DE69936632T2

DE69936632T2 - Hemmung der cytokin-herstellung

Info

Publication number: DE69936632T2
Application number: DE69936632T
Authority: DE
Inventors: Peter Anthony Bromley EAGLES; Richard Qihao Zheng
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1998-01-22
Filing date: 1999-01-20
Publication date: 2008-05-08
Anticipated expiration: 2019-01-21
Also published as: AU2287299A; WO1999037760A1; US6476214B1; DE69936632D1; JP2002500883A; EP1049773B1; EP1049773A1; CA2317839A1; ATE368108T1; AU764629B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Hemmung der Cytokin-Herstellung in Körperzellen, und so die Behandlung oder Prävention von Krankheiten, die mit übermäßiger Herstellung von Cytokin assoziiert sind. Von besonderem Interesse ist die Herstellung von Interleukin-5, einem Cytokin, welches mit der Entzündung der Lungenwege, insbesondere mit Asthma in Verbindung steht; und TNF-α, einem Cytokin, von dem gezeigt wurde, daß es eine sehr wichtige Rolle bei rheumatoider Arthritis spielt.
Beschreibung der verwandten Technik
Es besteht nunmehr Klarheit, daß Interleukin-5 (IL-5) eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von Asthma spielt (Corrigan, Clin. Exp. Allergy 25, 485-487 (1995)). IL-5 ist eines der bekanntesten Cytokine, welche von T-Helferzellen hergestellt werden. Es ist insbesondere in die Steuerung von Eosinophil-Funktionen verwickelt, einschließlich selektiver Chemotaxis, Wachstumsunterscheidung, Proliferation, Abgabe von cytotoxischen Proteinen und das Überleben dieser Zellen (Takatsu et al., Adv. In Immunol. 57, 145-190 (1995)). IL-5 erhöht ebenfalls die T-Zellen-Adhäsion an vaskulären Endothelzellen. IL-5 ist an dem Ort allergischer Entzündung und in dem peripherischen Blut von Patienten beobachtet worden, wobei sein Niveau mit dem Ausmaß der Eosinophilie, der Schwere, und dem Ansprechen der Behandlung von Asthma korrelierte (H. Okudaira et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 107. 255-258 (1995); Corrigan, Clin. Exp. Allergy 25, 485-487 (1995)). Hier haben Modelle von Maus bis Affe die Involvierung von IL-5 in Asthma und die günstigen Wirkungen aufgrund der Cytokin-Hemmung gezeigt.
Eine prophylaktische und therapeutische Wirkung eines Anti-IL-5 Monoclonals, TRFK-5 in einem Mausmodell allergischer pulmonärer Entzündung ist unlängst gezeigt worden, (T.T. Kung et al., American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 13, 360-365 (1995)). Die Anzahl von Eosinophilen in bronchoaveolärem Lavage (BAL) Fluid und Lungengewebe wurde verringert und die Abnahme in Knochenmarkeosinophilen wurde verhindert. Beide dieser Wirkungen wurden beobachtet, in einer Dosis-abhängigen Weise aufzutreten. Nach der Neutralisierung von IL-5 zeigte die Ovalbumin-allergische Maus keine Anzeichen eines erhöhten ephitelischen Schadens, Ödeme, oder die Anwesenheit von Schleim, welcher sich aus eosinophiler Apoptose und Abgabe von toxischen Proteinen ergeben haben könnte. Bei der IL-5 „knock-out" Maus wurde die Pathologie der Atemwege vollkommen zerstört (P. S. Foster et al., J. Exp. Med. 183, 195-201 (1996)).
Andere Gruppen haben an Meerschweinchenmodellen gearbeitet und haben berichtet, daß in Studien, bei denen Anti-IL-5 Antikörper verwendet wurden, eine totale Hemmung der Entwicklung von Bronchohyperreaktivität auf Histamin und Arecolin nach einem Ovalbumin Immunitätstest auftrat (A. J. M. Van Oosterhout et al., American Review of Respiratory Diese 147, 548-552 (1993)). Die Anzahl der Eosinophile wurde in aufgezeichneter Weise verringert und die Anzahl der Neutrophile wurde nicht beeinträchtigt, was die Spezifizität von IL-5 auf Eosinophile bei Asthma verifiziert. Eine Antikörpertherapie für Menschen weist jedoch gut bekannte Probleme auf.
Eine alternative Idee, die erwogen werden könnte, ist es, die Herstellung von IL-5 vor der RNA Transkription zu hemmen, indem eine modifizierte synthetisierte Doppelstrang (msds)-DNA-Sequenz verwendet wird, zu welcher ein besonderer Teil des Promotorabschnitts von IL-5 ähnlich oder identisch ist, z. B. der Teil, welcher an einen Transkriptionsfaktor bindet.
Als ein allgemeines Prinzip würde ein DNA „decoy" („Ablenker") vorgesehen, welcher mit dem nativen Gen um einen eingeschränkten Vorrat des Transkriptionsfaktors in Wettbewerb treten würde. Dies würde ein doppelsträngiges (ds) DNA Oligomer sein, modifiziert, um zu verhindern, daß es durch endogene DNasen zerstört würde. Zum Beispiel könnten die Phosphatbindungen in großem Ausmaß durch Thiophosphatbindungen ersetzt werden. Siehe Bieliaska et al., Science 250, 997-1000 (1990), mit Beziehung auf Interleukin-2.
NOMENKLATURNOTE
Jede in dieser Patentspezifizierung verwendete Nukleotidnomenklatur der nicht-kodierenden 5'-Region (Abschnitt) ist basiert auf dem ersten Nukleotid des Starts des Kodierungsabschnitts (A von der ATG) welches +1 ist und dem diesen vorangehenden Nukleotid, welches –1 ist. Alle in den Referenzen verwenden Nomenklaturen sind in diese Basis konvertiert worden.
