región comprendida entre los nucleótidos 241 a 259 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592.
La invención tiene también por objeto un oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología (también denominada apareamiento complementario) de las secuencias oligoribonucleotídicas según la reivindicación 1 , donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados:
5'-gcgaauuccuagacaccuguu-3' (SEQ ID NO 7)
3'-uucgcuuaaggaucuguggac-5'
5'-gcgaauuccuagacaccugtt-3' (SEQ ID NO 8)
3'-ttcgcuuaaggaucuguggac-5'
En la presente solicitud el término "secuencia oligoribonucleotídlca" es un término que se refiere a la composición de un oligoribonucleótido. Los oligoribonucleótidos son elementos o entidades biológicas (segmentos cortos de RNA) necesariamente de cadena sencilla. Asimismo en la presente solicitud el término "oligoribonucleótido dúplex" se refiere a los oligoribonucleótidos de doble cadena, como por ejemplo siRNA, shRNA, etc.
Preferentemente la secuencia oligoribonucleotídica está extendida por cualquiera de sus extremos por como máximo cuatro ribonucleótidos adicionales en total, formando una secuencia oligoribonucleotídica extendida, donde dichos ribonucleótidos adicionales son homólogos a la correspondiente región comprendida entre los nucleótidos 237 a 263 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592, o sea:
5'-gaaagcgaauuccuagacaccuggaac-3' (SEQ ID NO 13)
Efectivamente, la adición de dichos ribonucleótidos adicionales no modifica subs- tancialmente la eficacia de la secuencia. La invención comprende también los oligoribonucleótidos dúplex formados por la unión por homología de estas secuencias oligoribonucleotídicas extendidas, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados. Estos nucleótidos terminales uu o tt son obtenidos en función del procedimiento de síntesis empleado: enzimático (uu) o químico (tt).
Asimismo es posible el empleo de secuencias oligoribonucleotídicas que estén for- madas por una parte de las secuencias oligoribonucleotídicas anteriores, en las que se ha eliminado entre 1 y seis ribonucleótidos de uno de sus extremos, y. se han añadido la misma cantidad de oligoribonucleótidos por el extremo opuesto. Adicio- nalmente es posible alargar la secuencia resultante con una cantidad de ribonucleótidos comprendida entre 1 y 6. Dicho de otra manera, la invención tiene asi- mismo por objeto una secuencia oligoribonucleotídica que comprende una subse- cuencia oligoribonucleotídica del grupo formado por las subsecuencias oligoribonucleotídicas
5'-uccuagacaccug-3' (SEQ ID NO 3)
5'-gcgaauuccuaga-3' (SEQ ID NO 4)
5'-ucuaggaauucgc-3' (SEQ ID NO 5)
5'-caggugucuagga-3' (SEQ ID NO 6)
y que comprende, adlcionalmente un máximo de 12 ribonucleótidos adicionales añadidos por cualquiera de sus extremos o por ambos extremos simultáneamente, formando una secuencia oligoribonucleotídica modificada, de tal manera que la secuencia oligoribonucleotídica modificada es homologa a la región comprendida entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica par el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592. Es asimismo ventajoso la obtención de un oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas modificadas como las citadas anteriormente, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
Ventajosamente, cualquiera de las secuencias oligoribonucleotídica de acuerdo con la invención comprende, adicionalmente de uno a tres ribonucleótidos terminales por su extremo 3', formando una secuencia nucleotídica alargada, donde dichos ribonucleótidos terminales no son homólogos a la correspondiente región entre los nucleótidos 230 a 270 en el cDNA que codifica para el receptor CD40 humano, tal como consta en GeneBank accession number X60592. También es ventajoso la obtención del correspondiente oligoribonucleótido dúplex formado por la unión por homología de dos secuencias oligoribonucleotídicas alargadas, donde la doble cadena resultante está extendida por sus extremos 3' por dos nucleótidos terminales uu o tt no apareados.
Preferentemente la secuencia oligoribonucleotídica, la secuencia oligoribonucleotídica extendida, la secuencia oligoribonucleotídica modificada, o la secuencia oligoribonucleotídica alargada, presenta la unión de por lo menos un péptido, un azúcar, un lípido o un polímero. Son asimismo interesantes los oligoribonucleótidos dúplex formados a partir de las mismas.
