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Hintergrund der Erfindung
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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung fällt
in den Bereich DNA-Rekombinations-Technologie und betrifft Ribozyme.
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Beschreibung
verwandter Fachgebiete
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Auf
dem Gebiet der Erfindung werden zur Zeit die zahlreichen verschiedenen
Weisen untersucht, auf die das menschliche Immunschwächevirus
(HIV), das durch HIV-1
und HIV-2 dargestellt ist, oder die zellulären Mechanismen, die in eine
Infektion durch HIV und ihrer Weiterentwicklung in vivo involviert
sind, angegriffen werden kann. Erst jüngst wurde gezeigt, dass HIV
und das Affen-Immunschwächevirus
(SIV) durch Bilden eines Komplexes zwischen dem viralen Hüllprotein
und zwei Zelloberflächenmembran-Rezeptoren – CD4 und einem
transmembranen Chemokinrezeptor – in Targetzellen eindringen.
Isolate von HIV, die sich in Bezug auf zellulären Tropismus unterscheiden,
verwenden verschiedene Teilmengen an Chemokinrezeptoren als Eintritts-Cofaktoren:
Makrophagen-tropische HIV verwenden primär CCR5-, während dual-tropische Isolate
sowohl CCR5- als auch CXCR4- (auch "Fusin" genannt) Rezeptoren verwenden; CXCR4
wird auch von T-tropischen Viren verwendet.
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Die
Rolle von CCR5 wurde von S. O'Brien
und M. Dean, Scientific American, 28–35 (September 1997), im Überblick
dargestellt. Dieser Überblick
schlägt
mehrere Möglichkeiten
vor, wie dieses Stadium der HIV-Infektion oder -Erhaltung blockiert
werden kann. Diese Möglichkeiten
umfassen:
- – Obstruktion
der Bindungsstelle an CCR5 für
HIV durch Verwendung eines Chemokin-Derivats, das mit den natürlichen
Chemokinen konkurriert, oder durch Verwendung synthetischer Antikörper
- – Impfung
mit Fragmenten von CCR5,
- – neue
Gene, deren Produkte die Bildung von CCR5 vermeiden oder CCR5 in
seiner Funktion als Dockingstelle für HIV stoppen würde.
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PCT-Anmeldung
mit der Veröffentlichungs-Nr.
WO 97/45543 schlägt
vor, die Wirkung oder Bildung von CCR5-Rezeptoren auf verschiedene
Weisen zu hemmen, umfassend Therapie mit Antikörpern; Bildung von Varianten
von CCR5 zur Verwendung als Köder,
der somit die Fusion von Zellen stört; über Agenzien, die sich an CCR5
binden, und Antisense-Oligomere und Ribozyme, um Expression der
für CCR5
kodierenden DNA zu unterbinden.
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PCT-Anmeldung
mit der Veröffentlichungs-Nr.
WO 97/44055 schlägt
demähnlich
zahlreiche Wege zur Hemmung der Wirkung oder Bildung von CCR5-Rezeptoren
vor, wobei das Konzept auf andere Chemokinrezeptoren, umfassend
CXCR4, ausgeweitet wird.
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Im
Antiviral Agents Bulletin 10 (Nr.9), 261–262 (September 1997), in dem
Artikel "Trojan
Horse Virus' Controls
HIV in vitro" wird
berichtet, dass das Virus der vesikulären Stomatitis (VSV), modifiziert,
um CD4 und CXCR4 zu exprimieren, HIV-Zellen in vitro selektiv auswählen und
töten kann.
Dieser Ansatz wird als problematisch beschrieben, hebt jedoch laut
den Autoren die Möglichkeit
hervor, HIV-nachahmende, abgeschwächte Viren oder Liposomen mit
Oberflächenzell-HIV-Rezeptoren
für gezieltes
Freisetzen von HIV-Proteaseinhibitoren, anderen antiretroviralen
Wirkstoffe, Antisense-Agenzien, Gentherapien, Ribozymen oder anderen
Agenzien für
HIV-infizierte Zellen
zu verwenden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Nun
wurde herausgefunden, dass mRNA, die für die CCR5- und CXCR4-Proteine
kodiert, durch Hammerkopf-Ribozyme so wirksam gespalten werden können, dass
die Produktion dieser Proteine blockiert wird.
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In
einem Aspekt stellt die Erfindung ein Vektorsystem bereit, das zumindest
einen DNA-Vektor umfasst, wobei der Vektor oder die Vektoren eine
zielspaltende Hammerkopf-Ribozym-DNA-Sequenz unter der Kontrolle
eines in menschlichen Zellen wirksamen Promotors enthält/enthalten,
die eine erste Erkennungssequenz (5' bis 3'):
tagattg oder ctcact für CCR5 bzw.
CXCR4
und stromabwärts
davon eine zweite Erkennungssequenz
acttg oder acgttgt für CCR5 bzw.
CXCR4 enthält
und
die bei Transkription zu RNA die von einem Zielgen, das für das CCR5-
oder CXCR4-Protein kodiert, transkribierte mRNA spaltet.
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Die
Bindung zwischen der Ribozym-DNA-Sequenz und dem Promotor kann direkt
sein und muss nur einen einzelnen Vektor verwenden. Eine indirekte
Bindung birgt jedoch auch Vorteile, die die Wirkung des Promotors
verstärkt.
Solch eine indirekte Bindung erfordert normalerweise zwei oder mehrere
Vektoren. Somit umfasst die Erfindung ein Vektorsystem, umfassend
zumindest zwei DNA-Vektoren, worin ein erster Vektor einen ersten
Promotor enthält,
der in menschlichen Zellen wirksam und operabel mit einem Gen verbunden
ist, das exprimierbar ist, um ein Aktivatorprotein zu bilden, das
in der Lage ist, auf einen zweiten Promotor zu wirken, und ein zweiter
Vektor den zweiten Promotor enthält,
der operabel mit der zuvor erwähnten
zielspaltenden Hammerkopf-Ribozym-DNA-Sequenz verbunden ist. Die
Ribozym-DNA-Sequenz
kann eine einzelne Sequenz zum Spalten der CCR5- oder CXCR4-RNA
oder Sequenzen zum Spalten sowohl der CCR5- als auch der CXCR4-RNA
umfassen. Die Begriff "Vektorensystem", wie er hierin verwendet
wird, ist ein Sammelbegriff, der einen einzelnen Vektor oder ein
Set oder eine Zusammensetzung von zwei oder mehreren Vektoren umfasst.
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Streng
gesehen ist ein Ribozym ein RNA-Molekül, das ein RNA-Target spaltet.
Manchmal wird diese Bezeichnung in der Literatur ausgewählt, um
DNA-Moleküle
zu beschreiben, die zu RNA transkribiert werden, wodurch das Ribozym
selbst entsteht.
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In
dieser Beschreibung bedeutet die Bezeichnung "Ribozym-DNA" eine DNA, die zum Ribozym selbst transkribierbar
ist.
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Die
Erfindung schließt
Liposomen mit ein, die ein wie zuvor definiertes DNA-Vektorsystem und
pharmazeutische Zusammensetzungen, die Liposomen umfassend, enthalten.
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Weiters
umfasst die Erfindung den Vektor, die Zusammensetzung und Liposomen,
wie zuvor beschrieben, zur Verwendung bei der Behandlung von Krankheiten,
die mit Infektionen verbunden sind, insbesondere HIV und Aids. Sie
umfasst auch die Verwendung der Nucleinsäure, des Vektors und der Liposomen
für ein
Präparat
einer medizinischen Formulierung für dementsprechende Zwecke.