V. Gruart-Gouilleux et al., Eur. J. Immunol 25, 1431-1435 (1995) studierten die transkriptionale Aktivität des menschlichen IL-5 Gen Promotorabschnitts in Maus-EL4 Zellen, unter Verwendung einer Reihe von Zerstörungskonstrukte, die an ein Luciferase-Reportergen gebunden waren. Sie fanden heraus, daß die Zerstörung von Nukleotiden zwischen –358 und –274 oder –124 bis –79 die Induktion von IL-5 Promotoraktivität hemmte. Eine Untersuchung des –358 bis –274 Abschnitts offenbarte, daß das Octamer-Bindemotiv 5'-atgcaaat-3' bei –290 bis –283 für volle transkriptionale Aktivität erforderlich war. Siehe die Nomenklaturnote oben. Sehr geringfügige Fehler der Numerierung in diesem Paper sind ebenfalls korrigiert worden, indem die Sequenz der Oligoproben als korrekt genommen wurde.
Um ungefähr die gleiche Zeit beschrieben D. Z. Stynov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 3606-3610 (1995) und Int. Arch. Allergy immunol. 107, 217-219 (1995) ein regelndes Element in dem Promotor des menschlichen Granulocyt-Macrophag Kolonie-Stimulationsfaktor (hGMCSF) Gen, das verwandte Sequenzen in den Genpromotoren von menschlichen Interleukinen (hIL-2, hIL-4, hIL-5, hIL-13) aufweist. Die Autoren identifizierten eine Palindrom enthaltende Sequenz als in eine DNA-Proteinwechselwirkung involviert, indem ein nukleares Extrakt von Jurkat-Zellen als die Quelle des Proteins verwendet wurde. Eine 40 bp Sequenz von hGMCSF Promotor DNA enthaltend cttgg ... (22N) ... ccaag „äußere" palindromische Sequenzen nahe jedem Ende und ein 12 bp-langes „inneres" AT-reiches Palindrom in der Mitte wurde gefunden, an das nukleare Extrakt durch eine Gelretardationsprobe (in welcher das Protein-DNA komplex langsamer migriert als die DNA alleine an einem Gel) zu binden. Ein Anteil der Bindung wurde ausschließlich dem äußeren Palindrom zugeschrieben und etwas dem inneren. Die Verwendung dieser hohen Nuklearextrakte stellt jedoch in Frage, welche Proteine gebunden waren. Bemerkend, daß das äußere Palindrommotiv oder eine kürzere Version, ttgg ... ccaa in den Promotoren gewisser Interleukine anwesend ist, spekulierten die Autoren, daß einige der wechselwirkenden Proteine genspezifisch sein können. Hinsichtlich IL-5 tritt die Gegenstück palindrom-enthaltende Sequenz an Nukleotiden –514 bis –504 auf. V. Gruat-Gouilleux et al., oben, berichteten jedoch, daß eine Zerstörung der Nukleotide –552 bis –499 (somit die gesamte Palindrom-enthaltende Sequenz von Staynov et al.'s umfassend) eine geringe Wirkung auf die Induktion von IL-5 Promotoraktivität hatte.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Es ist nun überraschenderweise herausgefunden worden, daß ein doppelsträngiges oligomerisches Deoxyribonukleotid (DNA-Oligomer), welches modifiziert wurde, um es gegenüber Abbau resistent zu machen, und ein ähnliches Palindrom in hIL-5 enthält, die Herstellung von hIL-5 in T-Zellen hemmt, ersichtlich durch den Wettbewerb mit hIL-5 um einen Transkriptionsfaktor. Es ist weiter herausgefunden worden, daß es Palindromenthaltende Sequenzen gibt, die das ttgg ... ccaa Motiv in dem Genpromotorabschnitt von anderen Cytokinen neben denjenigen aufweisen, die von Staynov et al., erwähnt sind, wie etwa TNF-α. Diese sind ebenfalls Hemmer der Transkription der spezifischen Cytokine. Die Hemmung, auf die hierin Bezug genommen wird, umfaßt eine teilweise oder vollständige Verhinderung der Transkription.
Indem diese Oligonukleotide zu Zellen gebracht werden, wird es möglich, Krankheiten zu behandeln, die durch Über-Expression eines Zielgens charakterisiert sind, was zu unerwünschten Wirkungen auf zellulärem Niveau führt, auf dem Niveau von Gewebe- oder Organfunktion und/oder über den ganzen Körper. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Allergie, Asthma, Krankheit chronisch verstopfter Atemwege oder Bedingungen, die charakterisiert sind als eine Entzündung, einschließlich Autoimmunkrankheiten, oder Krebs.
Nach einem Gesichtspunkt stellt die vorliegende Erfindung ein ds-DNA-Oliogomer bereit, das aus 25 bis 150 Basenpaaren besteht, bevorzugt aus 25 bis 60 und weiter bevorzugt aus 50 Basenpaaren, und die Palindrom-enthaltende Sequenz (es ist nur ein Strang dargestellt) von Formel 1 aufweist (d. h., daraus besteht oder sie umfaßt): 5' B1 × N B2 3' (Formel 1)worin B¹ ttgg oder ccaa ist und B² dementsprechend ccaa oder ttgg ist und xN aag repräsentiert, zusammen mit dem komplementären Strang, wobei das Oligomer thiophosphatiert ist, um es gegenüber Abbau und Denaturierung in vivo resistent zu machen. Bevorzugt ist das Oligomer durch stabilitätsverleihende c oder g Nukleotide an jedem Ende terminiert. Es kann abbauwiderstandsfähig durch Thiophosphatierung auf eine jegliche der bekannten Weisen sein, insbesondere durch Ersetzen von 50-100% von Phosphatbindungen darin durch Thiophosphate. Eine alternative Methode liegt in dem Klonen des/der Oligomers/Oligomere in ein Plasmid.