Ventajosamente la secuencia oligoribonucleotídica, la secuencia oligoribonucleotídica extendida, la secuencia oligoribonucleotídica modificada, o la secuencia oligo-
ribonucleotídica alargada, o el oligoribonucleótido dúplex correspondiente, presenta por lo menos una modificación química en alguno de los elementos que componen su estructura, ya sea en los ribonucleósidos o en los enlaces intemucleotídicos. Preferentemente esta modificación química es una modificación del grupo formado por la adición de un grupo fosfato en el extremo 5' de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de grupos 2'-hidroxil por grupos 2'-0-metil en las ribosas componentes de la secuencia oligoribonucleotídica, la sustitución de ribonucleósidos por análogos ribonucleosídicos como los N3'- P5' fosforamidatos, y la sustitución de los enlaces fosfato intemucleotídicos por otros enlaces como fosforotioato o metilfosfonato. Estas modificaciones pueden ser realizadas fácilmente y no conlleva una alteración sustancial de las propiedades biológicas.
Otra forma preferente de realización de la invención se obtiene cuando en el oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención, las secuencias oligoribonucleo- tídicas, las secuencias oligoribonucleotídicas extendidas, las secuencias oligoribonucleotídicas modificadas, o las secuencias oligoribonucleotídicas alargadas, están unidas entre sí de manera covalente por uno de sus extremos a través de un lazo o linker de 2 a 25 nucleótidos para formar un shRNA.
La invención tiene también por objeto una composición farmacéutica que comprende una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de, acuerdo con la invención.
La invención tiene asimismo por objeto un vector de transferencia génica capaz de inducir la expresión de una secuencia oligoribonucleótidica y/o de un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención.
Ventajosamente se usa una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento, dicho medicamento siendo preferentemente para la inhibición de la expresión del receptor CD40 humano, o para el bloqueo o reducción de la interacción entre CD40 y CD40L humano.
Asimismo es ventajoso usar una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por fenómenos de rechazo en transplantes de órganos o tejidos, procesos inflamatorios agudos, pro- cesos inflamatorios crónicos, procesos con coestimulación de linfocitos, manifestaciones alérgicas, manifestaciones autoinmunes, manifestaciones o enfermedades cardiovasculares (como, por ejemplo y preferentemente, la arteriosclerosis), procesos infecciosos, manifestaciones reumatológicas y cáncer.
Otro uso preferente de una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención es para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad del grupo formado por dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales, infecciones bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, lupus, tiroiditis, artritis, linfomas y leucemias.
También es ventajoso el uso de una secuencia oligoribonucleótidica y/o un oligoribonucleótido dúplex de acuerdo con la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de desórdenes neurodegenerativos.
Breve descripción de los dibujos
Otras ventajas y características de la invención se aprecian a partir de la siguiente descripción, en la que, sin ningún carácter limitativo, se relata un modo preferente de realización de la invención, haciendo mención de los dibujos que se acompañan. Las figuras muestran:
Fig. 1 , representación gráfica de la distribución de 4 siRNAs dúplex diseñados para inhibir la expresión de CD40 humano a lo largo de la secuencia del correspondiente cDNA.
Fig. 2, relaciones CD40/ciclofilina obtenidas en la cuantificación relativa de transcritos CD40.
Fig. 3, análisis mediante Western blot de la expresión de CD40 (a) y β-actina (b) en las células ECV-304 tratadas con los diferentes siRNAs dirigidos contra CD40 humano.
Fig. 4, expresión de ICAM-1 en HUVEC no tratadas, mediante citometría de flujo, no estimuladas (histograma claro) y estimuladas con CD154 (histograma oscuro).
Fig. 5, expresión de VCAM-1 en HUVEC no tratadas, mediante citometría de flujo, no estimuladas (histograma claro) y estimuladas con CD154 (histograma oscuro).
Fig. 6, expresión de E-selectina en HUVEC no tratadas, mediante citometría de flujo, no estimuladas (histograma claro) y estimuladas con CD154 (histograma oscuro).