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Weiters
umfasst die Erfindung Ribozym-DNA, umfassend (1) eine zielspaltende
Hammerkopf-Ribozym-DNA-Sequenz unter Kontrolle eines in menschlichen
Zellen wirksamen Promotors, die eine erste Erkennungssequenz (5' bis 3'):
tagattg oder
ctcact für
CCR5 bzw. CXCR4
und stromab davon eine zweite Erkennungssequenz
acttg
oder acgttgt für
CCR5 bzw. CXCR4 enthält
und
die bei Transkription zu RNA die von einem Zielgen, das für das CCR5-
oder CXCR4-Protein kodiert, transkribierte mRNA spaltet und stromab
davon (2) eine 3'-autokatalytische
Hammerkopf-Ribozym-DNA-Sequenz enthält, sodass, wenn die Ribozym-DNA
zu RNA transkribiert wird, sie eine Form eines doppelten Hammerkopfs
aufweist, der erste und zweite Stämme des Target-spaltenden Ribozyms,
das auf die CCR5- oder CXCR4-mRNA zielt, und erste und zweite Stämme von
3'-autokatalytischem
Ribozym zusammen mit einem gemeinsamen, dritten System aufweist,
das sich an die zwei Hammerköpfe
anschließt.
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Das
Verb "umfassen", in welcher grammatischen
Form es hierin auch immer verwendet wird, bedeutet "bestehen aus" oder "einschließen".
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Weiterer Stand
der Technik
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AIDS
Weekly Plus, Seite 31 vom 19. Mai 1997, präsentiert einen Bericht über einen
Abstract von R. Tritz et al., der den "Keystone Symposia on Molecular and Cellular
Biology" mit dem
Titel "Discovery
and Development of Novel Therapeutic Agents of the 21st Century" vom 16. bis zum
21. März
1997 in Tamarron, Colorado, USA, vorgelegt wurde. Dieser Abstract
schlägt
vor, dass CCR5 ein geeignetes Target für Ribozym-Gentherapie sei,
und berichtet, dass zahlreiche Haarnadel-Ribozyme, die auf CCR5-RNA
gerichtet sind, hergestellt wurden.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine schematische Zeichnung einer zielspaltenden Ribozymsequenz
der Erfindung von CCR5;
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Die 2 und 11 sind
schematische Zeichnungen von zielspaltenden Ribozym-DNA-Sequenzen, die mit
einer 3'-autokatalytischen
Sequenz verbunden sind, um eine Doppelhammerkopf-Ribozym-DNA zum Richten
auf CCR5- bzw. CXCR4-RNA bereitzustellen;
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Die 3 und 12 zeigen
die DNA-Sequenzen von Kassetten, die die Ribozym-DNA aus den 2 und 11,
gesteuert von einem T7-Promotor, umfassen;
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Die 4a und 4b sind
schematische Zeichnungen von zielspaltenden Ribozymsequenzen, die in
dieser Erfindung verwendet werden, in Verbindung mit CCR5- und CXCR4-mRNA-Targets;
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Die 5a und 5b sind
Photographien von Agarosegelen mit Ethidiumbromid, die menschliche CCR5-mRNA
enthalten und mit einem Ribozym, das der Ribozym-DNA-Sequenz, die von einem Vektorsystem der
Erfindung bereitgestellt wird, entspricht, inkubiert werden; diese
Photographien zeigen, wie die CCR5-RNA nach 1 Stunde Inkubation
(5a) und nach 3 Stunden Inkubation (5b)
gespalten wurde;
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Die 6a und 6b, 15a und 15b und 16a und 16b sind
Diagramme von Zellanzahlen (y-Achse) gegenüber Fluoreszenzintensität (x-Achse)
von untransfizierten Zellen (6a, 15a, 16b)
und transfizierten Zellen (6b, 15b, 16b),
wobei die transfizierten Zellen mit einem Liposomenpräparat transfiziert
sind, das ein Plasmid, das ein für β-Galactosidase (6b)
kodierendes Reportergen exprimiert, oder ein Plasmidvektorensystem
der Erfindung enthält,
das ein auf CCR5-mRNA (15b) oder
CXCR4-mRNA (16b) gerichtetes Ribozym enthält: Die
Fluoreszenzintensität
gibt die Konzentration an β-Galactosidase
(6a, 6b), CCR5-Proteinexpression
(15a, 15b)
und CXCR4-Proteinexpression
(16a, 16b)
an;
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7 ist
eine Karte von Plasmid-pcDNA3, die zum Klonieren von CCR5-cDNA verwendet
wird;
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8 ist
ein schematisches Diagramm eines Plasmids pCS2 + NLS, das zum Klonieren
von T7-Polymerase-DNA verwendet wird;
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9 zeigt
in einem Diagramm bestimmte Details der erforderlichen Vorgänge zum
Klonieren von T7-Polymerase in Plasmid pCS2 + NLS aus 8
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10 ist
ein schematisches Diagramm eines Plasmids pTM1, das eine interne
Ribosomeneintrittsstelle (IRES) von der 5'-untranslatierten Region (UTR) vom Encephalomyocarditisvirus
(EMCV) enthält;
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Die 13a, 13b und 14 sind
Photographien von Agarosegelen, die Fragmente von RNA enthalten,
die aus menschlichen peripheren mononuklearen Zellen transkribiert
sind, die mit Ribozymen der Erfindung transfiziert wurden;
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17 ist
ein schematisches Diagramm eines 2-Plasmid-Vektorsystems der Erfindung,
wobei das erste einen CMV-Promotor umfasst, der eine Transkription
von RNA von einem T7-Polymerasegen steuert, das zweite einen T7-Promotor
umfasst, der Transkription von RNA aus den drei Ribozym-DNA im Tandem steuert;
und
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18 ist
ein schematisches Diagramm, das ein 3-Plasmid-Vektorsystem der Erfindung
zeigt, worin das erste Plasmid einen CMV-Promotor umfasst, der Transkription
von mRNA von einem T7-Polymerasegen steuert, das zweite Plasmid
einen T7-Promotor
umfasst, der Transkription von mRNA von einem T7-Polymerasegen steuert,
und das dritte Plasmid einen T7-Promotor umfasst, der Transkription
von RNA von einer Ribozym-DNA steuert, die auf CCR5- oder CXCR4-RNA
oder beides gerichtet ist.
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Beschreibung
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Die
Ribozyme dieser Erfindung sind vom Hammerkopf-Typ. Ribozyme weisen
katalytische Sequenzen auf, die die RNA an der erwünschten
Zielstelle spalten. Die katalytischen Sequenzen von Hammerkopf-Ribozymen
weisen üblicherweise
die Form (5' bis
3') (1) cuganga...
und (2) ...gaa auf, worin n ein beliebiges Nucleotid ist. In der
vorliegenden Erfindung ist n vorzugsweise u. Sie sind durch eine
stabilisierende Struktur getrennt, die vorzugsweise ein "Bäumchen" ist. Die Ribozym-DNA in der Erfindung
kann diese Form (unter Substitution von Uracil durch Thymin) aufweisen.
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Die
Zielsequenzen der vorliegenden Erfindung sind
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Der
unterstrichene Abschnitt ist die wesentliche Sequenz aus drei Basen,
die vom in der vorliegenden Erfindung verwendeten Hammerkopf-Ribozym
benötigt
werden.
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Unmittelbar
stromauf und stromab von den katalytischen Sequenzen liegen zielbindende
(d.h. Zielerkennungs-) Sequenzen. Das Target ist RNA, und das Ribozym,
das RNA ist, ist zur Ziel-RNA komplementär (abgesehen vom zusätzlichen
c-Nucleotid, das
im Target, wie nachstehend beschrieben wird, vorhanden ist).
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Die
in das Target und in die Ribozymbindung an das Target eingebundenen
Sequenzen können
daher wie folgt zusammengefasst werden:
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Für das Ribozym,
das auf die CCR5-mRNA gerichtet ist, ist 5' uagauug 3' die erste Zielerkennungssequenz und
5' acuug 3' die zweite Zielerkennungssequenz.
Die Spaltungsstelle im Target ist guc *, wobei das mit Sternchen versehene Nucleotid
c der Spaltungsstelle entspricht und daher kein Gegenstück im Ribozym
aufweist. Die Sequenzen (a) und (b) von CCR5 sind in 4 der Zeichnungen gezeigt. Für das Ribozym,
das auf die CXCR4-mRNA gerichtet ist, sind 5' cucacu 3' und 5' acguugu 3' die erste bzw. die zweite Zielerkennungssequenz.
Die Spaltungsstelle im Target ist wiederum guc*.