Allgemein ausgedrückt können die Cytokine in einfacher Weise bestimmt werden, indem nach einer Palindrom-enthaltenden Sequenz von Formel (1) gesucht wird. Innerhalb des Promotorabschnitts, oder wenn der Promotorabschnitt noch nicht identifiziert ist, sollte sie er die ersten 3000 Basen, insbesondere die ersten 1000 Basen des nicht-kodierenden 5'-Abschnitts betrachtet werden, welche dem Kodierungsabschnitt vorangeht, d. h. oberhalb von ATG. Durch Definition ist der Promotorabschnitt ebenfalls aufwärts von dem Startort zur Transkription von RNA, und daher ist der Teil des nicht-kodierenden 5'-Abschnitts, welcher auf mRNA überschrieben wird oder ein Intron des Gens ist, ausgeschlossen. Übermäßige Längen einer Promotorsequenz sind für viele Cytokine veröffentlicht worden, somit wird ein Sequenzieren selten notwendig werden.
Wie früher erwähnt umfaßt die Erfindung auch einen Vektor, welcher wenigstens eine Kopie einer ds-DNA Palindromsequenz (es ist nur ein Strang gezeigt) von der obigen Formel (1) enthält, zusammen mit dem komplementären Strang. Der Vektor kann z. B. ein Plasmid oder eine Phage oder ein modifizierter viraler Vektor sein. Diese Herangehensweise weist den Vorteil auf, mehrfache Kopien der DNA Sequenz, z. B. bis zu 100, zu erlauben, verwaltet zu werden und liefert eine höhere Stabilität in der Form eines zirkulären Plasmids/Vektors.
Die Erfindung umfaßt ebenfalls pharmazeutische Formeln für die oben definierte DNA oder den Vektor, insbesondere Liposome, welche die DNA oder den Vektor enthalten.
Die medizinische Verwendung der obigen DNA kann ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit beinhalten, die mit der Überproduktion von einem TNF-α Cytokin assoziiert ist, insbesondere durch eine Über-Expression des Gens, wobei das Verfahren die Behandlung für einen Patient bei dessen Bedarf einer wirksamen Menge des DNA Oligomers, Vektors oder pharmazeutischer Formel wie oben definiert aufweist. Die DNA, der Vektor und die pharmazeutische Formel können bei der Therapie dieser Krankheit verwendet werden, und die DNA oder der Vektor können bei der Vorbereitung einer pharmazeutischen Formel für diesen Zweck verwendet werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Die 1a bis 1c zeigen die Ergebnisse einer Probe zur Hemmung von IL-5-Herstellung unter Verwendung eines palindrom-enthaltenden modifizierten ds-DNA-Oligomers „R27" in
(1a) einem menschlichen Th2-ähnlichen T-Zellen-Klon zur Messung des verbleibenden Prozentsatzes von IL-5-Herstellung,
(1b) einem menschlichen Th2-ähnlichen T-Zellen-Klon zur Messung des verbleibenden Prozentsatzes von IL-2-Herstellung,
(1c) einer menschlichen Th2-ähnlichen T-Zellen-Linie zur Messung des verbleibenden Prozentsatzes von IFNγ-Herstellung;
2 zeigt die Ergebnisse eines Kontrollexperiments zur Messung des Prozentsatzes von verbleibender IL-5-Herstellung in einer menschlichen Th2-ähnlichen Zelle unter Verwendung einer gesteuert modifizierten ds DNA, die nicht auf das IL-5-Gen bezogen ist, genannt „RC3";
3 ist ein Diagramm des pcDNA3-Plasmids, welches von der Website von Invitrogen, Inc. genommen ist;
4 zeigt Probenergebnisse ähnlich zu denjenigen von 1(a), aber in welchen die TNF-α-Herstellung gehemmt ist, indem ein Plasmid verwendet wird, welches die Sequenz eines palindrom-enthaltenden Oligomers der Erfindung enthält; und
5 zeigt Probenergebnisse zur Hemmung eines TNF-α ähnlich zu denjenigen von 1(b) und 1(c), bei denen aber die IL-5, IL-2 und IFN-γ-Herstellung ungehemmt bleibt.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das ds-DNA-Oligomer der Erfindung hemmt die Herstellung von TNF-α in menschlichen Zellen. Es ist hypothetisch angenommen worden, daß es mit der nativen cytokingenomischen DNA für einen mutmaßlichen Transkriptionsfaktor im Wettbewerb steht. Der Transkriptionsfaktor ist „mutmaßlich", da er soweit noch nicht identifiziert oder isoliert worden ist, aber es ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung nicht notwendig, dies zu tun. Die Erfindung ist nicht von der Korrektheit dieser Hypothese abhängig. Was wichtig ist, ist, daß die Herangehensweise der vorliegenden Erfindung das Cytokin hemmen wird. Darüber hinaus hat das getestete Oligomer in Beziehung mit TNF-α, unten beschrieben, nur eine geringe oder keine Wirkung auf hIL-2, hIL-5 und hIFN-γ.
Bevorzugt ist das ds-DNA-Oligomer der Erfindung gegen Spaltung in ss-DNA stabilsiert, indem seine Enden reich an g-c-Bindungen zwischen den beiden Strängen gemacht werden. In der Praxis bedeutet dies, daß wenigstens das Terminalnukleotid und gewöhnlich seine Nachbarn g oder c sind und dies auf beide, das 5'- und das 3'-Ende zutrifft. Bevorzugt besteht ein g-c-reiches Ende (eines oder beide Enden) aus zwei oder mehr g-c-Rasenpaaren pro Ende, z.B. von 2 bis 4 bp.