Fig. 7, expresión de ICAM-1 en HUVEC estimuladas con CD154 y transfectadas con siRNA-2 (histograma claro) o con ms¡RNA-2 (histograma oscuro).
Fig. 8, expresión de VCAM-1 en HUVEC estimuladas con CD154 y transfectadas con siRNA-2 (histograma claro) o con msiRNA-2 (histograma oscuro).
Fig. 9, expresión de E-selectina en HUVEC estimuladas con CD154 y transfectadas con siRNA-2 (histograma claro) o con msiRNA-2 (histograma oscuro).
Fig. 10, porcentaje de expresión de ICAM-1 en HUVEC estimuladas y transfectadas con siRNA-2 o con msiRNA-2, respecto a las no transfectadas.
Fig. 11, porcentaje de expresión de VCAM-1 en HUVEC estimuladas y transfectadas con siRNA-2 o con msiRNA-2, respecto a las no transfectadas.
Fig. 12, porcentaje de expresión de E-selectina en HUVEC estimuladas y transfectadas con siRNA-2 o con msiRNA-2, respecto a las no transfectadas.
Figs. 13 a 18, imágenes mediante microscopio de contraste de fases de diversas monocapas de HUVEC. HUVEC no tratadas (Fig. 13); HUVEC no tratadas y estimuladas con CD154 (Fig. 14); HUVEC no tratadas e incubadas con células HL-60 (Fig. 15); HUVEC no tratadas, estimuladas con CD154 e incubadas con células HL- 60 (Fig. 16); HUVEC tratadas con msiRNA-2, estimuladas con CD154 e incubadas con células HL-60 (Fig. 17); HUVEC tratadas con siRNA-2, estimuladas con CD154 e incubadas con células HL-60 (Fig. 18).
Fig. 19, relación de fluorescencia entre células HL-60 adheridas y células HUVEC transfectadas con siRNA-2 o con msiRNA-2.
Resultados experimentales
Los resultados originales que se presentan a continuación incluyen el diseño, sínte- sis y caracterización de la eficacia inhibidora de siRNAs para el silenciamiento gé- nico de CD40. Se demuestra la obtención de un siRNA (siRNA-2) con actividad inhibidora potente y específica de la expresión/síntesis de CD40 en un modelo celular tumoral que expresa el receptor CD40.
Obtención de siRNAs contra el receptor CD40 humano
Se han diseñado y sintetizado siRNAs dúplex dirigidos contra CD40 humano, más un siRNA dúplex control, cuya secuencia no está dirigida a silenciar la expresión de ningún gen. A continuación se describe la metodología utilizada en el cribado de las diferentes moléculas de siRNA sintetizadas. Como ejemplo, se detalla la completa caracterización de 4 de dichas moléculas. La distribución de 4 de los siRNAs dúplex diseñados para inhibir la expresión de CD40 humano a lo largo de la secuencia del correspondiente cDNA se muestra en la Figura 1.
Para diseñar los siRNAs a partir de la secuencia del cDNA diana se evitan las regiones 5' y 3' no traducidas así como las regiones cercanas al codón de iniciación, ya que poseen lugares de unión a proteínas reguladoras. Dichas proteínas, así como los complejos de iniciación de la traducción proteica pueden interferir con la
unión del complejo RISC (RNA-induced silencing complex) con actividad endonu- cleasa, mediador de la degradación del mRNA diana.
Para cada siRNA se utiliza una pareja de oligonucleótidos de 21 pares de bases, 19 de las cuales son complementarias al gen diana, en este caso al CD40 humano.
Existen fundamentalmente dos maneras de preparar los dúplex de siRNA in vitro, el método químico, en el que las cadenas de RNA de 21-25 nucleótidos se sintetizan mediante un sintetizador convencional de RNA/DNA por separado y posteriormente se anillan por complementariedad formando el dúplex de siRNA. Alternativamente, se utiliza un método enzimático de síntesis de siRNA basado en la transcripción in vitro utilizando la T7 RNA polimerasa. En el presente caso se ha utilizado el segundo método, la transcripción in vitro, al resultar más económico para los experimentos de caracterización a pequeña escala.