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In
der folgenden Beschreibung wird die Struktur von Hammerkopf-Ribozymen
in Bezug auf RNA diskutiert, wobei natürlich die Ribozym-DNA, aus
der sie transkribiert werden, unter Substitution von Uracil durch Thymin
entspricht. Auch gilt anzumerken, dass die Konformationen dieser
hierin gezeigten Ribozymen jene sind, die aufgrund von Basenpaarung
und anderen energetischen Betrachtungen nahe liegend sind, und dass die
Erfindung in keiner Weise durch diese Zeichnungen eingeschränkt ist,
d.h. dass die Erfindung andere Konformationen derselben Moleküle einschließt.
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Hammerkopf-Ribozyme
werden durch zwei "Bäumchen" aufrechterhalten,
einem ersten "Bäumchen" ("Stamm I"), das der ersten
Zielerkennungssequenz vorangeht, und einem zweiten "Bäumchen" ("Stamm
II"), das zwischen
der ersten und der zweiten Zielerkennungssequenz liegt. Diese zwei "Bäumchen" können
jede erwünschte
Form aufweisen, umfassen jedoch typischerweise 3 bis 5 komplementäre Basenpaare,
die den Stamm bilden, und 4 oder 5 Basen in der Schleife. 1,
die sich auf ein Ribozym bezieht, das auf die CCR5-mRNA gerichtet
ist, zeigt 4 Basenpaare im Stammabschnitt selbst und 5 Basen im
Schleifenabschnitt. 11, die sich auf ein Ribozym
bezieht, das auf die CXCR4-mRNA gerichtet ist, zeigt 5 Basenpaare
in Stamm I, 4 in Stamm II und 4 Basenpaare in jedem Schleifenabschnitt.
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Nach
der zweiten katalytischen Sequenz folgt ein dritter Stamm, der aus
der zweiten Zielerkennungssequenz besteht oder sie einschließt. In einer
Ausführungsform
der Erfindung weist Stamm III eine spezielle Sequenz von guc am
3'-Ende auf, die
teilweise oder gänzlich
hinzugefügt
werden kann, sofern sie nicht natürlich vorhanden ist. Wo, wie
hierin, g das natürliche
Ende darstellt, wird uc als ein Überhang
addiert (siehe 1), sodass sich die letzten
paar Basen davon mit den Basen der zweiten katalytischen Sequenz
paaren. In 1 wird dies durch a-u- und g-c-Basenpaare
erreicht. Dieser Konstruktionstyp ist geeignet, wenn das Ribozym
keine 3'-autokatalytische
Sequenz enthält,
kann jedoch auch verwendet werden, wenn es diese Sequenz doch aufweist.
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Noch
bevorzugter enthält
das Ribozym eine 3'-autokatalytische
Sequenz. Solche Sequenzen sind an sich bekannt, insbesondere aus
der PCT-Patentanmeldung der Veröffentlichungs-Nr.
WO/97/17433 (Medical University of South Carolina). Die 3'-autokatalytische Sequenz ist vorzugsweise
so gebildet, dass eine Sequenz in der Nähe des 3'-Endes des zielspaltenden Ribozyms mit
einem Stromab-Teil der autokatalytischen Sequenz bei oder nahe bei
dem 3'-Ende davon
basengepaart ist. Diese bevorzugten Konstrukte weisen zumindest
4 Basenpaare in Stamm III auf, d.h. 4 vom zielspaltenden Ribozym,
die mit 4 vom autokatalytischen Ribozym gepaart sind. Sie können bis
zu 10 dieser Basenpaare aufweisen. Typischerweise beträgt der Überhang
nicht-basengepaarter Nucleotide, der sich über Stamm III hinaus erstreckt,
nur 1 oder 2 am 3'-Ende
der zielspaltenden Ribozymsequenz und 0 bis 5 Nucleotide am 3'-Ende der autokatalytischen
Sequenz. Solche Konstruktionen sind für CCR5 in 2 und
für CXCR4
in 11 beispielhaft dargestellt. Hier liegt die 3'-autokatalytische (= selbstspaltende)
Sequenz in der Form eines Hammerkopf-Ribozyms vor, das eine 3'-Spaltungsstelle
(guc), ein erstes "Bäumchen" ("scas-Stamm I"), ein zweites "Bäumchen" ("scas-Stamm
II") und einen dritten
Stamm ("scas-Stamm
III") umfasst, wobei
der dritte Stamm mit Stamm III des zielspaltenden Ribozyms basengepaart
ist. Spaltung tritt nach dem c der guc-3'-Spaltungsstelle auf. Die katalytische
Sequenz (cugauga) zwischen scas-Stamm I und scas-Stamm II ist eine,
die zur Stabilisierung der Hammerkopfstruktur beiträgt und auch
in der WO 97/17433 verwendet wird. Zwischen den Stämmen II
und III ist eine katalytische gaa-Stelle bereitgestellt.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ribozyme können eine
5'-autokatalytische
Sequenz enthalten, wie beispielsweise in der WO 97/17433 beschrieben
wird. In der WO 97/17433 wird ein doppeltes Ribozym bereitgestellt,
das eine zentral angeordnete BgIII-Clonierstelle agatct enthält, in die
jede erwünschte Zielerkennungs-
und katalytische Sequenz insertiert werden kann. In der WO 97/17433
umfasst das Insert 42 Basen. Diese bestehen aus einer ersten Zielerkennungssequenz
(8 Basen), katalytischen und strukturstabilisierenden Sequenzen
(23 Basen) und einer zweiten Zielerkennungssequenz (11 Basen, wovon
die letzten zwei die ag einer BgIII-Stelle sind). Unter geringen
Modifikationen könnte
dieselbe Konstruktion an die vorliegende Erfindung angepasst werden,
z.B. durch Substituieren der 23 Basen aus der WO 97/17433 durch
die einer Länge
von 36 Basen, 13–48
aus 1, entsprechende DNA, wobei zum Klonieren in eine
BgIII-Stelle am 3'-Ende
davon das Addieren von Nucleotiden notwendig ist. In dieser Konstruktion
würde Stamm
I durch die 5'-Sequenz
aus der WO 97/17433, umfassend die 5'-autokatalytische
Stelle, überflüssig gemacht
und durch sie ersetzt werden. In der WO 97/17433 liegt jedoch der
Abschnitt der Sequenz zwischen den katalytischen Stellen in keiner
engen "Bäumchen"-Form vor und scheint
so weniger strukturstabilisierend zu wirken.
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Das
Konstrukt der vorliegenden Erfindung umfasst einen oder mehrere
Vektoren, die Ribozym-DNA enthalten. Um in eukaryotischen, insbesondere
menschlichen, Zellen wirksam zu sein, sollte die Ribozym-DNA direkt
oder indirekt durch einen eukaryotischen Zellpromotor gesteuert
werden. Ein solcher besonders geeigneter Promotor ist der Zytomegalievirus-Promotor.
Es ist vorzuziehen, dass auch andere Quellen von RNA-Polymerase
zur Transkription der RNA bereitgestellt werden und man sich nicht
vollständig
auf endogene Polymerase in den Zellen des Körpers, die es zu transfizieren
gilt, verlässt.
Vorzugsweise ist die Polymerase eine, die die Wirkung des Promtors
katalysiert, typischerweise durch In-trans-Wirkung auf den Promotor.
Das bedeutet, dass ein erstes DNA-Molekül oder eine erste Länge von
DNA exprimiert wird, um eine Polymerase zu produzieren, die auf
den Promotor wirkt, der in einem anderen DNA-Molekül oder einer
bestimmten DNA-Länge
enthalten ist und Transkription der Ribozym-DNA fördert. Es
ist von Vorteil, wenn die für
die Polymerase kodierende DNA innerhalb des Vektors bereitgestellt
wird, stromab von der Ribozym-DNA. Die durch die DNA hergestellte
Polymerase wirkt dann in cis, da sie "rückwirkt", um ihren eigenen
Promotor zu stimulieren. Siehe z.B. 17, Plasmid
2 oder den Autopolymerase-Vektor in 18.
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In 17 umfasst
das Plasmid 2 eine Ribozym-DNA "rz1", die CCR5- oder
CXCR4-RNA oder beide spaltet.