Wenn die Enden des Oligomers g-c-reiche Enden aufweisen, können die nächstbenachbarten Nukleotide diejenigen des 5'- oder 3'-Endes jeweils der palindromenthaltenden Sequenz sein, d.h. B¹ oder B² von Formel (1). Alternativ kann jegliches willkürliche Flankierungsnukleotid (welches nicht mit Basenpaarungen zwischen B¹ und B² interferiert) B¹ voranstehen oder B² folgen, jeweils zwischen B¹, B² und den Enden.
Bevorzugt werden im wesentlichen native flanierende Nukleotide verwendet. „Nativ" bedeutet von der gleichen Sequenz wie in dem nicht-kodierenden 5'-Abschnitt des Cytokingens, von welchem die palindrom-enthaltende Sequenz abgeleitet ist. Entweder B¹ oder B² oder beide können so flankiert sein. „Im wesentlichen nativ" zeigt in diesem Zusammenhang an, daß eine gewisse Modifizierung in der nativen Sequenz möglich ist, z.B. durch Zerstören, Variieren oder Zugabe (von etwa) 1 bis 3 Basenpaaren. Das Maß an möglicher Modifizierung kann in einfacher Weise gefunden werden durch ein einfaches Trial and Error-Verfahren, indem ein ELISA mit einem monoklonalen Antikörper verwendet wird, um eine Hemmung der Cytokinherstellung zu kontrollieren. Der Ausdruck „im wesentlichen nativ" sollte demgemäß in freier Weise ausgelegt werden. Wenn man IL-5 als ein Beispiel nimmt, ist, gegeben daß die Gesamtlänge des Oligomers am meisten bevorzugt 25 bis 60 bp ist, daß die bevorzugten g-c-Enden typischerweise 5 bp insgesamt lang sind und daß die palindrom-enthaltende Sequenz 11 bp lang ist, ist die gesamte Flankierungssequenz typischerweise von 9 bis 44 bp und sie kann im wesentlichen symmetrisch um das Palindrom oder asymmetrisch angeordnet sein. So ist die Länge der auswärtigen Flankierungssequenz an jeder Seite des Palindroms nicht notwendigerweise die gleiche. Z.B. kann die 5'-Flankierungssequenz länger oder kürzer als die 3'-Flankierungssequenz sein. Bevorzugt sind die Auswärts-Flankierungssequenzen zwischen 5 und 10 bp an jeder Seite und erlauben so eine oder zwei Entfernungen oder Variationen an jeder Seite. Wie unten beschrieben, streckt die native Flankierungssequenz die Palindromsequenz manchmal nach außen, d.h. diese Nukleotide sind selbst palindromisch.

Die Tabellen 1 und 2 zeigen einige Beispiele von palindrom-enthaltenden Sequenzen. Tabelle 1

SEQ ID NO:	Cytokin	Palindrom-enthaltende Sequenz, die der allgemeinen Formel (1) genügt	Ref:	Nukleotid-Nummern von Start-Kodon
1	hIL-2	ttgg ... (14N) ... ccaa	A	–220 bis –199
2	hIL-4	ccaa ... (14N) ... ttgg	B	–498 bis –477
3	hIL-5	ccaa ... (3N) ... ttgg	C	–514 bis –504
4	hIL-6	ttgg ... (17N) ... ccaa	D	–796 bis –771
5 6	hIL-8 hIL-8	ccaa ... (8N) ... ttgg ttgg ... (21N) ... ccaa	E	–533 bis –518 –1310 bis –1282
7 8	hIL-10 hIL-10	ttgg ... (24N) ... ccaa ccaa ... (19N) ... ttgg	F	–484 bis –453 –1148 bis –1120
9 10	hIL-13 hIL-13	ttgg ... (24N) ... ccaa ccaa ... (26N) ... ttgg	G	–93 bis –62 –411 bis –378
11	hGM-CSF	ttgg ... (22N) ... ccaa	H	–314 bis –285
12	hTNF-α	ttgg ... (3N) ... ccaa	I	–865 bis –875

Referenzen [und Nukleotidnummerierung der Referenz]

A. T. Fujita et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7437-7441 (1983) [258 bis 279].
B. N. Arai et al., J. Immunol. 42, 274-282 (1989) [673 bis 694].
C. T. Tanabe et al., J. Biol. Chem. 262, 16580-16584 (1987) [39 bis 49].
D. K. Yasukawa et al., EMBO J. 6, 2939-2945 (1987) [–796 bis –771].
E. N. Mukaida et al., übermittelt der Genbank unter Zugangsnummer M28130 [274 bis 302; 1051-1066] oder J. Immunol. 143, 1366-1371 (1989).
F. J. S. Rumbyrt et al., übermittelt der Genbank unter Zugangsnummer HSU06844 [913 bis 941]; D. Kube et al., Immunogenetics 45, 82-83 (1996).
G. A. N. J. McKenzie et al., J. Immunol. 150, 5436-5444 (1993) [679 bis 710; 361 bis 394].
H. S. Miyatake et al., EMBO J. 4, 2561-2568 (1985) [439 bis 468].
I. S. Takashiba et al., Gene 131, 307-308 (1993) [–698 bis –696], D. Pennica et al., 312, 724-729 (1984) [zeigt ATG Start-Kodon bei 796-798].