Dentro de la secuencia de cDNA de CD40 humano se buscan secuencias del tipo aa(n19), y una vez escogidas, en posición 3' de cada uno de los oligonucleótidos escogidos se añade una secuencia de 8 pares de bases complementaria a la secuencia del promotor T7 (5'-cctgtctc-3'). Dichos oligonucleótidos y sus homólogos complementarios se unen por separado al cebador del promotor T7, que en presencia de DNA polimerasa (Klenow) genera un DNA de doble cadena en cada caso. Posteriormente, se emplean estos fragmentos cortos de DNA como substratos para una reacción de transcripción in vitro. Finalmente, los productos de dichas reacciones de transcripción se hibridan entre ellos generando RNAs de doble ca- dena, también llamados siRNA dúplex. Las secuencias de 4 de los siRNA dúplex sintetizados, dirigidos contra CD40 humano, más las del siRNA control son las siguientes:
hCD40 siRNA-1
5'-uuucaccgcaaggaaggcauu-3' (SEQ ID NO 9)
3'-uuaaaguggcguuccuuccgu-5'
hCD40 siRNA-2
5'-caggugucuaggaauucgcuu-3' (SEQ ID NO 7)
3'-uuguccacagauccuuaagcg-5'
hCD40 siRNA-3
5'-agcuuguccaagggugacauu-3' (SEQ ID NO 10)
3'-uuucgaacagguucccacugu-5'
hCD40 siRNA-4 5'-aggaagaucgucgggaaaauu-3' (SEQ ID N0 11)
3'-uuuccuucuagcagcccuuuu-5'
siRNA control
5'-uggucacgagucuuguaguuu-3' (SEQ ID NO 12) 3'-uuaccagugcucagaacauca-5'
Eficacia de los siRNAs dúplex en el silenciamiento de la expresión de CD40 humano a nivel de mRNA
Las células ECV-304, una línea celular humana con características endoteliales, se transfectan (incuban) por separado con los diferentes siRNA dúplex dirigidos contra el mRNA para CD40 humano, incluido el siRNA dúplex control, a una concentración de 100 nM en cada caso. Su penetración en el interior de las células se facilita mediante la utilización de un lípido catiónico como vehículo de transferencia. A las 48 horas se analizan mediante RT-PCR a tiempo real, los niveles de expresión del transcrito de CD40 en todas las muestras transfectadas. Dichos valores se normalizan respecto a la expresión de un gen constitutivo de referencia (el gen de la ciclo- filina se toma aquí como referencia). Así, se calcula la relación de expresión de CD40/ciclofilina.
En dicho análisis semicuantitativo, la expresión del gen diana (CD40) de cada una de las muestras tratadas con siRNAs se expresa como un valor relativo a la mués-
tra tratada con el siRNA control. El resultado de la cuantificación viene dado en unidades relativas de expresión.
La Tabla 1 siguiente muestra las relaciones CD40/ciclofilina obtenidas en la cuanti- ficación relativa de transcritos CD40.
Tabla 1
Así, según los resultados obtenidos, el dúplex siRNA-2 objeto de la presente inven- ción causa una inhibición significativa (p<0.05, test "t" de student) de la expresión de CD40 de unas 4 veces respecto al valor obtenido en las células tratadas con el dúplex siRNA control. En la figura 2 se muestran estos resultados de una forma gráfica.
Eficacia de los siRNA dúplex en la inhibición de la síntesis del receptor CD40 humano
En este caso, las células ECV-304 se transfectan también con los siRNAs (100 nM) dirigidos contra CD40 humano (y paralelamente con el correspondiente siRNA con- trol). Seguidamente se estimulan con las citoquinas proinflamatorias TNF-α y IF-γ, que inducen la sobreexpresión de CD40. A las 24 horas del tratamiento, las células se lisan y en el extracto proteico se analizan los niveles de expresión de CD40 (50 kDa) mediante Western blot, con un anticuerpo específico contra CD40 humano.
Los valores obtenidos se normalizan respecto a la expresión de β-actina (42 kDa) en dichas células.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 3. Se confirma que solamente en células tratadas con el dúplex siRNA-2, y no en células tratadas con cualquiera de los demás siRNA analizados, se induce un silenciamiento importante de la expresión de CD40. En el caso del siRNA-2 objeto de la presente invención los niveles de proteína CD40 muestran una reducción de más del 80% respecto a las muestras no tratadas, o tratadas con el dúplex siRNA control.