Dennoch wurde es lange Zeit als wünschenswert erachtet, das HIV
an mehr als einem Punkt in seinem Infektions-, Wachstums- und Replikationszyklus
anzugreifen. So könnte
derselbe Vektor eine oder mehrere Arten an Ribozym-DNA enthalten,
die auf andere RNA gerichtet sind, die durch HIV gebildet werden,
oder erforderlich sind, um ein Protein herzustellen, das für Wachstum
oder Replikation des HIV erforderlich ist. So zeigt 17 drei
Arten an Ribozym-DNA als rz1, rz2 und rz3. Jede dieser Arten kann
gegen CCR5- oder CXCR4-RNA oder beide gerichtet sein, während die
andere abwesend sein kann oder sich gegen eine andere RNA richten
könnte,
die vom HIV oder von einem Chemokinrezeptor gebildet wird. Besonders
bevorzugt sind Ribozymsequenzen, die gegen die mRNA von Chemokinrezeptoren
CCR2b oder CCR3 gerichtet sind. Die RNA/DNA-Sequenz von CXCR4 ist
in B. Federspiel et al., Genomics 16, 707–712 (1993), offenbart. Die RNA/DNA-Sequenzen von CCR2b
und CCR3 sind auch bekannt und ermöglichen es, dass Ribozyme,
die auf diese Chemokinrezeptoren gerichtet sind, entwickelt werden,
vorzugsweise analog zu jenen für
CCR5 und CXCR4. Für
CCR2b, das zuvor menschliches chemisches Monozyt-Chemoattraktans-Protein-1-Rezeptor (MCP-1RB)
genannt wurde, siehe GenBank, Zugriffs-Nr. UO3905, und I.F. Charo
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 2752–2756 (1994), und für CCR3 siehe
GenBank, Zugriffs-Nr. U28694, und C. Combadiere et al., J. Biol.
Chem. 270, 16491–16494
und 30235 (1995) und ibid. 271, 11034 (1996). Die Rolle von CCR2b
und CCR3 bei HIV-Infektionen
wird von B.J. Doranz, Cell 85, 1149–1158 (1996), und von R.I.
Connor, J. Exp. Med. 185, 621–628
(1997), beschrieben.
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Ein
anderes Target ist eine Sequenz am 3'-Ende der viralen HIV-mRNA (auf DNA
bezogen eine 5'-Leader-Sequenz).
Siehe die PCT-Anmeldung der Veröffentlichungs-Nr. WO 97/07667 (University
of California), die ein Haarnadelschleifen-Ribozym beschreibt und
das Target identifiziert.
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Um
den Promotor zu "starten", ist es wünschenswert,
eine eigene Quelle der Polymerase zur Verfügung zu stellen, entweder als
das Enzym selbst oder noch bevorzugter in Form eines anderen Vektors,
der auch vorzugsweise ein Plasmid ist und für diesen Zweck bestimmt ist.
Siehe 17, Plasmid 1, und 18.
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In 18 enthält ein erstes
Plasmid den CMV-Promotor, der Transkription des T7-Polymerase-Gens vorantreibt,
ein zweites Plasmid enthält
den T7-Promotor und einen Translations-Enhancer (beispielhaft dargestellt
als eine IRES und veranschaulicht als ein vom EMC-Virus stammend)
für die
Produktion von T7-Polymerase, und ein drittes Plasmid, in dem ein
T7-Promotor, aktiviert durch die Polymerase, die durch die ersten zwei
Plasmide gebildet wurde, treibt die Transkription des CCR5- und/oder CXCR4-Ribozyms
voran. Andere Translations-Enhancer könnten anstelle des gezeigten
verwendet werden.
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Andere
Targets sind die LTR (lange terminale Redundanz) und tat-Gen-Regionen
von HIV. Hammerkopf-Ribozyme für
diesen Zweck werden in der PCT-Veröffentlichung
WO 95/04818 beschrieben, die auch eine Bibliographie anderer HIV-Gene
enthält,
die bereits als Target dienten, umfassend das gag-Gen [Chang et
al., Clinical Biotechnology 2, 23 (1990), und N. Sarver et al.,
Science 247, 1222–1225
(1990)] und das vif-Gen [E.U. Lorentzen et al., Virus Genes 5, 17–23 (1991)].
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Um
die Wirksamkeit zu steigern, kann der Promotor vor jeder Ribozym-Sequenz
sowie der Polymerase-Sequenz insertiert werden, wie in 17 gezeigt
ist. Diese Anordnung kann jedoch durch Verwendung eines einzelnen
Promotors geändert
werden, wodurch die Reihenfolge der Gene verändert wird. Durch die Verwendung
mehrerer Vektoren anstelle von Plasmid 2 kann auch die Expression
der Ribozyme verändert
werden.
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Verfahren
zur Abgabe, die verwendet werden können, umfassen Einkapselung
in Wirkstoffabgabevehikel, insbesondere Liposomen, Transduktion
durch retrovirale Vektoren und Konjugation mit Cholesterin.
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Wirkstoffabgabevehikel
sind sowohl bei systemischer als auch bei topischer Verabreichung
wirksam. Sie können
entworfen werden, um als ein Speicher für langsame Freisetzung zu dienen
oder um deren Inhalt der Targetzelle direkt bereitzustellen. Als Beispiele
solcher spezialisierter Wirkstoffabgabevehikel können Liposomen, Hydrogele,
Cyclodextrine, biologisch abbaubare Nanokapseln und bioadhäsive Mikrokügelchen
genannt werden.
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Liposomen
werden bevorzugt. Sie sind hohle kugelförmige Träger, die sich aus Lipiden zusammensetzen,
welche auf ähnliche
Art wie die Lipide in der Zellmembran angeordnet sind. Sie weisen
einen inneren wässrigen
Raum auf, um wasserlösliche
Verbindungen einzufangen, und liegen in einem Größenbereich von 0,05 bis mehrere μm im Durchmesser.
Liposomen können
die DNA an Zellen abgeben, sodass die Nucleinsäure biologisch aktiv bleibt.
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Sie
können
leicht durch Vermischen der DNA mit Liposom-bildendem Lipid wie
Dialkyl oder Diacylglycerin oder Phosphatidinylcholin, auf dem Gebiet
der Erfindung bekannt für
Liposomenbildung, hergestellt werden. Siehe J.J. Rossi et al., AIDS
Research and Human Retroviruses 8, 183–189 (1992).
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Liposompräparate,
die für
die Erfindung nützlich
sind, umfassen: (a) Lipofectamin-Reagens
(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD, USA), das ein polykationisches Lipid-Molverhältnis aufweist,
(b) die kationischen Lipide DDAB und DOPE in einem 2:1-Verhältnis, R.
Philip, Mol. Cell. Biol. 14, 2411–2418 (1994); und (c) DMRIE, gegebenenfalls
in Kombination mit DOPE, z.B. in einem Molverhältnis von 1 : 1 (VICAL Corp.,
San Diego, CA, USA). Neuere Liposomen, beispielsweise das Serum-resistente
kationische Lipid GS 2888, J.G. Lewis et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93, 3176 (1996), und Liposomen, die einen Polylysin/DNA-Komplex
enthalten, S. Li und L. Huang, J. Liposome Research 7, 63–75 (1997),
können
auch verwendet werden.
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Nanopartikel
und Hydrogelträger
wurden für
chemotherapeutische Mittel und Protein-basierte Pharmazeutika entwickelt und
können
folglich zur Ribozymfreisetzung für die Zwecke der vorliegenden
Erfindung angepasst werden.
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Ein
anderes Verfahren zur Freisetzung erfolgt über T-Zellen. Kompatible T-Zellen,
vorzugsweise die des Patienten selbst, werden mit Ribozym-DNA der
Erfindung beispielsweise durch Elektroporation infiziert, und dem
Patienten werden dann diese Zellen mittels Infusion zugeführt. Elektroporation
von T-Lymphozyten mit DNA, wie in Beispiel 6 der PCT-Veröffentlichung
WO 96/22638 (Gene Shears Pty Ltd.) beschrieben, und dieses Verfahren
können
in der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Die
Zusammensetzungen zur pharmazeutischen Verwendung enthalten normalerweise
ein Magnesiumsalz, vorzugsweise in Form von gepuffertem Magnesiumchlorid,
das für
die Funktion des Ribozyms erforderlich ist. Sie können auch
einen Träger
oder ein Verdünnungsmittel
enthalten, das ein Suspendiermittel oder einen Emulgator umfassen
kann.