Tabelle 2

SEQ ID NO:	Cytokin	Vollständige palindrom-enthaltende Sequenz	Länge
1	hIL-2	ttgggggttt aaagaattcc aa	22
2	hIL-4	ccaagatgcc acctgtactt gg	22
3	hIL-5	ccaaggcttg g	11
4	hIL-6	ttgggagacg gcaggcagca gccaa	25
5 6	hIL-8 hIL-8	ccaataaaat gattgg ttggtgtgct ctttatctac agaatccaa	16 29
7 8	hIL-10 hIL-10	ttgggtattc atcccaggtt ggggggaccc aa ccaagacaac actactaagg cttctttgg	32 29
9 10	hIL-13 hIL-13	ttgggcctat aaaagctgcc acaagagccc aa ccaaaagggt ctgaggacag gagctcagag ttgg	32 34
011	hGM-CSF	ttggaaaggt tcattaatga aaacccccaa	30
12	hTNF-α	ttggaagcca a	11

Die Oligonukleotide können derart aufgebaut sein, wenigstens ein Paar von Nukleotiden zu umfassen, welche Nukleotide ttgg oder ccaa an entweder einem oder beiden Enden flankieren, und dadurch das Palindrom ausweiten, 5 oder mehr Paare von Nukleotiden aufzuweisen. (Bemerkung: der Ausdruck „Paar von Nukleotiden" bedeutet ein palindrom-bildendes Paar innerhalb eines einzelnen Strangs von DNA und sollte nicht mit Basenpaaren verwechselt werden.) Tatsächlich können Cytokine palindrom-enthaltende Sequenzen in Übereinstimmung mit der allgemeinen Formel (2) aufweisen: 5' N1-B1-N3-yN1-N4-B2-N2 3' (2), worin entweder das Paar N¹ und N² oder das Paar N³ und N⁴ oder beide diese Paare palindromische Nukleotide sind und yN 1-28 Nukleotide der nativen Cytokin-Gensequenz in der nicht-kodierenden 5'-Region repräsentiert, wobei B¹ und B² wie in Formel (1) definiert sind.
Die Oligonukleotide können in jeglicher bekannten Weise thiophosphatiert werden, um diese weniger anfällig für Abbau in vivo zu machen. Das Maß an Thiophosphat-Bindung ist nicht kritisch, wird aber normalerweise zwischen 50 und 100%, bevorzugt zwischen 70 und 80%, basierend auf der Gesamtanzahl von Phosphatbindungen sein.
Es ist als notwendig befunden worden, ein Oligomer zu verwenden, welches vergleichsweise lang ist. Diese Länge bezieht sich auf das gesamte Oligomer, nicht nur die palindrom-enthaltende Sequenz. Kürzere Oligomere von IL-5-Promotorsequenz von Längen von 17 und 23 bp wurden präpariert und getestet, aber für nicht erfolgreich befunden. Eine bevorzugte Länge ist 25 bis 50 bp und 27 bis 45 bp ist am meisten bevorzugt.
Ein Oligomer zur Verwendung zur Hemmung von IL-5 ist als „R27" bezeichnet und weist die 27 bp lange Sequenz (SEQ ID NO: 13) cgacctgcc aaggcttqqc agttggc auf.
Ein bevorzugtes Oligomer der Erfindung zum Gebrauch zur Hemmung von TNF-α ist als „R42" bezeichnet und hat die 42 bp lange Sequenz (SEQ ID NO: 14) cagggacccc agagttcctt ggaagccaag actgaaacca gc, wobei das Palindrom unterstrichen ist.
Die SEQ ID NO: 13 und 14 sind „künstlich" für den Zweck der Sequenzliste und enthalten freien Text unter Identifizierer <223>, wie folgt:
SEQ ID NO: 13 „Oligomer enthaltend eine palindromische Sequenz von menschlichem IL-5 Promotor" und
SEQ ID NO:14 „Oligomer enthaltend eine palindromische Sequenz von menschlichem TNF-alpha-Promotor".
Das Oligomer könnte als nackte DNA verwendet werden, aber die Synthetisierung des Oligomers ist selbst unter Verwendung des PCR relativ teuer und eine große Menge wird gebraucht, um eine wirksame Hemmung durch Kompetition zu erreichen. Daher besteht ein alternativer Weg darin, die Palindrom-enthaltende Sequenz, entweder als solche oder als das Oligomer in ein multi-copy Plasmid einzusetzen, bevorzugt als bakterielles Plasmid, so daß es in der gewöhnlichen Weise durch bakterielle Fermentierungsverfahren multipliziert werden kann, wodurch jede Zelle eine große Anzahl von Kopien des Plasmids enthält. Weiter kann jedes Plasmid mehr als eine Kopie der Palindrom-enthaltenden Sequenz, oder eine oder mehrere Kopien von unterschiedlichen Palindrom-enthaltenden Sequenzen enthalten, abgeleitet von Promotoren von den gleichen oder unterschiedlichen Cytokinen. Die oben erwähnten Plasmide werden bevorzugt als die Hemmungs-DNA verwendet. Plasmide geeignet zur Zugabe von Einsätzen sind gut bekannt und von vielen kommerziellen Gesellschaften kommerziell erhältlich, wie etwa Promega oder Invitrogen. Zum Beispiel kann pcDNA3 von Invitrogen, Inc verwendet werden. Hinsichtlich der Struktur dieses Plasmids, siehe die Webseite www.invitrogen.com/vecgif/pcdna3.dif. Sie enthält, in der Ordnung, einen CMV Promotor, gefolgt von dem T7 Promotor, einem Polybinder, welcher einen mehrfachen Klonungsort bereitstellt und einen sp6 Promotor zur Transkription in der bezüglich des T7 Promotors umgekehrten Richtung. Ein Diagramm ist in 3 bereitgestellt.