Inhibición mediante interferencia de RNA (RNAi) de la expresión de moléculas de adhesión celular (CAM) en células endoteliales CD154-activadas. Inhibición mediante RNAi de la adhesión leucocitaria en células endoteliales CD154-activadas.
Una etapa importante en el proceso inmunoinflamatorio, la activación de las células endoteliales por la interacción CD40-CD154, induce la expresión de moléculas de adhesión de la superficie celular (cellular adhesión molecules, CAM) que provoca la salida de células inflamatorias del lumen del vaso sanguíneo. Por lo tanto se inves- tigó si el siRNA-2 puede interferir en la ruta de activación de CD40-CD154 en HUVEC (human umbilical vein endothelial cells, células endoteliales de la vena umbilical humana). Se ha comparado el efecto de siRNA-2 con respecto un control, el msiRNA-2, que es una secuencia de siRNA igual a la siRNA-2 pero con una subse- cuencia de 5 pares de bases alterada en un punto intermedio. La comparativa se ha realizado analizando por citometría de flujo tanto las moléculas de adhesión celular CAM como la adhesión de leucocitos en células endoteliales CD40-activadas. Cuando se ha co-cultivado HUVEC con células CD154+ Jurkat D1.1 , HUVEC incrementaron las expresiones de ICAM-1 , VCAM-1 y E-selectina. Por el contrario, HUVEC tratadas con siRNA-2 mostraron una fuerte reducción en la expresión de las CAM anteriores cuando fueron activadas vía CD154. El tratamiento de HUVEC con el msiRNA-2 de control comportó únicamente una ligera reducción de la expresión de CAM después de la activación mediante CD154. Además la valoración directa de la adhesión de leucocitos en HUVEC activadas con CD154 usando células
HL-60, que expresan los ligandos para las tres moléculas de adhesión ICAM-1 , VCAM-1 y E-seleclina demostró que el pretratamiento con siRNA-2 reduce la adherencia de leucocitos en un 87% (Fig. 19), cosa que no se consigue con el msiRNA- 2. Por lo tanto el potente efecto inhibitorio del siRNA-2 sobre la vía CD40-CD154 es comparable con lo observado al usar un anticuerpo que bloquee al CD154. Adicio- nalmente el siRNA-2 anti-CD40 no tiene efecto sobre la adhesión de leucocitos inducida por activación de HUVEC mediante TNF-α, demostrando su inhabilidad para interferir con el CD-120 (otro miembro de la familia de receptores de TNF-α) y, por lo tanto, su especificidad.
En una serie de ensayos, células HUVE€, tanto no transfectadas como transfectadas con siRNA-2 o msiRNA-2, fueron activadas por co-incubación con células Jurkat D1.1 (CD154+) con una relación T:EC de 5:1 durante 6 horas (E-selectina) o 16 horas (ICAM-1 y VCAM-1) antes del análisis. Unas 48 horas después de la transfección los co-cultivos fueron lavados con PBS para eliminar las células Jurkat D1.1 adheridas a la monocapa de HUVEC. En las células endoteliales se analizó la expresión de E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1 mediante citometría de flujo. En las Figs. 4, 5 y 6 los histogramas claros representan la expresión basal de CAM para HUVEC no tratadas y los histogramas oscuros representan la expresión de CAM en HUVEC no tratadas, estimuladas con D1.1 (CD154+). En las Figs. 7, 8 y 9 los histogramas claros representan la expresión de CAM en HUVEC transfectadas con siRNA-2, estimuladas con D1.1 (CD154+), y los histogramas oscuros representan la expresión de CAM en HUVEC transfectadas con msiRNA-2, estimuladas con D1.1 (CD154+).
En las Figs. 10, 11 y 12 se muestran unos diagramas de barras en los que se indica el tanto por ciento de expresión de CAM calculado de la siguiente manera:
[((expresión de CAM para células tratadas con siRNA-2 e inducidas con D1.1(CD154+)) - (expresión de CAM basal)) / ((expresión de CAM para células no tratadas e inducidas con D1.1 (CD154+)) - (expresión de CAM basal))] x 100.