-
Vektorsysteme
der Erfindung, vorzugsweise in einer Liposomenformulierung, werden
vorzugsweise systemisch verabreicht, z.B. intravenös, subkutan,
intraperitoneal, intranasal oder intrathekal. Die Dosierung von
Ribozym, das durch das Vektorensystem bereitgestellt wird, hängt von
der diagnostizierten Erkrankung und der Art der Verabreichung ab,
sollte jedoch bis zu 200 mg/kg und üblicherweise zumindest 10 mg/kg
Körpergewicht
pro Tag betragen. Die Anzahl an Dosen hängt von der Art des Krankheitsübertragungsvehikels
und von Daten aus klinischen Versuchen hinsichtlich der Wirksamkeit
ab.
-
Die
folgenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung der Erfindung.
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Beispiele
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1. CCR5-DNA-Klonieren
und -Expression
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Menschliche
CCR5-mRNA wurde aus der Blutprobe einer normalen Person wie folgt
entnommen. Menschliche mononukleare Peripherblutzellen (PBMC) wurden
wie in "Methods
of Immunological Analysis", R.F.
Masseyeff, W.H. Albert & N.A.
Staines, veröffentlicht
im V.C.H. Verlag, Weinheim, Deutschland, Bd. 3 "Cells and Tissues", 121–135 (1993), beschrieben kultiviert
und unter Verwendung von Gradientenzentrifugation isoliert. Die
Zellen wurden dann mit Lectin der roten Bohne (PHA-L, Sigma) bei
1 μg/ml
24 Stunden lang stimuliert. Die stimulierten Zellen wurden mit 4
M Guanidiniumthiocyanat und SDS-Lösung behandelt und Säure-Phenol-Trennungs-
und Isopropanol-Fällungsverfahren
unterzogen, alles gemäß dem Verfahren,
das in "Molecular
Cloning: A Laboratory Manual",
J. Sambrook, E. F. Fritsch & J.
Maniatis (Hrsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, 2. Auflage (1989), beschrieben wird. cDNA wurde anschließend mit
Oligo-dT (16–18
Basen) und reverser Transkriptase mittels eines Standardverfahrens
hergestellt. PCR wurde mit den Primern durchgeführt, die basierend auf der
DNA-Sequenz entworfen wurden, die in M. Samson et al., Biochemistry
35, 3362–3367
(1996), offenbart ist. So lautete die Sequenz des Vorwärts-Primers
5'-tgcacagggt ggaacaagat
gg-3' (Seq.-ID Nr.
3)
und die Sequenz des Rückwärts-Primers
lautete
5'-cacttgagtc
cgtgtcacaa gc-3' (Seq.-ID
Nr. 4)
-
Taq-Polymerase
wurde verwendet, die einen a- (Adenosin-) Überhang ergab, der zum 3'-Ende hin endete.
Das PCR-Produkt wurde dann in pcDNA3, ein bei Invitrogen UK Ltd.
erhältliches
5,4-kb-Plasmid (siehe 7), in einer EcoRV-Restriktionsstelle
kloniert. Dann wurden den 3'-Enden
einer EcoRV-Restriktionsstelle des Vektors t- (Thymidin-) Nucleotide
hinzugefügt,
um eine "ta-Klonierungs"-Stelle im Vektor
herzustellen. "ta-Klonieren" wird von J.M. Clark,
Nucleic Acids Research 16, 9677–9686
(1988), im US-Patent 5.487.993 und im Worldwide Web auf http://www.gene-labs.com/pro42.htm
beschrieben. Das Plasmid wurde dann in E. coli XL1-Blue transfiziert
und gescreent. Das CCR5-DNA-Insert wurde zur Gänze sequenziert, wobei herausgefunden
wurde, das es mit der veröffentlichten
CCR5-DNA-Sequenz
identisch war. Wie in 7 gezeigt enthält pcDNA3
einen T7-Promotor
vor der multiplen Klonierungstelle. CCR5-mRNA-Transkripte wurden
durch Hinzufügen
von T7-Polymerase in "Ribomax", einer wie in den "Protocols and Applications
Guide" von Promega
Ltd. beschriebenen Lösung,
hergestellt.
-
2. CCR5-Ribozym-DNA-Kassette
-
Eine
vollständige
Ribozym-DNA-Kassette wurde mit der Nucleotidsequenz Seq.-ID Nr.
5 konstruiert, die in 3 noch näher beschrieben wird:
-
-
Sie
wurde aus einem Vorwärts-Oligomer
von den Positionen 1 bis 80 der Codiersequenz und einem Rückwärts-Oligomer
von den Positionen 137 bis 56 unter Verwendung eines Oligonucleotid-Synteseautomaten
hergestellt. 25 Basen an den 3'-Enden
der Oligomere waren völlig
komplementär
zueinander, und die zwei Stränge
waren anelliert. Deren Verlängerung,
um sie zu einem kompletten Doppelstrang zu machen, wurde mit DNA-Polymerase
an einer PCR-Maschine durchgeführt.
Die 137-lange ds-DNA-Kassette
wurde in pUC19 unter Verwendung von Xbal- und EcoRI-Stellen (siehe 3)
für das
5'-Ende bzw. das
3'-Ende kloniert.
Ihre Sequenz wurde durch DNA-Sequenzieren bestätigt. Die Kassette enthält einen
T7-Promotor, da das im Handel erhältliche pUC19 diese Stelle
nicht enthält.
-
Gemäß den 3 und 1 umfasst
die Kassette in der folgenden Reihenfolge (5' zu 3'):
-
-
Die
Ribozym-RNA wurde durch Hinzufügen
von T7-Polymerase in "Ribomax"-Lösung,
wie in den "Protocols
and Applications Guide"-Handbuch
von Promega beschrieben, hergestellt. "Ribomax" ist eine ausgeglichene Salzlösung, die
die für
Ribozym-Aktivität
erforderlichen Magnesiumionen enthält. T7-Polymerase löst den T7-Promotor aus, damit
er RNA aus- DNA transkribiert. Die Transkripte wurden unter Verwendung
von RNase-freier DNase isoliert, woraufhin Säure/Phenol-Isolierung von RNA
und anschließende
Ethanolfällung folgten.
Dies wurde wie im zuvor zitierten "Molecular Cloning – A Laboratory Manual" beschrieben durchgeführt.
-
Wenn
RNA auf einem Agarosegel laufen gelassen wurde, so wurde das Ribozym
vor der Spaltung (103 Basen) klar vom Ribozym nach der Spaltung
(48 Basen, 1) getrennt. RNA wurde durch
Ethidiumbromid, das im Gel enthalten war, gezeigt (unter UV-Licht
sichtbar gemacht).
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3. Spaltung
von menschlichem CCR5-Target
-
Menschliche
CCR5-DNA, die wie in Abschnitt 1 zuvor beschrieben hergestellt und
in pcDNA3 kloniert worden war, wurde in E. coli XL1-Blue transfiziert
("Molecular Cloning – A Laboratory
Manual", s.o.),
um ein RNA-Transkript von CCR5 zu bilden.
-
Vom
Plasmid transkribierte Ribozyme, die im Abschnitt 2 zuvor beschrieben
wurden, wurden mit dem CCR5-RNA-Transkript bei einem Molverhältnis von
1 Mol Ribozym zu 10 Mol CCR5-RNA-Transkript inkubiert. Innerhalb
von 3 Stunden Inkubationszeit bei 37°C war vollständige Spaltung des CCR5-mRNA-Targets
erreicht. Die RNA wurde auf einem 2%igen Agarosegel, das Ethidiumbromid
enthielt, laufen gelassen. Gel-Photographien, die unter UV-Bestrahlung
aufgenommen wurden, sind in den 5a und 5b dargestellt. 5a zeigt
in der linken Bahn Produkte nach 1 Stunde Inkubation, als die CCR5-mRNA
nicht vollständig
gespalten war und so als eine Bande mit hohem Molekulargewicht am
oberen Ende erschien. Die rechte Bahn besteht aus Molekulargewicht-Markern.