Die g-c-reichen Enden, höchst wünschenswert in dem Oligomer, sind nicht notwendigerweise erwünscht, wenn die oligomerische Sequenz in einen Vektor eingesetzt wird, da der Vektor normalerweise ein Abwickeln der DNA in einzelne Stränge verhindert. Wenn ein Vektor verwendet wird, müssen die Nukleotide oder Phosphatbindungen ebenfalls nicht hinsichtlich der Widerstandsfähigkeit gegenüber Abbau modifiziert werden. Mit anderen Worten wird das Oligomer gegenüber Denaturierung und Abbau resistent gemacht, indem es in den Vektor eingesetzt wird, und der Ausdruck „oligomerische Sequenz", der hierin verwendet wird, sollte in diesem Zusammenhang demgemäß ausgelegt werden. Wenn ein Vektor verwendet wird, könnte die oligomerische Sequenz länger als 150 bp, z. B. bis zu 200 bp sein, da sie stabiler ist, wenn sie in dem Vektor vorliegt. Da die Sequenz auswärts des Palindroms nicht notwendigerweise nativ zu dem Cytokingen ist, folgt jedoch, daß es nicht immer möglich oder von Bedeutung sein wird, die genaue Länge des oligomerischen Einsatzes in dem Plasmid zu unterscheiden. Tatsächlich kann der Einsatz in dem Vektor von der obigen Palindrom-enthaltenden Sequenz sein, ohne daß die Notwendigkeit besteht, daß jegliche der nach auswärts flankierenden Nukleotide in dem Oligomer vorhanden sind.
Egal ob das Oligomer als solches verwendet wird oder die Palindrom-enthaltende Sequenz innerhalb eines Vektors wie etwa einem Plasmid getragen wird, welches eine oder mehrere Kopien ihrer DNA-Sequenz enthält, kann die relevante DNA den Patienten durch jegliches bekannte Verfahren der zellulären Therapie gegeben werden, mit der DNA in Zellen eingeführt wird. Dies kann umfassen, z. B. die Verkapselung in Medikamentenlieferträgern, z. B. eine Liposomformel, enthaltend die relevante DNA, Transfektion durch Retroviralvektoren, und Konjugation mit Cholesterol.
Medikamentenbeförderungsträger sind wirksam für sowohl systematische als auch lokale Behandlung. Diese können gestaltet sein, als ein langsames Abgebereservoir zu dienen, oder um ihre Inhalte direkt zu der Zielzelle zu liefern. Einige Beispiele derart spezialisierter Medikamentenbeförderungsträger sind Liposome, Hydrogele, Cyclodextrine, bioabbaubare Nanokapseln, und bioadhäsive Mikrosphären.
Liposome werden bevorzugt. Diese sind hohle sphärische Träger, die aus Lipiden bestehen, welche in einer ähnlichen Weise angeordnet sind wie die Lipide der Zellmembran. Diese weisen einen internen aquaösen Raum zum Einschließen wasserlöslicher Verbindungen auf und reichen in der Größe von 0,05 bis einige Mikrometer im Durchmesser. Liposome können die DNA zu Zellen liefern, so daß die Nukleinsäure biologisch aktiv bleibt. Sie können in einfacher Weise hergestellt werden, indem die DNA mit einem Liposom- bildenden Lipid wie etwa einem Dialkyl oder Diacylglycerol oder Phosphatdinylcholin gemischt werden, wie in der Technik der Liposombildung bekannt. Siehe J. J. Rossi et al. AIDS Research and Human Retroviruses 8, 183-189 (1992).
Für die Erfindung nützliche Liposomherstellungen umfassen: (a) Lipfectaminreagent (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD USA) enthaltend ein polykationisches Lipidmolarverhältnis, (b) das kationische Lipid, DDAB und DOPE, in einem 2:1 Verhältnis, R. Philip et al. Mol. Cell. Biol. 14,2411-2418 (1994); und (c) DMRIE, optional in Kombination mit DOPE, z. B. in einem 1:1 Molarverhältnis (VICAL Corp. San Diego, CA, USA). Neuere Liposome, z. B. das Serum-resistente kationische Lipid GS 2888, J. G. Lewis et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 93, 3176-3181 (1996) und Liposom enthaltend einen Polylysin/DNA Komplex, S. Li and L. Huang, J. Liposome Research 7, 63-75 (1997) können ebenfalls verwendet werden.
Nanopartikel und Hydrogelträger sind ebenfalls für chemotherapeutische Mittel und proteinbasierte Pharmaceutika entwickelt worden und können folglich zur Verabreichung der DNA für die Zwecke der vorliegenden Erfindung angepaßt werden.
Eine weitere Verabreichungsmethode ist via weiße Zellen. Kompatible weiße Zellen bevorzugt die patienteneigenen, werden mit der DNA der Erfindung transfiziert, z. B. durch Elektroporation, und der Patient erhält dann eine Infusion mit diesen Zellen. Elektroporation derartiger Zellen (Lymphocyten) mit DNA ist in Beispiel 6 der PCT Veröffentlichung WO 96/22638 (Gene Shears Pty Ltd.) beschrieben und dieses Verfahren kann bei der vorliegenden Erfindung zur Anwendung gebracht werden.
Die Erfindung kann in jeglicher Form von Therapie verwendet werden, in welcher es erwünscht ist, die Herstellung von TNF-α vom Patienten zu unterdrücken, zu verringern oder zu mildern, insbesondere wenn der Patient eine annormale Konzentration des Cytokins in seinen Körperzellen herstellt. Bevorzugt ist die Erfindung für menschliche Krankheiten und menschliche Cytokine anwendbar. Krankheiten, welche mit einer übermäßigen TNF-α Herstellung assoziiert sind, oder durch Hemmung von TNF-α Herstellung behandelbar sind, sind gut bekannt. Zum Beispiel kann TNF-α septische Schocksyndrome und Krebs-Abmagerung verursachen und eine wesentliche Rolle bei Entzündungskrankheiten wie etwa rheumatoider Arthritis spielen.