Análogamente se ha calculado para ms¡RNA-2.
Los datos de expresión de CAM son los valores medios de intensidad de fluorescencia (MFI) de los histogramas correspondientes, para tres experimentos independientes.
En otra serie de ensayos, células HUVEC, no transfectas o transfectas con siRNA- 2 o msiRNA-2, fueron activadas mediante co-cultivo con células Jurkat D1.1 (CD154+), con una relación T:EC de 5:1 , 16 horas antes del ensayo. 48 horas después de la transfección, los co-cultivos fueron lavados abundantemente con PBS para eliminar las células Jurkat D1.1 adheridas a la monocapa de HUVEC, que fue posteriormente co-incubada con células ΗL-60, cargadas con calcein-AM, durante 30 minutos a 37° C. Se aspiró el sobrenadante y se realizaron dos suaves lavados con PBS para eliminar las células no adheridas. En las Figs. 13 a 18 se muestran imágenes mediante el microscopio de contraste de fase con una ampliación de 40 aumentos que muestran:
Fig. 13, monocapa de HUVEC no tratadas
Fig. 14, monocapa de HUVEC no tratadas, co-incubadas con células HL-60
Fig. 15, HUVEC no tratadas, activadas con Jurkat D1.1 (CD154+) Fig. 16, HUVEC no tratadas, activadas con Jurkat D1.1 (CD154+), co-incubadas con células HL-60,
Fig. 17, HUVEC tratadas con msiRNA-2 activadas con Jurkat D1.1 (CD154+), coincubadas con células HL-60, Fig. 18, HUVEC tratadas con siRNA-2 activadas con Jurkat D1.1 (CD154+), co- incubadas con células HL-60.
Tras la visualización microscópica, las células adheridas restantes fueron recogidas y se determinó la relación entre células HL-60 adheridas, marcadas fluorescentemente, y células endoteliales no marcadas. La relación se determinó por citometría de flujo tras contar 10.000 eventos por muestra. A la relación media obtenida a partir de HUVEC tratadas con msiRNA-2 se le asignó el 100% de adhesión (Fig. 19).
Indicaciones
La interacción entre CD40 y CD40L juega un papel muy importante en diferentes aspectos de la respuesta inmune humoral y celular. Dicha interacción es esencial en la activación de los linfocitos T, para potenciar la capacidad de presentación de antígeno en las células presentadoras de antígeno (APC), en la activación de los linfocilos B (induciendo su proliferación y en el control del cambio de isotipo de las IgG), y en la activación de células epiteliales y endoteliales, involucradas en procesos inflamatorios.
Por lo tanto, un uso de acuerdo con la invención es el uso para la preparación de medicamentos con un inhibidor anti-CD40 humano de acuerdo con la invención, como el siRNA-2, para el bloqueo o reducción de la interacción entre CD40 y CD40L que en cualquier grado o intensidad sea base de patología humana o este presente en ella, en cualquier disciplina médica, y con la finalidad de producir efectos beneficiosos o terapéuticos.
Por tanto, el empleo de siRNAs anti-CD40 estará indicado especialmente en el campo del trasplante de órganos para inhibir o evitar en su totalidad los fenómenos de rechazo agudo y para la inducción de tolerancia a largo plazo con la administración concomitante de otros inmunosupresores o de forma única y aislada. •
Además, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L mediante siRNAs puede ser adecuado en aplicaciones terapéuticas en cualquier enfermedad que curse con procesos inflamatorios, como las manifestaciones alérgicas, autoinmunes, cardiovasculares, infecciosas y reumatológicas (dermatitis alérgica, psoriasis, arteriosclerosis, esclerosis múltiple, fibrosis pulmonar, infecciones virales y bacterianas, asma, diabetes tipo I, enfermedad de Lyme, enfermedad de Crohn, tiroiditis, artritis), e incluso para desórdenes neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. Diferentes estudios preclínicos que han empleado anticuerpos bloqueantes anti- CD40L, o ratones knock-out tanto para CD40 como para CD40L apoyan estas afirmaciones.
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