Auch sind in der linken Bahn Banden geringeren Molekulargewichts dargestellt,
die (in absteigender Reihenfolge des Molekulargewichts) einem 3'-Fragment der CCR5-mRNA nach
der Spaltung, einem 5'-Fragment der CCR5-mRNA
nach der Spaltung und der Ribozym-RNA zuzuordnen sind. So ist es
eindeutig, dass sich das rzsccr5-Ribozym selbst spalten kann, um
ein aktives Ribozym zu bilden, das CCR5 katalytisch spaltet. In 5b zeigt
die rechte Bahn die Produkte nach 3 Stunden Inkubation, als die
CCR5-mRNA zur Gänze
gespalten war. Die ungespaltene mRNA darstellende Bande aus 5a ist verschwunden
und durch eine Bande ersetzt, die dem 3'-Ende des gespaltenen Produkts bei geringerem
Molekulargewicht entspricht. Das Fragment, das das 5'-Ende der CCR5-mRNA enthält, ist
bei sogar noch geringerem Molekulargewicht als in 5a sicht bar.
Es gibt keine sichtbare Bande, die das CCR5-Ribozym enthält. Dies
ist darauf zurückzuführen, dass
das Gel mit einer um das Zehnfache stärker verdünnten Probe im Vergleich zu
jener aus 5a beladen wurde.
-
4. Transfektion
von Plasmiden in PBMC
-
Plasmide
wurden in normale menschliche mononukleare Peripherblutzellen (PBMC),
die von einer Blutbank erhalten wurden, transfiziert. Die Zellen
wurden isoliert und mit PHA-L und IL-2 unter Verwendung von Standard-Verfahren
von S.J. Martin et al., J. Immunol. 152, 330–342 (1994), stimuliert. Sechs
Tage später wurden
die Zellen mittels eines Verfahrens behandelt, das unter im Folgenden
beschriebenen Anpassungen von Gibco Life Technologies Ltd. übernommen
wurde. 12 μl
DMRIE-C (Life Technology Ltd.), ein Liposomen-bildendes Präparat, wurden
mit 0,5 ml OPTI-MEM-I-reduziertem
Serummedium vermischt. 20 μl
oder 200 μl
Plasmide wurden in 0,5 ml OPTI-MEM-I-Medium dem Gemisch zugesetzt
und gut mit ihm vermischt. Die Lösung
wurde dann bei Raumtemperatur 45 Minuten lang stehen gelassen, bevor
0,2 ml PBMC-Suspension, die 4 Millionen Zellen enthielt, zugesetzt
wurden. Die Zellsuspension wurde aus ¼ Kulturüberstand und ¾ RPMI
hergestellt und mit IL-2 auf 10 U/ml aufgefüllt. Das Endgemisch wurde bei
37°C 4–5 Stunden
lang mit 5 % CO2 inkubiert. Dann wurden
die Zellen in normalem Kulturmedium (RPMI1640, IL-2 10 μ/ml und 10
% fötales Kalbserum)
durch Zusetzen des Gemischs in aliquoten Mengen zum Medium resuspendiert.
Die Lebensfähigkeit
an diesem Punkt betrug mehr als 90 %, bestimmt durch Trypanblau-Färbung. Die
Zellen wurden dann auf normale Weise für die Analyse kultiviert.
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Das
zuvor beschriebene Verfahren wurde anfänglich unter Verwendung eines
9,8-kb-Plasmids
durchgeführt,
das den Maus-Moloney-Leukemia-Virus-Promotor und das β-Galactosidase-Gen,
ein Reportergen, enthielt. Am Tag 8 nach der Transfektion wurde
das β-Galactosidaseprodukt
mittels FACS-FDG-Färbung
nach der Hemmung der endogenen β-Galactosidase
analysiert (Reagents and Protocol, Molecular Probes, USA). Wie die 6a und 6b zeigen,
in denen die Zellanzahl als ein Pro zentsatz auf der senkrechten
Achse gegenüber
der Fluoreszenzintensität
auf der waagrechten Achse dargestellt ist, gab es eine klare Verschiebung
der Fluoresceinisothiocyanat- (FITC-) Intensität, was auf eine erfolgreiche
Transfektion von Plasmiden zu menschlichen PBMC hinweist.
-
Dieses
Verfahren kann mit geringfügigen Änderungen
unter Verwendung von Plasmiden der Erfindung, die die Ribozym-DNA
tragen, wie in Abschnitt 9 gezeigt wird, durchgeführt werden.
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5. CXCR4-Ribozym-DNA
-
Menschliche
CXCR4-Ribozym-DNA wurde analog zu menschlicher CCR5-Ribozym-DNA, wie in Abschnitt
1 zuvor beschrieben, hergestellt. Die CXCR4-DNA-Sequenz ist in B.
Federspiel et al., Genomics 16, 707–712 (1993), offenbart. Die
Sequenz des Vorwärts-Primers
lautete
und jene
des Rückwärts-Primers
lautete
-
-
Die
Ribozym-DNA-Kassette wurde mit der Nucleotidsequenz Seq.-ID Nr.
8 konstruiert, die ausführlicher
in 12 beschrieben wird:
-
-
Gemäß 12 umfasst
die Kassette in der folgenden Reihenfolge (5' zu 3'):
-
-
6. Gentechnische
Herstellung des Polymerasevektors
-
Wie
in 18 ersichtlich umfasst der Polymerasevektor einen
Promotor aus Zytomegalie-Virus (CMV) und das T7-Polymerasegen. Die
vollständige
T7-Polymerase-DNA-Sequenz
ist bei Genbank/EMBL unter der Zugriffs-Nr. M.38308 erhältlich.
In diesem Beispiel wurde eine modifizierte T7-Polymerase-DNA erhalten
und durch PCR an Plasmid pT7Autol amplifiziert [J. Dubendorff & F. Studier, J.
Mol. Biol. 219, 61–68
(1991)]. Die für
die PCR verwendeten Primer umfassten die Restriktionsstellen EcoRI
und NcoI am 5'-Ende
des Vorwärts-Primers;
und BamHI am 5'-Ende
des Rückwärts-Primers
(BamHI wurde später
zum Klonieren des Autopolymerasevektors verwendet). Die Sequenzen
der Primer lauteten wie folgt, wobei die überlappende T7-Polymerase unterstrichen
ist.
-
Vorwärts:
-
- 5' acgaattccatggacacgattaacatcg 3' (Seq.-ID Nr. 9)
- EcoRI-Stelle = gaattc; NcoI-Stelle = ccatgg
-
Rückwärts:
-
- 5' atataaggatccttacgcgaacgcgaac 3' (Seq.-ID Nr. 10)
- BamHI-Stelle = ggatcc
-
Die
PCR wurde unter Verwendung von Vent-Polymerase (die für ein "stumpfes Ende" im PCR-Produkt sorgte)
durchgeführt.
Die durch den Vorwärts-Primer
eingeführte
NcoI-Stelle ist eine zusätzliche
Klonierungsstelle und wurde durch Ändern des zweiten Codons der
T7-Polymerase-DNA von Asn (aac) zu Asp (gac), gebildet. Dies verändert jedoch
nicht die Aktivität
von T7-Polymerase.
-
Das
T7-Polymerase-PCR-Produkt wurde in ein pCS2-NLS-Plasmid [R.A.W.
Rupp et al., Genes and Development 8, 1311–1323 (1994), und D.L. Turner & H. Weintraub,
s.o., 1434–1447]
kloniert, wobei 8 eine Karte des Plasmids pCS2-NLS
ist. Die T7-Polymerase-DNA wurde in eine EcoRI-Stelle und eine SnaB1-Stelle
(stumpfendig) in das CS2 eingeführt,
das in Uhrzeigerrichtung kurz nach dem NLS lokalisiert wurde. Die
NLS-Sequenz im pCS2 war für
den vorliegenden Zweck in diesem Stadium nicht erforderlich und wurde
durch Schneiden mit dem Restriktionsenzym NcoI deletiert, da die
NLS-Sequenz nun zwischen den zwei NcoI-Stellen lag. Anschließend wurde
das Plasmid über
die NcoI-Stellen erneut ligiert. 9 beschreibt diese
Vorgänge.