Dosierungen der DNA der vorliegenden Erfindung können zwischen weiten Grenzen variieren, abhängig von der Krankheit oder der zu behandelnden Fehlordnung, des Alters und des Zustands des zu behandelnden Einzelnen, der Schwere der Krankheit, usw., und ein Arzt wird letztlich die geeigneten zu verwendenden Dosierungen bestimmen. Diese Dosierung kann so oft wie geeignet wiederholt werden. Wenn sich Nebenwirkungen entwickeln, kann die Menge und/oder Häufigkeit der Dosierung verringert werden, im Einklang mit der normalen klinischen Praxis.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung
Vergleichsbeispiel 1: Hemmung von IL-5-Abgabe in menschlichem Blut-peripherischen mononuklearen Zellen
Das Oligomer R27, modifiziert, um einen Thiophosphatgehalt von etwa 70-80% (basierend auf der Gesamtanzahl der Phosphatgruppen in dem unmodifizierten Oligomer) aufzuweisen, wurde unter Verwendung eines Oligosynthesizers synthetisiert. Eine gleiche Menge der zwei Stränge von DNA wurden gemischt und zum Sieden gebracht, dann bei Raumtemperatur abkühlen gelassen.
Unter Verwendung eines ELISA zur Erfassung von Cytokinabgabe sind Studien von menschlichen T-Zellen, Klone und Linien durchgeführt worden, die von menschlichem Blutperipherischen Mononuklearzellen von normalen Individuen erhalten wurden, verwendend Anti-CD3 Antikörper alle 7 Tage und IL-2 Einspeisung alle 3-4 Tage. T-Zellen wurden mit 5-10 μg/ml von R27 für 3 Stunden bei 37°C am Ende des Speisezyklus ausgebrütet, d. h., 7 Tage nach der zuvorigen Stimulation, bei keiner extra IL-2 Einspeisung am Tag 3 oder Tag 4. Die Zellen wurden dann mit Anti-CD3 monoklonalen Antikörper, auf Plastik immobilisiert, ausgebrütet. (Dieser Antikörper stimuliert T-Zellen und IL-5 Herstellung.) Die Kulturüberstände wurden 24 Stunden später gesammelt. Das verwendete ELISA war von dem colorimetrischen Sandwichtyp „Quantikine" (registrierte Handelsmarke) von R & D Systems, Inc., Minneapolis, USA oder R & D Systems Europe, Abingdon, Oxforshire, England. Ein Maus-monokularer-Einfang-Antikörper gegen das Cytokin, beschichtet auf eine Mikrotiterplatte, wird bereitgestellt. Der Erfassungsantikörper ist ein polyklonaler Antikörper gegen das Cytokin gebunden mit Meerrettich (horseradish) Peroxidase. Die farbformenden Reagenten sind Wasserstoffperoxid und Tetremethylbenzidin. Die optische Dichte wird bei 450 nm gelesen.
Die Ergebnisse in 1a zeigen, daß R27 in der Lage war, durch Stimulation mit Anti-CD3 Molekülen indizierte IL-5 Herstellung zu hemmen. Wie in den 1b und 1c gezeigt ist, war die Herstellung weiterer Cytokine wie etwa IL-2 und IFNγ nicht beeinträchtigt. Kulturprotokolle führ T-Zellkultur waren wie in Masseyeff et al. in Methods of Immunological Analysis 3, 121-138, VCH Verlag, Weinheim, Deutschland (1993) beschrieben.
Verwendung eines 27 bp ds DNA Kontrolloligomers „RC3":
gctgcctcgc cgtatgggtg atgacgg (SEQ ID NO: 15) anstellte von R27, keine Hemmung von IL-5 Herstellung wurde erhalten, wie in 2 gezeigt ist. SEQ ID NO: 15 ist „künstlich" für die Zwecke der Sequenzliste und enthält freien Text unter Identifizierer <223> wie folgt: „Oligomer nicht bekannten Ursprungs". Es hat g-c-reiche Enden und ihm fehlt es an dem Palindrom von SEQ ID NO: 13.
Beispiel 2: Hemmung von TNF-α Herstellung in menschlichem Blut-peripherischen Mononuklearzellen
Die Oligomersequenz enthaltend das Palindrom (unterstrichen) wurde als „R42" (SEQ ID NO: 14) ausgewählt. Zwei Primer wurden synthetisiert, indem EcoRI-Ort-Nukleotide aattc an den 5'-Enden zu Klonbildungszwecken eingebaut wurden. So umfaßte der Vorwärtsprimer aattc gefolgt durch SEQ ID NO: 14, während der Rückwärtsprimer (lese 5' zu 3') aattc gefolgt durch das Komplement von SEQ ID No: 14 aufwies.