So wurde der Polymerase-Plasmidvektor wie in 18 dargestellt
vervollständigt.
Er enthielt einen CMV-Promotor (der bereits im CS2-Vektor existiert),
der die Produktion von T7-Polymerase aktivierte. T7-Polymerase ist
für den
Ribozym-DNA-Vektor und den Autopolymerase-Vektor, die nachstehend
näher beschrieben
werden, erforderlich.
-
7. Gentechnische
Herstellung des Autopolymerase-Vektors
-
Der
Zweck dieses Vektors ist, eine beständige und angemessene Bereitstellung
von T7-Polymerase zu gewährleisten.
Diese Polymerase wirkte autokatalytisch, was zur Bildung von mehr
T7-Promotor führte,
was wiederum mehr T7-Polymerase bildete (18).
-
mRNA,
die durch transfizierte Vektoren über Nicht-Säugetier-Promotoren in Säugetier-Zellzytoplasma gebildet
wurden, werden üblicherweise
nicht von den Zellen zur Translation in Proteine erkannt. Um die
Zelle dazu zu überlisten,
die T7-Polymerase-mRNA,
die durch den Promotor transkribiert wurde, zu translatieren, wurde
ein Encephalomyocarditis- (EMC-) Virus, UTR- (untranslatierte Region)
Sequenz (Moss et al., Nature 348, 91–92 (1990)), hinzugefügt. Diese
Sequenz dient als ein Translations-Enhancer, der Bindungsstellen
für Ribosomen
bereitstellt, und wurde durch PCR-Amplifikation von EMC-UTR aus
dem pTM1-Vektor erhalten (siehe B. Moss et al., Nature 348, 91–92 (1990)).
Die verwendeten Primer umfassten eine XbaI- Restriktionsstelle im Vorwärts-Strang.
In den Rückwärts-Primer
wurde keine Restriktionsstelle eingeführt, da die EMC-Sequenz, die
aus diesem Vektor erhalten wurde, mehrere gentechnisch gebildete
Restriktionsstellen wie BamHI und NcoI enthielt. Diese Primer lauteten
wie folgt, wobei die überlappenden
EMC-Sequenzen unterstrichen sind:
-
Vorwärts:
-
- 5' gctctagaccacaacggtttccctctag 3' (Seq.-ID Nr. 11)
- XbaI-Stelle = tctaga,
-
Rückwärts:
-
- 5' cagcttcctttcgggctttgttagcagc 3' (Seq.-ID Nr. 12)
-
Die
EMC-Sequenz wurde dann in pET11a (Novagen Ltd.) unter Verwendung
von XbaI- und BamHI-Stellen kloniert. Eine Karte ist im Katalog
1996/97 von R & D
Systems Ltd., Abingdon, Oxfordshire, England, auf S. 74 zu finden.
Die EMC-UTR-Sequenz
enthielt von Natur aus eine NcoI-Restriktionsstelle an ihrem 3'-Ende vor einer BamHI-Stelle.
So wurde die T7-Polymerasesequenz, wie in Abschnitt 6 beschrieben,
die NcoI- und BamHI-Stellen enthielt, einfach in das Plasmid stromab
der EMC-UTR-Sequenz, wie von X. Chen et al., Nucleic Acids Research
22, 2114–2120
(1994), beschrieben wurde, kloniert.
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8. Gentechnische Herstellung
der Ribozymvektoren
-
Die
Kassetten, die die vollständige
Ribozym-DNA und den T7-Promotor enthielten, wurden in das bekannte
Plasmid pUC19 kloniert. In einer Experimentenreihe wurde unter Verwendung
von XbaI- und EcoRI-Stellen menschliche CCR5-Ribozym-DNA in das
Plasmid kloniert. In einer anderen Experimentenreihe wurde die CXCR4-Kassette in dasselbe
Plasmid genau vor der CCR5-Kassette kloniert. Dies erfolgte unter
Verwendung von PstI- und XbaI-Restriktionsenzymen. Die CXCR4-Kassette
weist eine PstI-Stelle in der Nähe
ihres 5'-Endes und
eine XbaI-Stelle in der Nähe
ihres 3'-Endes auf
(12). Restriktion mit XbaI bringt das 3'-Ende der zu ligierenden
CXCR4-Kassette direkt an die XbaI-Stelle in der Nähe des 5'-Endes der CCR5-Kassette (3).
Die resultierenden Plasmide bilden zusammen den "Ribozymvektor", der in 18 gezeigt
ist.
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9. Expression der Vektoren
in menschlichen mononuklearen Peripherblutzellen die starke Hemmung
von CCR5- und CXCR4-RNA aufweisen
-
Menschliche
mononukleare Peripherblutzellen (PBMC) wurden wie in Abschnitt 1
beschrieben isoliert und kultiviert. Verschiedene der drei Vektoren,
d.h. von Polymerase, Autopolymerase und Ribozym-DNA, wie in 18 gezeigt,
wurden in gleichmäßigen Anteilen
zur Transfektion hinzugefügt.
Drei Experimente wurden durchgeführt,
(1) worin alle drei Vektoren hinzugefügt wurden, (2) worin nur der
Polymerasevektor und der Ribozym-DNA-Vektor hinzugefügt wurden
und (3) worin nur der Polymerasevektor hinzugefügt wurde.
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Transfektion
wurde wie von Gibco Ltd., die das DMRIE-C-Reagens bereitstellte,
beschrieben durchgeführt.
8 μl DMRIE-C
wurden mit 4 μg
in 1 ml Optic-MEM vermischt, bevor 2 × 106 Zellen
zur Transfektion, wie in den Anweisungen von Gibco beschrieben,
zugesetzt wurden. Die Zellen wurden dann mit PHA-L (Sigma) bei 1 μg/ml und
IL-2 10 U/ml 48 Stunden lang stimuliert (Endvolumen: 3 ml), bevor
sie zur Analyse geerntet wurden. In einer ersten Experimentenreihe
wurde das Ribozym-DNA-Plasmid
verwendet, das nur CCR5-Ribozym-DNA enthielt. In einer zweiten Experimentenreihe
wurde die PBMC mit einem Plasmid transfiziert, das sowohl CXCR4- als auch CCR5-Ribozym-DNA
in einem einzelnen Plasmid enthielt (18, Abschnitt
8 s.o.).
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RNA
wurde aus den transfizierten Zellen wie in Abschnitt 1 beschrieben
transfiziert, und PCR wurde durchgeführt, um zelluläre CCR5-
oder CXCR4-mRNA unter Ver wendung des zuvor beschriebenen CCR5- oder
CXCR4-Primers zu identifizieren. Da die Zellen auf natürliche Weise
auch Actin exprimieren, sorgt die Menge an mRNA von Actin für eine quantitative
Kontrolle. Solch eine Kontrolle bestätigt, dass das Hemmen von CCR5
und/oder CXCR4 nicht auf den allgemeinen Abbau von RNA zurückzuführen ist;
sonst wäre
die Actin-RNA ebenfalls abgebaut worden. Dies bestätigt auch,
dass die Ribozymwirkung spezifisch ist, indem sie Actin-RNA nicht
spaltet. Diese Kontrolle unter Verwendung von Actin ist auf dem
Gebiet der Molekularbiologie weit verbreitet.
-
Die
Resultate sind in den 13a, 13b und 14 in
Form von gefärbten
Agarose-Gel-Photographien
der relevanten PCR-Produkte gezeigt. Die 13a und 13b beziehen sich auf die erste bzw. zweite Experimentenreihe,
wobei 13a die Wirkung von Ribozym
gegen CCR5-RNA und 13b die Wirkung gegen CXCR4-RNA
zeigt. Die Anordnung der 13a und 13b ist dieselbe und entspricht der folgenden
Tabelle, worin die Bahnen 1–8
von links nach rechts durchnummeriert sind.
-
-
Bahn
1 zeigt, dass CCR5 und mRNA aus den PBMC, die mit allen drei Vektoren
transfiziert wurden, d.h. mit Polymerase-, Autopolymerase- und den
Ribozymal-DNA-Vektoren,
nicht deletierbar sind, was auf völlige Hemmung von CCR5-mRNA
schließen
lässt.
Bahn 2 weist eine schwache Bande von CCR5-mRNA auf, was zeigt, dass ohne
den Autopolymerasevektor die Hemmung von CCR5- und CXCR4-mRNA nicht
vollständig
ist. Bahn 3 enthält
eine helle Bande der CCR5- oder CXCR4-RNA, was darauf hinweist,
dass es ohne den Ribozym-Vektor zu keiner Hemmung von CCR5-(13a) oder CXCR4- (13b)
mRNA kommt. Die Hemmung der CCR5- oder CXCR4-RNA war spezifisch,
da die Kontrollen in den Bahnen 5–7 eindeutig eine helle Bande
von Actin-mRNA von denselben transfizierten Zellen wie in den Bahnen
1–3 zeigen.
So wurde spezifische und starke Hemmung von CCR5 und CXCR4 durch
die vorliegende Erfindung erreicht. Obwohl die starke Hemmung den
Autopolymerasevektor erforderte, werden Fachleute in der Lage sein,
alternative Wege zum Boosten der Ribozymproduktion auf gleichwertige
oder höhere
Niveaus zu definieren. Dies kann durch Steigern der Konzentration
der Ribozyme unter Verwendung von beispielsweise Multikopien von
Ribozym-DNA-Sequenz im Vektor oder in den Vektoren und/oder durch
Steigern der Menge und/oder Wirksamkeit der Promotoren erfolgen.
-
Die
gesamte hierin beschriebene T7-verbundene Arbeit wurde gemäß den Protokollen
und Empfehlungen von Novagen Ltd. durchgeführt, einschließlich der
pLysS-Gelreinigung.
Der Rest wurde gemäß den Protokollen
in "Molecular Cloning – A Laboratory
Manual", 2. Auflage
(1989), Sambrook, Fritzsch & Maniatis (Hrsg.),
durchgeführt.
-
Wie
bereits erwähnt
enthält
der Ribozym-DNA-Vektor, der CXCR4-Ribozym-DNA aufweist, auch CCR5-Ribozym-DNA.
Das mRNA-Niveau von CCR5 aus PBMC, die mit diesem Vektor behandelt
worden waren, wurde beobachtet, und die Ergebnisse sind in 14 gezeigt.
In 14 sind die Bahnen von rechts nach links nummeriert.
In Bahn 1 sind Molekulargewichts-Marker zu sehen, Bahn 2, die eine
breite helle Bande aufweist, stellt PBMC dar, die mit einem Kontrollvektor
CS2 behandelt wurden, der kein Ribozym enthält. Bahn 3 zeigt PBMC, die
nur mit Polymerase- und Ribozym-DNA-Vektoren behandelt wurden, und
Bahn 4 zeigt PBMC, die mit Polymerase-, Autopolymerase- und Ribozym-DNA-Vektoren
behandelt wurden. Das Verschwinden der CCR5-Bande weist darauf hin,
dass eine vollständige
Spaltung er sichtlich ist. Dies lieferte auch den eindeutigen Beweis,
dass das selbstspaltende Ribozym in der Lage ist, multiple Ribozyme
aus demselben Vektor zu bilden.
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10. Wirkungen von PBMC-Zellexpression
von CCR5- und CXCR4-Proteinmolekülen nach
der Behandlung mit Ribozymen
-
Nach
der in Abschnitt 9 beschriebenen Transfektion wurden menschliche
PBMC von einzelnen Spendern (nicht gepoolt) mit PHA-L und IL-2,
wie in Abschnitt 4 beschrieben, oder mit einem monoklonalen Antikörper gegen
CD3, UCHT-1 genannt (erhältlich
beim Dept. of Immunology, University College Hospital, London, UK)
mit IL-2 bei 10 U/ml, wie von Masseyeff et al. in "Methods of Immunological
Analysis" (veröffentlicht
im VCH Verlag, Weinheim, Deutschland (1993)) beschrieben, stimuliert.
Die Zellen wurden an den Tagen 3, 5, 7, 10 und 12 mit monoklonalen
Antikörpern
gegen CCR5 oder CXCR4 oder Kontrollantikörpern gefärbt, die direkt mit fluoreszierenden
Materialien konjugiert waren, die im Handel bei PharMingen Ltd.
erhältlich
sind. Das Färbungsverfahren
wurde gemäß den Anweisungen
derselben Gesellschaft durchgeführt.
Die Daten wurden unter Verwendung eines Fluorescent Activated Cell
Sorter (Becton Dickinson Ltd.) wie in Abschnitt 4 analysiert. Die
Ergebnisse sind nachstehend wie auch in den 16a, 16b (CCR5) und 17a, 17b (CXCR4) zusammengefasst. Diese Figuren
sind den 6a und 6b ähnlich,
auf die in Abschnitt 4 verwiesen wird. Hier zeigen sie eine klare
Verschiebung der Zellpopulation nach links, was auf einen Rückgang der
Expression von CCR5 oder CXCR4 schließen lässt.
-
Die
beste Hemmung wurde in jeder einzelnen Person an verschiedenen Tagen
festgestellt. Im Durchschnitt hemmte das CCR5-Ribozym 78 % der Expression
von CCR5. CXCR4-Ribozym (das auch CCR5-Ribozym enthielt) hemmte
CXCR4-Expression
zu 69 % und CCR5-Expression zu 79 %.
-
11. Hemmung von HIV-Infektion
in menschlichen mononuklearen Peripherblutzellen (PBMC), die mit
den Ribozymen behandelt wurden
-
Nach
der in Abschnitt 9 beschriebenen Transfektion wurden die Zellen
mit PHA-L und IL-2 wie in Abschnitt 4 beschrieben stimuliert. Diese
Zellen wurden am Tag 5 pelletiert, bevor sie mit 100 μl eines HIV-Stamms
namens LAI, der bei MRC (Medical Research Council, UK) erhältlich ist,
inkubiert wurden. Dieser Stamm enthielt 3.000 pg von p24-HIV-Oberflächen-Antigenprotein,
was durch Sandwich-ELISA, zur Verfügung gestellt von Coulter Ltd.,
bestimmt wurde. (Dies ist derselbe Test, der im klinischen Bereich
verwendet wird, um die Menge an Viren im Blut eines Patienten zu
bestimmen.) Das Gemisch wurde dann bei 37°C 2 Stunden lang mit 5 % CO2 inkubiert. Die Suspension wurde mit RPMI1640
(Gibco Ltd.) dreimal gewaschen und unter Verwendung von 200 g zentrifugiert.
Anschließend
wurden 1 Million Zellen in 4 ml RPMI1640-Kulturmedium, das 10 %
fötales
Kälberserum
und 10 U/ml IL-2 enthält,
wie zuvor beschrieben resuspendiert. 3–4 Tage später wurde IL-2 auf 10 U/ml
aufgefüllt.
Die Kulturüberstände wurden
an Tag 7 nach der Infektion geerntet. Sandwich-ELISA, wie zuvor
erwähnt,
wurde eingesetzt, um die Menge an p24 zu bestimmen, die einen direkten Rückschluss
auf die Menge an Viren zulässt.
Die Kulturüberstände wurden
1 : 100 und 1 : 500 für
den Test verdünnt,
um Daten in pg/ml innerhalb der zuverlässigen Kalibrationsregion der
Standardkurve für
ELISA zu erhalten. Die Resultate lauten wie folgt:
-
-
Die
obigen Daten zeigen, dass durch die Behandlung mit dem Ribozym-Vektorensystem
HIV-Infektiosität
zur Gänze
gehemmt wurde.
-
Alle
früheren
Verweise, die hierin zitiert wurden, um auf bekannte Materialien,
Sequenzen und Verfahren hinzuweisen, sind einschließlich der
Beschreibung der erwähnten
Materialien, Sequenzen und Verfahren ausdrücklich durch Verweis hierin
aufgenommen.
-
FREIER TEXT
IM SEQUENZPROTOKOLL
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Sequenzen,
die als "künstlich" betrachtet werden,
enthalten im Rahmen des Sequenzprotokolls unter der Kennung <223> folgenden freien Text:
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