Die zwei Oligos wurden zusammen wie in Beispiel 1 beschrieben hybridisiert. Diesem folgte die Digestion mit EcoRI vor dem Abbinden der, nun doppelsträngigen DNA in dem relevanten Abbindpuffer. Das abgebundene Produkt wurde auf 1% Agarose-Gel zur Trennung offengelassen und ein schweres Band (anzeigend eine große Molekulargröße) wurde ausgeschnitten und gereinigt durch Dialyse („Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2^nd ed. 1989, ed. Sambrook, Fritzsch and Maniatis, Seiten 6.28 und 6.29). So wurde die Gelscheibe in eine Dialysetasche gegeben, welche mit Elektrophoresepuffer gefüllt war, die Tasche wurde geschlossen und in eine seichte Schicht des Puffers in einen Elektrophoresetank getaucht. Strom bei 50V, 45mA wurde durch die Tasche für approximativ 45 Minuten geleitet, alle 15 Minuten aufzeichnend. Nach Umkehr der Polarität des Stroms für eine Minute, um die DNA von der inneren Wand der Tasche zu lösen, wurde die Tasche aus dem Tank entfernt und der Puffer aus der Tasche entfernt. Die Tasche wurde mit dem Puffer ausgespült und die Schlämmung aufgesammelt. Der verwendete Puffer war 1 x TAE (Tris Acetat EDTA).
Das Klonen wurde durchgeführt durch Bindung der ds Oligo-DNA in das pcDNA3 Plasmid wie durch den Hersteller, Invitrogen, Inc. beschrieben. Das Plasmid war mit EcoRI ausgeschnitten worden und vor der Bindung dephosphorisiert worden. Die Prozedur folgte den Instruktionen des Herstellers von pcDNA3. Das Plasmid (enthaltend das Oligo-DNA) wurde in JM109 Bakterien transfiziert und die Kolonien wurden unter Verwendung von PCR gescreent. Die Primer für dieses PCR waren basiert an den T7 und Sp6 Stellen, enthalten in dem Plasmid, welche den Polybinder flankieren (siehe 3). Positive Klone wurden für die weiteren Proben ausgewählt, die Plasmide wurden mit Restriktionsenzymen digeriert und sequenziert, bestätigend daß das Plasmid 2 Kopien der ausgwählten Gensequenz enthielt.
Die Hemmung der TNF-α Herstellung wurde wie folgt gezeigt. Peripherische Blutmononuklearzellen wurden wie durch den Herster von DMRIE-C beschrieben isoliert und Transfektion wurde ausgeführt, indem DMRIE-C (Gibco, Life Technologies Ltd.) wie in Beispiel) 1 beschrieben verwendet wurde. Die Zellen wurden stimuliert mit PHA-L Lectin bei 1 μg/ml und 10μ IL-2/ml in RPMI 1640 Standard Kulturmedium mit 10% fötalem Calfserum. Nach Übernacht-Ausbrüten bei 37°C wurden Kulturüberstände aufgesammelt und ELISA wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt. 4 zeigt die Hemmung der TNF-α Herstellung und 5 zeigt, daß die Hemmung spezifisch war, da sie nicht die Herstellung von IFNγ, IL-5 und IL-2 beeinträchtigt. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

ds-DNA-Oligomer, das aus 25 bis 150 Basenpaaren besteht und eine palindrom-enthaltende Sequenz (es ist nur ein Strang dargestellt) der Formel (1) umfasst: 5' B1 × NB2 3' (1)worin B¹ ttgg oder ccaa ist und B² dementsprechend ccaa oder ttgg ist und xN aag repräsentiert, gemeinsam mit dem komplementären Strang, wobei das Oligomer thiophosphatiert ist, um es gegenüber Abbau und Denaturierung in vivo resistent zu machen.
Oligomer nach Anspruch 1, worin die palindrom-enthaltende Sequenz gegen In-vivo-Abbau durch die Bereitstellung von Thiophosphatinternucleotidbindungen anstelle von 50-100 % der Phosphatbindungen stabilisiert ist.
Oligomer nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, das die natürliche Sequenz der Promotorenregion des menschlichen TNF-alpha-Gens am 5'- und/oder 3'-Ende der palindrom-enthaltenden Sequenz umfasst.
Oligomer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das 1 bis 3 terminale Nucleotide umfasst, die aus Desoxycytosin und Desoxyguanosin ausgewählt sind.
Oligomer nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das 25 bis 50 bp lang ist.
Vektor, der einen Teil der Nucleotidsequenz aus dem menschlichen TNF-alpha-Gen umfasst, wobei diese Nucleotidsequenz aus zumindest einer Kopie einer ds-DNA-Oligomersequenz besteht, die aus bis zu 200 Basenpaaren besteht und eine palindrom-enthaltende Sequenz (es ist nur ein Strang dargestellt) der Formel (1) umfasst: 5' B1 × N B2 3' (1)worin B¹ ttgg oder ccaa ist und B² dementsprechend ccaa oder ttgg ist und xN aag repräsentiert, gemeinsam mit dem komplementären Strang.
Vektor nach Anspruch 6 in Form eines Plasmids, das zumindest eine Kopie der ds-DNA-Oligomersequenz umfasst.
Vektor nach Anspruch 6, der ein nicht-infektiöser Virusvektor ist.
Liposomen, die ein Oligomer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder einen Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 8 enthalten.
Oligomer nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder Vektor nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder Liposomen nach Anspruch 9 zur Verwendung bei der Therapie einer Erkrankung, die mit übermäßiger in-vivo-Produktion von menschlichem TNF-alpha assoziiert ist oder die durch Reduktion der In-vivo-Produktion von menschlichem TNF-apha gelindert werden kann.
Verwendung eines Oligomers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 oder eines Vektors nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder von Liposomen nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Mittels zur Therapie einer Erkrankung, die mit übermäßiger In-vivo-Produktion von menschlichem TNF-apha assoziiert ist, jenem Gen, dem die palindrom-enthaltende Sequenz in seiner nicht-kodierenden 5'-Region entspricht, oder welche durch Reduktion der In-vivo-Produktion von menschlichem TNF-Alpha gelindert wird.
Oligomer, Vektor oder Liposomen nach Anspruch 10 oder Verwendung nach Anspruch 11, worin die assoziierte Erkrankung rheumatoide Arthritis ist.